Nghiên cứu tính đa dạng sinh học, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây hàm ếch ( saururus chinensis lour bail, họ lá giấp saururaceae)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc điểm h nh thái thực vật của cây Hàm ếch đƣợc mô tả trong các tài liệu 3 Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch Saur

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên, các bạn đồng môn và gia đình em

Hoàn thành khóa luận này, trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và

biết ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Ơn đã chỉ bảo tận tình và trực tiếp hướng dẫn

em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là DS Phạm Hà Thanh Tùng và DS Nghiêm Đức Trọng đã luôn giúp đỡ, hướng dẫn, chia sẻ kinh nghiệm và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình em thực hiện khóa luận Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới BS Lê Thị Hồng Hạnh

- Trung tâm Sinh y dược học – Học viện quân y, DS Nguyễn Thị Thu Huế - Phòng Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, TS Thu – Bộ môn Vi sinh – Trường ĐH Dược Hà Nội đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em cho em trong suốt quá trình em làm thực nghiệm tại cơ sở

Em cũng xin cảm ơn các bạn đồng môn đã luôn giúp đỡ và trao đổi với

em để em có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận dễ dàng hơn

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc công ty Dược Hoa Linh, gia đình em, đặc biệt là chồng và con trai đã luôn bên cạnh động viên, tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành tốt khóa học

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2010

1.2.1.Khái niệm về bệnh viêm da dị ứng 12

1.3.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 15 1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN)

trong nghiên cứu đa dạng sinh học

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu tính đa dạng sinh học 25

2.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 25 2.2.1.2 Nghiên cứu dựa trên chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD

2.4.3.3 Thử tác dụng chống viêm đư ng ngoài da bằng mô h nh

gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin

3.1.1.2 Đặc điểm giải phẫu các cơ quan sinh dưỡng của HEHS 41

3.1.2 Kết quả nghiên cứu thành phần h a học hàm lượng cắn toàn

phần của phần trên mặt đ t của mẫu HEHS

50

3.1.2.1 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học phần trên

mặt đ t của mẫu HEHS

51

3.1.2.2 Kết qủa định lượng cắn toàn phần của phần trên mặt đ t

của mẫu HEHS

52

3.1.2.3 Kết qủa định lượng tinh dầu và phân tích tinh dầu của

phần trên mặt đ t của mẫu HEHS

53 3.1.3 Kết quả thử tác dụng sinh học của phần trên mặt đ t của

mẫu HEHS

56

3.1.3.1 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng n m 56 3.1.3.2 Kết quả thử độ kích ứng da 59 3.1.3.3 Kết quả thử tác dụng chống viêm đư ng ngoài da 60

4.1.1 Phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học 64 4.1.2 Phương pháp nghiên cứu h a học 64 4.1.4 Phương pháp thử tác dụng sinh học 65

4.2.1 Về nghiên cứu đa dạng sinh học 66 4.2.2 Về nghiên cứu thành phần h a học 67 4.2.3 Về nghiên cứu tác dụng sinh học 69

DANH MỤC CÁC KÝ HI U CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Ý nghĩa

AND Acid deoxyribonucleic

ALT Alanin amino transferase

AST Aspartat amino transferase

BT-20 Dòng tế bào ung thư vú

Cao HE2 Cao l ng 3:1 phần trên mặt đ t cây Hàm ếch thu hái tại Hương

Sơn chiết trong cồn 70%

DU – 145 Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt ở ngư i

ERK Kinase liên quan tới tín hiệu ngoại bào

GATA – 3 Yếu tố vận chuyển acid aminobutyric gama

GPT Glutamic pyruvic transaminase

GS/MS Gas chromatography and mass spectrometry

HA Hyaluronic acid

hACAT Acyl CoA cholesterol acyltransferase ở ngư i

HEHS Mẫu cây Hàm ếch thu hái tại Hương Sơn- Mỹ Đức- Hà Nội HepG2 Dòng tế bào ung thư gan

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngư i

HL – 60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu ở ngư i

IC100, IC50 Nồng độ ức chế sự tăng trưởng 100% (50%) tế bào ung thư

IL Interleukin

iNOS Men tổng hợp NO cảm ứng

LDL Lipoprotein tỉ trọng th p

LPS Lipopolysaccarid

m – ARN Acid ribonucleic thông tin

MAPK Kinase hoạt h a mitogen

MDA Malonyl dialdehyd

MSH Hormon kích thích tế bào biểu b tạo sắc tố

NC/Nga Phía bắc Carolina

NF - kappaB Yếu tố nhân kappaB

NSAIDs Thuốc chống viêm giảm đau không steroid

NXB Nhà xu t bản

PC3 Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

PCR Polymerase Chain Reaction

RANKL Yếu tố hoạt h a receptor của phối tử yếu tố nhân kappa B RAPD Random Amplified Polymorphic AND

RAW 264.7 Dòng tế bào đại thực bào đơn nhân trong bệnh bạch cầu ở chuột

SK – Hep – 1 Dòng tế bào ung thƣ gan

SK-BR-3 Dòng tế bào ung thƣ vú

SK-MEL-28 Dòng tế bào ung thƣ da

SOD Superoxid dismutase

SREBP Protein gắn yếu tố điều chỉnh sterol

T-47D Dòng tế bào ung thƣ vú

T98G Dòng tế bào ung thƣ u nguyên bào đệm

Th1, Th2 Tế bào T sản xu t cytokine

TLCT CCT Trọng lƣợng cơ thể chuột cống trắng

TLTK Tài liệu tham khảo

TNF Yếu tố hoại tử khối u

UV Ánh sáng tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm h nh thái thực vật của cây Hàm ếch đƣợc

mô tả trong các tài liệu

3

Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm

ếch (Saururus chinensis (Lour.) Baill)

8 Bảng 2.1 Địa điểm, th i gian thu hái và mã số tiêu bản của mẫu

Hàm ếch

23

Bảng 2.2 Các thành phần cơ bản và điều kiện của phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Các phản ứng hoá học dùng để định tính các nh m ch t 28 Bảng 2.4 Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đ phù

trong phần trên mặt đ t của Hàm ếch

Bảng 3.11 Tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột sau khi gây viêm

trong thử nghiệm tác dụng kháng viêm đƣ ng ngoài da của cao l ng HE2 tỷ lệ 3:1 trong cồn 70%

60

H nh 3.7 Đặc điểm giải phẫu bột lá HEHS 46

H nh 3.8 Đặc điểm giải phẫu bột thân HEHS 46 Hình 3.9 Hình ảnh vết AND của 5 mẫu Hàm ếch trên 7 mồi

khác nhau

48

Hình 3.10 Sơ đồ cây phả hệ của 5 mẫu hàm ếch 49 Hình 3.11 Phổ phân tích và công thức c u tạo của Myristicin 54 Hình 3.12 H nh ảnh phổ và công thức c u tạo của safrole 55 Hình 3.13 H nh ảnh các vòng vô khuẩn của mẫu thử kháng sinh

trên VSV

57

Hình 3.14 H nh biểu hiện mức độ ức chế phù viêm bàn chân

chuột ở các lô tại các th i điểm đo trong thí nghiệm thử tác dụng kháng viêm đƣ ng ngòai da của HE2

