Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng

và ít nhiều khẳng định được các tác dụng sinh học của cây lá đắng thông qua việc phát hiện các hợp chất hoá học liên quan.. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện:

Bộ môn Dƣợc học cổ truyền

HÀ NỘI - 2017

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1: TỔNG QUAN……… 2

1.1 Tổng quan về cây lá đắng 2

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Vernonia 2

1.1.2 Loài Vernonia amygdalina Del 3

1.1.3 Tác dụng sinh học 6

1.2 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động và hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể 7

1.2.1 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động 7

1.2.2 Hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể 8

1.2.3 Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý 10

1.2.4 Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa 12

1.3 Tổng quan về cao đặc 12

1.3.1 Định nghĩa 13

1.3.2 Phương pháp điều chế cao 13

1.3.3 Yêu cầu chất lượng với cao 13

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu 15

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Điều chế cao chiết ethanol lá đắng 16

2.2.2 Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng… 16

2.2.3 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng 16 2.2.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol lá đắng… 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp điều chế cao 17

2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm 18

2.3.3 Phương pháp cảm quan 18

2.3.4 Phương pháp định tính 18

2.3.5 Phương pháp bán định lượng 22

2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 24

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Điều chế cao chiết ethanol lá đắng 28

3.2 Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng 29

3.2.1 Định tính 29

3.2.2 Bán định lượng 32

3.2.2.2 Thẩm định phương pháp HPTLC 34

3.3 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng cao chiết ethanol cây lá đắng 37

3.3.1 Tính chất: 37

3.3.2 Độ ẩm: 37

3.3.3 Định tính: 38

3.3.4 Bán định lượng luteolin bằng HPTLC: 38

3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao chiết ethanol lá

đắng… 38

3.4.1 Tiến hành 38

3.4.2 Kết quả 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CCOH: chất chống oxy hóa

SOD: enzym superoxyd dismutase

DOXHĐ: dạng oxy hoạt động

LDL: lipoprotein tỷ trọng thấp

DĐVN IV: dược điển Việt Nam IV

HPTLC: high performance thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

DPPH: 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl

TLC, SKLM: Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)

MDA: Malonyl dialdehyd

POL: peroxyd hóa lipid

TMCB: thiếu máu cục bộ

TMTL: tưới máu trở lại

RSD: độ lệch chuẩn tương đối

TT: thuốc thử

Bảng 3.5 Hàm lượng luteolin có trong cao cây lá đắng 33

Bảng 3.7 Hàm lượng luteolin chuẩn và diện tích pic đáp ứng 36

Bảng 3.9 Độ hấp thụ và % ức chế gốc tự do của cao tổng lá đắng

và quercetin

40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 2.1 Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Limonat 5

15

Hình 3.1 Kết quả định tính flavonoid ở bước sóng 254 nm 31 Hình 3.2 Sắc ký đồ định lượng bằng HPTLC ở bước sóng 254

nm

33

Hình 3.3 Hình dạng pic và Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn 35

Đồ thị 3.1 Đường chuẩn phân tích nồng độ luteolin theo diện

tích pic

34

Đồ thị 3.2 Mối liên hệ giữa hàm lượng luteolin và diện tích pic 36

Đồ thị 3.3 Khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây lá đắng 41

Đồ thị 3.4 Khả năng chống oxy hóa của chất đối chứng

quercetin

41

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành nhất tới ThS Phạm Thái Hà Văn – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ

bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi

về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS-TS Nguyễn Mạnh Tuyển đã hỗ trợ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài và ThS Nghiêm Đức

Trọng – Bộ môn Thực vật đã giúp tôi giám định tên khoa học của mẫu

nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy cô giáo và các anh chị kỹ

thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội đã

luôn hỗ trợ kịp thời, tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng

toàn thể các Thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn của tôi đã luôn động

viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt qua mọi khó khăn

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trần Thu Giang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lá đắng có nguồn gốc từ châu Phi, đã được di thực vào Việt Nam trong một thời gian dài và được nhân dân ta sử dụng như một loại rau xanh ăn hằng ngày hoặc thảo dược để phòng và điều trị các bệnh như: tiểu đường, lipid máu, các bệnh chuyển hoá liên quan đến gan

