Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

Sử dụng acid chlorogenic tinh chế được làm chất chuẩn PTN để định tính, định lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Kim ngân hoa……….. Trong phạm vi của đề tài này, mục đích chúng tôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

===***===

LÊ THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ACID CHLOROGENIC TỪ KIM NGÂN HOA

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA

CHẤT LƯỢNG THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất

Mã số : 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Đoàn Cao Sơn

2 TS Trần Hồng Anh

HÀ NỘI - 2010

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Cao Sơn và TS Trần Hồng Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Trần Việt Hùng – Khoa Vật lý

đo lường, ThS Lục Thị Vân – Khoa Kiểm nghiệm các dạng bào chế, ThS Nguyễn Tuấn Anh – Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, đã nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng quản lý sau Đại học, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà nội, các bạn đồng nghiệp của khoa Kiểm nghiệm các dạng bào chế, khoa Kiểm nghiệm Đông dược, khoa Vật lý đo lường

- Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, các cán bộ của Trung tâm Dược điển - Dược thư Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ, san sẻ công việc và góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn này

Ds LÊ THỊ THU HIỀN

LỜI CẢM ƠN

CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

ĐẶT VẤN ĐỀ………

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN………

1.1 Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn

1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học

1.1.2 Các thông tin về chuẩn acid chlorogenic

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa

1.2.1 Tổng quan về acid chlorogenic

1.2.2 Tổng quan về dược liệu Kim ngân hoa

1.3 Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được nghiên cứu………

1.4 Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột…………

1.4.1 Phương pháp sắc ký cột silica gel………

1.4.2 Sắc ký loại trừ theo kích cỡ và ứng dụng trong tinh chế acid chlorogenic………

1.5 Phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc phân tử………

1.5.1 Định tính và xác định độ tinh khiết bằng điểm chảy – MP

1.5.2 Định tính bằng phổ hồng ngoại - IR ……… 1.5.3.Định tính, định lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, các sản phẩm của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược liệu

1

3

3

3

3

3

3

6

8

9

9

12

15

15

16

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

2.1 Nguyên liệu………

2.2 P hương tiện nghiên cứu………

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ………

2.2.2 Hoá chất, dung môi………

2.3 Nội dung nghiên cứu………

2.4 Phương pháp nghiên cứu………

2.4.1 Kiểm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa dùng để nghiên cứu……

2.4.2 Phương pháp chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa………

2.4.3 Phân lập và tinh chế acid chlorogenic bằng phương pháp sắc ký cột………

2.4.4 Các phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc acid chlorogenic………

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ………

3.1 Kiểm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa………

3.1.1 Định tính dược liệu Kim ngân hoa………

3.1.2 Định tính, định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Kim ngân hoa………

3.2 Chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa……

3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết và phương pháp chiết………

3.2 2 Tiến hành chiết xuất………

3.2.3 Định tính acid chlorogenic trong cao đặc và cắn C1 bằng phương pháp TLC………

24

24

24

24

25

26

26

26

27

27

27

31

31

31

33

35

35

35

36

gel ………

3.3.1 Kỹ thuật phân lập……… 3.3.2 Kết quả phân lập acid chlorogenic bằng sắc ký cột silica gel……

3.4 Tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex ………

3.4.1 Kỹ thuật tinh chế……… 3.4.2 Kết quả tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex G15……… 3.4.3 Kết quả tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex G10………

3.5 Định tính, xác định cấu trúc, định lượng và xác định tạp chất liên quan của acid chlorogenic tinh chế được………

3.5.1 Đặc điểm hình thái………

3.5.3 Định tính acid chlorogenic bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng………

3.5.4 Định tính acid chlorogenic bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại………

HPLC ………

3.5.7 Định lượng acid chlorogenic tinh chế được bằng phương pháp HPLC……… 3.5.8 Xác định tạp chất liên quan của acid chlorogenic tinh chế được

3.6 Thẩm định phương pháp HPLC đã sử dụng để định lượng acid chlorogenic tinh chế được………

3.6.3 Độ lặp lại………

3.6.4 Độ đúng………

3.6.5 Xác định LOD………

3.6.6 Xác định LOQ………

3.7 Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm

3.8 Sử dụng acid chlorogenic tinh chế được làm chất chuẩn PTN để định tính, định lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Kim ngân hoa………

3.8.1 Định tính acid chlorogenic trong dược liệu Kim ngân hoa ……

3.8.2 Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Kim ngân hoa……

3.8.3 Xác định độ ẩm dược liệu………

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ………

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… PHỤ LỤC

71

71

73

74

74

77

77

80

82

83

86

88

Cacbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two – Dimensional NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Phổ khối lượng phun điện tử

Electron Spray Ionization Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC Heteronuclear Singular Quantum Coherence

IR Infrared

Phổ hồng ngoại TLC Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng HPLC High performance liquid chromatography

