Nghiên cứu tác dụng hạ glocose huyết của chiết phẩm steviosid từ lá của cây cỏ ngọt trồng ở việt nam trên động vật thực nghiệm

ĐỖ THỊ PHƯƠNGNGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA■ ■ CHIẾT PHẨM STEVIOSID TỪ LÁ CỦA CÂY cỏ NGỌT■ TRỒNG ở VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THựC NGHIỆM■ ■ ■ a • LUẬN VĂN THẠC sĩ Dược HỌC Chuyên

Đỗ THỊ PHƯƠNG ■

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA■ ■

CHIẾT PHẨM STEVIOSID TỪ LÁ CỦA CÂY cỏ NGỌT■

TRỒNG ỏ VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THựC NGHIỆM ■ ■ ■ ■ ■

LUẬN VĂN THẠC s ĩ D ư ợ c HỌC

- C h s - h ĩ

o2 é /

HÀ N Ộ I- 2005

ĐỖ THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA■ ■

CHIẾT PHẨM STEVIOSID TỪ LÁ CỦA CÂY cỏ NGỌT■

TRỒNG ở VIỆT NAM TRÊN ĐỘNG VẬT THựC NGHIỆM■ ■ ■ a •

LUẬN VĂN THẠC sĩ Dược HỌC

Chuyên ngành: Dược lý - Dược lâm sàng

- PQễ ^ễ>KJi %ề- "^'uuuỷ ^ à m , n < ị^i tkàiỷ đã tậ n ũnẤ ẹùíp- uà hư ổnẹ clư^ iô i MẤièncỷ ỉu ^ c ầ i đầu Ũê4i, t/ưm(ỷ ncịẦùêH cứi4 kkờa kạc ^kàiỷ đã ân cần, cẤủ ếứớ- tô i i/ưmcỳ ■iuếi (ịu d ỈAÌnk kạc tập- aà Uiực kiện Luậyi- aă^, đóH(ỷ Cf6^- ckữ- tứi iJưẾinxỷ kieM, Uiức aâ cỉmcị, (ịid ká ii ÌAũmị, c&ii/ỷ m ệc aà ouộc ẳẩHCỷ.

- PQẵ ^ễ>KJí K.im QẩK, HCỊ4^i tkàiỷ đã tọK ũíiẤ lue^ncj, dẫn, cịlÚỸ cJủ

ỉmo- ckữ- tữl ẬziếvL thứ c Cịỉú cịÁd tnan^ HCỷlúên cứu- kkữa kức.

^ỗi oẤn ẩặc ỉù ệt cảm (m tớ i J^(ỷmfễn K.lm pkiyamcỷ- Klíỡa ảúiẤ kơd-V iện 'ĩbm íc íiệ ti uà tờàn U iểcán ếậ nkoM uíên inxmcỷ kkữa, tâ i đoMCỷ c&ncỷ tdc, ẩd tọừ- m ại ầiền ki£M uề ŨệM,, kữd ũkất aà đã tộM^ Ù m U (ịùlp ầữ, cU l ỉiảỡ- tô i ÌAữHCị, câncỷ iúệc, đỚHCỷ ẹáf- nlúỉncỷ íỷ kiến (ịu l kaú đ ể iô l Uờàn ÌkàtiẰ LuỘẬt oãK.

L^-Với ừ iJ^ cảm ckâK tkà n k, tô i Ỉỉàiỷ tẩ ÌÀnẹ ỉù ũ cm tổ i ^ ể ỉ^ẹiUịần, ÍẰíok ^k a - phó- '^'u/eẻncỷ Klma p kâ n Uck ừ êa cUuẩkt đã đặc ỉú ệi ầà n k ciíớ- tô i áự cỹUip- đ^, c íủ ỉiảờ;

uà cá tnẤiểu, Ỷ ỉe^íến (ịỉ4X ỉsdu-, áửa ckĩẼa íu ậ ịt oẩM.

oỉúd<ỷ 'Xiíi cdm ím 'ỉh ể Kim íìứ d t- ^n-iứỈHỶ K.Uữa piíâtn, Uck tiễu cịiMẩn cimcị, tiià n tk ể các cám^ ếậ nkâK iúên ÌAOMíị, KUữa đã Cfldp- ^ ^ 4 ^ ^Aều, JsJện cUữ- tâi ÌAữncỷ óúếi Cỳiid U ỉh à làm Laậ4^ ưã*t.

^ữi MM- ckân U uinh cẩm PQẵ ^ẳ cẰíoàncỷ Kim Jím ỷần,- '^nưẻncị, ÍẰỘ- m ỗ^ 'ìhưực lâm áÒM(ỷ, in/ỷmsl ikàiỷ ầã tnực tiếp- ầcuỷ hảứ- okữ- tôi HkiầA, ỉsíến ikứ c ế ẩ ícU aề cịuufỀ4i yuỷànk lâm áầ*Kỷ.

ADN : acid deoxyribonucleic

GOD : glucose oxidase

HPLC ; High Perform ance Liquid Chrom atography

(sắc ký lỏng hiệu năng cao) i.p ; intraperitoneal ( tiêm phúc mạc)

i.v ; intravenous ( tiêm tĩnh mạch)

kl/tt ; khối lượng/thể tích

NPH insulin: N eutral Protam ine H agedom insulin

( là insulin protam in trung tính H agedom )

Po : p so với lúc 0 giờ

POD : peroxidase

SL ; sinh lý

Ste (steviosid): chiết phẩm steviosid

W HO : W orld H ealth O rganization ( Tổ chức Y tế Thế giới)

Bảng 3.2 Diễn biến GH trong ngày ở động vật ăn uống bình thường 31

Bảng 3.3 Diễn biến GH trong ngày ở động vật nhịn đói kéo dài 33

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu liều alloxan gây tăng GH trên chuột nhắt 35

trắng

Bảng 3.5 Diễn biến GH khi tiêm alloxan i.v liều 60 m g/ kg trên chuột 36

nhắt trắng

Bảng 3.6 Tác dụng của steviosid trên GH ở chuột nhắt trắng bình 38

thường có so sánh với glipizid và chlorpropam id

Bảng 3.7 Tác dụng của steviosid trên GH ở chuột nhắt trắng bị tăng GH 41

do alloxan có so sánh với insulin và glipizid

1.3 Phân loại và cơ c h ế bệnh sinh của đái tháo đường 4

CHƯ ƠNG 3: K Ê T Q U Ả N G H IÊ N c ú ư 293.1 K ết quả chiết suất steviosid từ lá cỏ ngọt 293.2 K ết quả diễn biến glucose h u y ết trong ngày ở động vật 313.3 K ết quả diễn biễn glucose huyết khi đói ở động vật 323.4 K ết quả xác định liều alloxan làm tăng glucose huyết ở chuột 34

n hắt trắng

3.5 K ết quả nghiên cứu tác dụng của steviosid trên glucose huyết ở 37

chuột nhắt trắng bình thường khi đói, có so sánh với glipizid và

chlorpropam id

3.6 K ết quả nghiên cứu tác dụng của steviosid trên chuột nhắt 41

trắng bị đái tháo đường do alloxan, có so sánh với insulin và

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC của chiết phẩm steviosid 30

