Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm của hoa cây kim ngân (lonicera japonica thump caprioliaceae) kết hợp với anpha chymotrysin

Theo Vũ Triệu An và một số tác giả khác thì viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền tảng của nó là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần trong qu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ■ ■ ■ a BỘ Y TÊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ■ ■ Dược ■ HÀ NỘI■

GÓP PHẤN TìM HIểU TÁC DỤNG

CHỐNG VIÊM CỦA HOA CÂY KIM NGÂN

{LON/CERA JAPON/CA THUNB CAPRIFOLIACEAE)

KẾT HỢP VỚI alpha-CHYMOTRYPSIN

MÃ Số: 03.02.02

LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược ■ ■ ■ HỌC■

Người hướng dẫn khoa học:

X ~ ' - N PGS TS NGUYỄN XUÂN THắ NG

: i ề f f , J ệ § ù ;

'}Jíìi xin /à y tỏ /òiưỵ fiêf (ỉn ưĩrt iịắc (ới &*8iSP &ĨP J\fỹuyẽn 0Cuđn

' ỲỷrSỪ/ t l ư ị y Ỉttỉin ( Ị ! r a n t â m , t â n / ì t t / t /trửỉitỹ d ẫ n m à ỉ t ê ĩ / t ì ỉ t y y i ú ị t < f(ỉ {<>(

/tvàtt f/tàn/t fan /tfđn tcãiỉ này.

(€ỉtử nỉtìêm f<! nữin ’lfí<iá ũn/t tuắỉitọ %ai /toe (JÌ)ỉửĩf ’ Ha ■{(!/

■ f{(f jVfii Hựày J5 //tány J nãnt 2002

(Ê íf tyê 'J JỈÙ (J}-iẽm yfo tty

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

a-CT a-chymotrypsin

ESR Erythrocyte sedimentation rate (Tốc độ lắng hồng cầu)

FKNH Flavonoid kim ngân hoa

IL Interleukin

INF Interferon

KNH Kim ngân hoa

NSAID Non-steroid anti-inflammatory drug (Thuốc chống viêm phi steroid)PAF Platelet activating factor (Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu)

TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u)

MỤC LỤC

Mở đ ầ u 1

Chương 1: Tổng quan 3

1.1 Cơ sở lý thuyết về viêm 3

1.2 Một số nghiên cứu về enzym chống viêm 12

1.3 Dược liệu có tác dụng chống viêm 15

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên c ứ u 21

2.1 Nguyên liệu 21

2.2 Súc vật thí nghiệm 23

2.3 Thiết bị dụng cụ 23

2.4 Hoá chất thí nghiệm 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 24

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả 29

3.1 Ảnh hưởng của nước sắc kim ngân hoa đối vói hoạt tính của oc-chymotrypsin 29

3.2 Ánh hưởng của Serin đối V(5i hoạt tính của a-chym otrypsin 38

3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết flavonoid kim ngân hoa toàn phần đối với hoạt tính của a-chym otrypsin 39

3.4 Kết quả thử tác dụng chống viêm cấp trong nghiên cứu 46

3.5 Kết quả theo dõi sự biến đổi của một số chỉ số hoá s in h 49

Chương 4: Bàn luận 56

Kết luận và đề xu ất 62

Tài liệu tham khảo 64

MỞ ĐẦU

Viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưởng xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh

Vì vậy, việc phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng

Việc nghiên cứu, ứng dụng các loại thuốc chống viêm như thuốc có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID) nhằm hạn chế quá trình viêm đã đáp ứng được yêu cầu đó Các thuốc này đa phần có nguồn gốc hoá dược, đã được sử dụng từ nhiều năm nay Bên cạnh tác dụng chống viêm

đa dạng và hiệu quả, chúng vẫn chứa đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, kích ứng đường tiêu hoá, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu

Chính vì vậy, các thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease (papain, a-chymotrypsin) được chế tạo từ những chất gần gũi với cơ thể con người đã và đang được nghiên cứu Các protease này có vai trò rất quan trọng trong điều trị như kích thích tiêu hoá, chống viêm và phần nào cũng khắc phục được nhược điểm của các nhóm thuốc trên

Bên cạnh đó, nước ta lại có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng góp phần vào việc nghiên cứu các thuốc chống viêm Nhiều công trình nghiên cứu

về tác dụng của dược liệu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong các dược liệu có khả năng chống viêm là các flavonoid Cây kim ngân là một

trong những cây thuốc phổ biến ở Việt nam, có thành phần là flavonoid, được

dùng như một loại thuốc chống viêm, chống dị ứng và giải độc Trên cơ sở đó,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm của

hoa cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae) kết hợp với a-

chymotrypsin

Đ ề tài được thực hiện nhằm một sô mục tiêu sau:

1 Bước đầu tìm hiểu tác dụng của kim ngân hoa đối với a-chymotrypsinJjẽn

Theo Vũ Triệu An và một số tác giả khác thì viêm là một phản ứng bảo

vệ của cơ thể mà nền tảng của nó là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần trong quá trình tiến hoá của sinh vật [4, 68]

1.1.1 Nguyên nhân gây viêm.

1.1.1.1 Nguyên nhân bên ngoài.

- Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng

-T á c nhân lý hoá học: Chấn thương, nhiệt (bỏng nóng hoặc bỏng lạnh), bức

xạ ion, tác dụng của acid, kiềm, các hoá chất [4, 68]

1.1.1.2 Nguyên nhân bên trong.

- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng

- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất gian bào [12, 6-8]

1.1.2 Phân loại viêm.

- Theo nguyên nhân: viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng

- Theo vị trí: viêm nông, viêm sâu hoặc viêm bên ngoài và viêm bên trong

- Theo thành phần dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ

- Theo tính chất:

+ Viêm không đặc hiệu, thường là viêm cấp

+ Viêm đặc hiệu, thường là viêm mạn tính, do hậu quả của phản ứng khángnguyên-kháng thể [4, 69]

1.1.3 Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.

Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau Các phản ứng này được tóm tắt

ở hình 1.1

QUÁ TRÌNH VIÊM

(Xâm nhập các tác nhân gây viêm)

PHẢN ÚNG TẠI CHỖ

Giãn, chậm tuần hoàn mao mạch

Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô

Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu

Giải phóng các chất trung gian hoá học

Hình thành cục máu đông

Tích tụ fibrin và lắng cặn

Tích tụ BC trung tính, lympho

Tăng thực bào, phá huỷ mô

Tăng enzym huyết thanh

Giải phóng enzym lysosom bào tương

Tăng a , |3, Y globulin Giảm sắt, tăng đồng Tăng glycoprotein Tăng mucoprotein

(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương)

Hình 1.1 Các phản ứng tại chỗ và hệ thống của quá trình viêm [26,28].

1.1.3.1 Các phản ứng chính tại ổ viêm.

♦> Phản ứng tuần hoàn:

Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau, phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo một trình tự sau:

• Co mạch chớp nhoáng xuất hiện ở các tiểu động mạch, xảy ra ngay khi

có tác nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn bị kích thích [4, 69]

• Sau khi co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch là hiện tượng giãn mạch Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ Nguyên nhân của hiện tượng giãn mạch là do các yếu tố sau: Hưng phấn thần kinh giãn mạch; các yếu tố thể dịch sinh ra tại ổ viêm như histamin, bradykinin, leucotrien; các cytokin (IL-1, TNF, INF-y ); các sợi liên kết ở vùng mao mạch và tiểu động mạch bị tổn thương [4, 70], [12, 53]

• Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm giầu protein vào các mô quanh huyết quản Do sự chèn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố mạch máu như liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của máu gây ứ máu làm mất tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu oxy, gây rối loạn chuyển hoá nghiêm trọng, làm tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm sàng là phù và đau) [4, 70]

♦♦♦ Phản ứng tế bào:

Phản ứng tế bào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của

cơ thể chống viêm, và trong phản ứng này bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xảy ra kế tiếp nhau

• Bạch cầu thoát mạch:

Khi dòng máu chảy chậm, bạch cầu tách ra khỏi dòng trục lăn chậm

theo vách mao mạch và tiểu tĩnh mạch rồi dừng lại ở một điểm gọi là vách tụ

bạch cầu Dưới tác dụng của các chất trung gian hoá học như yếu tố hoại tử u (TNF), interleukin-1 (IL-1), yếu tố giãn mạch prostacyclin (PGIo), yếu tố giãn

cơ nguồn gốc nội mô (Endothelium-Derived Relaxing Factor, EDRF), bạch cầu tăng khả năng bám dính vào các tế bào nội mô Sự tương tác ban đầu do L-selectin trên bề mặt bạch cầu và p, E-selectin trên bề mặt tế bào nội mô quyết định Quá trình này được tăng cường bởi integrin trên bề mặt bạch cầu với các phần tử kết dính nội bào ICAM 1 và 2 (Intracellular Adhension Molecule) của các tế bào nội mô [23, 1453] Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn những chân giả vào

kẽ hở giữa các tế bào nội mô Chúng xuyên qua vùng nối đã dãn rộng giữa các

tế bào nội mô để xen vào giữa tế bào nội mô và màng đáy, và từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch [29, 351-354]

Hiện tượng bạch cầu di chuyển tới ổ viêm được gọi là hiện tượng hoá ứng động Tác dụng này là do ổ viêm có một số chất có tác dụng gây hoá ứng động: các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có các acid amin tận cùng là N- formyl-methionin), các thành phần của hệ thống bổ thể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b, 6, 7), các sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic theo đường lipoxygenase hoá (đặc biệt là leucotrien B4), các cytokin, các mảnh vụn sợi tạo keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào, fibrin và các sản phẩm phân huỷ của fibrin [1,252], [12, 64]

• Thực bào và mất hạt:

Thực bào là hiện tượng bạch cầu nuốt và tiêu huỷ đối tượng thực bào Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng thực bào của chúng tăng lên rõ rệt

Trước tiên, các tiểu phần bị thực bào dính vào bề mặt bạch cầu nhờ sự nhận biết của bạch cầu Các bạch cầu và đại thực bào có thể dính trực tiếp với tác nhân nhiễm trùng hoặc do ái lực giữa hai bề mặt Tuy nhiên, phần lớn các

vi sinh vật không bị nhận biết cho đến khi chúng bị bao bọc bởi các yếu tố được gọi là opsonin, các chất này gắn với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt bạch cầu Có hai opsonin chính: thứ nhất là đoạn Fc của phân tử IgG (bị bộc lộ khi IgG gắn với kháng nguyên đặc hiệu) sẽ dính với receptor FcyR trên màng bạch cầu Thứ hai là thành phần C3b và thành phần ổn định của nó là C3bi (được sinh ra do hoạt hoá bổ thể bởi cơ chế miễn dịch và không miễn dịch) sẽ gắn với các receptor 1, 2, 3 của bổ thể (CR1, 2, 3) [12, 68-69]

Sau khi dính với đối tượng thực bào, bào tương của đại thực bào tạo thành một màn bao vây quanh đối tượng, giới hạn hố thực bào với màng các hạt lysosom Các thành phần của hạt đổ vào hố thực bào, đại thực bào mất hạt dần Khi đó có thể có các khả năng sau xảy ra: Đối tượng thực bào bị tiêu đi bởi các men hydrolase acid; đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ mà tồn tại lâu trong tế bào hoặc theo thực bào đi đến nơi khác gây ra những ổ viêm mới; đối tượng thực bào bị nhả ra; đối tượng thực bào cũng đủ độc để làm chết thực bào [4, 72],

1.13.2 Các phản ứng hệ thống và sự thay đổi của các chỉ sô hoá sinh

Sau khi hiện tượng viêm xảy ra, toàn thân sẽ có những biến đổi Những biểu hiện xảy ra rõ nhất như đau, mất ngủ, ăn không ngon, tăng phân giải protein, hạ huyết áp, rối loạn chuyển hoá đường, mỡ [4, 73]

Sốt là biểu hiện nổi trội nhất của viêm, nhất là khi viêm kết hợp với nhiễm trùng Các chất trung gian hoá học như prostaglandin Ej và Et được chế tiết dưới kích thích của interleukin-1, tác động lên trung tâm điều nhiệt tại vùng dưới đồi (Hypothalamus) gây sốt [32, 310] Đặc biệt đáng chú ý là sự thay đổi về các chỉ số của máu:

Tăng bạch cầu là hiện tượng phổ biến của phản ứng viêm, đặc biệt là viêm do nhiễm trùng Bạch cầu thường tăng tới 15000-20000 trong lm l máu nhưng cũng có khi còn tăng cao hơn Phần lớn các trường hợp viêm là tăng bạch cầu đa nhân trung tính và lympho bào [12, 121], [26, 28].

