Nghiên cứu tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao giàu saponin từ ngưu tất (achyranthes bidentata blume)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU SAPONIN TỪ NGƯU TẤT ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME KHÓA LUẬN TỐ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT

CAO GIÀU SAPONIN TỪ NGƯU TẤT

(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LAN ANH

Mã sinh viên: 1301009

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT

CAO GIÀU SAPONIN TỪ NGƯU TẤT

(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Văn Hân

2 PGS.TS Lê Việt Dũng

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Công Nghiệp Dược

2 Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Hân và thầy PGS.TS Lê Việt Dũng – người hướng dẫn cho em về lý luận cũng như những lời

khuyên quý báu trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em muốn gửi lời biết ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Tuấn Hiệp người đã dành

nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo cho em các kiến thức cơ bản và chuyên sâu, tạo mọi điều kiện học tập và nghiên cứu thuận lợi giúp em có thể hoàn thành được đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh, chị ở khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện

Dược Liệu, đặc biệt là anh Đỗ Quang Thái đã giúp đỡ cũng như góp ý cho em trong suốt

quá trình thí nghiệm Chân thành cám ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại viện

Em cũng xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô bộ môn Chiết xuất dược liệu – Công nghiệp Dược đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để đạt được kết quả như ngày hôm nay

Mặc dù em đã cố gắng để khóa luận được hoàn thiện nhất nhưng không tránh khỏi

có những sai sót trong quá trình thực hiện Vì vậy, kính mong các thầy cô và các anh chị chỉ bảo, góp ý để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Lê Thị Lan Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………

DANH MỤC CÁC BẢNG………

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ………

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về loài Achyranthes bidentata Blume 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái 2

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2.2 Phân bố, sinh thái 2

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.3.1 Thu hái 3

1.1.3.2 Chế biến, bào chế cổ truyền 3

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.4.1 Saponin 4

1.1.4.2 Phytoecdyson 6

1.1.4.3 Polysaccharid 7

1.1.5 Tác dụng sinh học 8

1.1.5.1 Theo y học cổ truyền 8

1.1.5.2 Theo y học hiện đại 8

1.2 Nhóm chất saponin 9

1.2.1 Cấu trúc hóa học và phân loại 9

1.2.2 Tính chất hóa lý của saponin 11

1.3 Các phương pháp chiết xuất saponin và ứng dụng trên Ngưu tất 11

1.4 Phương pháp đáp ứng bề mặt 14

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt 14

1.4.2 Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt 15

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 17

2.1.2.1 Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm 17

2.1.2.2 Hóa chất 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp định tính, định lượng 19

2.3.1.1 Phương pháp thủy phân saponin triterpenoid 19

2.3.1.2 Phương pháp định tính 19

2.3.1.3 Phương pháp định lượng 19

2.3.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp và dung môi chiết xuất phù hợp 20

2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết xuất saponin tổng từ rễ cây Ngưu tất 22

2.3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol 23

2.3.3.2 Khảo sát thời gian chiết 24

2.3.3.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi và dược liệu 24

2.3.4 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin 24

2.3.5 Nâng cấp lên quy mô 1kg dược liệu/mẻ 26

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Sơ bộ khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất saponin từ rễ cây Ngưu tất (Radix Achyranthes bidentata Blume) 27

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol 27

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất 28

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và dược liệu (tỷ lệ DM/DL) 29

3.2 Tối ưu quá trình chiết xuất saponin từ rễ cây Ngưu tất theo phương pháp bề mặt đáp ứng RSM 30

3.2.1 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin 30

3.2.2 Chọn phương án chiết xuất tối ưu 37

3.3 Nâng cấp ở quy mô 1kg dược liệu rễ Ngưu tất/mẻ 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography) RRLC Sắc ký lỏng phân giải nhanh (Rapid-resolution liquid

chromatography) Q-TOF MS/MS Phổ khối tứ cực thời gian bay song song (Quadrupole – time of

flight tandem mass spectrometry)

SAbP SulfatAchyranthes bidentata Polysaccharid

RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology)

CCD Thiết kế cấu trúc có tâm (Central composite design)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ Ngưu tất 5

3.1 Các mức thí nghiệm sử dụng trong mô hình RSM-CCD 33

3.3 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình tổng hợp các yếu tố 35 3.4 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 36 3.5 Kết quả chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất theo thực nghiệm và dự