Hình 3.2 Phổ ƯV-VIS của steviosid chuẩn và pic có thời gian lưu 34,78 30

phút của chiết phẩm steviosid

Hình 3.3 Biểu đồ diễn biến GH trong ngày ở động vật ăn uống bình thưòỉng 32

Hình 3.4 Biểu đồ diễn biến GH trong ngày ở động vật nhịn đói kéo dài 34

Hình 3.5 Biểu đồ diễn biễn nồng độ GH phụ thuộc liều alloxan trên chuột 35

nhắt trắng

Hình 3.6 Biểu đồ diễn biến GH khi tiêm alloxan i.v liều 60 m g/ kg trên 37

chuột nhắt trắng

Hình 3.7 Biểu đồ biểu thị tác dụng của steviosid trên GH ở chuột nhắt trắng 40

bình thường có so sánh với glipizid và chloq^ropamid

Hình 3.8 Biểu đồ biểu thị tác dụng của steviosid trên GH ở chuột nhắt trắng 44

bị đái tháo đường do alloxan có so sánh với insulin và glipizid

Phụ l ụ c l Các chất nhầy trong cây đã thử tác dụng hạ glucose huyết

Phụ lục 2 Những cây thuốc có tác dụng hạ glucose huyết qua sàng lọc thực

nghiệmPhụ lục 3 30 cây thuốc thường dùng chữa đái tháo đường ở ấn độ

Phụ lục 4 Tác dụng hạ glucose huyết của cao từ 30 cây trên đái tháo đường do

alloxan ở chuột nhắt trắng

toàn xã hội Bệnh có chiều hướng tăng rõ rệt theo thời gian và sự tăng trưởng kinh tế H iện tại nó là m ột trong ba bệnh (ung thư, tim m ạch, đái tháo đường) phát triển nhanh nhất M ới gần đây W H O đã lên tiếng “ báo đ ộ n g ” về m ối lo ngại này trên toàn th ế giới [59] D o tốc độ phát triển nhanh của bệnh, nên nhu cầu điều trị đái tháo đường cũng tăng nhanh, đã có hàng loạt thuốc điều trị đái tháo đường ra đời nhằm cải th iện cuộc sống cho người bệnh.

Bên cạnh các thuốc có n guồn gốc tổng hợp, các nguồn thuốc thảo dược cũng đang được quan tâm và phát triển Uỷ ban chuyên gia của W H O về đái tháo đưòỉng đã khuyên nghị nên phát triển và sản xuất các thuốc điều trị đái tháo đường có nguồn gốc thảo dược, bởi vì đây là nguồn dược liệu sẵn có, dễ

sử dụng, độ an toàn cao, giá th àn h rẻ, dễ chấp nhận cho cộng đồng, đặc biệt là các nước kém phát triển [74]

Trước đây, lá cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) đã được dùng để chữa đái

tháo đường [52], [6 8], nhưng với quan niệm cho là do cỏ ngọt có vị ngọt làm cho bệnh nhân giảm ăn đường, nên glucose huyết giảm Gần đây, m ột số nhà khoa học đã chứng m inh ch ín h bản thân steviosid có tác dụng làm giảm glucose huyết [39], [50], [61]

Cây cỏ ngọt đã bắt đầu di thực vào nước ta từ năm 1988 và hiện được trồng khá phổ biến Tuy nhiên, chưa có m ột công trình nào trong nước nghiên cứu m ột cách đầy đủ về tác dụn g của nó Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:

“ N ghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của chiết phẩm steviosid từ lá của cây cỏ ngọt trồng ở V iệt nam trên động vật thực ng h iệm ”

từ lá của cây cỏ ngọt để nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết và làm bán thành phẩm cho sản xuất thuốc.

2 Chỉnh lý mô hình nghiên cứu thuốc chữa đái tháo đường thực nghiệm ở chuột nhắt trắng trong điều kiện của Việt Nam

3 Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết và sơ bộ tìm hiểu cơ chế tác dụng của chiết phẩm steviosid

Đ ái tháo đưcmg là m ột bệnh rối loạn chuyển hoá, được biểu hiện bằng tăng glucose h uyết m ạn tính do giảm tương đối hoặc tuyệt đối về tác dụng hoặc bài tiết insulin của tuyến tụy kèm theo rối loạn chuyển hoá các chất glucid, lipid, protid [3], [15], [19], [48], [56] Các rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính, tình trạng dễ nhiễm trùng và về lâu dài sẽ gây ra các biến chứng ở m ạch m áu nhỏ và m ạch m áu lớn [62].

1.2 Tỷ lệ m ắc bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường có xu hướng tăng rõ rệt theo thời gian và sự tăng trưởng của kinh tế Trên th ế giới, theo thống kê về tỷ lệ m ắc bệnh đái tháo đường năm 1997 của m ột số quốc gia như sau: M ỹ: 6,6%; N hật Bản; 1,7%;

A nh 2,1% ; Pháp 4,4% ; Đức 9,1% ; Tây Ban Nha: 4,0% [15], [19], [25]

M ặt khác, bệnh đái tháo đường cũng thay đổi theo lứa tuổi, dân tộc, các vùng địa lý khác nhau [19]

ở V iệt nam , cho đến nay chưa có tài liệu nào công bố về dịch tễ học của bệnh đái tháo đường trên phạm vi toàn quốc

N ăm 1991, Lê H uy L iệu và Phan Sĩ Q uốc đã thực hiện m ột cuộc điều tra ở H à N ội, tỷ lệ m ắc bệnh chung là 1,1% trong đó nội thành chiếm 1,6% và ngoại thành chiếm 0,82% [18]

N ăm 1993, M ai T h ế Trạch và cs đã điều tra ở thành phố Hồ C hí M inh,

tỷ lệ m ắc bệnh đái th áo đường là 2,52% [30]

N ăm 1996, theo điều tra của Trần Hữu D àng tại thành phố H u ế tỷ lệ

m ắc bệnh đái tháo đường là 0,96% [5]

Rõ ràng đái tháo đường đang có chiều hướng phát triển nhanh cả ở nước

ta nhất là lại tập trung ở lứa tuổi lao động 30- 64 [53]

Do hậu quả của bệnh đái tháo đường với những biến chứng về tim

m ạch, thần kinh, gây đột qụy, m ù loà, tổn thương thận, cắt cụt chi, giảm tuổithọ nên bệnh đái th áo đường k hông chỉ là m ối quan tâm của ngành Y tế m à còn liên quan đến vấn đề kin h tế xã hội

1.3 P hân loại và cơ chê bệnh sinh của đái tháo đường

1.3.J P hán loại:

a Đ ái tháo đường typ 1: Đ ái tháo đường typ 1 xảy ra khi tế bào beta bị tổn

thương dẫn đến thiếu insulin N guyên nhân tổn thương có thể do cơ c h ế m iễn

dịch trung gian tế bào, cũng có thể do khuyết tật về gen ở tế bào beta [15],

[26], [43]

h Đ ái tháo đường typ 2: Đ ái tháo đưòng typ 2 là do kháng insulin kết hợp với

khả năng bài tiết insulin giảm N guyên nhân có thể do cơ thể sinh ra yếu tốkháng insulin (kháng insulin typ A), do kháng thể tranh chấp với insulin tại thụ thể hoặc cũng có thể do thuốc gây ra (acid nicotinic, glucocorticoid, các thiazid, horm on tuyến giáp ) N guyên nhân bệnh lý do rối loạn nội tiết như bệnh C ushing, u tuỷ thượng thận, ưu năng tuyến giáp, bệnh to đầu chi cũng gây ra bệnh đái tháo đường typ 2 [26], [48]

c C ác typ Đ TĐ đặc hiệu khác

Đái tháo đường thai nghén Rối loạn dung nạp glucose Đái tháo đường do di truyền Đái tháo đưòỉng thứ p h á t

1.3.2 C ơ c h ế b ệ n h sin h c ủ a đ á i th á o đư ờ n g

a C ơ c h ế bệnh sinh Đ T Đ typ ỉ

nhất là virus (C ytom egalovirus, virus Cox sackie B, Epstein-B ar, E cho ) [55],

th ứ đến là thức ăn ( sữa, cafein ) và điều kiện sống ( stress ) [75]