Protein huyết thanh được chia thành hai loại chính là albumin và globulin Bằng phương pháp điện di, globulin tách thành các thành phần a ,, a?, f3 và y Từ đó tính được tỷ số albumin/globulin (A/G) Bình thường, tỷ số A/G ở người từ 1,3-1,8 Trong viêm, tỷ số này giảm rõ rệt do giảm albumin, tăng các thành phần globulin, đặc biệt là globulin [3 và Ỵ Ngoài ra, trong các trường hợp viêm, người ta thấy có sự tăng của fibrinogen, tăng protein c phản ứng [10, 846-853], [ 19, 29-47],

Các mucoprotein tăng [26, 28]

Nguyên tố vi lượng trong huyết thanh có sự giảm của sắt, tăng đồng [26, 28]

1.1.4 Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm.

Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hoá học được giải phóng ra, duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm Những chất này có nguồn gốc huyết tương, tế bào và tổn thương mô Các chất trung gian hoá học gồm có:

1.1.4.1 Các amin hoạt mạch.

Histamin được giải phóng ra do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích: tổn thương vật lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịch gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các độc tố gây phản vệ (C3a và C5a), các protein giải phóng histamin xuất phát từ các bạch cầu, các neuropeptid, các cytokin (IL-1, IL-8) Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch của các tiểu tĩnh mạch [12, 82- 83], [16,76-77], [33, 121-122]

Serotonin giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích khi kết dính với sợi tạo keo, phức hợp kháng nguyên-kháng thể, yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF) Nồng

độ serotonin tăng trong máu khi viêm Serotonin có tác động tương tự như histamin [2, 10]

1.1.4.2 Các protease của huyết tương.

Hệ thống bổ thể, trong đó đặc biệt là các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin bởi các dưỡng bào C5a hoạt hoá đường chuyển hoá lipoxygenase của acid arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng tiếp các chất trung gian hoá học của viêm C5a còn là tác nhân hoá ứng động mạnh với bạch cầu C3b có chức năng hoạt hoá lympho B và T để tham gia vào quá trình viêm [1, 250], [12, 84-85]

Hệ thống đông máu và tiêu fibrin: Hệ thống đông máu là một loạt những protein của huyết tương có thể bị hoạt hóa bởi yếu tố Hageman Bước cuối cùng của quá trình là sự chuyển fibrinogen thành fibrin do tác động của thrombin Trong quá trình biến đổi này, có sự hình thành của fibrinopeptid, gây tăng tính thấm thành mạch và có hoạt tính hóa ứng động đối với bạch cầu [12, 85-86],

Bradikinin, một chất gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch, được giải phóng từ a-,-globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá dưới tác dụng

của yếu tố Hageman (yếu tố XII của đường đông máu nội sinh) hoạt hoá [2,

11].

1.1.4.3 Các chất chuyển hoá của acid arachỉdonic.

Acid arachidonic được giải phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ hai enzym phospholipase Ai và diglyceridlipase Từ đó acid arachidonic chuyển hoá theo hai con đường: chuyển hoá theo đường cycloxygenase tạo prostaglandin, prostacyclin, thromboxan; chuyển hoá theo đường lipoxygenase tạo leucotrien Các chất chuyển hoá của acid arachidonic như prostacyclin và thromboxan rất quan trọng trong điều hoà đông máu Trong viêm, prostaglandin E-, làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác làm tăng tính thấm thành mạch và gây đau Leucotrien là chất trung gian tiền viêm mạnh, có tác dụng hoá ứng động bạch cầu [47, 169-176]

1.1.4.4 Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF).

PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng được sinh ra sau khi hoạt hoá phospholipase A7 và thường được giải phóng đồng thời với các chất chuyển hoá của acid arachidonic PAF hoạt hoá mạnh bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính và xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các enzym của thể tiêu, sinh oxy phản ứng và các eicosanoid [46, 2559], [52, 749]

1.1.4.5 Các cytokin.

Các cytokin là các polypeptid do đại thực bào và lympho bào tiết ra, tham gia vào phản ứng miễn dịch tế bào và cũng giữ vai trò quan trọng trong phản ứng viêm Các cytokin chính gồm yếu tố hoại tử khối u (TNF a và Ị3) và các interleukin (IL-1, IL-6, IL-8 ) Trong viêm, nồng độ các cytokin ở ổ viêm tăng cao Tác động quan trọng nhất trong viêm của các cytokin là trên tế bào nội mô, bạch cầu và gây phản ứng hệ thống [27, 618-619]

1.1.4.6 Các gốc dẫn xuất oxy tự do.

Gốc tự do oxy hình thành trong ty thể đại thực bào đã hoạt hoá Vai trò chính của chúng là tiêu huỷ đối tượng thực bào Trong viêm, khi đại thực bào

bị ly giải gây tràn gốc tự do ra ngoài tạo điều kiện cho quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào, gây tăng tính thấm thành mạch, tạo thuận lợi cho sự giải phóng acid arachidonic từ phospholipid màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hoá học [7, 9].