3.6 Kết quả chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất trên mẻ 1kg 40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.3 Cấu trúc một số khung cơ bản nhóm Saponin triterpenoid pentacyclin 10 1.4 Cấu trúc một số khung cơ bản nhóm Saponin triterpenoid tetracyclin 10 1.5 Cấu trúc một số khung cơ bản nhóm Saponin steroid 11 1.6 Các kĩ thuật chiết xuất saponin hiện nay được sử dụng 15

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết và hàm lượng

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và dược liệu đến hiệu suất chiết và

3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết và hàm lượng

3.4 Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng hiệu suất chiết

Việt Nam chúng ta là một nước giàu tiềm năng cây thuốc Trong những năm gần đây xu hướng trên thế giới dùng thuốc từ dược liệu ngày càng tăng lên, việc nghiên cứu

và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để ngành công nghiệp dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các bài thuốc y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu

và tận dụng nguồn tài nguyên dược liệu

Cây Ngưu tất, tên khoa học là Achyranthes bidentata Blume, họ Rau dền, trồng

nhiều ở miền bắc Việt Nam Từ lâu rễ Ngưu tất đã được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền như một vị thuốc bổ, hoặc để điều trị chứng ứ máu, lợi tiểu, điều kinh nguyệt, đau xương khớp, cải thiện chức năng gan thận [45] Các nghiên cứu dược lý học hiện đại cho thấy rễ của Ngưu tất có khả năng tăng cường miễn dịch, kích thích tử cung, kháng u, chống viêm kháng khuẩn, chống loãng xương, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, hỗ trợ điều trị ung thư Thành phần chính bao gồm polysaccharid, saponin, phytoecdyson Nghiên cứu về hóa thực vật, đặc biệt là dược lý học đã chứng minh được rằng nhóm saponin oleanan là thành phần tạo ra tác dụng sinh học chính của rễ cây Ngưu tất [33], [43] Bởi tầm quan trọng như trên của saponin nên cần thiết phải xây dựng một quy trình chiết xuất để đạt được hiệu suất tối đa, đáp ứng với nhu cầu ngày càng tăng của bệnh nhân

Trên thế giới và ở Việt Nam cho đến nay đã có những nghiên cứu về chiết tách, tinh chế, định lượng saponin trong rễ Ngưu tất Tuy nhiên với mục tiêu tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin hiện chỉ có một vài nghiên cứu và đa phần tập trung theo hướng nghiên cứu tối ưu luân phiên từng yếu tố ảnh hưởng [2] Phương pháp này không phản ánh đầy đủ bản chất các quá trình xảy ra trong hệ do có sự tương tác giữa các nhân tố

Do đó nhóm tiến hành đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình chiết xuất cao giàu saponin từ Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume)” với

mục tiêu là:

1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất saponin từ rễ cây Ngưu tất

2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin từ rễ cây Ngưu tất

3 Nâng cấp quy trình chiết xuất ở cỡ mẻ 1kg

* Loài bidentata, Blume[7], [17]

Tên khoa học của cây: Achyranthes bidentata Blume

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hình 1.1: Ngưu tất – Achyranthes bidentata [14]

Cây Ngưu tất là một loại cỏ xước cho nên người ta nhầm với cây Cỏ xước

(Achyranthes aspera L) Cây thảo, sống nhiều năm, cao 1m, cũng có khi 2m Rễ củ hình

trụ dài, có nhiều rễ phụ to Thân mảnh, có cạnh, phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía Cành thường mọc hướng lên gần như thẳng đứng Lá mọc đối có cuống, dài 5-12cm, rộng 2-4cm, phiến lá hình trứng, đầu nhọn, mép nguyên [6], [36]

Cây dùng thay thế: Ở Việt Nam, các thầy thuốc y học cổ truyền và nhân dân ở

nhiều nơi đã dùng rễ cây Cỏ xước để thay thế Ngưu tất với tên Ngưu tất nam [6]

1.1.2.2 Phân bố, sinh thái

Ngưu tất có nguồn gốc từ Đông Bắc Trung Quốc hoặc Nhật Bản [12]

Ngưu tất được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam, năm 1960 Lúc đầu, cây được trồng để thuần hóa ở Sa Pa, sau chuyển sang Sìn Hồ (Lai Châu) rồi về trại thuốc Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và trại thuốc Văn Điển (Hà Nội) Cách đây khoảng 30 năm, Ngưu tất đã được trồng dưới dạng sản xuất dược liệu ở vùng ngoại thành Hà Nội và các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ Có thể coi Ngưu tất là một ví dụ điển hình về một cây thuốc có nguồn gốc ôn đới, qua quá trình nghiên cứu di thực đã có thể trồng thành công cả ở vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt đới gió mùa Điều đó cho thấy Ngưu tất là cây có biên độ sinh thái tương đối rộng, mặc dù thời vụ trồng chủ yếu vẫn là ở thời kì có nhiệt độ thấp trong năm [12]