Sác ký lỏng hiệu năng cao HSPL Hệ số pha loãng

MS Mass spectrum

PA Pure analysis

ISO International organization for standardization

IEC International electrotechnical commision

C Chuẩn

C + T Chuẩn + Thử

SD Standard deviation

TB Trung bình

UV Ultraviolet

VIS Visible

Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic trong một số loại cây

Bảng 1.2 Hàm lượng acid chlorogenic phân bố trong một số bộ phận

của cây Kim ngân

Bảng 1.3 Khả năng tách lọc của một số loại gel Sephadex

Bảng 3.4 Kết quả định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Kim

ngân hoa đem nghiên cứu

Bảng 3.5 Kết quả chiết xuất các mẻ dược liệu

Bảng 3.6 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cao đặc và cắn C1

Bảng 3.7 Hàm lượng acid chlorogenic trong cắn C1 thu được sau giai

đoạn chiết xuất

Bảng 3.8 Khối lượng cắn Si thu được sau giai đoạn phân lập cắn C1

qua cột silica gel

Bảng 3.9 Hàm lượng acid chlorogenic trong cắn Si thu được sau giai

đoạn phân lập cắn C1 qua cột silica gel

Bảng 3.10 Khối lượng cắn Se1 thu được sau khi tinh chế cắn Si qua

cột Sephadex G15

Bảng 3.11 Kết quả định lượng acid chlorogenic trong cắn Se1 thu

được sau giai đoạn tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G15

Bảng 3.12 Khối lượng cắn Se2 thu được sau khi tinh chế cắn Se1 qua

Bảng 3.16 Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo

chuẩn 1

Bảng 3.17 Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo

chuẩn 2

Bảng 3.18 Kết quả xác định hàm lượng tạp chất liên quan của acid

chlorogenic tinh chế được

Bảng 3.19 Kết quả xác định khoảng tuyến tính

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ lặp lại

Bảng 3.21 Kết quả xác định độ đúng

Bảng 3.22 Kết quả xác định LOD cho phép định lượng

Bảng 3.23 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của dịch chiết dược

liệu Kim ngân hoa

Bảng 3.24 Kết quả định lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu

Kim ngân hoa

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của acid chlorogenic

Hình 1.2 Cây Kim ngân

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Sephadex

Hình 2.4 Dược liệu Kim ngân hoa (Flos Lonicerae japonicae)

0

Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.6 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic và dịch

chiết dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.7.Sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn, cao đặc và cắn C1

Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất acid chlorogenic từ Kim ngân hoa

Hình 3.9 SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn phân lập

cắn C1 qua cột silica gel

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình phân lập acid chlorogenic

Hình 3.11a, 3.11b SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn

tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G15

Hình 3.12a, 3.12b SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn

tinh chế cắn Se1 qua cột Sephadex G10

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình tinh chế acid chlorogenic

Hình 3.14 Sắc ký đồ định tính acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.15 Phổ hồng ngoại của acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.16 Phổ hồng ngoại của acid chlorogenic chuẩn

Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn và thử khi định lượng acid

chlorogenic tinh chế được

Hình 3.18 Kết quả chồng phổ UV-VIS của acid chlorogenic trong

mẫu chuẩn và mẫu thử khi định lượng acid chlorogenic tinh chế

Hình 3.20 Cấu trúc hoá học (A) và các tương tác COSY, HMBC

chính của sản phẩm đem đo

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu trắng – xác định tạp chất liên quan của

acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu thử – xác định tạp chất liên quan của acid

chlorogenic tinh chế được

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu chuẩn - Khảo sát độ đặc hiệu

Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu thử - Khảo sát độ đặc hiệu

Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng

độ acid chlorogenic

Hình 3.26: Giới hạn phát hiện của phương pháp định lượng acid

chlorogenic

Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic và dịch

chiết dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.28 Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử-định lượng acid

chlorogenic trong mẫu dược liệu Kim ngân hoa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chữa bệnh bằng thuốc y học cổ truyền là một phương pháp có từ lâu đời ở nước ta và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò quan trọng trong nền y học nước nhà Những năm gần đây, các nước trên thế giới có khuynh hướng đẩy mạnh việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y trong điều trị một số bệnh mãn tính Ở Việt nam, thị trường thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc trở nên rất đa dạng về chủng loại và phong phú về nguồn gốc Công tác kiểm tra chất lượng thuốc đặc biệt là thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc là một nhiệm vụ cấp thiết và quan trọng góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên, công việc kiểm nghiệm thuốc và dược liệu gặp nhiều khó khăn do thiếu chất chuẩn

Với mong muốn cung cấp thêm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu, đề tài cấp nhà nước KC.10.16/06-10 đã thực hiện mục tiêu chiết 10 hợp chất đặc trưng từ dược liệu làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu

Acid chlorogenic là một trong số các chất chuẩn hiện tại trong nước chưa thiết lập được, phải mua của nước ngoài, giá cả đắt và không chủ động Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic, một hoạt chất có trong vị dược liệu dễ tìm ở Việt Nam là Kim ngân hoa

Trong phạm vi của đề tài này, mục đích chúng tôi đặt ra là sản xuất được acid chlorogenic có độ tinh khiết cao từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có để làm chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm thuốc và dược liệu dùng làm thuốc.Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa đạt độ tinh khiết ≥ 95,0%

- Điều chế được acid chlorogenic đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc và dược liệu

Nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài:

• Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa

• Định tính, định lượng, xác định cấu trúc acid chlorogenic tinh chế được

• Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic

tinh chế được

• Sử dụng acid chlorogenic đã tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic trong vị dược liệu Kim ngân hoa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn

Theo WHO, chất chuẩn đối chiếu hóa học (chemical reference standard, viết tắt CRS) là bất kỳ nguyên liệu đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/hoạt lực Một chuẩn đối chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục

chính thức của dược điển Châu Âu (EP), hay dược điển Mỹ (USP) hoặc danh mục của Tổ chức y tế thế giới (WHO) Có thể thiết lập một chuẩn đối chiếu cơ

sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/ hoạt lực với một chuẩn đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuẩn đối chiếu tùy theo mục đích sử dụng (dùng để định tính, dùng để định lượng) và bản chất phương pháp định lượng [15]

1.1.2 Các thông tin về chuẩn acid chlorogenic

Cho tới nay, chưa có nơi nào ở Việt Nam sản xuất acid chlorogenic để làm chất chuẩn Mặt khác, việc tìm mua chất chuẩn acid chlorogenic từ các hãng nước ngoài khó khăn và không chủ động Do đó có nhu cầu cao về chất chuẩn acid chlorogenic được sản xuất trong nước

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa

Công thức phân tử : C 16 H 18 O 9

Trọng lượng phân tử: 354,31

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic acid

3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-Tên khác: 3-O-Caffeoylquinic acid