1.1.5 Các thuốc chống viêm.

1.1.5.1 Thuốc chống viêm steroid.

Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon của tuyến thượng thận Cơ chế chống viêm là do ức chế enzym phospholipase A2 do đó ức chế

sự tạo thành acid arachidonic từ màng phospholipid, dẫn tới ức chế tổng hợp prostaglandin Bằng thực nghiệm, đã xác định được rằng các thuốc chống viêm steroid làm ổn định màng lysosom nên ức chế sự giải phóng các enzym lysosom trong đó có phospholipase A2 [18, 632] Ngoài ra chúng còn ức chế

sự tổng hợp và giải phóng các cytokin (IL-1, IL-6, yếu tố hoại tử u-a), ức chế chức năng di chuyển, bám dính thành mạch, hoá ứng động và thực bào của bạch cầu, ức chế giải phóng histamin [27, 1470-1471],

Tuy nhiên, trong sử dụng lâm sàng nhóm thuốc này bộc lộ khá nhiều tác dụng phụ như ức chế miễn dịch, xốp xương, hội chứng suy thượng thận khi

ngừng thuốc, bệnh về cơ, giảm phát triển chiều cao ở trẻ em [21, 1877-1886],

[41,956-971]

1.1.5.2 Thuốc chống viêm ph i steroid.

Thuốc có tác dụng chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid, ngoài

ra còn có tác dụng giảm đau ngoại vi và hạ nhiệt Cơ chế chống viêm của nhóm thuốc này là ức chế enzym cycloxygenase (COX), do đó làm giảm quá trình tổng hợp các prostaglandin và thromboxan từ acid arachidonic Gần đây, người ta nhận thấy cycloxygenase có các isoenzym (COX 1 và c o x 2) Sựtổng hợp các prostaglandin tại ổ viêm là do vai trò của c o x 2 ở trạng thái sinh lý, COX 1 tham gia vào tổng hợp các prostaglandin Et và prostaglandin I,

có vai trò sinh lý trong bảo vệ thận và dạ dày Các thuốc chống viêm phi

steroid không chọn lọc, ức chế cả c o x 1 nên gây ra các tác dụng phụ: loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [27, 617-655], [30, 209-305], [31, 1207- 1216].

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN cứu VỂ ENZYM CHỐNG VIÊM.

1.2.1 Sơ lược về các enzym chống viêm.

Ngày nay, trên thế giới các enzym có tác dụng chống viêm như a- chymotrypsin, bromelain, serratiopeptidase, chymopapain, amylase được sử dụng ngày càng rộng rãi Bên cạnh các thuốc chống viêm steroid và phi steroid, các protease chống viêm có bản chất tự nhiên hơn, có ưu điểm là tương đối gần gũi với cơ thể con người nên đã phần nào giúp tránh được những tác dụng không mong muốn Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo và cơ chất rất khác nhau, nhưng các enzym này đều có khả năng chống viêm trên cả động vật thực nghiệm cũng như người [43, 837-841] Các enzym này có khả năng thuỷ phân protein, tiêu huỷ mảnh vụn sợi tạo keo, các mảnh tế bào, fibrin kết tụ tại vùng bị tổn thương làm giảm phù viêm, cải thiện khả năng lưu thông máu, phục hồi tuần hoàn mao mạch, chống rối loạn dinh dưỡng Bên cạnh đó, các enzym chống viêm có hoạt tính điều hoà các protein pha cấp (Acute Phase Protein, APP), các cytokin, các receptor kết dính [2, 14] Ngoài

ra, các enzym này còn làm giảm hoạt hoá hệ thống bổ thể, các thụ thể gây kết dính trên màng bạch cầu [7, 11] Cơ chế tác động của các enzym này còn chưa thực sự được làm sáng tỏ, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu đưa đến giả thiết rằng, tác dụng chống viêm do đặc tính điều hoà miễn dịch nhiều hơn là tác dụng thuỷ phân đơn thuần [40, 664-676]

Các enzym thuỷ phân protein dùng trong chỉ định chống viêm và phù

nề do chấn thương hoặc sau phẫu thuật Ngoài ra, chúng còn được sử dụng hỗ trợ trong các bệnh lý viêm nhiễm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhày, đờm, ức chế tiết dịch rỉ viêm

1.2.2 a-chymotrypsin.

1.2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo và tính chất.

a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein, thu được do hoạt hoá chymotrypsinogen chiết xuất từ tuỵ bò [24, 336]

a-chymotrypsin có phân tử lượng 21600, cấu tạo bởi 3 chuỗi peptid,

số lượng acid amin là 241 Quá trình hình thành oc-chymotrypsin được mô tả ở hình 1.2

a-chymotrypsin

Hình 1.2 Sự hoạt hoá chymotrypsinogen bởi enzytn phân cắt

a-chymotrypsin được tạo thành từ chymotrypsinogen, một peptid có

245 acid amin Chymotrypsinogen do những tế bào hình hạt nho của tuỵ tạo

ra Dịch tuỵ chuyển chymotrypsinogen đến tá tràng, ở đây chymotrypsinogen

được men trypsin cắt ở vị trí 15 để tạo thành 7ĩ-chymotrypsin Sau đó 2 peptid

bị phân cắt ở vị trí 14-15 và 147-148, tạo thành cấu trúc bền vững của ô- chymotrypsin ô-chymotrypsin chuyển cấu hình để thành a-chymotrypsin có

241 acid amin và 3 chuỗi polypeptid được nối với nhau bằng 2 cầu nối disulfua Việc giải phóng các enzym tuyến tuỵ đồng thời hình thành các protein ức chế trypsin [18, 138], [28, 74-75]

a-chymotrypsin thuộc loại serin-protease, có ký hiệu là E.c 3.4.21.1 trong hệ thống phân loại enzym, ưu tiên cắt các liên kết tyrosin, tryptophan, phenylalanin, leucin [25, 238]

a-chymotrypsin ở dạng kết tinh hay bột vô định hình màu trắng hay trắng vàng, tan trong nước Hoạt tính của thuốc không ít hơn 5 microkatal trong lm g (BP 1993) [24, 336-337] ở dung dịch, a-chymotrypsin có hoạt tính mạnh nhất ở pH=8 Độ ổn định tốt nhất ở pH=3 và hoạt tính bị ức chế có thể phục hồi được [37, 1689]

Ion Ca2+ đóng vai trò là chất ổn định cấu trúc và tăng cường hoạt tính thuỷ phân protein este hoá của a-chymotrypsin [44, 1196-1197]

a-chymotrypsin thuỷ phân các receptor trên màng tiểu cầu, thay hình dạng và ức chế giải phóng serotonin [35, 3213-3217] Các chất ức chế a - chymotrypsin làm gia tăng nồng độ ion Ca2+ và tăng chế tiết interleukin-2 từ lympho bào T Từ nghiên cứu này có thể giả định rằng a-chymotrypsin thúc đẩy quá trình hoạt hóa lympho bào T [22, 1253-1259].