61

da và gây loãng xương loét dạ dày – tá tràng [23] Hướng tới sự an toàn trong điều trị bệnh viêm da dị ứng xu hướng trên thế giới hiện nay là t m kiếm các loại thuốc từ cây c để thay thế dần các thuốc c nguồn gốc từ Corticoid tổng hợp

Cây Hàm Ếch hay còn gọi là cây Tam Bạch Bảo (Saururus chinensis

Baill họ Lá gi p Saururaceae) phân bố tập chung ở các tỉnh vùng núi th p trung

du và đồng bằng phía Bắc là cây thuốc đã được sử dụng lâu đ i và phổ biến trong cộng đồng ở nhiều nước phương Đông như: Trung Quốc 84], Việt Nam [7], [21], v.v… để ch a nhiều chứng bệnh khác nhau nổi bật là các bệnh ngoài

da như: nhọt viêm mủ da eczema lở loét 21], v.v… Trên thế giới cho tới nay

đã c nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của Hàm ếch, trong đ đã phân lập được nhiều hoạt ch t sinh học và chứng minh Hàm ếch

c ng như các hoạt ch t phân lập được c các tác dụng sinh học như: chống viêm [47], [51], bảo vệ gan 47 72 chống hen 56 v.v… Nhiều nghiên cứu đã

chứng minh tác dụng chống viêm c ng như cơ chế chống viêm của Hàm ếch và các hoạt ch t phân lập được từ Hàm ếch Ở Việt Nam cho tới nay mới chỉ c một nghiên cứu sơ bộ về đặc điểm thực vật thành phần h a học và tác dụng chống viêm của cây Hàm ếch Tuy nhiên nh ng nghiên cứu sâu về tính đa dạng sinh học dưới loài thành phần h a học c ng như tác dụng dược lý cần thiết cho một loài thực vật c tiềm năng làm thuốc ch a bệnh viêm da dị ứng th chưa c

Để g p phần nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu c ng như c nh ng

đ ng g p nh trong quá tr nh nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Viêm da dị ứng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu tính đa dạng sinh học thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài Hàm ếch” với mục tiêu sau:

- Xác định tính đa dạng sinh học của loài Hàm ếch

- Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hàm ếch

- Nghiên cứu độ kích ứng da, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của cây Hàm ếch

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỀ LO I H M ẾCH

nh ng đặc điểm tương đồng như sau:

Cây thảo c thân rễ ngầm Thân mọc đứng phần thân c đốt c g dọc xung quanh Lá mọc so le h nh bầu dục gốc h nh tim đầu thuôn nhọn; gân 5

xu t phát từ gốc; lá ở ngọn thư ng c màu trắng; cuống lá dài khoảng 2cm c

bẹ

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông thõng xuống màu trắng; lá bắc h nh thìa; không có bao hoa; hoa lưỡng tính; nhị 6 chẵn; baoph n thuôn; lá noãn 4 dính nhau mỗi lá noãn mang 2 noãn

Quả nang; hạt h nh cầu hoặc h nh trứng nhọn

Mùa hoa quả: tháng 4 – 6

So sánh các tài liệu trên th y c sự khác nhau trong mô tả một số đặc

điểm về h nh thái thực vật Sự khác nhau này chủ yếu ở kích thước các bộ phận điều này c thể do mức độ trưởng thành của cây ở các mẫu mà mỗi tài liệu quan sát là khác nhau Tuy nhiên cần chú ý tới đặc điểm về bẹ lá lá kèm lông và các đặc điểm của hoa là các đặc điểm quan trọng giúp xác định loài (bảng 1.1)

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hình thái thực vật của cây Hàm ếch được mô tả

trong các tài liệu

Tài liệu

Đặc điểm

Từ điển thực vật thông dụng [7]

Cây thuốc

và vị thuốc Việt Nam [21]

Cây c Việt Nam [15]

Thực vật chí Trung Quốc bản điện tử [84]

Chiều cao 30 – 80 cm 30 – 70 cm > 100 cm > 100 cm Kích thước lá Dài 8-12 cm

rộng 4-5 cm

Dài 5-12cm rộng 2-6cm

Không mô tả Dài 10-20cm

Cuống hoa nhiều lông tơ

Lá bắc h nh

th a bề mặt c lông trừ phần đỉnh không lông hoặc c lông tơ

Cây Hàm ếch phân bố ở Trung Quốc Lào Thái Lan và Việt Nam [21] Ở Việt Nam vùng phân bố của Hàm ếch tập chung chủ yếu ở các tỉnh vùng núi

th p trung du và đồng bằng phía Bắc Cây thư ng mọc trên đ t ẩm hoặc trên vùng bị ngập nước không thư ng xuyên dọc theo b các khe suối mương nước ruộng hay xung quanh các vùng lầy trong thung l ng Cây ra hoa quả hàng năm; hạt thư ng phát tán theo dòng nước Cây c thân rễ phát triển mạnh phân nhánh nhiều theo chiều ngang Trồng được bằng nhánh con hay từng đoạn thân rễ [21]

1.1.2 Công dụng

Cây Hàm ếch được sử dụng ở nhiều nước phương Đông như: Trung Quốc

84 Việt Nam 7 15 21 v.v… chủ yếu trong y học dân gian ch a nhiều chứng bệnh khác nhau:

 Các bệnh về da như: nhọt viêm mủ da, eczema [15 lở loét 15], [21 viêm da dị ứng 34];

 Các bệnh phụ n như: bạch đới quá nhiều 7 86 viêm vú 15];

 Các bệnh về thận – tiết niệu như: viêm thận phù th ng 7 86 tiểu tiện kh khăn 15], [21], [85];

 Các bệnh về khớp như: th p khớp, tạng khớp 7 86 cước khí (chân sưng đau khớp xương nhức thở g p v.v…) [21];

 Một số bệnh khác như: sốt cao 76 viêm amygdale sởi 7 rắn cắn [15 viêm hạch bạch huyết ung thư gan 7 86], beri – beri tăng huyết áp 59 vàng da lậu 59 76]

Bộ phận dùng là toàn cây hoặc rễ

Liều dùng hàng ngày là 10 – 20 g [21 hoặc c thể là 15 – 30 g [86]

1.1.3 Thành phần hoá học

Trên thế giới đã c nhiều nghiên cứu được tiến hành về thành phần hoá học của Hàm ếch Các nghiên cứu đã phân lập và xác định c u trúc của nhiều hợp ch t c trong Hàm ếch thuộc các nh m ch t hoá học là: flavonoid alcaloid sterol lignan tanin và tinh dầu