Acid chlorogenic là một hợp chất phenolic tự nhiên, được phân lập từ lá, hoa và quả của một số loại cây hai lá mầm (như hoa Kim ngân, hạt Cà phê, lá Việt

quất,…) Về mặt cấu trúc nó là một ester của acid cafeic với nhóm 3-hydroxyl của acid quinic [13], [16], [30]

OH

OH

O OH HO

O

Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước

và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid,… Khả năng hòa tan của nó trong các dung môi trên là khoảng 25 mg/ml

ở mức độ thấp [3], [26] Acid chlorogenic được ứng dụng dùng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hoá

dưới tên Sveltol (tại Anh và Na uy) Là một thành phần thêm vào thực phẩm (như cà phê, kẹo cao su) để thúc đẩy quá trình giảm cân và dùng trong mỹ phẩm

để làm đẹp [17], [26] Ở Trung Quốc, sản phẩm dược phẩm có chứa acid chlorogenic ở mức độ tinh khiết khác nhau từ 20 – 98% và được sử dụng rộng rãi như là một sản phẩm bảo vệ sức khoẻ [26]

Acid chlorogenic đã được nhiều Dược điển sử dụng làm chất đối chiếu hoá học

để định tính và định lượng đảm bảo chất lượng các dược liệu có chứa hoạt chất

này Ví dụ: trong Dược điển Anh 2009 có 20 chuyên luận, Dược điển Mỹ 31 có

14 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc 2005 có 18 chuyên luận sử dụng acid chlorogenic làm chất đối chiếu hoá học

Tài liệu [18] đã đưa ra kết quả khảo sát hàm lượng acid chlorogenic trong một

số loại cây trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic trong một số loại cây

Cây Acid chlorogenic

(% theo nguyên liệu khô)

Trong số các loại cây này, hoa Kim ngân là nguồn nguyên liệu dễ tìm ở Việt Nam, có thể được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chiết xuất acid chlorogenic Do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thêm những tài liệu có liên quan tới cây Kim ngân hoa

1.2.2.T ổng quan về dược liệu Kim ngân hoa

Hình 1.2 Cây Kim ngân

Cây Kim ngân

(Lonicera japonica Thunb.)

Kim ngân hoa

(Flos Lonicerae japonicae)

Họ cơm cháy (Caprifoliaceae)

Cây Kim ngân có nguồn gốc Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam Ở Việt Nam, Kim ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung du phía bắc, nơi có khí hậu mát, đất trồng thoát nước tốt như

ở Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây Kim ngân thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu và đất đai khác nhau, có thể trồng được ở cả miền núi, trung du và đồng bằng Ở nơi mát mẻ, cây sinh trưởng nhanh, còn ở những vùng nóng cây phát triển chậm Gần đây, cây được trồng ở một số gia đình, vừa làm cảnh vừa lấy hoa làm thuốc [3]

Cây Kim ngân, đặc biệt là hoa Kim ngân là một dược liệu được dùng làm thuốc từ bao đời nay ở Trung Quốc và Việt Nam [26] Bộ phận dùng của cây Kim ngân là hoa sắp nở (lẫn một số hoa đã nở), thân và cành đã phơi khô Mùa hoa nở là tháng 3 đến tháng 5 Thu hái hoa khi hoa sắp nở vào mùa hè rồi sấy khô Hoa mẫu 5 mọc thành xim 2 hoa ở kẽ lá Hoa thơm khi mới nở có màu trắng, về sau chuyển thành màu vàng Vì trên cây cùng có cả hoa trắng và hoa vàng nên mới gọi là Kim ngân Tràng hoa cánh hợp dài 2 - 3 cm chia làm 2 môi dài không đều nhau, một môi rộng lại chia thành 4 thuỳ nhỏ Năm nhị đính ở họng tràng, mọc thò ra ngoài

Tác dụng dược lý của Kim ngân hoa:

- Tác dụng kháng khuẩn

- Tác dụng trên chuyển hoá chất béo

- Tác dụng trên đường huyết

- Tác dụng chống choáng phản vệ

Kim ngân hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng Nó được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, mày đay, viêm mũi dị ứng, hạ sốt, chữa cảm cúm, chữa sởi, chữa viêm phổi, làm dễ tiêu, trị lỵ, hoa phơi khô dùng lợi tiểu Nước sắc hoa Kim ngân còn có tác dụng cải thiện chuyển hóa chất béo trong bệnh nhân tăng lipid máu, sau khi uống thuốc, các esters trong huyết thanh giảm Nước cất nụ hoa Kim ngân (Kim ngân hoa lệ) được dùng tiêm để điều trị bệnh nhiễm khuẩn [3], [7]

Thành phần hóa học gồm : các flavonoids, tinh dầu, các saponins và đặc biệt có chứa một hàm lượng acid chlorogenic đáng chú ý được phân bố trong các bộ phận của cây như bảng 1.2 [3] Theo các nghiên cứu từ trước và những nghiên cứu mới nhất gần đây, acid chlorogenic là một hợp chất chính giàu hoạt tính sinh học có trong hoa Kim ngân [26]

Bảng 1.2 Hàm lượng acid chlorogenic phân bố trong một số bộ phận

của cây Kim ngân

(%) a.chlorogenic 1,4 0,9 2,6 6,0

Có thể thấy rằng trong hoa có chứa acid chlorogenic cao hơn so với các bộ phận khác trong cây Kim ngân Vì vậy chúng tôi chọn hoa làm nguyên liệu cho việc nghiên cứu qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic

Các thử nghiệm chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa được mô tả trong phần thực nghiệm và kết quả