Ngưu tất là cây ưa sáng và ưa ẩm Cây ra hoa quả nhiều hàng năm [12]

1.1.3 Bộ phận dùng

1.1.3.1 Thu hái

Người ra dùng rễ phơi hay sấy khô – Radix Achyranthes bidentate – của cây Ngưu

tất Sách cổ nói vị thuốc giống đầu gối con trâu nên gọi là Ngưu tất (ngưu là trâu, tất là đầu gối) [6]

Rễ thu hái khi cây bắt đầu úa vàng, rửa sạch, xông sinh rồi phơi hoặc sấy Rễ to, dài, dẻo là loại tốt

1.1.3.2 Chế biến, bào chế cổ truyền

a) Chế biến (Sơ chế ngưu tất sau khi thu hoạch): Đào về, cắt bỏ cây sát đầu củ,

phơi qua 1-2 ngày cho củ tái để đỡ bị giòn gãy Rửa sạch, sau đó đem xông sinh 1 ngày rồi sấy ở 40-50° cho đến độ ẩm khoảng 15-18%; sau đó phân loại, bó thành bó nhỏ để bảo quản Ngưu tất sau khi xông sinh nhuận dẻo, có màu vàng rơm nhạt, hình thức bên ngoài đẹp hơn Ngưu tất sấy khô không xông sinh [13] Kết quả nghiên cứu một số phương pháp

sơ chế và bảo quản cho thấy xông sinh là phương pháp sơ chế và bảo quản Ngưu tất tốt nhất trong điều kiện nước ta Tuy nhiên, nếu dư lượng SO2 vượt quá mức cho phép sẽ gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sử dụng và ô nhiễm môi trường [1]

b) Bào chế cổ truyền: Khi sử dụng làm thuốc theo nguyên lí y học cổ truyền

thường phải qua khâu chế biến, thường có các phương pháp chế sau đây:

- Thái phiến hoặc cắt đoạn: Ngưu tất được ủ mềm, thái phiến, vát dày 1-3mm (nếu

rễ to); cắt đoạn 3-5mm (nếu rễ nhỏ), phơi khô hoặc sấy qua để dùng [10]

- Sao cám: sao cám nóng già, bốc khói trắng; cho Ngưu tất phiến vào sao đều đến

khi có màu hơi vàng Rây bỏ cám [10]

- Trích rượu:

Ngưu tất 10kg Rượu 2kg Ngưu tất sao nóng, phun rượu vào đảo đều, sao đến khô Hoặc tẩm Ngưu tất vào rượu; ủ 30 phút đến 1 giờ cho ngấm rượu, sau đó sao tới khô [10]

- Ngưu tất thán: đem Ngưu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong

vàng nâu đậm; có thể trích rượu rồi sao đen như trên [10]

- Ngưu tất sao đen: lấy Ngưu tất phiến, dùng lửa nhỏ sao đến khi xuất hiện các

chấm đen[10]

- Ngưu tất trích muối:

Ngưu tất phiến 10kg

Muối hòa thành dung dịch đem tẩm vào Ngưu tất; ủ 30 phút, sao khô [10]

Nghiên cứu cho thấy hàm lượng saponin toàn phần theo UV ở mẫu chế (trích rượu

và trích muối) cao hơn mẫu xông sinh, và ở mẫu trích muối là cao nhất Điều này cho thấy có sự ảnh hưởng của các phương pháp chế biến khác nhau đến hàm lượng saponin [11]

1.1.4 Thành phần hóa học

Saponin, polysaccharid, và phytoecdyson là 3 thành phần chính trong rễ cây Ngưu tất[32], [43], [45], [56].Ngoài ra gần đây đã có nghiên cứu phân lập được một feruloyl tyramin

glycosid mới, đó là N-trans-feruloyl-3-methoxytyramine-4´-O-β-D-glucopyranosid góp phần

làm giàu cho thành phần rễ cây Ngưu tất

Trong rễ còn có betatin với hàm lượng 0,930-1,029% đã được chứng minh là ổn định trong quá trình chế biến [6], [32]