 Nhóm hợp chất lignan:

Các hợp ch t được phân lập từ Hàm ếch tập trung chủ yếu vào nh m lignan-1 phân nh m của polyphenol Các lignan phân lập được trong Hàm ếch bao gồm:

- Sauchinone (1) (hình1.1), Sauchinone B [67 1’ – Epi – sauchinone

[72];

- Acid dihydroguaiaretic [24], Acid meso – dihydroguaiaretic từ phần trên mặt đ t 48 và rễ 44 57];

- Manassantin A (2) (hình 1.1) từ phần trên mặt đ t 34 và rễ 49 54

[67], Erythro, erythro – manassantin A, Threo, erythro – manassantin A [34 Manassantin B từ rễ 39], 4 - O – Demethylmanassantin A, 4 – O – Demethylmanassantin B [74];

- Saucerneol A Saucerneol B Saucerneol C từ phần trên mặt đ t 71], Saucerneol D, Saucerneol F, Saucerneol G, Saucerneol H, Saucerneol I từ rễ [54], (-) – Saucerneol methyl ether từ rễ 39];

- Saururin A từ phần dưới mặt đ t 32 Saururin B từ rễ 49 ( ) – Saururinone [67];

- Saucernetin – 7, Saucernetin – 8 từ phần dưới mặt đ t 60], (+) – Saucernetin [39];

- Machilin D từ rễ 67], Machilin D – 4 – methyl ether từ rễ 71];

- Licarin A, Licarin B [32], Acid ellagic, Galbacin [63 Di – O –

methyltetrahydrofuriguaiacin B từ phần dưới mặt đ t 71], Erythro –

austrobailignan – 6, Nectandrin B, Sarisan, Rel – (8R 8R’) – dimethyl – (7S, 7’R) – bis (3, 4 - methylenedioxyphenyl) tetrahydro – furan từ rễ 58]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số lignan phân lập được từ Hàm ếch

 Nhóm hợp chất flavonoid:

- Hyperoside (4) [55], [79], [86], Hyperin [21], [77];

- Quercetin (3) [32], [79], [86], Quercetin – 3 – O – beta – D –

glucopyranosyl (1 → 4) – alpha – L – rhamnoside [32];

- Quercitrin (5) [32], [55], [85], Isoquercitrin [32], [55], Rutin [32], [78],

[86]

Quercetin: R1=H, R2=H (3) Hyperoside: R1=H, R2=Galactosyl (4) Quercitrin: R1=H, R2=Rhamnosyl (5)

Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số flavonoid phân lập được từ Hàm ếch

- Một sterol phân lập đƣợc từ Hàm ếch là daucosterol 55]

- Một tanin đƣợc phân lập từ phần trên mặt đ t là corilagin 55]

- Toàn cây c tinh dầu c mùi thơm đặc trƣng trong tinh dầu c thành phần chính là: methyl – n – nonylcetone [21], [86], myristicin [86]

1.1.4 Tác dụng sinh học

Trên thế giới đã c nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành về các tác dụng sinh học của Hàm ếch c ng nhƣ của các hợp ch t phân lập đƣợc từ Hàm ếch Các nghiên cứu in vivo và in vitro đã chứng minh dƣợc liệu Hàm ếch c tác dụng: chống viêm bảo vệ gan chống ung thƣ giảm lipid chống oxy h a v.v… [34], [42] Các hợp ch t phân lập từ Hàm ếch đƣợc quan tâm nghiên cứu về tác dụng

dược lý là Sauchinone Manassantin A và B Saucernetin – 7 và 8, Saucerneol A

và B (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch

(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

[42]

Dịch chiết lá Ức chế sự phát triển các tổn thương da ở

chuột NC Nga c thể thông qua cơ chế điều chỉnh sự m t cân bằng Th1 Th2 bằng cách tăng đáp ứng tế bào Th1

[34]

Sauchinone Ức chế hoạt tính NF – kappaB p65 in

vitro giảm viêm đư ng hô h p do dị ứng thông qua ngăn chặn hoạt tính GATA – 3 cần cho sự tăng trưởng tế bào Th2

Saucerneol D Ức chế sự biểu hiện iNOS gây ra bởi LPS

bằng cách ngăn chặn sự hoạt hoá NF – kappaB và MAPK

[76]

Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch

(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

Độc tế bào đối với tế bào HL – 60 theo

cơ chế gây chết tế bào theo chương tr nh

[81]

Dịch chiết nước Giảm lipid trong gan và huyết tương đặc [82]

Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch

(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

n ng biệt là triglyceride ở chuột ăn giàu ch t

tr nh m t hạt nh của bạch cầu điều hoà

sự biểu hiện của IL – 4 và m – ARN eotaxin do đ c khả năng chống hen

Manassantin B Ức chế sự biểu hiện của IL – 1 beta trong

tế bào bằng cách ức chế hoạt động của cả

Bảng 1.2 Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch

(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

nM và 8 nM

[66]

Bảo vệ

xương

Sauchinone Ức chế sự h nh thành tế bào huỷ xương

gây ra bởi RANKL

[38]

(-) –Saucerneol Ức chế sự biệt hoá tế bào huỷ xương [43]

Bảo vệ

thần kinh

Sauchinone Bảo vệ các tế bào u thần kinh đệm C6

kh i cơ chế gây chết tế bào theo chương

tr nh gây ra bởi Staurosporine

1 B NH VI M DA D NG

1 .1 Khái niệm

Viêm da dị ứng là biểu hiện tổn thương da của một dạng dị ứng Bệnh c đặc trưng bởi bệnh sử gia đ nh bị hen viêm da ở trên 70% trư ng hợp Tỷ lệ mắc bệnh viêm da dị ứng đang tăng lên trên khắp thế giới chẳng hạn tỷ lệ mắc bệnh

ở học sinh Na Uy lên đến 23% 8 , [28]

1.2.2 Nguyên nhân

C nhiều nguyên nhân gây viêm da dị ứng như: Di truyền khi cả cha và

mẹ đều bị viêm da dị ứng th trên 80% các con đều c biểu hiện bệnh; nếu chỉ c cha hoặc mẹ bị bệnh th tỷ lệ mắc bệnh của các con là hơn 50% Một số gen trong đ c gen mã h a IgE là thụ thể IgE ái lực cao men trytase dưỡng bào và interleukin (IL) 4 được xem là c liên quan đến bệnh viêm da dị ứng [1], [13]

Bệnh nhân c thể c biểu hiện b t thư ng về điều hòa miễn dịch gồm c tăng tổng hợp IgE tăng IgE đặc hiệu với các yếu tố như: thức ăn dị ứng nguyên không khí vi khuẩn…; tăng biểu hiện thụ thể IgE ái lực th p trên bạch cầu đơn nhân to và tế bào B; suy giảm phản ứng quá mẫn cảm kiểu chậm; tăng đáp ứng cytokin loại II và giảm đáp ứng cytokin loại I [28]