Trong bối cảnh cây lá đắng ngày càng được sử dụng rộng rãi, xuất hiện nhiều nghiên cứu về đặc điểm thực vật cũng như thành phần hoá học của cây Các nghiên cứu này đã khẳng định được cây lá đắng di thực vào Việt Nam là

loài Vernonia amygdalina Del và ít nhiều khẳng định được các tác dụng sinh

học của cây lá đắng thông qua việc phát hiện các hợp chất hoá học liên quan Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu chính thức nào tiến xa hơn trong việc đưa cây lá đắng tiếp cận gần hơn với người sử dụng Việc chế biến và sử dụng lá đắng vẫn còn rất thủ công Người dân chủ yếu dùng lá tươi hoặc đã phơi khô hãm uống như chè hoặc nấu thành canh để ăn

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành

phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng” với

mục đích đưa ra bào chế cao giúp cho việc sử dụng loại dược liệu này được thuận tiện, dễ dàng hơn và bước đầu nghiên cứu tác dụng của cây lá đắng Để hoàn thành mục đích đó chúng tôi tiến hành để tài với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cao cây lá đắng

2 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên in vitro của cao cây lá đắng

Để thực hiện các mục tiêu trên đề tài cần thực hiện những nội dung sau:

1 Khảo sát một số tiêu chuẩn cao về cảm quan, độ ẩm, định tính các thành phần hóa học, định tính và bán định lượng luteolin

2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao cây lá đắng

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây lá đắng

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Vernonia

1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Vernonia

Theo một số tài liệu, chi Vernonia được xếp vào vị trí phân loại như

Chi Vernonia gồm khoảng 1000 loài cây thân thảo và cây bụi trong họ

Cúc Một số cây được biết đến như là cây gỗ Một số loài ăn được và có giá trị kinh tế Chúng thường có hoa màu tím đậm [18]

Các loài của chi này thường được tìm thấy ở Châu Á, Châu Phi, Bắc và Nam Mĩ Tại Ấn Độ, chi này có 56 loài và 17 thứ [19]

1.1.1.2 Đặc điểm của chi Vernonia

Cây lâu năm hoặc hằng năm hiếm khi là cây bụi, cây nhỏ, dây leo hoặc

bò sát, ít khi có nhựa mủ Lông đơn giản, đơn sắc, dạng chữ T, hình sao hoặc

có tuyến Lá thường xen kẽ, hiếm khi mọc đối hoặc chụm ba lá, đôi khi mọc hình hoa thị đơn giản, không cuống hoặc có cuống Lá thường có gân lông chim Toàn bộ mép lá có dạng thuỳ hoặc đầy gai, thường có những đốm tuyến Hoa mọc thành cụm, cụm hoa có 1 – 200 hoa, cụm hoa thường lưỡng tính Lá bắc xếp chồng lên nhau, có khoảng từ 1 đến 12 lá, lá bắc trong không rụng hoặc rụng sớm Tràng hoa có màu trắng hoặc tím, hiếm khi có màu

vàng, hình ống [18]

1.1.2 Loài Vernonia amygdalina Del

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Loài V.amygdalina Del có các đặc điểm sau [4]:

Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 1,5 – 3 m Thân vừa phải phân nhiều nhánh, thân cây non có góc cạnh, gần như nhẵn ở dưới, nhiều lông bao phủ bên ngoài

Lá mọc cách, nhiều hình dạng và kích thước, hình mác, một số hình trứng, kích thước 3 – 17 x 1,3 – 7 cm, đỉnh lá nhọn, mép lá có khía răng cưa, mặt trên lá nhẵn, có nhiều lông mềm, mặt dưới của lá và gân có màu nhạt hơn, có lông, vị đắng Cuống lá dài 1 – 4 cm, có nhiều lông mịn

Cụm hoa đầu với nhiều lá bắc nhỏ, dài 0,1 – 0,2 cm; có mùi thơm, có cuống ngắn Đầu mang hoa có 11 – 35 hoa lưỡng tính, hình chuông rộng 0,2 – 0,5 cm, đế hoa nhỏ dài 0,2 – 0,5 cm, màu trắng kem Tổng bao 25 – 30 lá bắc xếp 4 – 5 hàng, hình trứng hoặc hình chữ nhật hoặc nhọn, dài 0,4 – 0,6 cm, màu xanh hơi nâu ở đỉnh, hình dài hẹp, vòng trong dài hơn vòng ngoài