1.1.4.1 Saponin

Rễ Ngưu tất chứa 4,04% saponin toàn phần theo phương pháp UV [6], trong đó chủ yếu là triterpenoid mà khi thủy phân cho ra genin là acid oleanolic

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin triterpenoid trong rễ Ngưu tất[43]:

Khung cấu trúc chung của một số saponin trong rễ Ngưu tất

8 Achyranthosid C butyl dimethyl

3-[1-Carboxy-1-(carboxymethoxy)methy] -Glc Glc

11 Achyranthosid E butyl methyl

Phương pháp sắc ký lỏng siêu tới hạn (Supercritical Fluid Chromatography – SFC)

đã được sử dụng để xác định hàm lượng acid oleanoic (1) trong Ngưu tất Lượng acid

oleanoic trong rễ cây Ngưu tất là 1,75-2,19% [50]

Cùng với đà phát triển mạnh mẽ của công nghệ hiện đại, năm 2010 đã ứng dụng một phương pháp RRLC với Q-TOF MS/MS để sàng lọc và xác định một cách nhanh

chóng và hiệu quả 22 loại saponin oleanan ở Achyranthes bidentata, bao gồm cả những

saponin oleanan chưa được biết đến [33] Bảng 1.1 đưa ra 15 loại saponin triterpenoid olenane (2-16) đã biết, thuộc nhóm monodesmosid và bisdesmosides oleanane mà cấu

trúc gồm một phân tử axit oleanolic và 1-4 phân tử axit glucuronic, glucose hoặc rhamnose [43]

Gần đây nhất năm 2016, LiuYang phân lập thêm được một chất mới, gọi tên là niuxixinsteron

D (28) [53] Cấu trúc của các hợp chất được xác định như sau:

Hình 1.2: Cấu trúc một số phytoecdyson trong rễ Ngưu tất

1.1.4.3 Polysaccharid

Polysaccharid trong rễ cây Ngưu tất với tỷ lệ 42g/2000g (tính theo dược liệu khô kiệt), là một fructan mạch ngắn [6]

Achyranthes bidentata polysaccharid (AbP) là một polysaccharid tan trong nước có

trọng lượng phân tử thấp Cấu trúc bao gồm fructose và glucose MW 1400D theo tỷ lệ mol 8:1 với liên kết 2,1-fructose, 2,1-fructose, 1,2,6-fructose, 2 đầu còn lại là fructose và glucose[59]

Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy rằng AbP có thể tăng cường hệ thống miễn dịch, hạn chế di căn khối u, tăng số lượng bạch cầu, bảo vệ tế bào gan và kích hoạt các đại thực bào trên người [35] Sự biến đổi hóa học của các polysaccharid đã tạo ra các dẫn chất mới, cho phép ứng dụng điều trị ở phạm vi rộng hơn, trong đó bao gồm sulfat polysaccharid, là một dẫn chất hydroxyl của AbP bởi nhóm sulfat [52]

1.1.5 Tác dụng sinh học

1.1.5.1 Theo y học cổ truyền

Trích dẫn theo tài liệu tham khảo số [12]:

- Hoạt huyết thông kinh lạc: kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không đều

- Thư cân, mạnh gân cốt: đau khớp, đau xương sống, đặc biệt đối với khớp ở chân

- Chỉ huyết: hỏa độc bố lên gây nên ra máu, chảy máu cam

- Lợi niệu, trừ sỏi: tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra sỏi đục

- Giáng áp: cao huyết áp

- Giải độc chống viêm: bệnh bạch hầu

1.1.5.2 Theo y học hiện đại

Các nghiên cứu về dược lý học đã chứng minh được rằng các saponin oleanan tạo

ra những tác dụng sinh học chính của rễ cây Ngưu tất [33], [43]

- Tác dụng giảm đau, chống viêm: Trong nghiên cứu của Gao Chang Kun và cộng

sự, khi thiết lập các phản ứng viêm để quan sát cho thấy saponin tổng trong rễ Ngưu tất ở các liều khác nhau làm giảm đáng kể phản ứng viêm ở chuột, giảm đau, cải thiện tuần hoàn máu [24]

- Tác dụng hạ cholesterol máu: Dịch chiết nước của rễ Ngưu tất có tác dụng ức chế tạo mạch và kiểm soát trọng lượng cơ thể ở chuột được cho ăn với chế độ giàu chất béo [41]