Khi tác nhân m ôi trường tác động sẽ làm tăng độ nhạy cảm của cá thể,

m ôi trường chính là yếu tố khởi phát quá trình bệnh ở những cá thể m ẫn cảm

di truyền, nó khởi động hoạt tính m iễn dịch, tạo ra m ột chuỗi sự k iện hoạt hoá phản ứng tự m iễn [43] K hi phản ứng viêm do sự tự m iễn hoàn tất, tế bào beta

củ a đảo tụy bị phá huỷ nhiều, lượng insulin m áu vẫn đủ cho nhu cầu hoạt động của cơ thể, thì lâm sàng chưa có biểu hiện gì, đây là giai đoạn tiền ĐTĐ [19], [25], [43],

Giai đoạn tiền Đ TĐ có thể ngắn hoặc dài tuỳ từng cá thể Khi tế bào beta bị phá huỷ nhiều, lượng insulin sản xuất không đáp ứng đủ nhu cầu hoạt động của cơ thể, glucose h uyết sẽ tăng, lúc này biểu hiện lâm sàng rõ và được chẩn đoán là Đ TĐ [15]

b C ơ c h ế bệnh sinh Đ TĐ typ 2

M ặc dù Đ TĐ typ 2 hay gặp hơn (chiếm 80-90% tổng số bệnh nhân

Đ T Đ ) và có tính chất gia đình rõ rệt [15], [19], [37], nhưng sinh bệnh học của bệnh Đ TĐ typ 2 vẫn chưa được hiểu m ột cách đầy đủ Tuy nhiên hai yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ c h ế bệnh sinh Đ TĐ typ 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào beta tuyến tụy và hiện tượng k háng insulin, là hai yếu tố tác động qua lại lẫn nhau [41]

K hiếm khuyết chức năng bài tiết insulin có thể làm xuất hiện hiện tượng kháng insulin, hoặc ngược lại Giữa hai yếu tố này, yếu tố nào chiếm ưu

th ế và yếu tố nào xuất hiện trước cho đến nay vẫn chưa xác định Cùng với yếu tố m ôi trường (ch ế độ ăn uống, sinh hoạt, bệnh béo phì ) thúc đẩy làm phát sinh và phát triển bệnh [44], [65],

bình thường trong m áu.

G iai đoạn 2: T inh trạng k háng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăng glucose m áu sau bữa ăn

G iai đoạn 3; Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm và gây tăng glucose m áu lúc đói, bệnh Đ TĐ biểu hiện ra bên ngoài

T rong các yếu tố m ôi trường đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh, béo phì là yếu tố thường được đề cập nhất [41] Chính béo phì làm gia tăng tình trạng k h áng insulin N hiều bằng chứng cho thấy các biện pháp giảm béo phì sẽ làm giảm đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát tốt glucose huyết

Tóm lại, sự cùng tồn tại khiếm khuyết bài tiết insulin và kháng insulin

là điều kiện để bệnh Đ TĐ biểu hiện và béo phì là yếu tố góp phần thúc đẩy bệnh Đ TĐ phát triển

tiêm tĩnh m ạch Đ ể vừa có tác dụng nhanh, vừa có tác dụng kéo dài, phải phối hợp insulin hoà tan với insulin tác dụng trung bình hoặc kéo dài.

C ơ c h ế tác dụng

Insulin có tác dụng sinh học rất rõ rệt M ô đích quan trọng để điều hoà

sự hằng định glucose trong nội m ô là gan, cơ và m ô mỡ, nhưng insulin gây ra hiệu quả điều h o à m ạnh trên cả các loại tế bào khác [23], [48]

Sau khi được giải phóng, insulin đến các m ô đích, gắn vào thụ thể đặc

hiệu Thụ thể insulin là 1 glycoprotein gồm 2 tiểu đơn vị a (nằm ngoài tế bào)

và 2 tiểu đơn vị p (nằm trong tế bào) [42] Bốn đơn vị này gắn đối xứng với nhau bằng cầu nối disulfid Insulin liên kết với tiểu đofn vị a ở ngoài tế bào, kích thích tyrosin kinase của tiểu đơn vị p trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng, làm thay đổi sinh lý, sinh hoá trong tế bào K ết quả là làm tăng tính thấm của m àng tế bào với glucose, giúp glucose chuyển vào tế bào N gay sau khi vào trong tế bào, glucose được phosphoryl hoá, tạo thành glucose-6-phosphat (G6P) G6P sẽ được chuyển thành glycogen hoặc bị oxy hoá để cung cấp năng lượng cho cơ thể và do đó làm giảm hàm lượng glucose huyết [56]

Vì insulin có vai trò quan trọng chuyển hoá các chất glucid, lipid, protid, nên khi có các rối loạn về tác dụng hoặc bài tiết insulin sẽ gây rối loạn chuyển hoá các chất, đặc biệt là glucose, làm tăng glucose huyết, gây đái tháo đường

Dược động học của insulin

Insulin bị m en proteinase của dạ dày phá huỷ, do vậy uống không có tác dụng Tiêm dưới da hoặc tiêm bắp, insulin hấp thu tốt vào m áu K hả năng hấp thu insulin tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: nguồn gốc (insulin lợn, bò ), đường tiêm , vị trí tiêm và thay đổi theo từng bệnh nhân [26], [48]

Insulin chuyển hoá tại gan, thận và cơ K hoảng 50% insulin đến gan qua tĩnh m ạch cửa bị gián g hoá và không vào vòng tuần hoàn chung Insulin được lọc qua cầu thận, tái hấp thu ở ống lượn gần (80% ) K hoảng 60% insulin

tái hấp thu bị chuyển hoá ở ống lượn gần, do vậy ở những bệnh nhân có chức

năng thận suy giảm cần đ iều chỉnh liều cho phù hợp [48]

C h ỉ định của insulin [27], [62].

- Tất cả bệnh nhân ĐTĐ typ 1 (ĐTĐ phụ thuộc insulin)

- Đối với bệnh n h ân Đ TĐ typ 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulin), về nguyên tắc, cần được điều trị bằng c h ế độ ăn, luyện tập và dùng thuốc uống chữa ĐTĐ In su lin được dùng trong các trường hợp hôn mê do ĐTĐ, do nhiễm acid ceton khi phẫu thuật, sốt cao, nhiễm khuẩn, rối loạn chức năng gan thận nặng hoặc Đ TĐ ở phụ nữ có thai

T a i biến và tác dụng không m ong m uốn [27], [56].

- Hạ glucose huyết: là tai biến thường gặp, xảy ra khi nồng độ glucose giảm xuống dưới m ức bình thường N guyên nhân chủ yếu là do dùng quá liều insulin

- Phản ứng dị ứng với insulin: Có thể chỉ xuất hiện tại chỗ hoặc toàn thân

* Dị ứng nhanh: xuất hiện 15-30 phút sau khi tiêm insulin, tại chỗ tiêm

xuất hiện quầng m àu hồng nhạt, nổi m ẩn m ày đay

* Dị ứng chậm : xuất hiện sau m ột ngày, có khi còn lâu hơn với các triệu chứng thâm nhiễm tại chỗ tiêm

* N ổi m ày đay toàn thân, choáng phản vệ ít gặp, có thể có m ột số triệu chứng toàn thân như m ệt m ỏi, sốt, ngứa, đau các khớp, rối loạn tiêu hoá Loạn dưỡng m ô m ỡ tại chỗ tiêm : teo m ô m ỡ dưới da

hệ Các thuốc th ế hệ 1 gồm có tolbutam id, tolazam id và chlorpropam id; các thuốc th ế hệ 2 gồm có glyburid, glipizid và gliclazid Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh [15], [26], [27], [48].