Tràng hoa thu hẹp dần bên dưới Bộ nhị dài 4,5 – 5 mm, với 5 chỉ nhị, bao phấn dính nhau thành ống dài 3 – 4 mm, dính nhau ở đuôi Chỉ nhị dài 11

– 14,5 mm; bao phấn thuôn dài hình elip, kích thước 2 – 2,5 x 0,5 – 0,9 mm Vòi nhụy dài 8 – 9,5 mm, phía trên tách ra mang 2 đầu nhụy

Quả bế hình elip thuôn dài, 3 – 4 x 0,5 – 1 mm, quả có 10 gân Túm lông với những sợi lông cứng loe ra ở đầu

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Vernonioside

Nhóm flavonoid có 3 flavon là luteolin, luteolin 7-O-beta-glucosid, luteolin 7-O-glucuronosid và hàm lượng cao vitamin C liên quan đến hoạt

tính chống oxy hóa và có thể có vai trò chống ung thư, chống lại bệnh tiểu đường và xơ vữa động mạch của lá đắng [28]

Cao chiết nước lá đắng liều 300mg/kg thể trọng dùng theo đường uống thử trên chuột cống trắng có tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô hình gây độc gan bằng ethanol mãn (35 ngày) [16]

Cao chiết nước lá đắng liều 50mg/kg thể trọng dùng đường uống thử nghiệm trên chuột nhắt trắng có tác dụng bảo vệ gan chống oxy hóa trên mô hình gây độc gan bằng ethanol bán cấp (7 ngày) [29]

Ngoài ra ngoài dân gian còn sử dụng lá đắng với các tác dụng sau:

- Tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể Chữa rối loạn tiêu hóa, đau bụng

và tả lỵ

- Hạ sốt và điều trị cảm lạnh tích cực nhờ các hợp chất xanthone, acid phenolic trong lá

- Điều trị các bệnh qua đường tình dục như bệnh lậu nhờ tác dụng của các chất chống oxy hóa trong lá

- Chống giun sán

- Duy trì sức sống tình dục Giúp nhuận tràng và chữa táo bón

- Chống sốt rét vì chất đắng trong lá có thể thay thế cho quinin

- Chữa đau họng, ho, trừ đờm, chỉ cần nhai 1 lá trước khi đi ngủ vào ban đêm và sáng sớm sẽ thấy giảm các triệu chứng ho

- Tăng cường khả năng sinh sản, uống nước lá đắng giúp kích thích khả năng sinh sản ở phụ nữ khó sinh Các lá có chứa nhiều carotene, giúp cân bằng quá trình tổng hợp các hormon sinh dục nữ và duy trì nồng độ estrogen đo đó giúp phụ nữ khỏe mạnh và kéo dài tuổi xuân

- Chống buồn nôn và tăng cường cảm giác ngon miệng

- Hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B và C

- Tăng tiết sữa cho con bú

- Giảm đau và làm êm dịu thần kinh dễ ngủ Chống mẩn ngứa ngoài da Độc tính của lá đắng rất thấp nên có thể sử dụng lâu dài an toàn [22], [25] Trên thực nghiệm, dịch chiết nước từ lá có độc tính rất thấp nên có thể dùng liều cao mà vẫn an toàn trong điều trị bệnh cho người [25]

( ) bị enzym superoxyd dismutase (SOD) phân hủy tạo thành H2O2 theo phản ứng:

Các gốc tự do của oxy và các dạng oxy có khả năng phản ứng cao như vậy được gọi là các dạng oxy hoạt động hay các oxydant [1], [10], [12]

1.2.2 Hệ thống các chất chống oxy hóa (CCOH) trong cơ thể

Trong cơ thể có một hệ thống các chất trung hòa hoặc phân hủy các dạng oxy hoạt động trên và được gọi là các CCOH hay các oxydant bao gồm: ([1],

[10], [12])

SOD

GSHPO

- Enzym superoxyd dismutase (SOD)

Có 2 loại SOD:

 MnSOD có ở ty thể

 CuZnSOD có ở bào tương

Cả 2 loại này đều phân hủy đặc hiệu theo phản ứng (1)