Viêm da dị ứng còn hay gặp ở các thể bệnh: Viêm da dị ứng viêm da tiếp xúc dị ứng viêm da tiếp xúc kích thích bệnh tổ đỉa chàm h nh đồng xu lichen đơn mạn tính chàm không tiết nh n viêm da tiết bã nh n [28]

1.2.3 Biểu hiện

Các tổn thương gồm c nốt sần vết giống ban đ và mụn nước mụn nước

c thể kết tụ lại tạo thành mảng; nhiều tổn thương do nhiễm khuẩn và trầy da thể hiện thành rỉ nước và đ ng vảy [1] Trên 50% bệnh nhân viêm da dị ứng có biểu hiện trong vòng một năm đầu sau khi sinh và 80% c biểu hiện bệnh cho đến 5 tuổi; trong đ khoảng 80% số bệnh nhân về sau c biểu hiện mắc thêm các bệnh viêm m i dị ứng hoặc hen Ở trẻ sơ sinh c thể bệnh đặc trưng là vết đốm viêm rỉ nước và màng đ ng vảy xu t hiện trên mặt cổ và bẹn Trong khi ở trẻ

em và thiếu niên thể bệnh lại hay gặp là viêm da nếp g p nh t là ở các hố trước xương trụ và hố khoe Bệnh viêm da dị ứng c thể tự nhiên ở ngư i lớn nhưng ở trẻ em bị viêm da trên 50% c thể kéo dài đến tuổi trưởng thành Ngư i lớn mắc viêm da dị ứng thư ng c tổn thương khu trú biểu hiện dưới dạng chàm bàn tay hoặc lichen đơn mạn tính [1], [13]

Ngứa là một triệu chứng nổi bật của viêm da dị ứng và do gãi gây ra nhiều tổn thương thứ phát khác trên vùng da bị bệnh Các d u hiệu khác của viêm da dị

ứng là: xanh tím quanh miệng xu t hiện thêm một nếp g p n a dưới mí mắt dưới (đư ng Dennie) tăng số chỉ tay tăng nguy cơ bị nhiễm khuẩn da nh t là

khi bị nhiễm Staphylococcus aureus Bệnh nhân bị viêm da dị ứng thư ng c da

khô và ngứa một số trư ng hợp tăng IgE huyết thanh [28]

Bệnh lý miễn dịch cho th y tế bào T trợ giúp trí nhớ hoạt h a biểu hiện của kháng nguyên tế bào lympho da là phối tử của phân tử bám dính tế bào nội

mô chịu cảm ứng E-selectin Trong viêm da dị ứng tổn thương da cho th y c tế bào Langerhans CD 1a dương tính mang IgE Ngư i ta cho rằng nh ng tế bào này c liên quan với bệnh sinh viêm da dị ứng qua khả năng điều tiết đáp ứng quá mẫn cảm với các dị ứng nguyên của môi trư ng sống [28]

Để chẩn đoán bệnh thư ng dựa vào các tiêu chí như sau: ngứa và gãi; bệnh tiến triển nặng rồi thuyên giảm; tổn thương c đặc trưng của viêm da dạng chàm; bệnh sử c dị ứng cá nhân hoặc gia đ nh như hen viêm m i dị ứng dị ứng

thức ăn hoặc chàm; diễn biến bệnh kéo dài hơn 6 tuần [1], [13], [28]

1.2.4 Phương pháp chữa trị

Nguyên tắc điều trị bệnh viêm da dị ứng là tránh các kích thích da sử dụng hợp lý đúng chỉ định các ch t glucocorticoid tại chỗ c tác dụng th p hoặc tác dụng vừa và điều trị nhanh ch ng tổn thương da nhiễm khuẩn thứ phát [1], [8], [28]

 Các thuốc có nguồn gốc Corticoid

Các loại thuốc nguồn gốc Corticoid sử dụng trong điều trị Viêm da dị ứng

c 2 dạng: Thuốc bôi dùng tại chỗ và thuốc uống dùng toàn thân

Các loại thuốc bôi Corticoid c tác dụng chống viêm làm co mạch chống tăng sinh tế bào chống ngứa được sử dụng trong điều trị Viêm da dị ứng như sau:

- Kem (dạng nh dịch c nước) áp dụng trong trư ng hợp viêm da không chảy nước c p hoặc bán c p

- Thuốc mỡ dùng trong viêm da mạn tính khi da khô ráp da dày c vảy

- Dung dịch cồn và nước dùng trong viêm da mạn tính khu trú ở da đầu

Các loại Corticoid toàn thân sử dụng trong các trư ng hợp bệnh nặng lan rộng đ da toàn thân thứ phát 28]

Nh ng điểm cần chú ý khi sử dụng thuốc bôi tại chỗ Corticoid:

- Trẻ em thư ng hay gặp phản ứng toàn thân do bôi Corticoid v diện tích

da so với cân nặng tương đối lớn hơn so với ngư i lớn và c u tạo biểu b chưa phát triển đầy đủ Loại thuốc bôi Corticoid c tác dụng mạnh chỉ dùng cho trẻ

em khi chắc chắn loại thuốc c tác dụng nhẹ và vừa ít tác dụng phụ

- Để đề phòng bệnh tái phát nặng khi dùng thuốc Corticoid loại mạnh và cực mạnh không được ngừng thuốc đột ngột phải ngừng thuốc từng bước sau khi đã lành bệnh và dùng thuốc bảo vệ da tiếp theo một th i gian n a 28]

 Các loại thuốc kháng Histamin:

Các loại thuốc kháng Histamin c tác dụng đối với tiết dịch và làm giảm ngứa C thể tiêm dưới da loại thuốc gồm c Gama globulin histamin (histaglobine) nh t là đối với trư ng hợp chàm thể tạng 1 21

 Kháng sinh:

Kháng sinh dùng đư ng toàn thân và kháng sinh bôi tại chỗ được sử dụng trong trư ng hợp nhiễm trùng thứ phát Các loại vi khuẩn thư ng gặp trong các trư ng hợp này là liên cầu và tụ cầu v vậy cần chọn các loại kháng sinh phù hợp để điều trị 1 8 13], [28]

Các loại kháng sinh bôi tại chỗ thư ng dùng là:

- Tetracyclin và dẫn ch t: Oxytetracyclin Tetracyclin

- Các kháng sinh khác: Cloramphenicol, Neomycin, Bacitracin, Gentamycin, Amikacin

1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA V O

CHỈ TH PHÂN TỬ [14] [25]

Phân tử AND chứa thông tin di truyền tự sao chép một cách chính xác thông tin di truyền cho thế hệ sau và c khả năng biến đổi được Tính đa dạng của sinh giới c thể n i là hệ quả của sự đa dạng trong tr nh tự AND Như vậy

muốn nghiên cứu và phân loại các sinh vật khác nhau bên cạnh con đư ng truyền thống là dựa vào các đặc tính về h nh thái ta nên đi vào chỉ thị phân tử

1.3.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân một tr nh tự AND b t kỳ lên một số lượng bản sao gần như vô hạn tạo nguồn vật liệu AND cho các quá tr nh nghiên cứu tiếp theo

PCR là quá tr nh khuếch đại của một tr nh tự AND đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme AND polymerase Sự khuếch đại này n i chung được thực hiện nh các quy tr nh lặp lại gồm 3 giai đoạn: Biến tính gắn mồi kéo dài chuỗi Trong dung dịch c các primer (đoạn mồi) mỗi loại sẽ bắt cặp bổ xung với đầu mạch đơn tương ứng: nh vậy 1 mạch kép AND sau phản ứng do AND polymerase thực hiện sẽ thành 2 mạch AND kép và c thể thực hiện chu kỳ mới tạo thành số AND mới theo c p số nhân 2n

sau n chu kỳ [14], [25]

C c thành phần cơ bản của phản ứng [14] [25]:

1 AND khuôn dùng trong PCR: thư ng không đòi h i c độ tinh khiết cao lượng AND khuôn thay đổi trong khoảng rộng tùy theo phản ứng; AND c thể biết trước hoặc không biết trước tr nh tự hai đầu

2 Enzyme AND polymerase bền nhiệt hoạt động tối ưu ở 720C có tác dụng tháo xoắn phân tách phá b liên kết hydro gi a hai sợi đơn tổng hợp sợi mới theo quy tắc bổ xung

3 Mồi: c chiều dài khoảng 4-10 nucleotide được thiết kế để c thể gắn vào một số chỗ trên AND nhằm cung c p đầu 3’-OH cho hoạt động của enzyme polymerase Nồng độ mồi c giới hạn bởi nếu nồng độ mồi quá cao sẽ làm tăng gắn mồi nhầm nếu th p quá sẽ gây thiếu mồi cho phản ứng

4 Đệm PCR: c chức năng cân bằng pH của môi trư ng phản ứng trong suốt chu kỳ nhiệt

5 dNTP: là tiền ch t tổng hợp AND gồm: dGTP dATP dCTP dTTP Nồng hộ dNTP tốt nh t vào khoảng 200-250µMol

6 Nồng độ MgCl2: Cần thiết cho hoạt động của AND polymerase

7 Một số thành phần khác như: Gelatin Albumin huyết thanh bò c tác dụng làm tăng độ ổn định của enzyme

C c bước tiến hành: Mỗi chu kỳ tiến hành theo 3 bước cơ bản:

8 Bước 1: Biến tính AND khuôn

Là giai đoạn làm tách hai mạch của AND tạo điều kiện cho mồi gắn vào

vị trí bổ xung Nhiệt độ biến tính từ 920C đến 950C th i gian biến tính phụ thuộc AND khuôn thư ng từ 30s đến vài phút

9 Bước 2: Lai hay bắt gặp mồi

Trong giai đoạn này nhiệt độ thư ng hạ xuống khoảng 360

C (đối với các mồi dùng trong RAPD-AND) trong 30s để cho mồi bắt cặp với các sợi đơn tại

tr nh tự bổ xung Nhiệt độ và th i gian cần thiết cho gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base chiều dài và nồng độ mồi Nếu nhiệt độ gắn mồi cao làm giảm gắn mồi nhầm và kéo dài nhầm ở đầu 3’ do đ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng

10 Bước 3: Kéo dài chuỗi

Đến giai đoạn 3 tăng nhiệt độ lên 720C trong 30s là nhiệt độ thích hợp

nh t cho hoạt động của enzyme AND polymerase bền nhiệt để tổng hợp sợi mới theo nguyên tắc bổ xung Tốc độ tổng hợp vào khoảng 35-100 nucleotide một giây Th i gian tổng hợp tùy thuộc kích thước AND sản phẩm

Dựa vào phương pháp PCR ngư i ta đã tạo ra nhiều phương pháp phân tích AND mới như: RAPD, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)…

1.3 Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN) trong nghiên cứu đa dạng sinh học [ 5]

Nguyên lý: Dựa trên phản ứng PCR sử dụng một hay nhiều đoạn mồi c

tr nh tự tùy ý gồm 6-10 nucleotide để nhân một đoạn AND giãn xoắn nào đ và đoạn AND được nhân lên này c thể phân tách và điện di trên gel được

Đặc điểm: Kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một mồi đơn – mồi này đ ng vai

trò vừa là mồi xuôi vừa là mồi ngược Mồi ngẫu nhiên thư ng là nh ng đoạn Oligonucleotide c kích thước nh (5-12 nucleotide) với AND thực vật th đoạn mồi gồm khoảng 10 nucleotide với yêu cầu tỷ lệ số nucleotide loại G C từ 70-80%

Chọn cặp mồi cần lưu ý sao cho các mồi chỉ bắt cặp và bám vào hai đầu đoạn khuôn để đoạn AND gi a các mồi c thể được nhân lên Mồi càng ngắn th khả năng bắt cặp càng cao và càng dễ thực hiện phản ứng PCR mồi càng dài th kết quả nhân gen càng chính xác Mồi phải được thiết kế để c thể nhân bản ngẫu nhiên các đoạn AND ở nhiều sinh vật khác nhau Vì vậy sản phẩm nhân bản ngẫu nhiên thư ng c tính đa dạng cao nên được sử dụng làm dầu chuẩn AND trong các nghiên cứu c u trúc di truyền đa dạng sinh học… của nhiều đối tượng sinh vật khác nhau

Tiến hành:

1 Tách chiết AND tổng số nhân AND bằng máy PCR

2 Điện di trên gel agarose hoặc gel polyarylamid

3 Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc UPGMA Cluster Gelcompar…) lập ma trận các vết

Các số liệu thu được cho th y sự gần g i hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu Hệ số đồng dạng được tính theo công thức của M Nei& Li (1979): Si j = 2Ni j/(Ni + Nj) trong đ :

- Si j: Hệ số đồng dạng

- Ni: Vạch của giống i

- Nj: Vạch của giống j

- Ni j: Vạch của 2 giống i và j Sản phẩm RAPD của các sinh vật khác nhau trên cùng một mồi là các đoạn AND c kích thước tr nh tự khác nhau và các đoạn AND c kích thước và

tr nh tự giống nhau Các đoạn AND giống nhau c tốc độ di chuyển trên gel agarose bằng nhau nên băng c kích thước bằng nhau và ngược lại Các cây

trong cùng một chi càng c nhiều băng trùng nhau th c quan hệ di truyền càng gần nhau và ngược lại chúng sẽ xa nhau nhiều về mặt di truyền Việc phân tích dựa trên sự xu t hiện của các băng giống nhau và khác nhau là cơ sở của phương pháp RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền [14], [25]

Ứng dụng: Sử dụng phương pháp trên để đánh giá đa dạng sinh học và

nguồn gốc di truyền; nhận diện thỉ thị phân tử; xây dựng bản đồ gen di truyền

Ưu, nhược điểm:

Ưu điểm:

- Phát hiện tính đa dạng đáng tin (sự m t đoạn nhiễm sắc sự thay đổi thêm bớt nucleotide xen đoạn … đều làm thay đổi kích thước đoạn nhân bản)

Bộ mồi c thể sử dụng cho các loài khác nhau

- Phương pháp tiến hành đơn giản hơn so với RFTP th i gian ngắn hơn ít tốn kém hơn (2-4 gi )

- Phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) và phân tích dòng gần đồng gen (near isogenic line): các dòng chỉ khác nhau ở một tính trạng

Nhược điểm:

- Phương pháp này r t nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng: thành phần tham gia phản ứng đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi do đ cần tuân thủ nghiêm ngặt quy tr nh điều kiện thí nghiệm lặp lại nhiều lần khoảng cách gi a hai điểm bắt cặp mồi phải thích hợp

- Không chắc chắn các đoạn c cùng kích thước từ hai mẫu AND khác nhau thực sự tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen

1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ [17]

1.4.1 Sắc ký khí

 Định nghĩa:

Là kỹ thuật chia tách trong đ các thành phần của mẫu phân tích phân bố

gi a hai pha: pha t nh với diện tích tiếp xúc r t lớn pha động c bản ch t khí

th m qua pha t nh Mẫu được làm bay hơi và được mang bởi pha động khí (khí

mang) đi qua cột Mẫu phân bố trên pha t nh l ng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ

nh t định Các thành phần của mẫu phân tách ra kh i nhau dựa trên áp su t hơi

tương đối và ái lực khác nhau của chúng với pha t nh

 Thiết bị và quá trình sắc ký

- Cột sắc ký: Sử dụng cột mao quản Cột phù hợp c đư ng kính trong

0 25mm hoặc 0 32mm

- Chiều dài cột: Cột c chiều dài trung b nh 30m là phù hợp hơn cả Với tốc

độ khí mang khoảng 1ml phút th i gian phân tích sẽ vào khoảng 30-40 phút cho

1 lần chạy mẫu độ phân giải đủ để tách tới 20 ch t

- Độ dày lớp phim: Hiện tại cột phổ biến c độ dày tiêu chuẩn của lớp phim

là 0,25µm

- Pha tĩnh: Về cơ bản c hai loại pha t nh thông dụng Loại thứ nh t ít hoặc

không phân cực c u tạo bởi polymer của siloxan như OV1 DB1 HP1 SPB1 (100% methyl poly siloxan) hay OV17 HP5 SPB5 DB5 (hỗn hợp của methyl phenyl hay cyano poly siloxan) Loại thứ hai phân cực c u tạo bởi polyethylen glycol như Carbowax 20M Superox và DB-wax

1.4.2 Một số đặc trưng của detector sắc kí khí

- Nhiễu (N): Tín hiệu do detector tự sinh ra khi không c mẫu tỷ số tín

hiệu nhiễu (S/N) đặc trưng cho hiệu năng của detector Tín hiệu nh nh t mà detetor đáp ứng với ch t phân tích phải ít nh t g p hai lần nhiễu

- Tín hiệu (S): Độ lớn tín hiệu đầu ra của detector tiêu chuẩn của tín hiệu

gồm c : Độ nhạy giới hạn phát hiện khoảng tuyến tính và khoảng động học Khoảng tuyến tính và khoảng động học: Khoảng động học là khoảng nồng

độ trong đ thay đổi nồng độ ch t phân tích sẽ làm thay đổi tín hiệu đáp ứng của detector Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đ c dự phụ thuộc tuyến tính

gi a tín hiệu detector và nồng độ ch t phân tích

1.4.3 Detector chọn lọc khối phổ (MSD: Mass selective Detector)

- Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên nguyên tắc bẻ gẫy phân tử ch t phân tích

thành các mảnh ion c tỷ số gi a khối lượng và diện tích m z xác định và đặc trưng cho ch t phân tích

- Quá trình ion hóa: C nhiều kỹ thuật ion h a nhưng kỹ thuật ion h a

bằng va chạm điện tử EI (Electron Impact) là phổ biến hơn cả Quá tr nh ion h a được thực hiện bởi sự va chạm phân tử ch t phân tích với dòng điện tử c năng lượng cao (70eV) Quá tr nh này hầu như chỉ tạo ra các ion dương sau đ các ion dương sẽ bị bẻ gẫy thành các mảnh ion c khối lượng nh hơn

- Phân tích dữ liệu: Sau khi ion h a các ion thu được bởi một lăng kính

mang điện dẫn vào trong bộ phân tích khối Ở đây các ion khác nhau được phân tách do sự khác nhau về tỷ số khối lượng hạt trên diện tích (m z) trong từ trư ng hoặc điện trư ng Thiết bị phân tích khối điển h nh trong GC-MSD là bộ tứ cực Sau khi các ion tạo thành đã được tách detector thư ng là bộ nhân điện tử loại dynod liên tục được sử dụng để đếm các ion h nh thành khối phổ Ion từ bộ phân tích khối phổ va chạm vào bề mặt bán dẫn của detector giải ph ng các điện

tử cứ như thế sẽ nhân lên thành dòng thác điện tử dẫn tới hệ số khuếch đại c thể tới 1 triệu lần D liệu c thể thu được ở hai cách: quét toàn bộ các ion hoặc chỉ lựa chọn một số ion cơ bản hay đặc trưng để quét Chế độ quét toàn bộ các ion thư ng để định tính các ch t chưa biết Hiện tại các thiết bị GC MS sử dụng máy tính c thể cập nhật trong thư viện phổ trên 350.000 hợp ch t Do m t một khoảng th i gian nh t định để quét toàn bộ các ion độ nhạy trong chế độ quét toàn bộ các ion bị giới hạn Ở chế độ chỉ lựa chọn một số ion cơ bản hay đặc trưng để quét chỉ vài ion xác định được lựa chọn để quét tốc độ thu thập số liệu

sẽ nhanh hơn tương ứng với khoảng th i gian của một pic sắc ký (1 giây) như vậy kết quả định lượng sẽ tốt hơn và độ nhạy được cải thiện nhiều

- Áp dụng: Kết hợp ưu điểm của GC và MS tính năng phân tích nhanh và

độ phân giải cao của sắc ký khí được bảo toàn MS cung c p độ nhạy cả phân tích định tính và định lượng ở mức ng ml Tuy nhiên GC MS là thiết bị phân tích

đắt vận hành phức tạp hơn sắc ký khí thông thư ng Hiện nay việc áp dụng phân tích tinh dầu trong sắc ký khí khối phổ đang trở nên phổ biến và rộng rãi

1.4.4 Phương pháp phân tích định tính:

Dưới đây là một số đại lượng đặc trưng cho định tính:

- Thời gian lưu (t R ): tR của một ch t thư ng được sử dụng để định tính n nếu như các thông số cột (chiều dài pha t nh bề dày lớp phim nhiệt độ áp su t) được gi hằng định Th i gian lưu tương đối tR so với một ch t nội chuẩn thư ng lặp lại hơn cho nên thư ng được sử dụng Tuy nhiên tR thể hiện đặc trưng cho một hệ sắc ký đối với một ch t nào đ nhưng không phải là duy nh t

v vậy không thể sử dụng tR để khẳng định về ch t

- Sử dụng detector có tính chất phổ: Chỉ c phổ mới c thể hiện đặc trưng

về ch t chính v thế phương pháp phổ biến và c tính chính xác cao là sử dụng GC-MS để định tính

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG V PHƯƠNG PHÁP NGHI N C U

2.1 NGU N V T LI U THIẾT B

2.1.1 Ngu ên vật liệu

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật: mẫu cây mang tên Hàm ếch được thu hái tại các địa điểm khác nhau Mẫu thu thập được xử lý và lưu tr tiêu bản tại phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật – Trư ng Đại học Dược Hà Nội (HNIP), chi tiết tại bảng 2.1

Bảng 2.1: Địa điểm, thời gian thu hái và mã số tiêu bản của mẫu Hàm ếch

1 Xã Hương Sơn – huyện Mỹ

Đức – thành phố Hà Nội 12/03/2010 HNIP/1812/10

2 Xã Tiến Sơn – huyện Lương

Sơn – tỉnh Hoà Bình 4/7/2010 HNIP/1813/10

3 Huyện đảo Cát Bà– thành

4 Thị tr n Gôi – huyện Vụ Bản

– tỉnh Nam Định 15/7/2010 HNIP/1815/10

5 Xã Tân Thái – huyện Đại Từ

– tỉnh Thái Nguyên 8/8/2010 HNIP/1816/10

- Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng sinh học: phần trên mặt đ t của cây Hàm ếch thu hái tại tại xã Hương Sơn – huyện Mỹ Đức – thành phố Hà Nội vào tháng 3 2010 Mẫu được s y khô ở 50oC và bảo quản trong túi b ng kín tránh ẩm

Các mẫu dùng để phân loại dựa trên đặc điểm hình thái là phần trên mặt

đ t, bao gồm: c quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản Mẫu được sử lý thực địa bằng phương pháp ướp

Là lá bánh tẻ tươi bảo quản trong túi nilon có gi y th m ẩm, bảo quản ở nhiện độ 40C nhằm tránh phân hủy AND Có 5 mẫu đã được thu hái dựa trên kết quả phân loại bằng phương pháp so sánh h nh thái

- Tủ lạnh Elextrolux (Thủy Điển)

- Máy PCR: Gene Amp PCR System 9700, thiết bị điện di Bio EAD, nguồn điện di IBI CPS 500 (Mỹ), máy cô chân không Eppentdrorf

Concentrator 5301 (Đức)

- Tông đơ điện để cạo sạch lông th

- Kéo panh bông cà băng dính y tế

- Gạc không gây kích ứng (2 5 cm x 2 5 cm) c độ dày từ 2-3 mm

- Máy sắc ký khí khối phổ Agilent 6890N kết nối với detector Agilent

5973i

 Dung môi và hoá chất:

- Dung môi h u cơ (Ethanol ether dầu hoả) Các thuốc thử định tính (NaOH 10% Gelatin 1% thuốc thử Mayer Bouchardat Dragendoff v.v…) Carragenin của hãng Sigma – Hoa Kỳ Profenid gel (Ketoprofen 2 5%) sản phẩm của công

ty AVENTIS PHARMA Pháp

- Các hóa ch t thông dụng đủ tiêu chuẩn dùng trong sinh học phân tử của các hãng như Bio – Rad (Mỹ), Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Perkin Elmer

(Mỹ), Sigma (Mỹ)

- Mồi sử dụng cho phản ứng PCR: Mycrosynth (Thụy Sỹ), Metabion

(Singapore)

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột cống trắng dòng Wistar cả hai giống trưởng thành khoẻ mạnh trọng lượng 150 20 g đạt tiêu chuẩn dùng cho thí nghiệm do Ban chăn nuôi –

Học viện Quân Y cung c p

- Th trắng, cả hai giống kh e mạnh, không có chửa hoặc đang cho con

bú, do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung c p Trọng lượng khoảng 2,0

kg

- Các động vật được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nh t

5 ngày trước khi làm thí nghiệm được cung c p thức ăn và nước uống theo tiêu

- Xác định tên khoa học: Mẫu được xác định tên khoa học theo phương pháp so sánh h nh thái đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu tại Bảo tàng Thực vật Trư ng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU) h nh ảnh mẫu tiêu bản lưu tại phòng tiêu bản Vư n thực vật New York (phụ lục 2.1.) và

tham khảo các tài liệu: Từ điển thực vật thông dụng 7 Cây c Việt Nam 10 Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam 12 Thực vật chí Trung Quốc bản điện tử 64

2.2.1.2 Nghiên cứu dựa trên chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD – PCR

Phối hợp thực hiện tại Bộ môn Sinh Y – Khoa Sinh – Trư ng Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Tổng cộng có 5 mẫu phân tích dựa trên 7 mồi (BO2, OPA15, OPA15, OPM06, S2O2, BO1, CC1-F)

Các bước tiến hành:

a/ Tách chiết AND nhân:

Yêu cầu: Số lượng AND độ tinh sạch, mức độ nguyên vẹn tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Quá trình thực hiện gồm 3 bước:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào bằng các tác nhân vật lý hay hóa học kết hợp nhiều tác nhân giải ph ng AND ra môi trư ng Cụ thể mẫu AND của các mẫu nghiên cứu là thực vật, nên sử dụng lá để chiết tách Yêu cầu là phải không nát, vụ, dập được bảo quản lạnh ở 40C Lá được nghiền với ch t CTAB (Cetyl Trime Thyammonium Bromide) để phá vỡ tế bào, giải phóng AND

+ Bước 2: Loại b tạp protein trong mẫu bằng hỗn hợp dung môi Chloroform: isoamyl (21:1)

Bước 3: Kết tủa AND bằng isopropanol Rửa AND bằng Wash I, Wash

II Hòa tan lại AND bằng EDTA pH=8

b/ Phương pháp nhân bản AND bằng PCR:

Phản ứng PCR được thực hiện ở thể tích 25 µl với thành phần được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Các thành phần cơ bản và điều kiện của phản ứng PCR

c/ Điện di trên gel agarose 5%:

Nguyên tắc phương pháp này dựa vào đặc điểm c u trúc của các acid nucleotide Đ là các đại phân tử điện tích âm chúng sẽ di chuyển về cực dương trong điện trư ng Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào hình dạng và tỷ số điện tích – khối lượng Các AND khác nhau sẽ tách ra thành từng vết riêng và được phát hiện bằng nhiều cách Gel có c u trúc mạng lưới do các dây polymer aragose hoặc polyacrylamid đan xen với nhau tạo thành Các AND phải đi qua các lỗ này

để di chuyển đến điện cực Phân tử AND nh di chuyển nhanh hơn và ngược lại

Nh đ tách được AND thành từng vết riêng theo kích thước phân tử (phương pháp rây)

AND của từng mẫu sau khi nhân bản được cho vào các giếng trên thanh agarose đưa vào điện di Thiết bị điện di được dùng là Bio RAD được cài đặt ở chế độ U=70V; I=400mA; th i gian 1 gi

d/ Phát hiện AND trên băng điện di trên gel aragose 5% theo từng mồi riêng biệt:

AND phát hiện trên gel agarose 5% bằng ch t chỉ thị ethidium bromide –

ch t phát quang dưới ánh sáng tử ngoại Sau khi chiếu tia tử ngoại trên thanh agarose xu t hiện các băng AND c vị trí và kích thước khác nhau, mật độ khác nhau sau đ được chụp lại bằng máy chuyên dụng

2.2.2 Phương pháp định tính các thành phần hoá học định lượng cắn toàn phần và định lượng, phân tích tinh dầu trong cây Hàm ếch

2.2.2.1 Định tính sơ bộ c c nh m chất h u cơ c mặt trong dược iệu bằng c c phản ứng ho học đặc trưng (bảng 2.3) [2], [12]

3 Saponin Phản ứng tạo bọt

4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger

5 Glycosid tim Phản ứng Liebermann

Phản ứng Baljet Phản ứng Legal

11 Acid amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin

12 Đƣ ng khử Phản ứng với thuốc thử Fehling A B

13 Acid h u cơ Phản ứng với Na2CO3

TT Nh m ch t Phản ứng định tính

14 Polysaccarid Phản ứng với dung dịch Lugol

15 Tinh dầu C t kéo hơi nước bằng bộ c t tinh dầu

2.2.2.2 Định ượng cắn toàn phần

Bằng phương pháp cân: Chiết xu t dược liệu bằng bộ dụng cụ Soxhlet Hàm lượng các nh m ch t định lượng bằng phương pháp cân được tính theo công thức:

X (%) = 100

) 1 ( h x b

2.2.2.3 Định lượng tinh dầu

Tinh dầu được định lượng bằng phương pháp c t kéo hơi nước [9], [24]:

sử dụng bộ dụng cụ c t tinh dầu nhẹ hơn nước

Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu được tính theo công thức

Y (%) = 100

) 1 ( h x b

2.2.2.4 Phân tích thành phần trong tinh dầu Hàm ếch [17], [24]

Sử dụng kỹ thuật sắc ký khối phổ : thư viện phổ Wiley 7n.1 và NIST 05

có 350 ngàn phổ, c u trúc ch t ; cột mao quản phân tích: HP 5MS, dài 30m,

đư ng kính 0 25mm độ dày lớp phim là 0,25µm

Điều kiện chạy sắc ký khối phổ:

- Nhiệt độ kết nối detector: 2800C

- Thể tích mẫu bơm: 1 l bơm mẫu chia dòng

- Chế độ phân tích Scan, quét các mảnh phổ có m/z từ 40 đến 550

2.2.3 Phương pháp thử tác dụng sinh học

2.2.3.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm:

Sử dụng khoanh gi y lọc khuyếch tán trên môi trư ng thạch [27] Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh – Kháng sinh, Bộ môn Vi sinh trư ng Đại Học Dược Hà Nội

a/ Nguyên tắc:

Hoạt ch t c trong chế phẩm thử khuếch tán vào môi trư ng dinh dưỡng c

vi sinh vật chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng độ Vi sinh vật chỉ thị trước khi thử được làm thành các nh dịch c khoảng 106

- 107 tế bào trong 1ml và trộn vào môi trư ng theo tỷ lệ 1% Dịch chiết Hàm ếch được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đ a môi trư ng nuôi c y Sau th i gian nuôi c y thích hợp (24 gi ) đo đư ng kính vùng ức chế để đánh giá khả

năng ức chế vi sinh vật của mẫu nghiên cứu 27].:

b/ Chủng vi khuẩn:

- Sử dụng 10 chủng vi khuẩn gồm 5 chủng Gram ( ): Bacillus subtilis ATCC 6633 viết tắt là B.S ; Bacillus cereus ATCC 9946 viết tắt là B.C ; Sarcina lutea ATCC 9341 viết tắt là S.L ; Staphylococcus aureus ATCC 1128 viết tắt là Sta và Bacillus pumilus ATCC 10241 viết tắt là B.P Và 5 chủng Gram (-) : Shigella flexneri DT 112 viết tắt là Shi ; Salmonella typhii DT 220 viết tắt là Typh ; Escherichia coli ATCC 25922 viết tắt là EC.; Proteus

mirabilis BV 108 viết tắt là Pro Và Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt

là Pseu

- Vi n m : Candida albican

c/ Môi trường nuôi cấy:

- Môi trư ng 1 (MT1) : môi trư ng canh thang nuôi c y vi khuẩn kiểm định bao gồm :

Natri clorid 0,5% Nước vừa đủ 100ml

- Môi trư ng 2 (MT2): môi trư ng thạch thư ng, bao gồm:

+ Mẫu Hàm ếch đƣợc chiết ngâm lạnh với cồn 960 trong 3 ngày gộp dịch chiết cô thành cao l ng 3:1 (Cao HE3)

- Chuẩn bị mẫu chuẩn

Dung dịch penicillin G 28 UI = 18 m ml

+ Dung dịch gentamicin 20UI = 20 g ml

- Chuẩn bị khoanh gi y thử

Đục các khoanh gi y lọc c đƣ ng kính D = 6mm khối lƣợng từ 33 5 – 34,0mg

+ Các khoanh gi y lọc vô trùng và đƣợc s y khô

Tẩm các dịch thử vào khoanh gi y lọc đã tiệt trùng sau đ s y khô khoanh

c/ Tiến hành:

- Chuẩn bị môi trƣ ng và c y VSV kiểm định: VSV kiểm định đƣợc nuôi

c y vào môi trƣ ng canh thang Sabouraud rồi nuôi c y cho phát triển trong tủ

m 370C trong th i gian 18-24 gi đến nồng độ khoảng 107

tế bào ml (kiểm tra bằng pha loãng và dẫn dịch chuẩn) Môi trƣ ng thạch thƣ ng và sabouraud đặc

vô trùng (tiệt trùng ở 1180C trong 30 phút) đƣợc làm lạnh về 45-500C và đƣợc

c y giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2 5ml 100ml Lắc tròn để VSV phân tán đều trong môi trƣ ng thạch thƣ ng rồi đổ vào đ a petri vô trùng với thể tích 20ml đ a và để cho thạch đông lại