Tác dụng hạ glucose huyết của các thuốc th ế hộ 2 m ạnh hơn nhiều (khoảng 100 lần) so với các thuốc th ế hệ 1 M ặc dù nửa đời trong huyết tương ngắn hơn nhưng tác dụng hạ glucose huyết kéo dài hơn, do vậy chỉ cần dùng thuốc 1 lầ n /n g à y [49]

Tất cả các sulfonylurea đều chuyển hoá ở gan, sản phẩm chuyển hoá đào thải qua đường tiểu [49] C hlorpropam id chuyển hoá không hoàn toàn,

k hoảng 2 0% thuốc đào thải dưới dạng chưa chuyển hoá, do vậy cần thận trọng với bệnh nhân có bệnh lý suy giảm chức năng gan, thận [48], [49]

cho bệnh nhân đái th áo đường typ 2, làm tăng sự giải phóng insulin từ tuyến tụy.

Sulfonylurea cũng có thể làm tăng nồng độ insulin bằng cách làm giảm

độ thanh thải in su lin ở gan T rong những tháng đầu điều trị bằng sulfonylurea, nồng độ insulin trong huyết tương lúc đói và đáp ứng của insulin khi uống glucose tăng lên

K hi dùng lâu dài, nồng độ insulin trong tuần hoàn giảm đi đến mức bằng nồng độ in su lin trước điều trị N hưng m ặc dù nồng độ insulin giảm , nồng độ glucose trong huyết tương vẫn giữ ở m ức giảm N guyên nhân của sự việc này còn chưa rõ, nhưng có thể là do sự giảm glucose trong huyết tưcmg đã làm cho insulin trong tuần hoàn có tác dụng m ạnh hơn trên các m ô đích, đồng thời cũng do nguyên nhân là chính sự tăng glucose huyết m ạn tính đã làm tổn hại đến sự tiết insulin [48]

T ai hiến và tác dụn g không m ong m uốn

Hạ glucose huyết; dị ứng ngoài da, đỏ da, ngứa, nổi m ày đay, da m ẫn cảm với ánh sáng, vàng da; rối loạn tiêu hoá, buồn nôn, nôn; giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu

- Bệnh nhân trong giai đoạn phẫu thuật, nhiễm khuẩn cấp

- Bệnh nhân trong thời kỳ m ang thai và cho con bú

- Suy gan, suy thận nặng

N hững trường hợp trên phải dùng insulin

1.4.3 C ác bigu an id

C ác thuốc chính

Các thuốc thuộc nhóm biguanid bao gồm m etform in, phenform in và buform in Hiện nay m etform in là thuốc được sử dụng phổ biến nhất, vì ít gây tăng acid lactic huyết hơn [71]

C ơ c h ế tác dụng

Các biguanid là thuốc chống tăng glucose huyết, không gây hạ glucose huyết Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tụy, không có tác dụng kích thích tế bào beta của tuyến tụy bài tiết in su lin [48]

Cơ ch ế tác dụng của các biguanid là cải th iện liên kết của insulin với thụ thể, và có lẽ có cả tác dụng sau thụ thể Cụ thể là [48], [71]:

- Tăng cường sự sử dụng glucose trong tế bào, kích thích trực tiếp sự phân huỷ glucose trong các m ô và tăng chuyển vận glucose từ m áu vào mô

- Làm giảm sự tân tạo glucose ở gan

- Làm chậm sự hấp thu glucose qua ruột

- Làm giảm nồng độ của glucagon trong h u y ết tưcfng

1.4.4 D ẫn ch ất th iazolidin dion

C ác thuốc

Các thuốc thuộc dẫn chất thiazolidindion còn gọi là thiazolindion hoặc glitazon T roglitazon đã được dùng trên lâm sàng nhưng gây nhiều tai biến, nên hiện ít dùng Thuốc được dùng hiện nay là rosiglitazon, pioglitazon Các chất đang nghiên cứu là ciglitazon, englitazon

C ơ c h ế íá c dụng

Các thiazolindion làm giảm cả glucose h uyết lúc đói, cả glucose huyết sau khi ăn ở bệnh nhân bị Đ TĐ typ 2 do làm tăng sự nhạy cảm của các tế bào đích đối với insulin [63], [74] Do đó sự thu nạp và sử dụng glucose ở các mô ngoại vi (cơ xương, mô mỡ) được tăng cường, sự tân tạo glucose và sự sản

sinh ra glucose ở gan bị ức chế Các thiazolindion làm giảm sự kháng insulin, nên làm giảm nồng độ cả glucose huyết, cả insulin huyết và hem oglobin A|C

K hác với sulfonylurea, các thiazolindion không làm tăng sự tiết insulin

từ tế bào beta của tụy, thuốc k hông có hiệu quả nếu không có insulin Các thiazolindion không gây tụt glucose huyết thậm chí khi dùng liều cao V ì vậy, chúng được gọi là thuốc chống tăng glucose huyết, đúng hơn là thuốc hạ glucose huyết

1.4.5 C ác ch ấ t ức c h ế a lp h a -g lu c o sid a se

Có khá nh iều chất có tác dụng ức ch ế alpha-glucosidase H iện đã có

m ột số thuốc được lưu hành trên thị trường như acarbose (glucobay), m iglitol, voglibose

Các chất ức c h ế alpha-glucosidase làm giảm sự hấp thu qua ruột của tinh bột, dextrin và các disaccharid, do ức ch ế tác dụng của alpha-glucosidase

ở rìa bàn chải của ruột Sự ức c h ế này làm chậm sự hấp thu carbohydrat Do

đó, sự tăng glucose huyết sau khi ăn giảm ở cả người đái tháo đường và người bình thường T huốc làm giảm nồng độ glucose huyết ở cả người đái tháo đường typ 1 và typ 2 Tuy nhiên chỉ cải thiện được ít nồng độ hem oglobin A ,c [48], [56]

1.4.6 C ác ch ấ t ức c h ế aldose redu ctase

H iện nay đã tìm ra được khá nhiều chất có tác dụng ức c h ế aldose reductase như tolrestat, epalrestat, ponalrestat, zenarestat, zopolrestat, và đã

có thuốc được lưu hành trên thị trường như tolrestat

Các chất ức c h ế aldose reductase không ảnh hưởng trực tiếp trên glucose huyết m à chỉ có tác dụng chống lại m ột số tai biến do ĐTĐ, đặc biệt

là tai biến trên hệ thần kinh, gây rối loạn collagen, đục thuỷ tinh thể và bệnh võng m ạc [48]

1.5 C ác cây th u ốc có tác dụ ng hạ G H

T rong kho tàng y học dân gian thuộc các nền văn hoá khác nhau có nhiều cây thuốc, vị thuốc và bài thuốc được dùng để điều trị bệnh đái tháo đường m à Đ ông y gọi là bệnh tiêu khát [52], N hiều bằng chứng cho thấy rằng

th ế giới cây cỏ là m ảnh đất có thể tìm kiếm m ột cách hiệu quả để thu được các

thuốc uống có tác dụng làm hạ GH ở Ấn Độ, T rung Q uốc, N hật Bản, Hàn

Q uốc, P akistan và m ột số nước khác có rất nhiều cây thuốc có tác dụng hạ

GH [52], [6 8],

Q ua nghiên cứu, các tác giả đã tập hợp được khá nhiều cây thuốc có tác dụng hạ GH

N ăm 1989, H anda và cs đã lập danh sách hơn 100 cây cỏ có tác dụng

hạ GH, đồng thời nêu tên chất nhầy có tác dụng hạ GH trong các cây đó (Phụ lục 1) và thống kê được 47 cây có tác dụng hạ GH qua sàng lọc thực nghiêm (Phụ lục 2) [52],

C ũng trong năm đó, R ahm an và Z am an đã thu thập được 343 cây cỏ có tác dụng h ạ G H [6 8] Còn theo tài liệu của K ar A iit và cs (2003) thấy có vài trăm cây cỏ được dùng để chữa ĐTĐ, trong đó có 30 cây thường dùng nhất để chữa Đ TĐ ở Ấ i Đ ộ (Phụ lục 3) và nghiên cứu tác dụng hạ GH của cao chiết từ

30 cây trên m ô hìn h Đ TĐ do alloxan ở chuột cống trắng (Phụ lục 4) [58],

ở V iệt N am , cũng có nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa

Đ TĐ [20], [32] T rong thời gian vừa qua các cây bạch truật, cỏ mực, cỏ ngọt, hoàng kỳ, huyền sâm , m ướp đắng, sinh địa, thổ phục linh đã được m ột số tác giả V iệt N am nghiên cứu tác dụng hạ GH hoặc thử lâm sàng tác dụng chữa ĐTĐ

Đ oàn Thị N hu, Lê M inh Phương (1993) đã nghiên cứu tác dụng hạ GH

của bột quả của cây m ướp đắng {M om ordica charantỉa L.) và cao cồn rễ chiết

từ cây bạch truật {A tractyìodes m acrocephala Koidz) thấy rằng bột quả mướp

đắng và cao lỏng bạch truật có tác dụng hạ GH ở thỏ gây ĐTĐ bằng alloxan

[22].