O2 – một chất khơi mào cho quá trình POL Do đó vitamin E là một chất bảo vệ tốt màng tế bào, ngăn chặn sự tấn công của các gốc tự do

- β-caroten, ubiquinon và các chất tương tự tồn tại ở dạng semiquinon (gốc bền) và có tác dụng bẫy các gốc tự do

- Các tác nhân phức hóa các kim loại chuyển tiếp như sắt và đồng Bình thường phản ứng của với H2O2 tạo ra 1O2 và •OH xảy ra rất chậm (phản ứng Harber – Weiss), nhưng khi có mặt các kim loại chuyển tiếp

ở trạng thái tự do (Fe2+

, Cu+) thì phản ứng xảy ra rất nhanh (khi đó được gọi là phản ứng Fenton) Sắt và đồng trong cơ thể luôn tồn tại dưới dạng phức như Ferritin, Ceruloplasmin, Transferin…

 Transferin: Người khỏe mạnh chỉ cần 20 – 30 % lượng transferin

là đủ làm mất hoạt tính xúc tác của sắt Khi có quá tải sắt, huyết tương không đủ transferin và phản ứng Fenton xảy ra rất nhanh

 Lactoferin: Làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên

GSHPO

 Celuroplasmin: Là 1 protein chứa đồng Nó có khả năng tạo phức với đồng làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+

thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton

1.2.3 Sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý

1.2.3.1 Gốc tự do với một số quá trình viêm

Khi tác nhân gây viêm (vi khuẩn, dị vật…) xâm nhập vào cơ thể thì các

tế bào ở đó bị kích thích tiết ra các yếu tố hóa ứng động, hấp dẫn bạch cầu đến làm nhiệm vụ thực bào Khi tiếp xúc với vi khuẩn hoặc các tác nhân lạ, bạch cầu mọc ra các giả túc, bao lấy chúng Khi màng bao quanh đã được khép kín, ở bạch cầu có sự tăng đột ngột chuyển hóa oxy để sinh ra , OH•, H2O2… nhằm mục đích tiêu hủy các tác nhân này Để bảo vệ mình, bạch cầu cũng sản sinh ra rất nhiều các chất chống oxy hóa như SOD, GSH, catalase… song vẫn có khoảng 10% bạch cầu chết, do chính các dạng oxy hoạt động mà

nó sinh ra Khi bạch cầu bị ly giải, các gốc tự do của oxy thoát ra ngoài, tấn công vào các tế bào xung quanh, gây tổn thương làm cho sự đáp ứng kích thích của tế bào ở khu vực đó càng xảy ra mạnh hơn, những đáp ứng đó tương ứng trên lâm sàng là các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau ( viêm) [10]

1.2.3.2 Gốc tự do với các bệnh tim mạch

Bệnh tim mạch thường là bệnh của người già Bởi vì khi già thì các DOXHĐ tăng, các CCOH giảm Chính sự chuyển dịch cân bằng các DOXHĐ với các CCOH này làm cho lượng các gốc tự do có nhiều khả năng oxy hóa các hạt lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) [10]

Các hạt LDL bị oxy hóa không còn ở trạng thái tự nhiên, không còn vai trò cung cấp cholesterol cho tế bào, trở thành chất lạ bị các đại thực bào hay các bạch cầu thực bào Khi nó trầm lắng xuống thành mạch, mỗi hạt LDL bị

oxy hóa, bị bạch cầu hay các đại thực bào ăn theo cơ chế sinh ra các gốc tự do

cứ lớn dần, phát triển thành đám tế bào bọt Và từ đó các đám tế bào bọt phát triển thành các mảng xơ vữa thành mạch Thành mạch tích tụ nhiều tế bào bọt, cứ phình to dần, làm hẹp dần lòng động mạch Khi lòng động mạch bị thu hẹp tới 70 – 80% so với bình thường là lúc máu lưu thông tới các tổ chức không đủ nhu cầu Đặc biệt ở động mạch vành, khi đó bắt đầu xuất hiện những cơn co thắt ngực và tiếp theo sẽ dẫn tới nhồi máu cơ tim [10]