- Tác dụng điều hòa miễn dịch: Năm 2006, Hong-Xiang Sun cũng đã làm thí

nghiệm đánh giá khả năng bổ trợ miễn dịch của Achyranthes bidentata saponin (ABS)

trên chuột được tiêm ovalbumin (OVA), cho thấy ở liều 100g có sự gia tăng đặc biệt của các kháng thể đặc hiệu OVA, IgG huyết thanh như IgG1 và IgG2b [51]

- Tác dụng trợ lực tử cung: Dịch chiết Ngưu tất có tác dụng tăng cường hoạt động các cơ trơn tử cung trên chuột đã được chứng minh trong thử nghiệm của YJ Yuan và cộng sự [55]

- Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư: hoạt động chống ung thư của saponin thu được

từ rễ Ngưu tất đã được nghiên cứu ở invivo và invitro Nghiên cứu cho thấy có sự ức chế

rõ ràng sự gia tăng của các tế bào khối u, thông qua cơ chế ngăn chặn chu trình tế bào ở GO/G1 và dẫn tế bào đến quy trình tự chết [27], [49], [51]

1.2 Nhóm chất saponin

1.2.1 Cấu trúc hóa học và phân loại

Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật Saponin gồm các chất vô định hình thường là cao phân tử, tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng

và thực tế thường gặp từ “saponification” có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh

và tiếng Pháp

a) Cấu trúc:Saponin có cấu trúc gồm 2 phần: phần đường và phần sapogenin

- Phần sapogenin: có cấu trúc triterpen với khung 30 carbon hoặc steroid với 27 carbon dẫn xuất từ khung cholestan Nhóm thế trong sapogenin thường chỉ là nhóm hydroxyl đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat

- Phần đường: Đa số saponin có từ 1-2 mạch đường Tổng số đơn vị đường trong saponin thường là 1-4 đường, tối đa có thể lên đến 11 đơn vị Đường trong saponin là các

đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose…[3]

b) Phân loại saponin: Dựa theo cấu trúc hóa học khung sapogenin có thể chia ra:

saponin triterpenoid và saponin steroid

- Saponin triterpenoid: Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen Người ta chia làm 2 loại:

 Saponin triterpenoid pentacyclic: chia ra các nhóm: olean, ursan, lupan,

hopan (hình 1.3)

Hình 1.3: Cấu trúc một số khung cơ bản nhóm Saponin triterpenoid pentacyclin

Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12-ene, tức là β-amyrin Một vài aglycon như: acid olenanolic, hederagenin, gypsogenin

 Saponin triterpenoid tetracyclin: có 3 nhóm chính: dammaran, lanostan,

 Saponin steroid: gồm có nhóm spirostan, furostan

 Saponin steroid alkaloid: gồm có nhóm aminofurostan, spirosolan,

solanidan (hình 1.5)

 Các nhóm khác: gồm các saponin steroid có các cấu trúc mạch nhánh khác

ví dụ polydosaponin và oslandin được Jizba phân lập 1971 từ thân rễ cây

Polypodimvulgara L Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt, α-spinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) [3]

Hình 1.5: Cấu trúc một số khung cơ bản nhóm Saponin steroid

1.2.2 Tính chất hóa lý của saponin

Sự phức tạp về cấu trúc của saponin dẫn đến chỉ một số tính chất hóa lý là phổ biến đối với phần lớn các chất trong nhóm

- Saponin là những chất vô định hình, không màu tới màu trắng ngà Đa số saponin

có vị đắng, trừ một số có vị ngọt Ví dụ vị ngọt của cam thảo là do chính saponin acid glycyrrhizic, ngọt gấp 50 lần so với đường

- Saponin là những chất phân cực, tan trong các dung môi phân cực: alcol, nước, dimethyl sulfoxid, acid acetic, pyrindin, butanol, ít tan trong: aceton, ether, hexan,…tủa bởi: chì acetat, bari hydroxyl, muối amoni sulfat,…Độ tan của saponin cũng

cồn-bị ảnh hưởng bởi các tính chất của dung môi (như nhiệt độ, thành phần và pH) Thông thường, nước và cồn (methanol, ethanol) là các dung môi chiết xuất saponin phổ biến nhất Ví dụ như, trong khoảng nồng độ ethanol 30-100%, độ tan của soyasaponin Bb (soyasaponin I) là tối đa tại ethanol 60% Độ tan của gypsophia saponin tăng tỷ lệ với nhiệt độ từ 7,4 g / 100 mL tại 30°C đến 18,0 g / 100 mL tại 70°C

- Saponin có cấu trúc lưỡng cực nên là chất hoạt động bề mặt, với các tính chất tẩy rửa, nhũ hóa và tạo bọt