Trần Thuý, Trương V iệt Bình, Bùi Thị H ồng Thuý (1996) nghiên cứu

tác dụng hạ GH của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana H em slay), và kết luận là

cỏ ngọt dạng chè thuốc có tác dụng hạ GH trên bệnh nhân Đ TĐ typ 2 [28]

T rần Thị H ồng N ga và cs (2001) nghiên cứu tác dụng của chè tan

G am osa, thấy chè tan G am osa có tác dụng hạ G H trên thỏ và trên người tình nguyện [2 1]

Phạm V ăn T hanh (2001) nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học, chiết xuất bán thành phẩm , nghiên cứu dược lý, độc tính, bào c h ế dạng thuốc

m orantin để điều trị bệnh Đ TĐ từ quả của cây m ướp đắng [25]

N guyễn Thị Thu H ương, N guyễn Thị D iễm H ồng (2002) đã nghiên cứu

tác dụng hạ GH của cây cỏ m ực ( E clipta alba H assk.), kết quả cho thấy cao

cồn chiết từ cây cỏ m ực có tác dụng hạ glucose h uyết trên thỏ bình thường [16]

Phùng T hanh Hương, H ồ M ai A nh, N guyễn X uân T hắng (2002) nghiên

cứu tác dụng hạ GH của thân cây m ướp đắng (M om ordica charantia L.), thấy

dịch chiết cồn từ thân cây m ướp đắng có tác dụng hạ GH trên chuột cống trắng bị ĐTĐ do streptozocin [17]

Phạm Hữu Đ iển và cs (2002) đã nghiên cứu tác dụng hạ GH của thân

rễ sinh địa (R ehm ania glutinosa L ibosch) và thân rễ cây tri m ẫu {A nem arrhena a sphodeloides Bunge), thấy dịch chiết ethanol từ thân rễ sinh

địa và thân rễ tri m ẫu có tác dụng hạ GH trên chuột chắt trắng [10]

M ai Tất Tố, Dương Thị Ly Hương, Lưu M ạnh H ùng (2002) đã nghiên cứu tác dụng hạ GH của m ột bài thuốc đông dược (gồm 4 vị: quả mướp đắng, thổ phụ linh, vị thuốc X, cam thảo nam ) K ết quả cho thấy, dịch chiết nước sắc của bài thuốc này có tác dụng hạ GH trên m ô hình chuột cống trắng bình

thường và trên chuột nhắt trắng được gây tăng GH thực nghiệm bằng adrenalin [29].

N guyễn N gọc X uân (2004) đã nghiên cứu tác dụng dược lý, độc tính và bước đầu nghiên cứu cơ c h ế tác dụng hạ GH của cao khô thổ phục linh [24],[33]

1.6 C ây cỏ n gọt và steviosid

1.6.1 C ây cỏ n gọt

1.6.1.1 M ô tả thực vật

Cây cỏ ngọt Stevia rehaudỉana (Bert.) H em sley họ Cúc A steraceae là

loại cây thảo nhỏ, sống nhiều năm , cao 0 ,5 -0,6 m, có khi đến 1 m Thân cứng

m ọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông m ịn, ít phân nhánh Lá m ọc đối, hình

m ác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5- 7 cm , rộng 1-1,5

cm , có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai m ặt có lông trắng m ịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá rất ngắn H oa lưỡng tính,

tụ họp thành đầu m àu trắng ở ngọn thân Q uả bế, không có m ào lông, hạt không có nội nhũ M ùa hoa: tháng 5-9 [ 32]

1.6.1.2 P hân b ố và sinh thái

Cỏ ngọt đang trồng ở V iệt nam hiện nay, được nhập nội từ m ột nước

N am M ỹ (nguồn gốc Paraguay) năm 1988 c ỏ n gọt là cây ưa ẩm và ưa sáng,

có thể chịu bóng và ưa bóng vào thời kỳ cây con V ốn là cây ở vùng nhiệt đới,

cỏ ngọt trồng ở V iệt nam sinh trưởng, phát triển tốt vào vụ xuân - hè Cây ra hoa quả nhiều hàng năm Tuy nhiên người ta vẫn áp dụng cách nhân giống bằng cách giâm cành [32]

năm Thu hoạch trước lúc ra nụ hoa có chất lượng tốt nhất Cần thu hoạch vào buổi sáng sớm những ngày nắng ráo Thu xong rửa sạch, phơi khô ngay đến

độ ẩm dưới 10% và bảo quản nơi khô ráo N ăng suất trung bình đạt khoảng 4 tấn lá khô / 3 lứa cắt/ h a [32]

1.6.1.4 T hành p h ầ n hoá học

Lá cỏ ngọt chứa;

Các ent-kauren diterpen glycosid: steviosid (2,2- 18,5% ), rebaudiosid

A, B, c , D, E, dulcosid, steviobiosid [25], [32] Các thành phần này có vị ngọt

ở các mức độ khác nhau N guyễn K im c ẩ n và cộng sự (2001) đã chiết được steviosid trong lá cỏ ng ọ t trồng ở V iệt N am với hàm lượng từ 1,36- 4,89% tuỳ theo khu vực lấy m ẫu [1], [2]

Các labdan diterpen gồm jh an o l, austroinulin, 6-0-acetylaustroinulin.Các triterpen gồm P-am yrin acetat, lupeol

Các thành phần khác gồm (3- sitosterol, stigm asterol, tanin và tinh dầu (0,12-0,4% ) Các thành phần chính (43% ) trong tinh dầu là caryophylen oxyd

và spathulenol [20], [32]

1.6.1.5 C ông dụng

Cỏ ngọt và steviosid thường được dùng để chữa đái tháo đường, chữa

béo phì, chữa cao huyết áp và dùng để thay th ế đường sacharose trong công nghiệp thực phẩm , nước giải khát, ở V iệt nam hiện nay dùng steviosid hoặc

cỏ ngọt làm chất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc; có loại trà cũng được dùng cho người đái tháo đường hoặc để giảm béo như trà actiso-stevia; trà sâm qui- stevia: có sâm V iệt nam , tam thất, đương qui, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và cỏ ngọt; trà nhân trần, thảo quyết m inh, cỏ ngọt; trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ ngọt [32]

1.6.2 S tevio sỉd

Steviosid (13-[(2-0-|3-D -glucopyranosyl-a-D -glucopyranosyl) oxy]

k au r -16-en-18-oic acid Ị3-D- glucopyranosyl ester) là hoạt chất chính chiết từ

lá cây cỏ ngọt [32], [5 7 ], [72]

Đó là những tinh thể dễ chảy nước, có điểm chảy 198®c,

-3 9 ,3 ° ( c = 5,7 trong nước), có độ ngọt gấp 150- 300 lần đường m ía 1 g steviosid tan trong 800 ml nước Tan trong dioxan, hơi tan trong alcol [32], [72] H àm lượng steviosid trong

cỏ ngọt là 3-20% tuỳ theo giống

và các điều kiện trồng trọt, thu hoạch [32]

1.6.3 M ộ t s ố công trinh đ ã ngh iên cứu v ề stevỉo sỉd và cây cỏ n gọt

N gay từ năm 1986, Curi và cs đã nghiên cứu tác dụng của lá cỏ ngọt trên sự dung nạp glucose ở người lớn bình thường cho thấy nếu dùng lá cỏ ngọt, sau đó dùng liều cao glucose, GH tăng ít hơn và nhanh trở về bình thường hơn so với người không dùng cỏ ngọt [40]

Aze và cs (1991) đã phân lập steviosid từ lá cỏ ngọt và nghiên cứu độc tính bán trường diễn dùng đường uống cho chuột cống trắng [36

H anson và De O liveira (1993) đã phân lập được steviosid và m ột số glycosid diterpenoid có vị ngọt từ lá cây cỏ ngọt [54]

Jo ef Schlatter (1999) Ở Tổ chức y tế th ế giới đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu về sinh hoá steviosid như hấp thu, phân b ố và thải trừ, tác dụng trên các enzym và m ột số thông số sinh hoá khác, các kết quả về độc tính cấp, độc tính bán cấp, khả năng gây ung thư, độc tính gen, độc tính trên sự sinh sản

R askovic và cs (2004) đã nghiên cứu tác dụng của m ột chiết phẩm giàu steviosid từ lá cỏ ngọt trên GH ở chuột nhắt trắng bị ĐTĐ do alloxan, thấy dùng chiết phẩm trước alloxan có tác dụng ức c h ế sự tăng GH do alloxan [69]

L ailerd và cs (2004) đã nghiên cứu tác dụng của steviosid trên hoạt tính vận chuyển glucose vào trong cơ xương của chuột cống trắng nhạy cảm với insulin và kháng insulin, thấy steviosid làm tăng rõ rệt hàm lượng glucose trong cơ xương của chuột kháng insulin so với lô không dùng steviosid [61]

Cũng năm 2004, G regersen và cs đã thử lâm sàng tác dụng của steviosid trên bệnh nhân bị Đ TĐ typ 2, kết quả cho thấy steviosid làm giảm

GH ở các bệnh nhân này [50]

Gần đây n h ấ t , C hen và cs (2005) đã nghiên cứu cơ c h ế tác dụng hạ GH của steviosid chiết từ lá cỏ ngọt [39]

ở V iệt N am , cỏ ngọt đã được xác định sơ bộ về thành phần hoá học ở

V iện Dược liệu [1], [2] và thử lâm sàng dạng chè thuốc từ lá cây cỏ ngọt ở

V iện y học cổ truyền H à nội [28],

1.7 C ác phương pháp ngh iên cứu tác dụ ng hạ glu cose huyết

1.7.1 P hư ơng p h á p ngh iên cứu tác dụ n g của th u ốc trên g lu co se h u yết ở

đ ộ n g vật có glu cose h u yết bình thường.

ở người cũng như ở động vật, glucose huyết có thể thay đổi khá nhiều tuỳ theo thời điểm trong ngày, lại cũng tăng lên khá nhiều khi ăn và còn thay đổi theo chất lượng thức ăn N hưng khi đói thì glucose h uyết khá ổn định , từ

15, 18 hoặc 24 giờ kể từ khi không cho ăn và kéo dài đến 45- 50 giờ V ì vậy dùng thuốc khi đói m à thấy glucose giảm thì đó là do tác dụng của thuốc [60],

[66].

1.7.2 P hương p h á p ngh iên cứu tác dụ n g hạ g lu co se h u yết ở đ ộn g vật bị

tă n g g lu co se h u yết do d ù n g g lu co se (th ử du n g n ạp glu cose).

Khi dùng glucose thì glucose huyết sẽ tăng nhanh N hưng do cơ thể có

cơ c h ế điều chỉnh nên glucose huyết lại giảm nhanh V ì vậy không thể để glucose huyết tăng rồi m ới thử thuốc, m à phải dùng thuốc từ trước xem thuốc

có ức ch ế sự tăng glucose huyết so với lô chứng không [40], [51]

T rong phác đồ dùng thuốc m ột lần, để con vật nhịn đói trong 18 giờ để đạt m ức độ glucose huyết ổn định D ùng thuốc, rồi sau m ột thời gian thì dùng glucose với liều 2 g / kg, so sánh sự tăng glucose huyết ở lô dùng thuốc so với

lô chứng không dùng thuốc

Cũng có thể dùng nhiều lần, m ỗi ngày 1 lần trong 3-7 ngày tuỳ người nghiên cứu Đ ến ngày th í nghiệm cũng để con vật nhịn đói và dùng thuốc như trên

1 7 3 N gh iên cứu tác d ụ n g hạ glu cose h u yết ở đ ộn g vật bị tăn g glu cose

h u yết do alloxan.

A lloxan đã được dùng sáu thập kỷ nay để gây đái tháo đường thực nghiệm ở động vật và n hờ đó đã nghiên cứu ra nhiều thuốc chữa đái tháo đường [47] Tác dụng gây đái tháo đường của alloxan là do tác dụng độc chọn lọc của alloxan trên tế bào beta của tụy, là cơ quan làm nhiệm vụ sản xuất ra

insulin Thường sau m ột tuần, con vật sẽ xuất hiện triệu chứng đái tháo đường với glucose huyết lúc đói tăng cao [47], [58], [69].

1 J 4 N gh iên cứu tác dụ n g hạ g lu co se hu yết ở đ ộn g vật bị tăn g glu cose

h u yết do streptozocin

Streptozocin, còn gọi là streptozotocin, thường viết tắt là STZ là m ột kháng sinh phổ rộng có tác dụng chống u, sinh ung thư và gây đái tháo đường Tác dụng gây đái tháo đường của STZ là do chất này phá huỷ tế bào beta của tuyến tụy M ức độ phá huỷ này phụ thuộc liều dùng V ới liều thấp, chỉ gây tăng ít glucose huyết, có khi k h ô n g tăng vì số tế bào beta bị phá huỷ còn ít, nên các tế bào còn lại tăng tiết insulin để bù trừ, nhưng khi dùng nghiệm pháp dung nạp glucose thì glucose h uyết tăng vọt, lớn hơn so với không dùng STZ Với liều trung bình sẽ gây tăng glucose huyết rõ N ếu dùng liều cao STZ, glucose h uyết tăng rất cao, kèm nhiễm ceton nặng, có thể dẫn đến chết sau vài

ba ngày [45]

1.7.5 G áy tă n g glu cose h u yết b ằ n g fru c to se ở ch u ột cốn g trắn g

M ột c h ế độ ăn dùng fructose thay th ế cho glucid và chất đường thông thường, sẽ làm tăng glucose h uyết và tăng cả nồng độ insulin trong m áu M ô hình này thích hợp khi m uốn nghiên cứu tác dụng của thuốc trên sự kháng insulin, vì đây là trường hợp glucose h uyết tăng trong khi insulin huyết cũng tăng [6 6]

1.7.6 P hư ơng p h á p cắ t bỏ tụy

Tụy là cơ quan chính sản xuất ra insulin từ các tế bào beta đảo

L angerhans V ì vậy cắt bỏ m ột phần tụy thì số tế bào beta trong cơ thể ít đi, sự sản xuất insulin giảm sẽ gây ra tăng glucose huyết N ếu cắt bỏ toàn bộ tụy thì

cơ thể không sản xuất ra insulin được và con vật sẽ chết; còn nếu cắt bỏ ít, thì các tế bào beta còn lại sẽ tăng sản suất ra insulin để bù trừ, do đó glucose huyết vẫn không tăng [6 6]

1.7.7 D ù n g c h u ộ t b ị tă n g glu cose h u yết do d i truyền

Hiện nay người ta đã tạo ra được giống chuột nhắt trắng, chuột cống trắng và chuột h am ster di truyền có glucose h uyết cao K hi có các giống chuột này thì không cần phải gây tăng glucose h uyết nữa, m à nghiên cứu dùng thuốc ngay [33], [60]

1.7.8 M ộ t s ố p h ư ơ n g p h á p khác

N ghiên cứu sự hấp thu glucose qua ru ộ t [51], [6 6]

N ghiên cứu tác dụng trên sự chuyển hoá glucose [60]

N ghiên cứu sự giải phóng insulin từ đảo tụy cô lập

N ghiên cứu tác dụng ức ch ế enzym aldose reductase

N ghiên cứu tác dụng ức ch ế enzym alpha-glucosidase ở ruột

Gây tăng glucose huyết bằng các chất khác: adrenalin, corticotropin, ACTH, som atotropin, diazoxid, glucagon

C H Ư Ơ N G 2: Đ ố l T Ư Ợ N G , PH Ư Ơ N G T IỆ N , PH Ư Ơ N G P H Á P

NGHIÊN c ír ư 2.1 Đ ối tượng nghiên cứu

* C hiết phẩm steviosid: C hiết từ lá và ngọn cành cây cỏ ngọt, thu hái lúc cây sắp ra nụ ở T rung tâm trồng và c h ế biến cây thuốc H à N ội vụ năm

2004 N guyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi và sấy khô cho đến độ

ẩm dưới 1 0%, đóng vào túi nilông, hàn kín trước khi chiết lấy steviosid

2.2 Phương tiện ngh iên cứu

- Đ ộng vật thí nghiệm :

• C huột nhắt trắng Swiss, 20- 22 g, khoẻ m ạnh, cả đực và cái, đạt yêu cầu th í nghiệm do V iện vệ sinh D ịch tễ Trung ư ơ ng cung cấp

• Thỏ khoẻ m ạnh, cả 2 giống, cân nặng 1,8-2,2 kg, đạt yêu cầu thí nghiệm do T rung tâm nuôi thỏ Ba vì cung cấp

• Thức ăn tổ n g hợp nuôi động vật thí ng h iệm do V iện vệ sinh D ịch

tễ T rung ư ơ n g cung cấp

- Các loại dung m ôi, hoá chất chiết xuất đạt yêu cầu về chất lượng và độ tinh khiết do các H ãng trong và ngoài nước cung cấp

- Các dung m ôi hoá chất tinh khiết dùng cho H PLC của M ERK :

A cetonitril, m ethanol, chuẩn steviosid của Pháp

- Các dụng cụ, m áy m óc để chiết xuất và thu hồi dung m ôi như m áy cấtquay Buchi, tủ sấy thường, tủ sấy chân không

- Các dụng cụ , m áy m óc để phân tích hoá học: M áy sắc ký lỏng hiệunăng cao Shim adzu LC lOATvp, detector diod array SPD-M lO Avp, cột pha ngược L iC hrospher RP18 (150m m X 4,6m m ID, 5|Am), m àng lọc Supelco (13m m X 0,45 um )

- D ụng cụ m áy m óc để nghiên cứu tác dụng sinh học: quang k ế tự động Scout, ly tâm lạnh Sigm a, m áy K IK A -W ER K E-M S1 M inishaker.

- Các thuốc và hoá chất dùng trong nghiên cứu sinh học:

• A lloxan (5,6-dioxyuracil) m onohydrat; do hãng Sigm a- A ldrich sản xuất, được dùng để gây ĐTĐ

• Insulin tác dụng nhanh; do hãng N ovo N ordisk sản xuất, lọ 10

m l, 1 m l chứa 40 đvqt insulin

• M inidiab ( G lipizide): là sulfonylurea tác dụng m ạnh nhưng thời gian tác dụng ngắn, do hãng U pjohn sản xuất, viên 5 mg

• A po-chlorpropam id: là sulfonylurea tác dụng kéo dài, do hãng

A potex sản xuất, viên 250 mg

2.3 Phuơng pháp nghiên cứu

2.3.1 C h iết su ấ t stevio sid từ lá cỏ n g ọ t

2 3 1 1 C hiết su ấ t stevio sỉd

Q ua nghiên cứu thử nghiệm chiết steviosid bằng 3 qui trình: chiết bằng nước, chiết bằng m ethanol và chiết bằng ethanol, thấy hàm lượng steviosid chiết được trong chiết phẩm là tương đương nhau Tuy qui trình chiết

m ethanol cho tỷ lệ hàm lượng ch iết phẩm steviosid cao hơn 2 qui trình còn lại, nhưng vì dung m ôi này độc, giá thành cao Q ui trình chiết nước cho tỷ lệ chiết phẩm steviosid thấp nhất Do đó, chúng tôi đã chọn qui trình chiết ethanol là dung m ôi không độc, đỡ tốn kém lại cho hàm lượng chiết phẩm steviosid cao

Qui trình chiết suất chiết phẩm steviosid được trình bày trong sơ đồ 1

H ÌN H 2.1 S ơ ĐỔ Q U I T R ÌN H C H IÊ T ST E V IO S ID T Ừ LÁ c ỏ N G Ọ T

2 3 1 2 P hân tích chiết ph ẩ m steviosid chiết được bằng phương p h á p H P LC

- Phân tích định tính và định lượng steviosid trong chiết phẩm steviosid thô bằng phương pháp HPLC

- K hẳng định steviosid: So sánh thời gian lưu và phổ U V -V IS của pic trong m ẫu thử với steviosid chuẩn của Pháp

- H àm lượng steviosid trong chiết phẩm được tính dựa vào đường chuẩn steviosid

* C huẩn bi m ẫ u : cân 10 m g c h ế phẩm steviosid H oà trong m ethanol (M erck) với nồng độ 2m g/m l L ọc qua m àng lọc Supelco (13m m xO.45 Ịim) trước khi phân tích

* Pha dung dich c h u ẩ n : Chuẩn steviosid (Pháp) được pha trong m ethanol (M erck) với nồng độ 2m g/m l

* Đ iểu kiên chay HPLC:

Pha động: A cetonitril - Nước ( 30- 70)

Chương trình dung môi:

Tốc độ dòng: Im l/ phút Bước sóng phát hiện: 210 nm Thể tích tiêm m ẫu: lƠỊil

2.3.2 N gh iên cứu diễn biến G H tron g n gày ở đ ộ n g vật ăn uốn g binh thường

Thí nghiệm được tiến hành ở thỏ và chuột nhắt trắng Chọn động vật trưởng thành, khoẻ m ạnh, không phân biệt đực cái

V ào buổi sáng khi chưa cho ăn ( 0 giờ), sau khi ăn được 1 giờ và 5 giờ , lấy m áu xác định glucose h u y ế t

2.3.3 N gh iên cứu diễn biến G H k h i đ ó i ở đ ộn g vật [6 0 ]

T hí nghiệm được tiến hành ở thỏ và chuột nhắt trắng Chọn động vật trưởng thành, khoẻ m ạnh, không phân biệt đực cái

Cho động vật th í nghiệm nhịn đói từ chiều hôm trước, đến sáng hôm sau lấy m áu định lượng glucose h uyết (từ lúc không cho ăn đến lúc lấy m áu lần thứ nhất khoảng 16 giờ) Tiếp tục để động vật nhịn đói, sau đó, 4 giờ, 8 giờ

và 16 giờ, lấy m áu để định lượng glucose huyết

2.3.4 X ác định liều alloxan làm tăn g G H ở ch u ộ t n h ắ t trắn g

Đ ã có nhiều tác giả nghiên cứu thuốc chống Đ TĐ trên m ô hình gây tăng GH bằng alloxan [25], [47], [58], [69]

Tuy nhiên, tuỳ theo chất lượng của alloxan và đường dùng (i.v hoặci.p), m à liều alloxan gây tăng glucose huyết có thể thay đổi M ặt khác, tuỳ thuộc vào đối tượng n g h iên cứu: chuột nhắt trắng, chuột cống trắng, thỏ m à liều alloxan cũng khác nhau

Để nghiên cứu tác dụng h ạ glucose huyết của steviosid hoặc m ột thuốc nào đó, phải xác định liều alloxan gây tăng glucose huyết và thời gian thử thuốc là vào ngày nào sau khi tiêm alloxan

Xác định glucose huyết lúc đói vào các ngày 2, 4, 8, sau khi tiêm alloxan để xem vào ngày nào glucose huyết tăng nhiều nhất và kéo dài được bao lâu Thử thuốc n g h iên cứu vào ngày glucose huyết bắt đầu đạt mức cao nhất là thích hợp nhất

2.3.5 N gh iên cứu tác d ụ n g của stevỉo sid trên G H ở ch u ộ t n h ắt trắn g bỉnh thường kh ỉ đói, có so sán h với g lip izid và chlorpropam id.

Nhiều tác giả đã nghiên cứu tác dụng của thuốc trên GH của chuột nhắt trắng bình thường khi đói [52], [ 60 ], [6 8]

C họn chuột nhắt trắng trưởng thành, khoẻ m ạnh, không phân biệt đực cái, chia ngẫu nhiên thành các lô, m ỗi lô 12 con.

• lô chứng sinh lý: cho uống nước cất

• lô uống steviosid: uống liều 100 m g và 2 0 0 m g / kg

• lô uống glipizid: uống liều 2 m g/ kg

• lô uống chlorpropam id: uống liều 50 m g/ kg

Để chuột nhịn đói 16 giờ, xác định glucose huyết vào các thời điểm 0 giờ (trước khi dùng thuốc) và 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ sau khi dùng thuốc

2.3.Ố N gh iên cứu tác d ụ n g của stevio sid trên ch u ộ t n h ắ t trắn g bị tăn g G H

do alloxan , có so sánh với in su lin và g lip izid

T hí nghiệm được tiến hành trên m ô hình gây tăng GH ở chuột nhắt trắng bằng alloxan [47], [58], [69],

C họn chuột nhắt trắng trưởng thành, khoẻ m ạnh, không phân biệt đực cái, chia ngẫu nhiên thành các lô, m ỗi lô 8 con

• lô chứng gây bệnh ; tiêm i.v alloxan và uống nước cất

• lô gây bệnh + uống steviosid 200 m g và 400 m g / kg

• lô gây bệnh + uống glipizid 2 m g và 4 m g/ kg

• lô gây bệnh + tiêm i.v insulin Iđ v q t/ kg

Tiêm alloxan 60 m g/ kg cho m ỗi chuột Đ ến ngày thứ 8 tính từ sau khi tiêm alloxan, cho chuột nhịn đói trước 16 giờ, xác định GH trước khi dùng thuốc (0 giờ), sau khi dùng thuốc 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ R iêng đối với insulin, định lượng thêm GH ở thời điểm sau khi tiêm 1 giờ

2.3.7 P hư ơng p h á p định lượng G H tron g h u yết thanh

Đ ịnh lượng glucose trong huyết thanh bằng phương pháp GOD, thực hiện trên m áy sinh hoá bán tự động SCOUT

N guyên tắc của phương pháp là dùng enzym glucose oxidase để oxy

h óa glucose thành acid gluconic và hydro peroxyd H ydro peroxyd được tạo

thành sẽ phản ứng với phenol và 4-am inophenazon nhờ sự xúc tác của peroxidase tạo thành phức hợp quinoneim in có m àu đỏ tím.

glucose + O2 + H2O -555 -► acid gluconic + H2O2

H2O2 + 4- am inophenazon + phenol — ► quinoneim in + 4 H jOSau khi đã lấy m áu, ly tâm lạnh ở 3000 vòng/ phút trong 5 phút để tách huyết thanh Đ ịnh lượng glucose bằng kit theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sử dụng m áy định lượng sinh hoá bán tự động SCOƯT

2.3.8 P hư ơng p h á p x ử lý các k ế t q u ả ngh iên cứu

Các kết quả nghiên cứu được biểu thị bằng số trung bình cộng trừ sai số chuẩn ( M ± SE) Đ ánh giá so sánh giữa các lô được xử lý bằng nghiệm pháp t của Student dùng M icrosoft E xcel [8]

CHƯƠNG 3: K Ê T QUẢ N G H IÊ N c ứ u

3.1 K ết quả chiết su ất steviosid từ lá cỏ ngọt

3.1.1 K ế t q u ả c h iết su ấ t stevỉosid:

Bột lá cỏ ng ọ t 10 g (độ ẩm 8%), chiết hồi lưu 4 lần bằng ethanol 80% , qui trình chiết suất theo sơ đồ 1 Tập trung dịch chiết và thu hồi cồn, rồi cô tới cắn H oà cắn bằng nước nóng, lọc, chiết với n- butanol bão hoà nước, kết tinh bằng m ethanol, thu tủa, sấy khô tới khối lượng k hông đổi Cân tủa

Bột chiết phẩm steviosid thu được có m àu trắng ngà, vị ngọt

Để tính hàm lượng chiết phẩm steviosid chiết được, tiến hành chiết 5 lần Kết quả các lần chiết suất thu được ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả chiết suất steviosid

STT Lượng chiết phẩm steviosid thu được (g) Hiệu suất(%)

H àm lượng chiết phẩm steviosid qua các lần chiết trung bình là 3,50 ± 0,08%

3.1.2 K ế t q u ả p h â n tích ch iết p h ẩ m stevỉo sỉd b ằn g ph ư ơn g p h á p H P L C

Sắc ký đồ H PLC của chiết phẩm steviosid được thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.2: Phổ UV- VIS của steviosid chuẩn và pic có thời gian lưu

34.78 phút của chiết phẩm steviosid

T rên sắc ký đồ, pic chính (thời gian luu: 34.78 phút) có thời gian luxi và phổ U V -V IS giống với steviosid chuẩn (H ình 3.2) N hư vậy chiết phẩm steviosid chiết được có thành phần chính là steviosid.

Tiến hành định lượng hàm lượng steviosid trong chiết phẩm steviosid bằng phương pháp HPLC, dựa vào đường chuẩn steviosid, kết quả cho thấy hàm lượng steviosid trong chiết phẩm là 85,5 ± 1,2%

3.2 K ết quả diễn biễn G H tron g ngày ở độn g vật ăn uốn g bình thường

T hí nghiệm tiến hành trên thỏ (n =8) và chuột nhắt trắng (n = 14) Cho động vật nhịn đói 16 giờ trước khi thí nghiệm Đ ịnh lượng GH vào các thời điểm 0 giờ (trước khi cho ăn), 1 giờ sau khi cho ăn, 5 giờ sau khi cho ăn

K ết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.3

Bảng 3.2 Diễn biễn GH trong ngày ỏ động vật ăn uổng bình thường

động vật

thí ngiệm

Thôngsố

Nồng độ GH ( mmol/l)

O giờ(1) 1 giờ (2) 5 giờ (3)

1

Chuộtnhắttrắng

n = 14

Trị số

%p

5,73 ± 0,48 100

11,53 ±0,62 201,2 P2,1 < 0,001

7,02 ± 0,34 122,5

6,33 ± 0,18 100

8,19 ± 0,29 129,4 P2,1< 0,001

6,52 ±0,16 103,0 P3,1 > 0,05