1.3 Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được nghiên cứu

Bởi tác dụng đáng chú ý của acid chlorogenic và nhu cầu sử dụng hoạt chất này ngày càng cao, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp tối ưu nhất để phân lập và tinh chế acid chlorogenic Một số quy trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được công bố như dưới đây

Theo K Gorter, Liebíg Ann (1908), K Freudenberg (1920), cũng như W Pluml và W Keiholz, đã mô tả các qui trình sản xuất acid chlorogenic, bước đầu tiên trong tất cả các qui trình trên, acid chlorogenic trong dịch chiết cây lại được tách ra bằng cách tạo phức kali-caffein-chlorogenat, rồi được tinh chế bằng nhiều phương pháp, ví dụ như kết tinh lại trong ethanol/ nước hoặc kết tủa bằng chì acetat Tách cafein ra khỏi phức đã được tinh chế bằng cách chiết dung dịch trong nước với chloroform Acid chlorogenic được tủa lại bằng cách thêm acid sulphuric, và tinh chế bằng cách kết tinh lại trong nước [18]

U Fiedler (1954) đã mô tả một qui trình kết hợp giữa phương pháp của K Freudenberg và phương pháp của W Pluml và W Keiholz Dịch chiết dược liệu

có chứa acid chlorogenic được cô đặc lại và kết tủa bằng bari acetat Sau đó dịch lọc được trung hoà bằng acid sulphuric, bari thừa sẽ được loại bỏ ở giai đoạn này Acid chlorogenic được tách ra từ dịch lọc trung tính bằng phương pháp tạo phức với chì acetat, rửa phức bằng nước nóng và thêm hydrogen sulphid, để tủ lạnh 2-3 ngày, phức kali-caffein-chlorogenat được tách ra Caffein được loại ra khỏi phức bằng chloroform, và acid chlorogenic thu được bằng cách acid hoá nhẹ [18]

Một qui trình khác (1970) đã tách acid chlorogenic bằng cột acid silicic với dung môi rửa giải chloroform - butanol theo tỷ lệ gradient [18]

Năm 1978, Dower 44, Amberlite IRA 410 hoặc Amberlite IRA 47 được

sử dụng để tách acid chlorogenic ra từ dịch chiết nước hạt cà phê xanh [18], [19]

Theo tài liệu [28], acid chlorogenic trong dịch chiết cây có thể được hấp phụ bởi HPD-850 resin, sau đó phản hấp phụ bằng ethanol 95%, nhưng chỉ tiến hành ở qui mô nhỏ

Rõ ràng là những qui trình đã biết thực hiện rất khó khăn, dẫn đến giá thành của sản phẩm acid chlorogenic thương mại hóa bị đẩy lên rất cao

Vì vậy mục tiêu đặt ra cho các nhà sản xuất là nghiên cứu và phát triển một qui trình sản xuất đơn giản, ít giai đoạn và ít tốn kém để phân lập và sản xuất acid chlorogenic dạng tự do hoặc muối, có chất lượng đạt yêu cầu, không lẫn tạp chất có độc tính hóa học không mong muốn, từ nguyên liệu rẻ tiền và dễ

kiếm

Tài liệu [18] đã đưa ra một qui trình tinh chế và sản xuất acid chlorogenic hiệu quả, trong đó acid chlorogenic tự do hoặc dạng muối được tách ra từ dịch chiết nước của các cây phù hợp bằng sắc ký lọc qua gel bởi một rây phân tử có các lỗ xốp được tạo thành nhờ sự biến đổi của polysaccharide cụ thể là dextran Loại gel này được thương mại hóa dưới tên Sephadex [18]

1.4 Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột[13]

Hiện nay phương pháp phân lập một chất từ nhóm chất hoặc từ hỗn hợp, sắc ký cột là phổ biến nhất Có thể dùng một số kiểu sắc ký cột với một số cơ chế như: sắc ký pha thuận trên silica gel, pha đảo trên chất nhồi C8, C18… hoặc sắc ký rây

phân tử (Size exclusion chromatography, SEC) trên Sephadex

1.4.1 Phương pháp sắc ký cột silica gel

Nguyên tắc:

Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ Cột chứa chất hấp

phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Khi dung môi pha động di chuyển dọc theo

cột sẽ rửa giải các thành phần của mẫu thử ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực

tăng dần Các chất có độ phân cực thấp hơn được dung môi pha động rửa giải ra

trước, tiếp theo các chất có độ phân cực tăng dần được rửa giải ra Kiểm soát

hoạt chất rửa giải ra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích

hợp

Xác định các thông số của cột

Tùy theo mục đích phải tách sạch hay chỉ phân loại thành nhóm mà chọn các thông số cột khác nhau Với cột đầu chủ yếu để phân tách thành các nhóm, tỷ lệ giữa khối lượng silica gel và chất cần tách (msilica gel/mchất) chỉ cần từ 8-10 là đủ Quan trọng là với lượng silica-gel cho trước, phải chọn được cột có kích thước thích hợp, nếu chọn cột dài thì dù đủ khả năng tách tốt nhưng thời gian tách lại lâu Thực tế một cột có kích thước h/d (chiều dài/đường kính) từ 10-15 là phù

hợp

Nhồi cột

Có hai cách nhồi cột: Nhồi ướt và nhồi khô

Nhồi ướt: Cân silica-gel cho vào một cốc miệng rộng có dung tích thích hợp, đổ

dung môi vào, khuấy đều tay để đuổi hết bọt khí và làm silica-gel phân tán đều trong dung môi Giai đoạn này ảnh hưởng lớn đến khả năng tách của cột sau này

vì nếu có bọt khí hoặc silica-gel bị vón cục thì sự phân tách sẽ kém nhiều Cột được kẹp vào giá ở vị trí thẳng đứng, đáy cột được lót một lớp bông xốp Đổ từ

từ silica gel đã được trộn đều với dung môi vào cột Chú ý bổ sung dung môi vào cốc nếu thấy silica-gel khô, khó chảy, khi bổ sung phải khuấy đều liên tục Sau khi silica-gel đã được đưa vào cột, phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong dung môi vì nếu để khô hay nứt cột thì khả năng tách sẽ kém nhiều

Nhồi khô: Cân silica-gel vào một cốc có dung tích thích hợp, đổ từ từ silicagel,

sau khi đã đổ hết silica-gel vào cột thì tiến hành rót dung môi vài lần qua cột để nén chặt silica-gel, đảm bảo độ đồng đều, tránh hiện tượng vón cục hay tạo thành bọt khí

Đưa chất lên cột sắc ký

Thông thường người ta hòa tan một lượng chất thô đem chạy cột trong một lượng tối thiểu dung môi pha động/rửa giải, rồi đưa lên cột bằng pipet pasteur Bơm nhẹ nhàng dung dịch này vòng quanh đường kính cột thủy tinh, sao cho dung dịch chảy xuống thấm đều vào pha tĩnh mà không tạo bọt khí và làm xáo trộn bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh với dung môi pha động Có thể rắc một lớp cát sạch dày 1-2 cm lên bề mặt phía trên pha tĩnh để bảo vệ bề mặt pha tĩnh khi rót dung môi pha động lên cột

Trong trường hợp chất thô đem chạy cột rất ít tan trong dung môi rửa giải, phương pháp dùng silica gel hấp phụ chất trước khi đưa lên cột được áp dụng Chất thô được hòa tan trong một lượng dung môi pha động vừa đủ đến tan hoàn toàn Thêm một lượng silica gel khoảng gấp ba lần lượng cân chất thô vào dung dịch trên, trộn đều rồi làm bay hơi dung môi bằng cất quay trong chân không tới khô thu được bột silica gel khô tơi đã hấp phụ chất thô sẵn sàng để đưa lên cột sắc ký

Trong cả hai trường hợp, trước khi đưa chất thô dạng dung dịch hay dạng được hấp phụ vào silica gel cần duy trì mức dung môi trên cột chỉ vừa đủ để không pha loãng thêm dung dịch chất thô (trường hợp 1) và ngấm hết lượng silica gel hấp phụ chất thô đưa lên cột (trường hợp 2)

Chạy cột

Lựa chọn và thay đổi dung môi chạy cột hợp lý để đảm bảo các chất phân tách tốt mà thời gian chạy qua cột không quá dài Để tách các chất hữu cơ bằng silica-gel, dung môi bắt đầu chạy thường kém phân cực, sau đó thường nâng dần

độ phân cực của dung môi cho phù hợp với từng phân đoạn hỗn hợp, bởi vì mỗi hỗn hợp khi đem chạy cột sẽ bị tách thành các phân đoạn khác nhau đối với từng chất, những chất di chuyển nhanh hơn là những chất bị hấp phụ kém hơn và ứng với những dung môi ít phân cực

Nếu chỉ dùng một dung môi trong suốt quá trình chạy sắc ký, khoảng cách giữa các phân đoạn đầu và cuối càng xa, tuy có thể tách sạch nhưng mất nhiều thời

gian do phải chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phân đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyển được hoặc di chuyển chậm Vì vậy, với mỗi đoạn ta tăng dần độ phân cực của dung môi nghĩa là giảm dần độ hấp phụ của silica-gel, các phân đoạn sẽ di chuyển liên tục vẫn đảm bảo phân tách tốt

về kích cỡ của các tiểu phân để tách riêng chúng ra bằng cách sử dụng các chất

có kích thước lỗ xốp xác định làm pha cố định Quá trình tách các chất dựa vào kích thước phân tử, có thể phân thành các nhóm:

- Phân tử có kích thước lớn hơn kích thước cực đại của lỗ xốp trong pha tĩnh, sẽ chỉ nằm ở khe hạt, không xâm nhập vào các lỗ xốp được và nhanh chóng theo pha động thoát ra ngoài trước

- Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ xốp có thể xâm nhập vào các lỗ xốp của hạt, bị lưu giữ tạm thời trong các lỗ xốp này, sau đó mới di chuyển dần dần theo pha động và thoát ra sau

Quá trình bị “bẫy vào xoang - bị lưu giữ - thoát ra khỏi xoang” này xảy ra liên tục suốt chiều dài của cột, kết quả là các cấu tử nhỏ thoát ra khỏi cột chậm hơn các cấu tử lớn Đoạn đường di chuyển, thời gian lưu của các cấu tử lớn và

bé sẽ càng khác biệt nếu chiều dài cột càng lớn [2]

Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhưng gần 10 năm sau chất lọc gel làm pha cố định mới ra đời với tên Sephadex Đây là pha rắn dùng

để lọc các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước Cấu trúc hoá học của Sephadex gồm các chuỗi dextran liên kết với nhau bằng glycerin (hình 1.3)

Hình 1 3 Cấu tạo phân tử Sephadex

Có nhiều loại gel với các cỡ lỗ xốp khác nhau, dùng để tách các phân tử thuộc các dải cỡ khác nhau, ví dụ như ở bảng 1.3 [2]

Bảng 1.3 Khả năng tách lọc của một số loại gel Sephadex

STT Gel Sephadex Tách các phân tử cỡ

Về nguyên tắc, sắc ký thẩm thấu qua gel trên Sephadex được dùng để tách hỗn hợp các chất bởi kích thước lỗ xốp của rây phân tử, các phân tử được phát hiện trong quá trình rửa giải theo thứ tự kích thước phân tử giảm dần Nhiệt độ môi trường bình thường là điều kiện thích hợp cho thực hiện quá trình tách Pha động được chọn chủ yếu thoả mãn yêu cầu: hoà tan tốt hoạt chất trong mẫu thử,

độ nhớt thấp, ít độc hại, không quá đắt, không làm trương nở pha tĩnh quá độ vì

nó có thể làm bít các lỗ xốp Độ nhớt của pha động càng thấp thì nó càng có khả

năng xâm nhập vào các lỗ xốp của pha tĩnh để đưa các phân tử có kích thước

nhỏ đi vào và đi ra khỏi các lỗ xốp của hạt Có thể dùng môi trường rửa giải là nước hoặc cũng có thể sử dụng hỗn hợp cồn – nước và tùy theo các yêu cầu riêng biệt mà lựa chọn hệ thống dung môi có độ phân cực khác nhau cho phù hợp Đối với pha tĩnh Sephadex G, thường dùng pha động là nước Chiều dài cột

và kích thước lỗ xốp của Sephadex là yếu tố quan trọng để tăng cường hiệu lực tách của cột, chúng có mối quan hệ tỷ lệ thuận với nhau Để tách tốt nhất một chất, thông thường người ta sử dụng hai loại Sephadex có kích thước lỗ xốpkhác nhau từ bé đến lớn

Tài liệu [18] đã sử dụng cột Sephadex để tinh chế acid chlorogenic từ dịch chiết nước của hạt cà phê xanh với dung môi rửa giải là nước và thu được sản phẩm có hàm lượng acid chlorogenic cao và hiệu suất tinh chế cao Tác giả đã phát hiện ra một điều đặc biệt là trên thực tế, acid chlorogenic được lưu giữ chọn lọc trên Sephadex lâu hơn so với kích thước phân tử của nó Thật bất ngờ là gần như toàn bộ lượng chất có trong dịch chiết nước của dược liệu có trọng lượng phân tử lớn hơn và nhỏ hơn acid chlorogenic đều được rửa giải qua cột trong những phân đoạn rõ ràng và acid chlorogenic thì được lưu giữ chọn lọc

Để tách riêng acid chlorogenic dạng tự do, người ta nhận thấy rằng pH thích hợp nhất của dịch chiết cây phải từ 2-2,8 và cột sử dụng phải có một chiều dài thích hợp Trong một số trường hợp, dịch chiết nước tự nhiên của cây có pH cao hơn thì ta phải chỉnh pH về khoảng trên bằng một acid vô cơ như HCl, H2SO4

Qui trình này cho phép tách riêng acid chlorogenic tự do, dạng muối và thậm chí

cả các đồng phân của nó với các thao tác đơn giản dễ áp dụng và gần như là tối

ưu cho chế tạo acid chlorogenic từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên.[18]

Trong thực tế, sắc ký lọc qua gel với độ phân giải cao áp dụng ở các giai đoạn cuối cùng của quá trình tinh chế là lý tưởng với thể tích mẫu vừa phải và dung

môi rửa giải thích hợp

1.5 Phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc phân tử

Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng Thông thường phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy

Điểm chảy là tiêu chuẩn kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng mẫu thử rất ít Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem là sản phẩm kết tinh tinh khiết Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu

Đo điểm chảy bằng ống mao quản: Phương pháp này dùng mẫu thử từ 1-2mg

Quan trọng ở đây là tạo ra môi trường nhiệt độ đồng đều tại vùng tiếp xúc với

bầu thủy ngân của nhiệt kế và chất thử trong ống nghiệm mao quản

Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp

Các dụng cụ này có ưu điểm là dùng rất ít chất thử (vài tinh thể) vì có bộ phận phóng đại nên quan sát quá trình nóng chảy của tinh thể được rõ ràng Nhiệt độ được cung cấp qua một bộ phận điều nhiệt, nhờ thế nhiệt độ được điều chỉnh một cách chủ động và từ từ Khi các góc tinh thể bắt đầu biến dạng là lúc bắt đầu chảy và khi các tinh thể đã biến thành hạt dầu hình cầu hoặc hình trứng là quá trình chảy đã kết thúc [8],[9]

1.5.2 Định tính bằng phổ hồng ngoại - IR (infrared spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của bức xạ hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, dựa vào kết quả phổ hồng ngoại, người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng Đặc biệt, vùng dưới 700cm-1 được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp với chất chuẩn

[15]

phẩm của quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2],[5],[6]

1.5.3.1 Khái niệm cơ bản về HPLC

Nguyên lý của HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp hóa lý dùng để tách, định tính, định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn nhau: Pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi bên trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Mẫu thử và dung môi pha động được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng với 2 pha và dẫn tới sự tách các chất, sự tách các chất này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thu hoặc trao đổi ion Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector (Tử ngoại, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ…) Các tín hiệu được truyền qua bộ phận xử lý kết quả và được ghi hoặc hiển thị trên màn hình Đường cong rửa giải sau 1 quá trình gọi là sắc ký đồ

1.5.3.2 Các thành phần của hệ thống HPLC

Các bộ phận cơ bản của 1 máy HPLC gồm: Bình chứa pha động, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích (có thể được đặt trong bộ phận điều nhiệt), detector (bộ phận phát hiện), bộ phận thu nhận và xử lý số liệu v.v

Pha tĩnh (Stationary phase): Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột, hay

còn gọi là chất mang Trong HPLC, pha tĩnh thông dụng nhất là silica-gel dưới dạng hình cầu Hiện nay, các vi tiểu phân có kích thước 3µm ÷ 10µm, diện tích

bề mặt riêng 50 m2

/g ÷ 500 m2/g là vật liệu được dùng nhiều nhất để nhồi cột phân tích, Với loại vật liệu này, kỹ thuật nhồi khô không thích hợp mà phải nhồi cột ướt với dung môi thích hợp dưới áp suất tương đối cao

Pha tĩnh được chế tạo trên nền các chất sau: Pha tĩnh trên nền silica-gel, pha tĩnh trên nền oxyd nhôm, pha tĩnh trên nền mạch carbon Trong 3 loại trên, pha tĩnh trên silica-gel có nhiều ưu điểm hơn cả và thường được sử dụng

Pha tĩnh trên nền silica-gel

- Silica-gel trung tính: dùng trong sắc ký pha thuận Ví dụ: Lichrosorb Si 40, Lichrosorb 60, Hypersil, Micropack-Si…

- Silica- gel đã alkyl hóa: Dùng cho sắc ký pha đảo để tách các chất không phân

cực, ít phân cực, các chất phân cực ít có khả năng tạo cặp ion Các nhóm OH hoạt động trên bề mặt đã bị alkyl hóa, vì vậy nó không còn phân cực hoặc rất ít phân cực Ví dụ: Hypersil ODS, Lichrosorb RP18, Lichrosorb RP8…

Pha động là các chất hữu cơ phân cực: MeOH, ACN, nước hoặc hỗn hợp các chất trên Sự tách của các chất nhồi cột loại này có độ lặp lại cao nên được ứng dụng nhiều hơn loại silica-gel trung tính

- Silica- gel đã được sulfonic hóa, nitro hóa hoặc amin hóa: dùng cho sắc ký trao

đổi ion

Pha động: Pha động trong HPLC là dung môi được cho chảy qua cột, tức là pha

tĩnh, một cách liên tục Pha động có thể là một hay một hỗn hợp các dung môi khác nhau trộn theo tỷ lệ nhất định hoặc có thể là dung dịch muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức

Trong sắc ký phân bố pha đảo: Pha động là các dung môi phân cực, hay dung là acetonitril, methanol Pha động thường là hỗn hợp ACN và nước vì nó có độ nhớt thấp nên có thể sắc ký ở áp suất thấp Có thể thay đổi độ phân cực của pha

động bằng cách cho thêm vào những tỷ lệ nước nhất định Ngoài ra, trong một

số trường hợp còn có thêm chất tạo cặp ion, hệ đệm ổn định pH cho quá trình sắc ký…

1.5.3.3 Một số đặc trưng trong HPLC

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần thiết để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ khi tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic trên sắc ký đồ)

- Trong phân tích, nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém Còn nếu tR quá lớn (tR > 20 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài

R

t t t

QS, QM : lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động

VS, QM: thể tích của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Nếu k’ quá nhỏ thì quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, chất cần tách bị rửa giải

ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu Do vậy khả năng tách không tốt Nếu k’

quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài (tR lớn), đỉnh giãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp Trị số tối ưu: 1 ≤ k’ ≤5

Hiệu lực cột (Colum efficiency)

Hiệu lực của cột là thông số về hiệu suất phân tích của cột, được biểu thị bởi đại lượng quan trọng nhất là số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong 1 điều kiện sắc ký nhất định Thực tế N nằm trong khoảng 2500 ÷ 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

Số đĩa lý thuyết được tính toán dựa theo công thức:

N = 16

2 w

1.5.3.4 Các phương pháp định lượng trong phân tích HPLC

Nguyên tắc: Có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất phân tích với

diện tích hoặc chiều cao pic của nó Vì vậy có thể định lượng các chất dựa vào

sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic của chất cần xác định với mẫu chuẩn đã

biết trước nồng độ

Dựa vào diện tích pic: Phương pháp này hay được sử dụng nhất vì luôn có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất với diện tích pic của chất đó Không áp dụng phương pháp này trong trường hợp pic quá cao, đường nền nhiễu hoặc pic

bị doãng, không đối xứng…

Dựa vào chiều cao pic: Áp dụng khi pic có dạng không đổi, thì nồng độ chất

tuyến tính với chiều cao pic, vì vậy nếu không tính theo diện tích pic thì có thể tính theo chiều cao pic

Một số phương pháp định lượng cơ bản

- Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản

Nguyên tắc: So sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích pic của mẫu thử với chiều cao hoặc diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Yêu cầu: mẫu thử và mẫu chuẩn được sắc ký trong cùng một điều kiện, thời gian thực hiện 2 mẫu không cách nhau xa

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

- Phương pháp chuẩn nội

Nhằm giảm sai số và đạt được độ lặp lại cao, dùng 1 chất chuẩn thứ 2 thêm những lượng giống nhau vào cả chất chuẩn ngoại và mẫu thử Chất thêm vào này gọi là chất chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp này được sử dụng khi định lượng bằng HPLC có ảnh hưởng của các chất phụ (như tá dược) hoặc chất chuẩn có nồng độ quá nhỏ Dung dịch thử

được thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn

Cấu trúc các chất tinh chế ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao Dưới đây là một số phương pháp chúng tôi dùng để xác định cấu trúc của chất tinh chế được

1.5.4.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR (nuclear magnetic resonance spectroscopy)[15]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ nói chung

và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, người ta có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1

H, 13C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Ngoài

ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

Phổ 1

H-NMR: Trong phổ 1

H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang từ 0-14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

Phổ 13

C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13

C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm)

Phổ DEPT - distortinonless enhanccement by polarization transfer: Phổ này cho những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía

và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT 1350 Còn trên phổ DEPT

90othì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương

tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật thường được dùng chủ yếu như sau:

Phổ HMQC - heteronuclear multiple quantum coherence: Các tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các peak giao nhau trên phổ HMQC Trên phổ này, một trục là phổ 1

Phổ HMBC - heteronuclear multiple bond connectivity : Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của C và H trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này

mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

Phổ NOSEY - nucler overhauser effect spectroscopy: Phổ này biểu diễn các tương tác gần trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử

1.5.4.2 Phổ khối lượng – MS (mass spectroscopy) [15]

Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa vào sự

phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn có các peak ion mảnh khác, dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hóa học các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Các phương pháp chủ yếu là:

Phổ EI-MS (electron impact ionization mass spectroscopy): Phổ va chạm điện

tử (Electron Impact, EI), dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm điện tử hoặc ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

Phổ ESI-MS (electron spray ionization mass spectroscopy): Phổ tạo ra bởi ion

hóa bằng phun điện tử (Electron Spray Ionisation), Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là peak ion phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ

Phổ FAB-MS (fast atom bombardment spectroscopy): Phổ tạo ra bởi kỹ thuật

bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment, FAB) ở mức năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được peak ion phân tử

Ngoài ra còn có phương pháp phổ khối khác như phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) cho phép xác định peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Hay là phương pháp kết hợp sắc ký với phổ khối như sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích thành phần của hỗn hợp chất

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Dược liệu: Kim ngân hoa

• Tên khoa học: Flos Lonicerae japonicae

• Nơi mua: Công ty dược phẩm và thiết bị y tế Hà nội

Nguyên liệu Kim ngân hoa được mua về ở dạng tươi đã được sấy qua, có màu vàng nâu sáng Sau đó đem xay thô bằng cối xay dược liệu, thu được bột dược liệu đã xay thô

2 2 Phương tiện nghiên cứu

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR- BRUKER- 500MHz

- Máy đo điểm chảy BUCHI 535

1c

- Máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR

- Máy khối phổ 5989B.HP-MS

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT-PACKARD Series 1100

- Buồng soi tử ngoại DESAGA HP-UVIS

- Máy cất quay chân không Buchi 461 có cách thuỷ điều nhiệt

- Cột sắc ký lỏng PHENOMENEX luna C18 ( 5µm, 250 x 4,6 mm )

- Cân phân tích METTLER AG 245 có độ chính xác 0,01mg

- Máy lắc siêu âm

- Nồi cách thuỷ MEMMERT

- Tủ sấy MEMMERT

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng 15x15cm

- Cột thủy tinh đường kính 6 cm, có khóa điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi rửa giải

- Cốc thủy tinh 25 ml (để thu các dung dịch qua cột)

- Dụng cụ thuỷ tinh chính xác: bình định mức, pipet, ống đong, và các dụng cụ thuỷ tinh khác cần cho quá trình thực nghiệm

2.2.2 Hoá chất, dung môi

Các hoá chất dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC

- Bản mỏng Silica gel GF 254

- Chất chuẩn làm việc acid chlorogenic

Nguồn gốc: Trung Quốc, lot:110753-200413 Hàm lượng: 99,0% (tính theo nguyên trạng)

- Acid hydrocloric đậm đặc PA

- Bột kẽm PA

- Dung dịch natri hydroxyd 10%

- Ethanol tuyệt đối PA

- Butyl acetat PA

- Acid formic PA

- Acetonitril (HPLC)

- Acid phosphoric

- Methanol PA

- Các chất nhồi cột: Silica gel (cỡ hạt 40 – 63 µm, Merck)

Sephadex G15 và Sephadex G10 (Sigma)

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa

- Định tính acid chlorogenic tinh chế được

- Xác định cấu trúc của acid chlorogenic tinh chế được

- Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic tinh chế được

- Định lượng acid chlorogenic và xác định hàm lượng tạp chất liên quan

của acid chlorogenic tinh chế được

- Sử dụng acid chlorogenic đã tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic trong vị dược liệu Kim ngân hoa

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.1 Định tính dược liệu Kim ngân hoa:

Theo Dược điển Trung Quốc 2005

Định tính:

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định lượng:

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Acid chlorogenic là một acid phenol, tan được trong nước và trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, với tỉ lệ 25 mg/ml Dựa vào khả năng hoà tan của acid chlorogenic trong các dung môi trên, chúng tôi đã khảo sát các qui trình chiết xuất acid chlorogenic trong các dung môi khác nhau: nước, ethanol (ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, tuyệt đối), methanol (ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 100%) với 2 phương pháp chiết nóng và chiết nguội Dịch chiết thu được, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc

- Loại tạp tan trong nước bằng ethanol tuyệt đối

- Phân lập acid chlorogenic bằng sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 40-63µm, Merck)

- Tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex G15 và Sephadex G10

2.4.4 Các phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc acid chlorogenic

2.4.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính acid chlorogenic

Thử theo Dược điển Trung Quốc 2005 [21]

Điều kiện sắc ký:

- Bản mỏng Silica gel GF254

- Pha động: butyl acetat – acid formic – nước ( 70 : 25 : 25, lớp trên)

- Phát hiện: 2 cách:

+ Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm: vết acid chlorogenic phát huỳnh quang màu xanh

+ Bằng ánh sáng thường: vết acid chlorogenic có màu nâu vàng

Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử có nồng độ acid chlorogenic trong methanol là 1mg/ ml

Tiến hành:

- Chấm riêng biệt 10µl mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử

- Tiến hành SKLM theo qui định của DĐVN III

- Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí

- Quan sát các vết trên bản mỏng, so sánh vết trên sắc ký đồ của dung dịch

thử và dung dịch chuẩn để đưa ra kết luận

2.4.4.2 Phương pháp đo điểm chảy để định tính và đánh giá mức độ tinh khiết của acid chlorogenic tinh chế được

- Đo điểm chảy mẫu chất tinh chế được trên máy đo điểm chảy Buchi 535

- Đánh giá kết quả bằng cách so sánh với thông số nhiệt độ nóng chảy của acid chlorogenic trong các tài liệu tham khảo

2.4.4.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại để định tính acid chlorogenic tinh chế được

- Chuẩn bị mẫu viên nén KBr

- Đo phổ IR

- Đánh giá kết quả bằng cách so sánh với phổ chuẩn

2.4.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định tính, định lượng acid chlorogenic

Thử theo Dược điển Trung Quốc 2005 [21]