Hiện tượng các mảng xơ vữa bong ra, lang thang theo dòng máu và có thể bít một mao mạch nào đó trên đường di chuyển, gây ra tắc mạch, dẫn đến nhũn não và các tai biến mạch máu não [10]

Quá trình nhồi máu, nhũn não… đều do không được cung cấp đủ lượng máu theo yêu cầu gây ra tình trạng thiếu máu cục bộ (TMCB) Người ta thấy TMCB có thể do tắc mạch hay chèn ép thành mạch gây ra Hiện tượng này có thể nhất thời, cũng có thể khá lâu Khi dòng máu lưu thông lại được đưa tới thì gọi là tưới máu trở lại (TMTL) [10]

Người ta thấy rằng các gốc tự do của oxy tăng lên rất nhanh ngay trong thời gian TMCB và đặc biệt tăng vọt lên ngay khi TMTL Chính sự gia tăng các gốc tự do khi TMCB và TMTL (hay xảy ra khi phẫu thuật, choáng, sốc…) đã góp phần phá hủy thành mạch, cơ tim và các tổ chức của cơ thể, làm cho các triệu chứng bệnh tim mạch thêm nặng nề [10]

1.2.3.3 Gốc tự do với quá trình ung thư

Ngày nay bản chất gốc tự do của các tác nhân ung thư đã dần sáng tỏ Mặc dù các tác nhân gây ung thư có bản chất hết sức khác nhau: có thể là các tác nhân vật lý (tia phóng xạ, tia X…), có thể là do tác nhân hóa học (có hàng nghìn chất hóa học có thể gây ung thư) Song nhìn chung tất cả các tác nhân

này khi xâm nhập vào cơ thể, bị chuyển hóa dẫn đến hậu quả làm cho các DOXHĐ gia tăng [10]

Sự gia tăng của các gốc tự do, điển hình là gốc OH•, sẽ tạo ra điều kiện cho các gốc này tấn công vào các ADN, gây ra những tổn thương về cấu trúc Những tổn thương này không được sửa chữa, di truyền lại tức là đột biến xuất hiện làm cho tế bào bình thường phát triển dần thành bất thường Các tế bào bất thường phát triển mạnh thành u lành và cuối cùng thành u ác tính với các biểu hiện ung thư lâm sàng [10]

1.2.4 Các phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa

Có một số phương pháp xác định hoạt độ chống oxy hóa như sau:

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO

- Phương pháp xác định hàm lượng MDA

- Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym Xanthin oxydase

Trong khóa luận này, tôi xin được trình bày phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol cây lá đắng vì phương pháp này có một số ưu điểm sau:

- DPPH có thể được sử dụng trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước không phân cực và có thể sử dụng để kiểm tra cả 2 chất chống oxy hóa ưa nước và ưa mỡ

- Có độ chính xác cao, dễ dàng thực hiện và giá trị kinh tế cao

- DPPH được phép phản ứng với toàn bộ mẫu và đủ thời gian nhất định trong phương pháp này

1.3 Tổng quan về cao đặc

1.3.1 Định nghĩa

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay đông vật với các dung môi thích hợp Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) [3]

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% [3]

1.3.2 Phương pháp điều chế cao

Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn [3]:

Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi với phương pháp thích hợp: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm

Giai đoạn 2: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 600C Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt

độ không quá 800

C

1.3.3 Yêu cầu chất lượng với cao

Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây [3]:

- Mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): không quá 20%

- Hàm lượng cồn: đạt 90 – 110% lượng Ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng và cao đặc)

- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng

- Dung môi tồn dư: nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn – nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 10.14: Xác định dung môi tồn dư – DĐVN

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lá cây lá đắng Cây lá đắng đã được giám định bởi ThS Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội và tên khoa

học là Vernonia amygdalina Del., họ Cúc Asteraceae

- Cao chiết ethanol 70% của lá cây lá đắng

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu

- Cân kỹ thuật Precisa

- Tử sấy Memmert

- Bình nón, bình định mức, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm và các dụng cụ thủy tinh khác

- Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Limonat 5 (Camag – Switzeland): (hình 2.1)

 Thiết bị phun mẫu Limonat 5

 Thiết bị chụp ảnh Camag

 Phần mềm: WinCats, Videoscan

(1) (2)

Hình 2.1 Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5

(1) Thiết bị phun mẫu Linomat 5

(2) Thiết bị chụp ảnh Camag

- Bản mỏng silicagel 60GF254 (Merck), cốc chạy sắc ký, bình phun thuốc hiện màu

- Máy đo quang UV HITACHI U-1800

- Micropipet 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl

- Máy cất quay thu hồi dung môi Buchi Rotavapor R-200

- Bếp cô cách thủy BATHS

- Thuốc thử trong phản ứng hóa học: thuốc thử Fehling A, Fehling B; thuốc thử Buchardat, Dragendoff, Mayer; thuốc thử Lugol, Cianidin; dung dịch NaOH, dung dịch FeCl3, acid Sulfuric, acid Clohydric…

- Thuốc thử hiện màu: amoniac

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Điều chế cao chiết ethanol lá đắng

Nghiên cứu bào chế cao từ dược liệu lá đắng: chiết xuất bằng ethanol 70%

2.2.2 Nghiên cứu/ khảo sát thành phần hóa học cao chiết ethanol lá đắng

Định tính, bán định lượng thành phần hóa học của cao

2.2.3 Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao chiết ethanol lá đắng

- Tính chất

- Độ ẩm

- Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm

- Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Bán định lượng luteolin trong cao bằng HPTLC

2.2.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol lá đắng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp điều chế cao

- Phương pháp xác định độ ẩm: độ ẩm dược liệu, độ ẩm cao

- Phương pháp cảm quan: đánh giá cao

- Phương pháp định tính: bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm, bằng

Cô dịch lọc đến thể chất cao đặc, bảo quản trong 2 lớp túi PE Tính hiệu suất chiết

 Xác định hiệu suất điều chế cao:

Hàm lượng cao ( tính theo khối lượng cao khô và dược liệu khô) – H (%):

( ) ( )

( )Trong đó:

tủ sấy hoặc 6 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg Công thức tính hàm ẩm:

Trong đó:

m (g): khối lượng dược liệu (cao) ban đầu

m0 (g): khối lượng dược liệu (cao) sau khi sấy đến khối lượng không đổi

2.3.3 Phương pháp cảm quan

Đánh giá cao đặc về thể chất, màu sắc, mùi vị [3]

2.3.4 Phương pháp định tính

2.3.4.1 Định tính các thành phần trong cao bằng phản ứng hóa học

Các nhóm chất hữu cơ được định tính bao gồm [11]:

 Định tính alcaloid:

Cân khoảng 2 g cao, hòa tan vào 20 ml nước cất, lọc vào bình gạn, kiềm hóa bằng NH4OH đặc đến pH = 8-9, lắc với CHCl3 3 lần, mỗi lần 10 ml Gộp các dịch chiết CHCl3 Lắc, chiết với dung dịch H2SO4 1N (3 lần x 10 ml) Gạn lấy lớp dịch acid, chia 3 phần vào 3 ống nghiệm

- Phần 1: thêm 2-3 giọt TT Mayer, tạo tủa trắng (+)

- Phần 2: thêm 2-3 giọt TT Dragendroff, tạo tủa vàng cam đến đỏ (+)

- Phần 3: thêm 2-3 giọt TT Bouchardat, tạo tủa nâu đến nâu đen (+)

- Lấy một lượng cắn, hoà tan với 5ml nước trên bếp cách thuỷ Chia đều vào 2 ống nghiệm

 Ống 1: thêm 2ml dung dịch HCl 0,5N

 Ống 2: thêm 2ml dung dịch NaOH 0,5N

Lắc mạnh trong 1 phút, quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống:

 Bọt ở 2 ống tương tự nhau: saponin triterpen

 Ống 2 cao hơn 2-3 lần ống 1: saponin steroid

- Phản ứng Rosenthaler: Hoà tan cắn trong ống nghiệm với 1ml dung dịch vanilin 1% trong ethanol Thêm vào một giọt HCl đậm đặc Hơ

nóng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn thì dung dịch xuất hiện màu tím hoa cà

- Phản ứng với chì acetat: cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm Thêm 2 giọt chì acetat 10%, nếu có tanin xuất hiện tủa bông trắng

 Định tính nhóm flavonid:

Cân khoảng 5 g cao vào cốc có mỏ, pha loãng bằng 50 ml nước cất, lọc

Dịch lọc đem lắc với n-hexan để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 15 ml n-hexan Dịch chiết nước thu được lắc với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 15 ml Gộp các dịch chiết lại, bốc hơi dung môi, cắn thu được hòa tan trong 10 ml ethanol

90% để làm phản ứng định tính

- Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết Ethanol, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Dung dịch chứa flavonoid sẽ có màu sắc thay đổi, đậm màu hơn hoặc đổi màu

- Phản ứng Shinoda: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết ethanol Thêm 1 ít bột magnesi kim loại, sau đó nhỏ vài giọt HCl đậm đặc Dung dịch có màu từ cam, hồng, đỏ tới tím

- Phản ứng với acid Sulfuric: Lấy 2ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt acid Sulfuric đặc Hợp chất flavon và flavonol sẽ cho màu vàng đậm

Chalcon hay auron cho màu đỏ và đỏ xanh Flavanon cho màu cam –

 Định tính đường khử:

Cân khoảng 2 g cao, hòa tan vào 10 ml nước nóng, lọc lấy dịch lọc Cho 2

ml dịch lọc vào ống nghiệm Cho TT Fehling A và B vào, đun nóng Nếu có đường khử sẽ xuất hiện kết tủa đỏ gạch

 Định tính coumarrin:

Đun cách thủy trong bình nón chứa 5 g cao với 30ml ethanol 90%, lọc

nóng qua giấy lọc, dịch thu được đem làm các phản ứng mở đóng vòng

- Thêm vào ống một vài giọt dd HCl đặc, ống 1 sẽ đục trở lại như ống 2 (phản ứng dương tính)

2.3.4.2 Định tính flavonoid và luteolin bằng sắc ký lớp mỏng

- Dung dịch thử: lấy 5 g cao lá đắng, hòa tan trong 40 -50 ml nước nóng, lọc hút chân không Lắc dịch với diethyl ether 3 lần loại tạp (mỗi lần 10 ml), gạn lấy dịch nước Sau đó lắc dịch nước với ethyl acetat 3 lần (20 – 15 – 15 ml), gạn lấy dịch ethyl acetat Cô dịch đến cắn, hòa tan cắn với 2 ml ethanol (lắc siêu âm để hòa tan)

- Dung dịch đối chiếu: hòa tan chính xác khoảng 0,5 mg luteolin trong chính xác khoảng 2 ml ethanol (lắc siêu âm để hòa tan)

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60GF254 (Merck), 4 x 10 cm, hoạt hóa ở

110oC trong 1 giờ

- Pha động: n-hexan : ethyl acetat : acid formic = 20:19:1

- TT hiện màu: amoniac

2.3.5 Phương pháp bán định lượng

2.3.5.1 Bán định lượng luteolin bằng HPTLC

- Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 5 g cao lá đắng, hòa tan trong 40

- 50 ml nước nóng, lọc hút chân không Lắc dịch với diethyl ether 3 lần loại tạp (mỗi lần 10 ml), gạn lấy dịch nước Sau đó lắc dịch nước với ethyl acetat 3 lần (20 – 15 – 15 ml), gạn lấy dịch ethyl acetat Cô dịch đến cắn, hòa tan cắn với 2 ml ethanol (lắc siêu âm để hào tan)

- Dung dịch đối chiếu: hòa tan chính xác khoảng 0,5 mg Luteolin trong chính xác khoảng 2 ml Ethanol (lắc siêu âm để hòa tan)

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel 60GF254 (Merck), 4 x 10 cm, hoạt hóa ở

110oC trong 1 giờ

- Pha động: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (20:19:1)

- Quan sát ở bước sóng 254 nm

2.3.5.2 Thẩm định phương pháp HPTLC

 Độ đặc hiệu:

- Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các mẫu khác có trong mẫu thử [9]

- Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

1) Mẫu trắng: ethanol

2) Mẫu thử: dịch chiết ethanol

3) Mẫu chuẩn: luteolin hòa tan trong ethanol

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (20:19:1) Soi và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 254 nm, quan sát

- Tiến hành: Pha mẫu chuẩn luteolin 0,25 mg/ml Tiêm 6 lần mẫu chuẩn

và tiến hành sắc ký với điều kiện triển khai HPTLC ở mục 2.3.4.2 Ghi