Tác dụng thuỷ phân protein của a-chymotrypsin phụ thuộc vào trạng thái cơ chất, a-chymotrypsin chỉ thuỷ phân những protein bị biến tính mà không tác động tới các protein vẫn giữ được cấu trúc không gian từ bậc 2 trở lên [9, 15-17]

Những nghiên cứu lâm sàng về việc sử dụng các enzym thuỷ phân protein trong khoa ung thư đã cho thấy: khi sử dụng kết hợp papain, trypsin và a-chymotrypsin có thể làm giảm các ảnh hưởng có hại gây ra bởi tia X, hoá học trị liệu trong việc điều trị các khối u Các tác dụng này dường như là dựa trên tác dụng chống viêm của chúng Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của các enzym này vẫn còn chưa được biết chính xác [34, 769-780]

a-chymotrypsin có tác dụng của một enzym phân giải protein, a - chymotrypsin được dùng uống, tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ để chống viêm và điều trị một số chấn thương, với tính chất là một endopeptidase tuyến tuỵ Ngoài ra, a-chymotrypsin còn được chỉ định trong các trường hợp chống phù

nề, kháng viêm trong chấn thương, viêm nhiễm, dùng tại chỗ hoặc tiêm bắp trong các khoa: nội, tai mũi họng, phụ, ngoại (chấn thương và chỉnh hình), da liễu [18, 138]

1.3 DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM.

1.3.1 Vài nét về dược liệu chống viêm.

Từ thời xa xưa dân tộc Việt nam đã biết sử dụng các nguồn thuốc từ động vật và thực vật Trong nền y học cổ truyền Việt nam phương pháp chẩn

đoán và điều trị căn bản dựa trên học thuyết âm dương ngũ hành Trong y học

cổ truyền Đông phương có hai cách chữa bệnh khác nhau, chủ yếu dựa vào việc điều chỉnh âm dương trong cơ thể người bệnh Theo quan niệm đó thì bệnh tật là sự mất cân bằng giữa hai mặt đối lập trong cơ thể Mục đích cuối cùng của việc điều trị là khôi phục sự cân bằng về âm dương khí huyết cho cơ thể trở lại trạng thái vững mạnh bình thường Đó là cách chữa bệnh thứ nhất Phương pháp thứ hai là giải độc cho cơ thể Cơ thể có thể bị nhiễm độc bởi các tác nhân gây độc bên trong và bên ngoài cơ thể Các cây thuốc có khả năng giải độc cho cơ thể thường thuộc nhóm thanh nhiệt giải độc Nhiều vị thuốc được dùng phổ biến với mục đích trên như bồ công anh, ké đầu ngựa, cúc hoa, kim ngân hoa Các vị thuốc này được dùng để chữa một số bệnh như mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng, thấp khớp Cơ chế tác dụng của các thuốc này còn chưa được biết tường tận, song các nghiên cứu đã cho những kết quả điều trị khả quan và ít tác dụng phụ

Qua một số công trình khảo sát và nghiên cứu về nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc, các kết quả đã chỉ ra rằng: các cây này mặc dù thuộc các họ thực vật khác nhau, nhưng đều chứa các hợp chất flavonoid với hàm lượng đáng kể Do đó, có thể giả thiết nhóm flavonoid là các chất có hoạt tính sinh học và chính chúng đã gây nên tác dụng chống viêm, giải độc của các cây thuốc "Thanh nhiệt" [8, 5]

1.3.2 Giới thiệu về flavonoid.

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất tự nhiên được phân bố rộng rãi nhất trong thiên nhiên Cho đến nay đã có khoảng trên dưới 3000 chất íìavonoid biết rõ cấu trúc và tính chất Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây (hoa, quả, hạt, lá, rễ, thân rễ, vỏ cây, gỗ) Phần lớn flanovoid có mầu vàng và xanh Đây là một nhóm hoạt chất có nhiều tác dụng sinh học quan trọng

Các flavonoid có tác dụng sinh học được gọi là bioflavonoid Tác dụng sinh học của bioflavonoid rất đa dạng, trên nhiều cơ quan khác nhau Một số tác dụng sinh học của bioflavonoid có thể kể đến là:

Flavonoid làm bền vững thành mạch, có khả năng điều hòa làm giảm tính thấm thành mạch, chống lại hiện tượng thoát dịch ra khỏi lòng mạch Giả thiết cho rằng flavonoid làm mất hoạt tính của enzym O-methyl transferase, men phân huỷ adrenalin, nên kéo dài tác dụng co mạch của adrenalin [8, 19]

Flavonoid có khả năng triệt tiêu các gốc tự do Khi vào cơ thể, các flavonoid sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững và ít hoạt động hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hoá ) Tính chất chống oxy hoá của flavonoid được thể hiện thêm một số tác dụng, như tác dụng chống viêm và tác dụng bảo vệ chức năng gan Khả năng chống oxy hoá của flavonoid có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng gan, ngăn cản sự hoại tử mô gan và sự phân huỷ phospholipid màng tế bào Flavonoid có tác dụng làm ổn định màng tế bào, làm tăng sức đề kháng màng tế bào, loại trừ các tác nhân gây độc hại, giảm quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào [43, 837-841]

Flavonoid có tác dụng ức chế enzym cycloxygenase và 5-lipoxygenase,

ức chế quá trình tổng hợp các chất trung gian gây viêm như prostaglandin và leucotrien do đó có khả năng chống viêm [54, 270-277]

Flavonoid có khả năng hoạt hoá enzym histaminase vì vậy ức chế giải phóng histamin và các chất trung gian khác trong cơ chế gây ra hiện tượng viêm nhiễm, dị ứng và choáng phản vệ Flavonoid kìm hãm sự phát triển khối

u, kìm hãm hoạt tính của các enzym oxy hoá khử, hạn chế sự phá vỡ cân bằng của các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào, kìm hãm sự sinh tổnghợp protein trong các tế bào ung thư [42, 483-491]

/ ' x* s'> ’• 1 "'

Nhiều flavonoid làm giảm nhiễm trùng, khi dùng ở liều cao có khả năng làm mất hoạt tính virut nhờ tác dụng chống sao chép (antireplication) [45,521-536],

1.3.3 Cây kim ngân.

-Tên khoa học: Lonỉcera japonica Thunb., thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae

-T ên gọi khác: Dây nhẫn đông

- Bộ phận dùng: Cây kim ngân cho các vị thuốc:

+ Hoa kim ngân (Flos Lonicerae) là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân.+ Cành và lá kim ngân (Caulis cum folium Lonicerae) là cành và lá phơi hay sấy khô của cây kim ngân

- Thành phần hoá học:

+ Cây chứa tanin và một saponin

+ Hoa chứa một flavonoid là scolymosid (lonicerin) có cấu tạo luteolin-7- rutinosid, một số carotenoid (£,-caroten, Ị3-cryptoxanthin, auroxanthin)

+ Lá chứa loganin

OH

Scolymosid

^-caroten

+ Tác dụng trên chuyển hoá chất béo: Kim ngân có tác dụng tăng cường chuyển hoá các chất béo.

+ Tác dụng trên đường huyết: Đỗ Tất Lợi [11, 77] đã trích dẫn một số tài liệu nghiên cứu về Kim ngân Lonicera japonica Thunb nói rằng khi cho thỏ uống nước sắc hoa kim ngân thì lượng đường huyết tăng, hiện tượng này kéo dài 5-6 giờ mới trở lại bình thường

+ Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ: Năm 1966, ở hội thảo Cây thuốc Việt nam, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn Năng An và Bùi Chí Hiếu đã thông báo rằng, nước sắc kim ngân có khả năng ngăn ngừa choáng phản vệ trên chuột lang Khi cho chuột lang uống nước sắc kim ngân, không thấy có sự thay đổi đáng kể số lượng và hoạt tính tế bào hạt (mastocytes) ở màng treo ruột của các súc vật này Hàm lượng histamin ở phổi chuột lang bị choáng phản vệ lớn hơn 1,5 lần chỉ số này ở chuột lang bình thường hoặc ở chuột đã được uống nước sắc kim ngân trước khi gây choáng phản vệ

+ Độ độc: Cũng theo các tác giả trên, cho chuột nhắt trắng uống nước sắc kim ngân trong thời gian 7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho người (tính theo gam thể trọng), không dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong phủ tạng và 100% chuột sống sót Điều này chứng tỏ rằng, nước sắc kim ngân thực tế không độc

Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 NGUYÊN LIỆU.

2.1.1 Hoa kim ngân.

Là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japonica Thunb., thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.

Hoa cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae) được thu

hái ở xã Phụng Công, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên vào tháng 3-5 và được Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược-Hà Nội định tên khoa học Nguyên liệu sau khi thu hái được nhặt bỏ tạp chất, phơi trong râm mát và sấy

ở nhiệt độ 50-60°C đến khô.

2.1.2 Flavonoid kim ngân hoa toàn phần.

Để có được flavonoid toàn phần từ kim ngân hoa trong nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành chiết tách flavonoid toàn phần từ kim ngân hoa theo quy trình, tóm tắt như sau: Dược liệu được sấy 60-65°C trong tủ sấy một giờ, đem tán nhỏ thành bột Sau đó cân 500g bột dược liệu, chiết cách thuỷ hồi lưu bằng cồn 80° (1,51 X 3 lần) Gộp các dịch chiết thu được, cất thu hổi dung môi đến khi còn khoảng 50% thì đem cô cách thuỷ đến cắn Hoà tan cắn trong 500ml nước cất, lọc loại tạp Dịch lọc cho vào bình gạn lắc vói ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết ether không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết ether Tiếp tục chiết bằng cloroform trên bình gạn cho đến khi dịch chiết cloroform không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết cloroform Dịch nước cho vào bình gạn, chiết bằng ethyl acetat, gộp dịch chiết ethyl acetat, cô cách thuỷ hết dung môi ethyl acetat Thu được cắn flavonoid toàn phần Quy trình được thực hiện có thể mô tả như sơ đồ ở hình2.1 [6, 13][36, 78]

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết tách flavonoid toàn phần từ hoa kim ngân.

Casein hộp 100g hoá chất của Budapest Hungary.

Cân chính xác l,2g casein cho vào cốc có mỏ, thêm dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5) vừa đủ 100ml Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa đun vừa khuấy, lọc qua gạc, pH cuối cùng của dung dịch bằng 7,2

Chú ý: Dung dịch casein chỉ pha đủ dùng trong 1-2 ngày và phải được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi dùng phải lắc đều

Chuột cống trắng đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng lOOg

do trại chăn nuôi súc vật thí nghiệm Học viện quân y 103 cung cấp

2.3 THIẾT BỊ DỤNG c ụ

- Máy điện di Biometra

- Máy đo quang Trung Quốc 752

- Máy ly tâm Hettich

- Tủ lạnh

HP7 a'

- i u say

- Máy điều nhiệt Mtakutesz

- Dụng cụ đo thể tích chân chuột

- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius

2.4 HOÁ CHẤT THÍ NGHIỆM.

- Thuốc thử Gomall [20, 223]

- Dung dịch acid tricloacetic 10%

Acid tricloacetic Nước cất vừa đủ

lOg100ml

- Dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5)

Na2H P 0 4.12H20KH2P 0 4

Nước cất vừa đủ

10,745 lg 4,0827g

1000,Oml

- Dung dịch acid percloric (HC104) 1,8M [20, 303]

- Dung dịch acid phosphotungstic 5% trong acid clohydric 2N [20,303]

- Dung dịch protein chuẩn lg/1 [10]

- Các hoá chất dùng trong điện di [20, 234-235]

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.5.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzym.

2.5.1.1 Phương pháp định lượng protein bằng phản ứng Biuret [20,223] 2.5.1.2 Phương pháp xác định hoạt tinh enzym.

a ) Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân giải phóng ra các peptid

có các acid amin Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid tricloacetic Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo màu tím hồng Đo

quang phổ hấp thụ, ở bước sóng X = 530 nm, cuvet 1 cm.

Thuốc thử Ống cơ chất (ml) Ống thử (ml)

Lắc đều các ống, ủ ấm ở nhiệt độ 40°c trong thời gian theo dõi thích hợp Sau thòi gian ủ cần thiết, thêm vào ống thử 2,5ml dung dịch acid tricloacetic 10%, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm các ống lấy tủa Thêm vào mỗi ống 4ml thuốc thử Gomall, khuấy đều cho tan hết tủa Để

yên ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng X = 530 nm,

cuvet 1 cm

Chú ý:

- Xác định khả năng thuỷ phân protein của a-chymotrypsin khi kết hợp với dịch nước sắc kim ngân hoa: Kim ngân hoa được dùng dưới dạng nước sắc theo tỷ lệ 1 phần dược liệu, 10 phần nước Từ đó được pha loãng thành các nồng độ thích hợp

Ống cơ chất: thêm 0,lm l N aH C 03 2%

Ống thử: thêm 0,1 ml dịch nước sắc kim ngân hoa

- Tương tự khi xác định khả năng thuỷ phân protein của a-chymotrypsin kết hợp với dịch chiết flavonoid KNH toàn phần: cắn flavonoid KNH toàn phần được pha loãng thành các nồng độ thích hợp tạo thành dịch chiết flavonoid KNH toàn phần

Đơn vị hoạt động của enzym được tính là Katal hoặc ịiKatal (1 ịiKatal

= 10 ' 6 Katal) Katal là lượng enzym (a-chymotrypsin) xúc tác thuỷ phân 1 mol cơ chất (casein) trong thời gian 1 giây

Công thức tính kết quả như sau:

A 106 209 B

UKatal

y =

-23600 103 t m A: Lượng casein bị thuỷ phân, tính bằng mg

B: Hệ số pha loãng của dịch enzym

23 600 X 103: Trọng lượng phân tử của casein, tính bằng mg

209: Số dây nối của một phân tử casein,

t: Thời gian thực hiện phản ứng, tính bằng giây,

m: Số lượng enzym đem thử, tính bằng mg

2.5.2 Phương pháp gây viêm.

Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [51]: Tiêm 0,05ml dung dịch dextran 6% vào dưới bề mặt gan bàn chân sau của chuột

2.5.3 Phương pháp thử tác dụng chống viêm.

Sử dụng phương pháp đo độ phù chân chuột theo mô hình của Winter [51]

Đo thể tích bàn chân sau của chuột tới khớp cổ chân vào thời điểm trước khi tiêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc

- Lô chứng: Chuột không được uống thuốc gì

- Lô chuột thử dược liệu: Chuột được uống dịch chiết dược liệu bằng một kim cong đầu tù vào các thời điểm 60 phút trước khi gây viêm, 30 phút trưóc trước khi gây viêm và sau khi gây viêm 30 phút

- Lô chuột thử với oc-chymotrypsin: Sau khi gây viêm 2 giờ, chuột được tiêm màng bụng a-chymotrypsin

- Lô thử tác dụng kết hợp: Chuột được uống dịch chiết dược liệu và tiêm a-chymotrypsin vào các thời điểm như ở các lô chuột thử dược liệu và lô chuột thử a-chymotrypsin

- Lô so sánh: Chuột được uống indomethacin vào thời điểm 30 phút trước khi gây viêm

Vj : thể tích chân chuột trước khi gây viêm.V2 : thể tích chân chuột sau khi gây viêm.

Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuộttrong cùng một lô và sai số chuẩn của nó: AV% ± SE

Tính tỷ lệ % ức chế phù để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của thuốc theo công thức:

AVt%: Số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lô thử

2.5.4 Phương pháp xác định một sô chỉ sô hoá sinh.

2.5.4.1 Định lượng protein toàn phần bằng phản ứng Biuret [20,223].

Nguyên tắc: Protein khi tác dụng với thuốc thử Gomall (CuS04/Na0H)

sẽ tạo phức chất màu tím hồng Dung dịch được đem đo quang ở kính lọc bước sóng 530 nm, cóng 1 cm

Nồng độ protein được tính theo công thức:

Et

M (g/1) = _ X 1 (g/1)

Ec

Trong đó: M (g/1): nồng độ protein huyết thanh.

Et : mật độ quang ống thử

Ec : mật độ quang ống chuẩn (Nồng độ protein 1 g/1)

2.5.4.2 Định lượng seromucoid huyết thanh [20, 303], [53, 298-300].

Nguyên tắc: Seromucoid được kết tủa bởi acid phosphotungstic 5% Độ đục của dung dịch tỷ lệ với nồng độ seromucoid

Hỗn dịch được đo độ đục ở quang kế kính lọc bước sóng 400 nm Căn

cứ vào sự thay đổi độ đục để đánh giá khả năng chống viêm của thuốc Tỷ lệgiảm nồng độ seromucoid được tính theo công thức:

Dc - Dt

l % = — -X 100%

DcTrong đó: 1%: tỷ lệ giảm nồng độ seromucoid

Dc : độ đục lô chuột chứng

Dt : độ đục lô chuột thử

2.5.4.3 Điện di protein huyết thanh [20,233-235].

Nguyên tắc: Protein là những phân tử lưỡng tính, điện tích quyết định bỏi pH môi trường Tại pH = 8,6, các phân tử protein mang điện tích âm sẽ chuyển động về phía cực dương của điện trường Riêng thành phần Ỵ-globulin chuyển động về phía cực âm Tuỳ theo điện tích và kích thước, các phân tử sẽ chuyển động nhanh chậm khác nhau Trên giấy thạch protein huyết thanh tách thành các thành phần albumin và globulin a l5 ao, p, y Dựa vào các thành phần được phân tách, ta tính được tỷ số albumin/globulin (A/G) của từng lô chuột thử và so sánh với lô chuột chứng

2.5.5 Phương pháp xử lý sô liệu.

Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với sự trợ giúp của chương trình Excel

Chương 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 ẢNH HƯỞNG CÚA NƯỚC SẮC KIM NGÂN HOA Đ ố i VỚI HOẠT TÍNH

CỦA a-C H Y M O i RYPSIN.

3.1.1 Ảnh hưỏng của nước sắc kim ngân hoa đối với hoạt tính của a- chymotrypsin trên cơ chất casein.

3.1.1.1 Anh hưởng của nồng độ nước sắc kim ngân hoa đôi với hoạt tính của a-chymotrypsỉn.

Với mục đích tìm ra nồng độ thích hợp nhất của nước sắc kim ngân hoa để kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin mạnh nhất, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính cua a-chymotrypsin khi kết hựp với nước sắc kim ngân hoa ỏ' nhữny nồng độ khác nhau trong cùng điều kiện: nhiệt độ 40°c,

thời gian 30 phút, pH = 8 Do điều kiện thời gian có hạn nên chúng tôi SƯ bộ khảo sát một số nồng độ Kết quả thu đưực trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ nước sắc kim ngân hoa đôi với hoạt tính

của a-chymotrypsỉn.

Nồnti độ

nước sắc KNH (%)

Hoạt tính enzym (fiKalal'/img protein)

% protein hi ihtiỷ phâĩi

% thay đổi hoạt tính p

0 126.4 + 6.2 26.8 ± 1,3 100

0,125 144,1 ± 7,3 30,5 ± 1,5 114,1 < 0,050,250 157,4 ± 8 ,4 33,3 ± 1,8 124,9 <0,010,500 153,7 ± 7 ,4 32,6 ± 1,7 122,0 <0,01

Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy: Nước sắc kim ngân hoa với nồng độ 0,25% có khả năng kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin mạnh nhất, phần trăm thay đổi hoạt tính lên tới 124,9% (P < 0,01) Với nồng độ nhỏ hơn hay lớn hơn nồng độ này khả năng kích thích giảm đi.

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian đôi với hoạt tinh của a-chymotrypsin khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25%.

Thời gian có ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin Khi thời gian càng lớn, khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin càng tăng nhưng đến một mức độ nào đó khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin sẽ tăng chậm Tiến hành xác định khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25% trong thòi gian 5', 15', 30', 45', 60' ở cùng điều kiện: 40°c, pH = 8 Kết quả trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.1

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a-chymotrypsỉn

khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25%.

% thay đổi hoạt tính

p

0C-CT+ KNH

384,4 ± 20,3 459,3 ± 29,3

13,6 ± 0 ,7 16,2 ± 1,0

100119,7 <0,05

a-C T + KNH

210,5 ± 11,5 243,0 ± 13,3

22,3 ± 1,2 25,7 ± 1,4

100115,5 <0,05

a-C T + KNH

126.4 ± 6 ,2157.4 ± 8 ,4

26,8 ± 1,3 33,3 ± 1,8

100124,9 <0,01

a-C T + KNH

115,4 ± 6 ,4 140,8 ± 7,4

36.6 ± 2,044.7 ± 2,3

100122,0 <0,05

a-C T + KNH

100,3 ±5,6 113,7 ±5,8

42,5 ± 2,4 48,1 ±2,5

100113,4 <0,05

Ghi chú: Kết quả trên là giá trị trung bình ± S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần

xác định 3 lần

Thời gian (phút)

Hình 3.1 Đ ồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a-

chymotrypsin khỉ kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25%.

* p < 0,05 ** p < 0 ,0 1

Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy: Ở thời gian 5', 15', 30', 45', 60' khả năng thuỷ phân protein của a-chymotrypsin khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa mạnh hơn khi dùng a-chymotrypsin đơn độc Sự kết hợp nước sắc kim ngân hoa không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của tác nhân thời gian đến hoạt tính của a-chymotrypsin Như vậy, kim ngân hoa có tác dụng kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin khi thay đổi thời gian thuỷ phân

3.1.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đôi với hoạt tính của a-chymotrypsỉn khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25%.

Để tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a- chymotrypsin khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25% ở các nhiệt độ khác nhau: 20°c, 40°c, 60°c trong cùng điều kiện thời gian 30 phút, pH = 8 Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a-chymotrypsin khi

kết hợp với nước sắc kim ngân hoa 0,25%.

% protein

bị thuỷ phân

% thay đổi hoạt tính

p

0C-CT+ KNH

118.4 ± 6 ,0141.5 ±7,3

25,1 ± 1,3 29,9 ± 1,5

45.8 ± 2,351.9 ± 2 ,6

9,7 ± 0,5 11,0 + 0,6

100113,5 <0,05

Ghi chú: Kết quả trên là giá trị trung bình ± S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần

xác định 3 lần

a-chymotrypsin sử dụng có hàm lượng là 0,05mg/ml

Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy: Khi nhiệt độ càng tăng thì khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin càng tăng Nhưng đến một mức độ nào đó khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin sẽ tăng chậm Khi kết hợp với nước sắc kim ngân hoa không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của tác nhân nhiệt độ đến hoạt tính của a-chymotrypsin