- Khối lượng phân tử lớn nên saponin khó bị thẩm tích

- Tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid khác

- Tùy nhóm thế mà saponin có tính acid hoặc kiềm [3]

1.3 Các phương pháp chiết xuất saponin và ứng dụng trên Ngưu tất

Trong chiết xuất saponin, các kỹ thuật thường sử dụng được chia làm 2 nhóm, đó

là công nghệ thông thường và công nghệ xanh Công nghệ thông thường bao gồm: chiết ngâm, chiết soxhlet, chiết hồi lưu; công nghệ xanh bao gồm: chiết siêu âm, chiết vi sóng, chiết bằng dung môi dưới áp lực cao Các phương pháp chiết xuất thông thường dựa vào

độ tan của dược chất từ dược liệu vào trong dung môi Do đó, thường sử dụng một lượng lớn dung môi, mặc dù đôi khi được hỗ trợ bởi nhiệt độ, khuấy cơ học hoặc lắc Trong khi

đó, các phương pháp chiết xuất xanh sử dụng hóa chất an toàn, tiết kiệm năng lượng, sử

dụng nguyên liệu tái tạo và ngăn ngừa ô nhiễm môi trường [15] Tuy nhiên các phương pháp chiết xuất này cũng tồn tại một số nhược điểm như vốn đầu tư cao, một số phương pháp khó triển khai khi nâng cấp lên quy mô công nghiệp Các nhà nghiên cứu thường chọn phương pháp chiết xuất thông thường (70%), so với công nghệ xanh (30%) mặc dù chúng sử dụng ít dung môi hơn Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất được dựa vào mục tiêu chính của nghiên cứu, tính chất, đặc điểm của dược liệu và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có để đem lại hiệu quả cao nhất [8], [21]

Để phân lập saponin mới và nghiên cứu về dược lý học, 78% và 91% các công trình trước đây đã sử dụng phương pháp chiết xuất thông thường Tuy nhiên, đối với các nghiên cứu tập trung vào phân tích định lượng và tối ưu hóa, 58% và 67% các công trình trước đây đã chọn công nghệ chiết xuất xanh Trong đó chiết siêu âm là công nghệ xanh được lựa chọn nhất trong các nghiên cứu định lượng cho thấy khả năng và hiệu quả tích cực trong việc thu được đáng kể lượng saponin[21]

Chiết ngâm là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp

xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết [44] Hiệu suất của quá trình chiết ngâm được xác định bởi hai yếu tố chính, độ hòa tan và

sự khuếch tán Do không cần dụng cụ và thiết bị phức tạp nên chiết ngâm là một sự lựa chọn phổ biến trong các nghiên cứu Yếu tố quan trọng cần quan tâm trong chiết ngâm để tăng hiệu suất đó là sự tương đồng về tính phân cực giữa hoạt chất cần chiết và dung môi Nước, ethanol, methanol là những dung môi thường được sử dụng, trong đó ethanol được dùng nhiều hơn cả vì tính thân thiện với môi trường, rẻ tiền và ít độc Thời gian ngâm có thể mất 1 vài ngày hoặc hàng tuần, vì vậy máy lắc cơ học [19] hoặc khuấy từ [47] được dùng hỗ trợ để rút ngắn thời gian chiết xuất

Hình 1.6: Các kĩ thuật chiết xuất saponin hiện nay được sử dụng [21]

Chiết hồi lưu và soxhlet có cơ chế gần tương tự nhau Trong chiết hồi lưu, dược

liệu được ngâm cùng dung môi trong một bình cầu nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết Đối với quá trình soxhlet, dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và

đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt Phương pháp này thường được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm và công nghiệp.Bởi vì dung môi được hoàn lưu liên tục, lực chuyển khối lớn hơn dẫn đến thời gian chiết ngắn hơn Việc tái sử dụng dung môi trong quá trình chiết xuất cũng làm giảm lượng dung môi cần thiết Nhược điểm của phương pháp này là dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy, tốn năng lượng để cung cấp cho quá trình cấp nhiệt

Đã có rất nhiều nghiên cứu thực hiện chiết saponin bằng cách kết hợp hai phương pháp chiết xuất Mục đích có thể là nhằm tinh chế cao chiết trước khi phân tích HPLC để

cô lập và xác định hợp chất saponin từ dược liệu Ví dụ người ta thường chiết Soxhlet trước để loại bỏ lipit từ thực vật bằng dung môi như chloroform[16] và hexane[39]sau đó chiết hồi lưu như bình thường

Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm: sóng siêu âm lan truyền trong môi trường lỏng gây

nên những dao động mạnh của các phân tử, làm xuất hiện nhất thời các bóng khí trong

Chiết ngâm 36%

Chiết hồi lưu 22%

Chiết Soxhlet 2%

Kết hợp các phương pháp chiết 10%

Chiết siêu âm

14%

Chiết vi sóng 11%

Chiết dung môi nhanh 5%

lòng chất lỏng Quá trình bóng khí hình thành và xẹp đi gây ra một số tác dụng: tạo ra các sóng va đập và lực cắt xé mạnh, tăng nhiệt độ, tạo các tia dung môi nhỏ va đập vào bề mặt pha rắn Kết quả là siêu âm làm phá vỡ một phần màng tế bào, tăng khả năng thấm của thành tế bào, giảm kích thước tiểu phân, phát sinh các kênh khuếch tán trong dược liệu và tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp Các nghiên cứu về chiết xuất dược liệu đều khẳng định siêu âm rút ngắn đáng kể thời gian chiết, tuy nhiên khi sử dụng siêu âm phải chú ý vì

nó có thể làm biến đổi các chất do nhiệt độ tăng cao và hình thành hydroperoxyd, hoặc một số dược liệu khi sử dụng siêu âm dễ bị phân hủy Mặc dù việc chiết siêu âm thường được sử dụng để chiết xuất nhiều hợp chất sinh học, nhưng chỉ có một số ít được tìm thấy trong khai thác saponin

Chiết xuất bằng vi sóng, dùng sóng điện từ không ion hoá với dải tần số từ 0.3

đến 300 GHz Gần đây, phương pháp này đã thu hút sự chú ý do thời gian chiết xuất ngắn, sử dụng dung môi tối thiểu và cơ chế gia nhiệt đặc biệt, cho năng xuất saponin cao hơn Các tia vi sóng có thể xâm nhập vào dược liệu và tạo ra nhiệt bằng cách tương tác với các phân tử phân cực như nước bên trong vật liệu [44] Nước bên trong dược liệu hấp thụ năng lượng vi sóng dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc tế bào, và do đó tạo điều kiện cho sự khuếch tán hoạt chất sinh học vào dung môi Tuy nhiên mới chỉ có một vài nghiên cứu chiết xuất saponin sử dụng vi sóng

Nhìn chung trong chiết xuất saponin từ rễ cây Ngưu tất, các nghiên cứu trong nước

và trên thế giới thường sử dụng một số phương pháp như: chiết hồi lưu [30], [33],[36],[37], [43]; chiết ngâm [40], [58]; Soxhlet [22]

1.4 Phương pháp đáp ứng bề mặt

1.4.1 Giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề mặt

Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology: RSM) được phát triển từ những năm 50 của thế kỉ trước bởi nhà khoa học Box và đồng sự [31] Phương pháp đáp ứng bề mặt bao gồm một nhóm các kĩ thuật toán học và thống kê dựa trên sự phù hợp của mô hình thực nghiệm để các dữ liệu thực nghiệm thu được liên quan đến

thiết kế thí nghiệm [46].Mục tiêu của phương pháp là tối ưu hóa một đáp ứng (biến đầu

ra) bị ảnh hưởng bởi một số biến độc lập (các biến đầu vào) Nếu điểm tối ưu hoá (điểm cực đại hoặc cực tiểu) có tồn tại trong khu vực các mức của các biến đầu vào thì mô hình

bề mặt đáp ứng trong thí nghiệm RSM có thể xác định được chính xác điểm tối ưu đó

Ứng dụng kĩ thuật tối ưu RSM cần trải qua các bước sau:

Hình 1.7: Sơ đồ phương pháp RSM để thiết kế tối ưu [18]

Ưu điểm của phương pháp bề mặt đáp ứng là phản ánh được sự tương tác lẫn nhau giữa các biến đầu vào mà phương pháp tối ưu hóa đơn yếu tố không làm được, hiển thị ảnh hưởng thực của các biến lên đáp ứng đầu ra, với hiệu quả cao và chi phí thấp [9]

1.4.2 Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt

Thiết kế cấu trúc có tâm (Central composite design – CCD) là một trong những thiết kế thường gặp, được Box và Wilson đưa ra vào năm 1951 Đây là một kiểu thiết kế thí nghiệm kết hợp giữa một thiết kế toàn phần hai mức và hai loại điểm, điểm tâm và điểm trục hay “điểm sao”:

- Điểm thí nghiệm toàn phần: là các điểm của một thiết kế toàn phần hai mức, được mã hóa là -1 và 1 Các điểm này có vai trò đáng kể trong việc ước tính các thuật ngữ tuyến tính và tương tác giữa hai yếu tố

- Điểm tâm: là điểm mà giá trị của tất cả các yếu tố được thiệt lập ở mức không (trung bình cộng của mức cao và mức thấp) Nó cung cấp thông tin về sự tồn tại của độ cong trong mô hình, cho phép ước tính sai số và ước lượng thông số bậc hai trong mô hình

- Điểm trục (hay “điểm sao”): là những điểm cách điểm tâm thiết kế một khoảng α xác định, trong đó mỗi phương trên mỗi trục được xác định bởi các mức mã hoá của các yếu tố Các điểm trục rất quan trọng trong ước tính các thông số bậc hai

Hình 1.8: Hình ảnh thiết kế CCD với 3 yếu tố[4]

Giá trị của α và số lần lặp lại điểm trung tâm được chọn sao cho CCD có thể đạt được một số đặc tính mong muốn nhất định, như tính quay hoặc tính trực giao [26]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là rễ cây Ngưu tất được thu hái từ Hưng Yên Mẫu dược liệu

đã được giám định tên khoa học là Radix Achyranthes bidentata và lưu giữ tại khoa Công

Nghệ Chiết Xuất – Viện dược liệu Rễ cây sau khi thu hái được làm sạch, xông sinh, xác định hàm lượng saponin toàn phần là 2,5% theo UV

Xử lý dược liệu trước khi chiết: Cắt rễ Ngưu tất thành từng đoạn kích thước 5cm, bảo quản trong túi ni lông kín, tránh ánh sáng trực tiếp

4-Hình 2.1: 4-Hình ảnh dược liệu Ngưu tất

2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm

 Máy đo hàm ẩm OHAUS, Thụy Sỹ

 Tủ sấy Memmert, Đức

 Cân phân tích 4 số AND, Nhật Bản

 Máy UV Shimadzu, Nhật bản

 Máy cô quay, Daihan scientific Hàn Quốc

 Bếp thủy phân Cole – Parmer, Mỹ

 Thiết bị lắc

 Cồn kế

 Các dụng cụ khác: ống đong 100ml, 250ml, 1000ml; cốc có mỏ; bình nón 1000ml, 500ml; ống nghiệm; pipet chính xác các loại; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh;…

2.1.2.2 Hóa chất

Bảng 2.1: Tên hóa chất và nguồn gốc

2 Chất chuẩn acid

2.2 Nội dung nghiên cứu

Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định tính, định lượng

2.3.1.1 Phương pháp thủy phân saponin triterpenoid

- Dịch chiết được thủy phân trong môi trường acid HCl 10% với tỷ lệ dịch thủy phân:acid là 2:1 (v/v)

- Điều kiện: nhiệt độ là 85° C trong thời gian 3 giờ

2.3.1.2 Phương pháp định tính

Phương pháp: sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:

- Lựa chọn điều kiện pha động: Dicloromethan:methanol (24:1) (v:v)

- Pha tĩnh: bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck)

- Mẫu thử: dịch được thủy phân như mục 2.3.1.1 và lấy phần tủa đem hòa với ethanol tuyệt đối

- Chất đối chiếu: axit oleanolic

- Thuốc thử hiện màu: bản mỏng được nhúng thuốc thử vanilin/acid sulphuric (pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100°C và quan sát dưới ánh sáng thường Saponin cho vết màu tím trên bản mỏng

2.3.1.3 Phương pháp định lượng

Saponin toàn phần được xác định theo phương pháp so màu dựa trên nguyên tắc: phản ứng oxy hóa giữa saponin với vanillin/HClO4, HClO4 được sử dụng như là chất oxy hóa và tạo sản phẩm có màu tím đặc trưng Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng saponin được xác định ở bước sóng 550 nm Acid oleanoic được dùng làm chất chuẩn để tham chiếu

 Quy trình chuẩn bị mẫu:

- Chuẩn bị mẫu trắng:

+ Lấy chính xác 1ml methanol cho vào ống nghiệm và cô đến cắn rồi thêm 0,3 ml vanillin trong axit acetic và 1 ml HClO4 đem ủ ở 75o trong 15 phút sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic

- Chuẩn bị mẫu cần định lượng: