Nghiên cứu bào chế hệ nano curcumin sử dụng chất mang zein

Minh họa phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi và tóm tắt một số yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính hạt, hiệu suất nạp DC và khả năng giải phóng DC của vi hạt/vi nang sử dụng chất mang zei

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Th.S Nguyễn Cảnh Hưng, cùng các thầy cô, cán

bộ, anh chị kỹ thuật viên ở bộ môn Bào chế, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội và Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, Ban giám hiệu trường Đại học Dược

Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị, bạn bè đã luôn

ở bên động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2018 Sinh viên

Vũ Mai Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về zein 2

1.2 Tổng quan về các hệ vận chuyển thuốc sử dụng chất mang zein 2

1.3 Tổng quan về curcumin 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis 17

2.3.2 Phương pháp bào chế 18

2.3.3 Phương pháp đánh giá đặc tính hệ nano zein – curcumin 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis 27

3.2 Khảo sát lựa chọn phương pháp bào chế 29

3.3 Khảo sát các yếu tố thuộc về công thức 30

3.4 Đánh giá một số đặc tính của hệ nano zein – curcumin 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMCS Carboxymethyl chitosan

DC Dược chất

DĐVN Dược điển Việt Nam

EE Hiệu quả bẫy thuốc (Encapsulation Efficiency)

KTTP Kích thước tiểu phân

LC Hiệu suất nạp thuốc (Loading Capacity)

MeOH Methanol

NaCas Natri caseinat

PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity Index)

PEG Polyethylen glycol

SKD Sinh khả dụng

SPI Protein phân lập từ đậu tương (soy protein isolate)

TPGS D-α-tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat

USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia)

VD Ví dụ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 16 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16 Bảng 2.3 Thành phần các mẫu HD nano zein – curcumin bào chế theo

Hình 1.2 Khoảng KTTP thu được và cơ chế chính để tạo vi hạt/vi nang sử

dụng chất mang zein của một số phương pháp Biểu đồ tròn thể hiện xu

hướng lựa chọn phương pháp của các nghiên cứu gần đây [41]

5

Hình 1.3 Minh họa phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi và tóm tắt

một số yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính hạt, hiệu suất nạp DC và khả năng

giải phóng DC của vi hạt/vi nang sử dụng chất mang zein [41]

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

curcumin trong môi trường MeOH

27

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

curcumin trong môi trường môi trường Tween 80 0,05%

28

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của KTTP và PDI hỗn dịch nano

zein – curcumin vào nồng độ NaCas trong pha ngoại

31

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất quy trình tạo HD

nano zein – curcumin vào nồng độ NaCas trong pha ngoại

31

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của KTTP và PDI hỗn dịch nano

zein – curcumin vào nồng độ zein trong pha nội

32

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất quy trình tạo HD

nano zein – curcumin vào nồng độ zein trong pha nội

33

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của KTTP và PDI hỗn dịch nano

zein – curcumin vào tỷ lệ thể tích pha nội : pha ngoại

33

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất quy trình tạo HD

nano zein – curcumin vào tỷ lệ thể tích pha nội : pha ngoại

34

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi về KTTP và PDI của HD nano zein

– curcumin theo thời gian

36

Hình 3.10 Đồ thị giải phóng của HD nano zein – curcumin và đồ thị giải

phóng của curcumin nguyên liệu trong môi trường nước Tween 80 0,05%

37

Hình 3.11 Phổ hồng ngoại của các mẫu nguyên liệu, HHVL và bột nano

sau khi đông khô

38

Hình 3.12 Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu nguyên liệu, HHVL và bột

nano sau khi đông khô

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Curcumin là một chất polyphenol được chiết xuất từ rễ cây nghệ (Curcuma longa)

và có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư [5],… Tuy nhiên, những nhược điểm như độ tan thấp, sinh khả dụng đường uống thấp, tốc độ chuyển hóa và thải trừ nhanh đã làm hạn chế ứng dụng của hoạt chất tiềm năng này [1]

Vì vậy, các hệ vận chuyển thuốc chứa curcumin có cấu trúc nano như liposome, micell, siêu vi cầu và siêu vi hạt đã được nghiên cứu để khắc phục những nhược điểm trên Đặc biệt hệ tiểu phân nano đã cho thấy khả năng bảo vệ và vận chuyển hướng đích, làm tăng

độ tan trong nước và cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin Tuy nhiên, những polyme sử dụng lại thường được tổng hợp nhân tạo và không thân thiện sinh học [22]

Trong một số nghiên cứu gần đây, zein – một loại protein trong ngô – đã được ứng dụng để tạo hệ vận chuyển cho curcumin Zein được cấp phép bởi Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ US – FDA như một loại tá dược bao viên vào năm 1985 Đây là một nguyên liệu an toàn sinh học (GRAS – Generally Recognized As Safe) với những đặc tính như thân thiện sinh học, có khả năng phân hủy sinh học và độc tính thấp Đặc biệt, nhờ đặc tính kỵ nước và tính chất tan, các tiểu phân nano/micro zein có thể dễ dàng được bào chế, tạo thành các hệ vận chuyển thuốc Các hệ vận chuyển này còn có khả năng ứng dụng cao trong đường uống do zein bị tiêu hóa chậm hơn những loại protein khác [19] Hơn nữa, do zein là một protein giàu prolin, có ái lực mạnh với curcumin nên có thể sử dụng để bào chế hệ nano vận chuyển thuốc nhằm tăng sinh khả dụng và bảo vệ curcumin khỏi sự phân hủy ở đường tiêu hóa [22]

Các hệ vận chuyển curcumin sử dụng chất mang zein đang là hướng phát triển mới

chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ nano curcumin sử dụng chất mang zein” được thực hiện với những mục tiêu sau:

dung môi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về zein

1.1.1 Nguồn gốc

Zein là protein dự trữ chiếm 35 – 60% tổng các loại protein trong ngô, và chỉ nằm trong phần nội nhũ ngô [19]

1.1.2 Cấu trúc và phân loại zein

Dựa theo tính chất tan, zein được xem như một prolamin Zein chủ yếu chứa các amino acid không phân cực (VD: leucin, prolin, alanin, phenylalanin, isoleucin, valin) hoặc trung tính nhưng cũng có một vài amino acid phân cực (VD: glutamin) [19] Căn cứ vào độ tan, điện tích và trọng lượng phân tử, zein được phân loại thành 4 nhóm: α-zein (19 và 22 kDa), β-zein (14 kDa), γ-zein (16 và 27 kDa), δ-zein (10 kDa) Trong 4 loại này, α-zein chiếm 75 – 85%, β-zein chiếm 10 – 15%, còn γ-zein chiếm 5 – 10% tổng lượng zein có trong ngô [19]

1.1.3 Tính chất của zein

- Tính chất tan: Zein không tan trong nước nhưng tan trong các dung dịch alcol (VD: dung dịch EtOH nồng độ khoảng 55 – 90% [43]), dung dịch ure nồng độ cao, dung dịch kiềm nồng độ cao (pH > 11) có/ không có chất tẩy rửa anionic [30] Tính chất tan đặc biệt này là do zein có chuỗi amino acid với hơn 50% ở dạng không phân cực [19]

- Điểm đẳng điện: Điểm đẳng điện của zein là 6,2 Zein tinh khiết thường có khuynh hướng kết tụ mạnh, đặc biệt trong dung dịch nước với pH trung tính hoặc trong pH sinh

lý [22]

1.2 Tổng quan về các hệ vận chuyển thuốc sử dụng chất mang zein

1.2.1 Tính chất mang và hình thái của các hệ vận chuyển thuốc sử dụng chất mang zein

Các hệ vận chuyển thuốc sử dụng chất mang zein thường dùng nhất là vi hạt và vi nang với đường kính từ nanomet đến micromet [41]

Hình 1.1 Phân loại và hình thái của các hệ vận chuyển thuốc sử dụng chất mang zein [41]

1.2.1.1 Vi hạt

Vi hạt sử dụng chất mang zein là một hệ đồng nhất [41] Trong đó, các phân tử DC

có thể được phân tán vật lý hoặc liên hợp cộng hóa trị với zein [14], [33] Vi hạt sử dụng chất mang zein chứa các DC kỵ nước thể hiện hiệu quả bẫy thuốc (EE) và tỷ lệ nạp thuốc cao hơn các DC ưa nước, điều này liên quan chặt chẽ đến đặc tính kỵ nước của phân tử zein [32], [33] Tuy nhiên, các vi hạt zein thường không bền về mặt vật lý do khuynh hướng tự kết tụ của các tiểu phân [23] Một vài nguyên liệu bao (VD: NaCas và D-α-tocopheryl polyethylen glycol 1000 succinat [TPGS]) đã được nghiên cứu cho thấy khả năng cải thiện độ ổn định, độ thấm qua màng của các hạt nano zein, do vậy cải thiện sinh khả dụng đường uống của DC được nạp [3], [18], [23]

1.2.1.2 Vi nang

Các vi nang sử dụng chất mang zein là một hệ tiểu bào với phần vỏ tách biệt và một khoang lõi có thể chứa DC Các nang micro cũng có thể là một hệ các hạt nano được sắp xếp liên tục và có khoảng trống kích cỡ micromet bên trong [42] Những vi nang này thường được nghiên cứu để giải phóng chậm hoặc kiểm soát vận chuyển DC [38] Phương pháp phun sấy và kỹ thuật dùng đối dung môi siêu tới hạn có thể tạo nang micro với bề mặt mịn và hình dạng cầu, nhưng vỏ nang thường nhăn do bị tách dung môi nhanh và thiếu lõi dịch lỏng bên trong [38] Không giống nang micro, nang nano thu được bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi cho hình thái tương tự các tiểu phân nano zein và có kích thước nhỏ hơn 100 nm [39]

1.2.1.3 Micell

Các micell zein có khả năng hình thành một cách tự nhiên kết cấu lõi – vỏ hình cầu nhờ sự tự tập hợp các phân tử zein tương tự chất diện hoạt trong dung môi thích hợp Chúng có thể tách ra thành các đơn vị tự do và giải phóng tất cả DC được nạp bằng cách pha loãng sao cho nồng độ của đơn vị thấp hơn nồng độ tới hạn của micell [41]

Hệ micell zein có thể ổn định hơn và tăng khả năng phân hủy sinh học bằng cách gắn một phần ưa nước của PEG vào phân tử zein, với PEG là phần vỏ ưa nước và zein là phần lõi kỵ nước [24]

1.2.1.4 Nhũ tương Pickering ổn định bởi zein

Nhũ tương Pickering là một loại nhũ tương không dùng chất diện hoạt thông thường mà được tạo bởi các vi hạt zein Nó có kích thước và độ ổn định liên kết lớn nhờ cấu trúc lõi – vỏ như hình 1.1 Lớp vỏ không có kết cấu nguyên vẹn mà chỉ là một lớp màng đơn tạo bởi các hạt nano nguyên chất Kết cấu đặc biệt này rất tiềm năng trong việc vận chuyển nhiều DC, bởi cả vỏ lẫn lõi của nó đều có thể chứa DC Các hạt nhũ tương này không tan nhưng có thể phân tán một phần trong cả dầu và nước [10]

1.2.2 Một số phương pháp tạo vi hạt/vi nang sử dụng chất mang zein

Nhiều phương pháp đã được nghiên cứu để tạo ra các hệ vận chuyển nano/micro

sử dụng chất mang zein nhằm thay đổi các đặc tính lý hóa của hệ Những phương pháp này thông thường gồm nhiều giai đoạn và dựa trên nhiều cơ chế khác nhau, nhưng đều liên quan chặt chẽ đến các đặc tính lý hóa và cấu trúc của zein [41] Hình 1.2 tóm tắt khoảng kích thước của vi hạt/ vi nang sử dụng chất mang zein được tạo ra từ mỗi phương pháp và các cơ chế tương ứng

1.2.2.1 Phương pháp tạo liên kết chéo nhờ tác nhân hóa học

Nhờ tác nhân hóa học glutaraldehyd, zein có thể tạo liên kết chéo nội phân tử với nhiều thuốc chống ung thư, như polysaccharid-K, mitomycin, daunomycin hay peplomycin, hoặc với chính các phân tử zein khác [33] Do tính kỵ nước đặc biệt của zein và sự ra tăng trọng lượng phân tử, phản ứng liên kết chéo nội phân tử giúp cho hệ zein – DC tăng khuynh hướng kết tập và thường tạo thành các hạt micro khi tiếp xúc với dung dịch nước [41]

Hình 1.2 Khoảng KTTP thu được và cơ chế chính để tạo vi hạt/vi nang sử dụng chất mang zein của một số phương pháp Biểu đồ tròn thể hiện xu hướng lựa chọn phương pháp của các

nghiên cứu gần đây [41]

1.2.2.2 Phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi

Phương pháp này dựa trên cơ sở nhũ tương hóa dung dịch alcol của zein và DC vào pha dầu chứa chất diện hoạt, tạo thành nhũ tương nước trong dầu, sau đó bốc hơi dung môi pha nội để hệ zein – DC hóa rắn thành các hạt micro Các tác nhân hóa học (VD glutaraldehyd) có thể được thêm vào trước khi bốc hơi dung môi để tạo các hạt micro liên kết chéo [14]

1.2.2.3 Phương pháp nhũ tương hóa – kết tủa và nhũ tương hóa – kết tủa – gel hóa

- Phương pháp nhũ tương hóa – kết tủa: zein và DC được hòa tan trong nước có tính kiềm Sau đó, dung dịch này được nhũ tương hóa vào pha dầu chứa chất diện hoạt, tạo thành nhũ tương nước trong dầu Cuối cùng, một acid tan trong dầu (VD acid acetic băng) được dùng để điều chỉnh pH của pha nội về gần trung tính (6,0), hệ zein – DC sẽ kết tủa và tập hợp thành các hạt với kích thước khác nhau [9]

- Phương pháp nhũ tương hóa – kết tủa – gel hóa: là sự kết hợp của phương pháp nhũ tương hóa/ kết tủa và nhũ tương hóa/ gel hóa pha nội, dùng để tạo các hạt micro

zein phức tạp Ở đây, acid acetic băng có hai vai trò: một là để trung hòa pH của pha nội nhằm kết tủa các phân tử zein, và hai là để giải phóng các ion calci giúp khởi đầu quá trình gel hóa polyme Do vậy, muối calci và các polyme có thể bị liên kết chéo bởi ion calci (VD alginat hay SPI biến tính bởi nhiệt) phải được kết hợp trong công thức [8]

1.2.2.4 Phương pháp phun sấy

Quá trình phun sấy nhìn chung bao gồm 3 giai đoạn: a) phun để phân tán dung dịch chứa zein và DC, b) sấy để bốc hơi dung môi và tạo hạt, và c) thu hạt Sau khi phân tán, do dung môi liên tục bay hơi khỏi các giọt, hệ zein – DC sẽ giảm dần độ tan, tạo nhân và hình thành các hạt rắn Kích thước và hình thái của sản phẩm có thể đạt từ hạt cầu nano đến hạt kích cỡ micro [32]

1.2.2.5 Kỹ thuật dùng đối dung môi siêu tới hạn (Supercritical anti-solvent technique – SAS)

Phương pháp này dựa trên cơ sở: zein và DC được hòa tan trong dung môi carbonic siêu tới hạn ở áp suất cao trong bình khí nén, sau đó xả CO2 để giảm áp suất đột ngột,

hệ zein – DC sẽ bị kết tủa lại dưới dạng siêu mịn do CO2 bay hơi Toàn bộ quá trình tương tự như phun sấy, nhưng nhiệt độ thấp hơn và môi trường không có oxy của kỹ thuật này có lợi hơn, đặc biệt với các DC không ổn định khi tiếp xúc với nhiệt độ hoặc

dễ bị oxy hóa [38]

1.2.2.6 Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi

Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi, còn gọi là phương pháp tách pha, phân tán lỏng – lỏng, đồng tụ hay kết tủa đối dung môi, đã được sử dụng rộng rãi để tạo các

vi hạt sử dụng chất mang zein [41] Hình 1.3 miêu tả quá trình kết tủa do thay đổi dung môi để tạo thành vi hạt/vi nang sử dụng chất mang zein

Việc khuấy trộn giúp alcol bay hơi và làm giảm nồng độ alcol, do vậy sự tạo nhân zein được đẩy nhanh tốc độ Các nhân tạo thành có thể tiếp tục lớn lên bằng cách bắt các phân tử ít tan hoặc bằng phân tán Ostwald, một quá trình tự nhiên xảy ra bởi nhiệt động trong đó các hạt nhỏ hòa tan và tái lắng lại thành các hạt lớn hơn [4] Mặc dù vậy, trong trường hợp nồng độ zein cao và tạo nhiều nhân hơn, sự lớn lên của các nhân có thể chỉ xảy ra thông qua va chạm ngẫu nhiên của các hạt đã hình thành [4] Thêm vào

đó, sự tạo nhân và lớn lên của nhân có thể bị ảnh hưởng bởi nhiễu động bề mặt trong quá trình phối hợp Các hạt sẽ đạt kích thước cuối cùng ở trạng thái ổn định nhiệt động nhờ hấp phụ các ion điện hoặc các chất diện hoạt, khi nồng độ zein trong dung môi dưới giới hạn độ tan và phân tán Ostwald bị hạn chế [41]

Hình 1.4 Giản đồ 3 pha zein/EtOH/nước và sự biến đổi của hệ khi phối hợp [21]

Bất kỳ yếu tố nào tác động đến các quá trình trên, như sự tái hòa tan zein, sự tạo nhân và lớn lên của nhân đều sẽ ảnh hưởng đến các đặc tính của hạt tạo thành và từ đó ảnh hưởng đến khả năng nạp và giải phóng DC [41] (hình 1.3)

+ Tốc độ kết tủa do thay đổi dung môi tăng, nồng độ cồn ban đầu tăng hoặc nồng

độ zein giảm giúp kích thước hạt nano nhỏ hơn Điều này có thể được giải thích bằng giả thuyết về sự phá vỡ các giọt phân tán, sự tạo nhân và sự lớn lên của nhân nhờ va chạm [26], [43]

+ Tỷ lệ pha loãng: tỷ lệ pha loãng hay tỷ lệ cồn/nước lúc phối hợp sẽ quyết định nồng độ quá bão hòa của zein và do đó là số lượng các nhân (hình 1.4) Dựa vào lý thuyết tạo nhân cổ điển, độ quá bão hòa cao sẽ sinh ra vô cùng nhiều nhân, trong khi độ quá bão hòa thấp sẽ sinh ra ít nhân ổn định hơn Ít nhân hơn trong khi nồng độ zein cao

sẽ sinh ra các hạt có kích thước lớn hơn ở trạng thái cuối cùng [43]

+ Tốc độ phối hợp nước vào dung dịch alcol nước chứa zein: Tốc độ cao thường giúp hạt có kích thước nhỏ hơn trong cùng điều kiện thí nghiệm Nếu thêm nước chậm,

sự tạo nhân zein sẽ xảy ra dần, và zein hòa tan sẽ bị dùng một cách cạnh tranh cho quá trình tạo nhân và lớn lên của nhân Trong phần lớn thời gian, các hạt có thể tiếp tục tăng kích thước do phân tán Ostwald và dẫn tới dải phân bố kích thước rộng [41]

+ Bên cạnh những yếu tố trên, pH, nhiệt độ, độ nhớt của hệ và các nguyên liệu khác cũng ảnh hưởng đến các đặc tính của hạt bởi chúng ảnh hưởng đến sự tái hòa tan của zein, sự tạo nhân và lớn lên của nhân Giữ cho pH ở pha nước chỉ cao hơn điểm đẳng điện của zein một chút có thể tạo kích thước hạt nhỏ hơn Cho các nguyên liệu

khác vào công thức có thể tạo các hạt kiểu lõi – vỏ, giúp cải thiện độ ổn định liên kết và kiểm soát giải phóng thuốc [25]

1.2.3 Các phương pháp ổn định hệ vận chuyển nano/micro zein

Độ ổn định liên kết thấp và khả năng phân tán trở lại kém sau khi ly tâm và đông khô là hai vấn đề làm giới hạn các ứng dụng của các hệ vận chuyển zein trong lĩnh vực dược phẩm Khuynh hướng tự kết tập của các hệ zein khi gần pH trung tính hoặc khi độ ion hóa cao chủ yếu là do lực đẩy tĩnh điện giảm khi gần điểm đẳng điện ở pH 6,2 của zein và do tương tác kỵ nước tăng [30] Dưới đây là các phương pháp để giải quyết vấn

đề này:

1.2.3.1 Điều chỉnh pH

Ly tâm và phân tán trở lại thường dùng để loại alcol dư và các chất không được bao trong quá trình tạo hệ vận chuyển zein Nhưng lực ly tâm lớn và thời gian dài sẽ dẫn tới kết tụ hạt và khiến hệ phân tán trở lại kém Do vậy, hiệu suất tạo hạt thường thấp sau khi ly tâm Vấn đề này có thể giải quyết bằng cách điều chỉnh pH của dung môi phân tán Điểm đẳng điện của zein là 6,2 Dùng một dung môi phân tán cho zein ở pH 4 – 5

có thể giảm sự kết tập do ly tâm một cách hiệu quả Cơ chế đằng sau nó là sự proton hóa của zein và lực đẩy mạnh sinh ra giữa các hạt Trong điều kiện này, các hạt nano sẽ dễ dàng phân tán dù đã ly tâm lâu ở tốc độ cao Biện pháp này cũng phù hợp để bao các hạt nano zein bằng cách chỉnh pH ra xa điểm đẳng điện của nguyên liệu bao Thêm vào đó,

để pH ra xa điểm đẳng điện của zein hay các nguyên liệu bao cũng có lợi cho việc bảo quản các vi hạt lâu dài Tuy nhiên, khi các hệ vận chuyển trên được phân tán trở lại trong các dung dịch có pH gần điểm đẳng điện của zein hay các nguyên liệu bao, sự kết tụ có thể xảy ra nhanh chóng do sự giảm lực đẩy tĩnh điện Điều này đặc biệt đúng với các hạt nano zein nguyên chất tại pH trung tính hoặc sinh lý [13], [41]

1.2.3.2 Sử dụng chất ổn định

Nhằm tăng độ ổn định liên kết và khả năng phân tán trở lại của các hệ vận chuyển zein, một số chất ổn định được đưa vào các công thức như lecithin/ poloxamer 188, β-lactoglobulin, lysin, pectin và NaCas [3], [6], [7], [41] Trong nghiên cứu của tác giả Kun Hu và các cộng sự, hạt nano zein – curcumin sử dụng chất ổn định pectin có KTTP tương đối nhỏ (khoảng 250 nm), PDI thấp (khoảng 0,24), hiệu quả nạp thuốc cao (> 86%) và giữ được độ ổn định sau khi đông khô [13] Một nghiên cứu khác sử dụng

NaCas làm chất ổn định cũng tạo thành các hạt nano zein – curcumin có KTTP nhỏ (100 – 150 nm), EE cao (71,1 – 86,8%), độ ổn định cao hơn curcumin nguyên chất dưới tác động của tia UV và trong môi trường kiềm (pH 9,0) [22] Nguyên tắc dùng những chất

ổn định này là chúng có thể hấp thụ lên bề mặt của các hạt nano qua tương tác kỵ nước hoặc tĩnh điện, tạo thành một màng tách biệt giữa hạt zein và dung môi Sự tăng độ ổn định liên kết và khả năng phân tán trở lại của các hạt zein chủ yếu là nhờ thay đổi các đặc tính bề mặt như tăng lực đẩy tĩnh điện, tăng phân cách không gian hoặc cả hai [23] Như đã nói ở trên, trong khi lực đẩy tĩnh điện có thể bị mất khi gần điểm đẳng điện của nguyên liệu bao, thì sự phân tách không gian không bị ảnh hưởng rõ rệt khi thay đổi điều kiện môi trường Cũng cần phải nói rằng bên cạnh ưu điểm, các chất ổn định cũng ảnh hưởng đến tính chất khác của hệ vận chuyển (VD hiệu quả bẫy thuốc EE, sự giải phóng thuốc và nạp thuốc vào tế bào)

1.2.4 Một số ứng dụng của các hệ vận chuyển nano/micro zein

Lợi ích của các hệ vận chuyển nano/micro zein có thể phân làm bốn nhóm sau:

1.2.4.1 Kiểm soát giải phóng

Việc kiểm soát giải phóng DC thường được ưu tiên để đạt tác dụng điều trị trong

cả đường uống lẫn đường tiêm Các hệ vận chuyển kiểm soát giải phóng DC sử dụng chất mang zein được bào chế dựa trên những dặc tính, tính chất sau:

a) zein kỵ nước;

b) zein có thể tạo liên kết chéo nhờ tác nhân hóa học;

c) zein có thể chịu được pH dạ dày;

d) các hệ liên kết zein chịu được sự tiêu hóa mạnh hơn zein

Quá trình giải phóng thuốc là kết quả của cả công thức và các yếu tố môi trường Các dạng bào chế như hạt micro zein tạo liên kết chéo nhờ tác nhân hóa học glutalraldehyd, hạt micro zein phức hợp với SPI, viên nén tạo từ hạt micro zein, hay các hạt nano zein được bao ngoài bởi CMCS, TPGS, pectin và NaCas đã cho thấy tác dụng kiểm soát giải phóng thuốc vô cùng đa dạng của các hệ vận chuyển DC sử dụng chất mang zein [41]

1.2.4.2 Tăng độ ổn định

Sự tạo nang là một cách hiệu quả để bảo vệ các tác nhân hoạt động sinh học khỏi những yếu tố ảnh hưởng trong môi trường bên ngoài Như đã trình bày, zein kỵ nước và giảm tính mẫn cảm với sự phân giải protein và dịch dạ dày Do vậy, các hệ vận chuyển zein có thể dùng để bảo vệ thuốc khỏi pH dạ dày – ruột và các enzyme tiêu hóa khi dùng đường uống Lợi ích này đã được chứng minh trong một số nghiên cứu Ví dụ, nạp catalase hay superoxid dismutase vào trong các hạt nano zein giúp bảo vệ chúng khỏi

sự phân hủy điều hòa bởi enzym và giữ được 40 – 60% hoạt tính của các protein này tại

pH 7,0, trong khi hoạt tính của các protein này chỉ còn 5 – 10% trong pH 1,3 với pepsin [17] Tương tự, các hạt nano/micro zein cũng bảo vệ thành công ADN, curcumin, abamectin và dầu cá khỏi tác động của pH, enzym, ánh sáng và sự oxy hóa [41] Các hạt zein có vỏ bao còn cho thấy tác dụng bảo vệ tốt hơn [18] Ngoài ra, các hệ micell như micell PEG – zein và micell zein thủy phân cũng làm tăng độ ổn định của curcumin thông qua bao gói và hòa tan [24]

1.2.4.3 Vận chuyển hướng đích

Vận chuyển thuốc hướng đích nhằm làm giảm độc tính và tăng hiệu quả điều trị Các hệ vận chuyển zein đang có tiềm năng rất lớn trong việc đạt được mục đích này Các hạt micro zein nạp aceclofenac được liên kết chéo với glutaraldehyd cho thấy sự giải phóng chậm rõ rệt của thuốc (14%) sau 2 giờ, trong pH 1,2 mô phỏng dịch dạ dày, trong khi 79% thuốc được giải phóng sau 72 giờ trong môi trường mô phỏng dịch ruột [14] Trong nghiên cứu khác, hạt zein nạp 5-florouracil với kích thước nhỏ hơn 150 nm

cho thấy khả năng hướng đích tại các tế bào nhu mô gan với tốc độ nạp vào tế bào tương đương 2,79 sau khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt [16] Các nang nano zein liên kết chéo với acid citric lại hướng đích tại thận và có thời gian lưu dài hơn [39] Các tính chất

phân bố in vivo của các hệ vận chuyển zein cho thấy chúng có tiềm năng trong việc vận

chuyển hướng đích tại gan và thận, hai nội tạng quan trọng của người, và từ đó chữa các bệnh liên quan Tuy nhiên cần nghiên cứu thêm về cơ chế và các tác động lên trạng thái bệnh lý có thể có trên động vật của các hệ này [41]

1.2.4.4 Tăng hấp thu vào tế bào và sinh khả dụng đường uống

Đến nay, sự đánh giá khả năng nạp thuốc vào tế bào và sinh khả dụng mới chỉ giới hạn ở các hệ nano zein, đặc biệt với các hệ có cấu trúc lõi-vỏ Có ít nghiên cứu về hạt nano zein nguyên chất bởi khả năng phân tán trở lại kém và khuynh hướng kết tập của các hạt Như đã trình bày, một số nguyên liệu tạo vỏ không chỉ làm ổn định các hệ vận chuyển zein mà còn tăng tính thấm và khả năng hấp thụ Ví dụ, hạt nano zein bao NaCas cho thấy sự tăng khả năng nạp thuốc vào tế bào ở cả tế bào Caco-2 và tế bào HeLa [18] Hạt nano zein bao NaCas cũng cho thấy làm tăng dược động học của simvastatin trong chuột cống, và làm tăng sinh khả dụng đường uống gấp 3 lần so với simvastatin giải phóng chậm [3] Tương tự, do tăng tính bám màng và tính thấm qua mô, sinh khả dụng đường uống của atorvastatin cũng được cải thiện bằng cách nạp vào hạt nano zein Các hạt nano zein chứa atorvastatin cho thấy sinh khả dụng gấp 4 lần so với viên atorvastatin trên thị trường [12]

1.3 Tổng quan về curcumin

1.3.1 Nguồn gốc

Curcumin, hay diferuloylmethan, là một chất polyphenol hoạt động sinh học trong

rễ của cây Curcuma longa (nghệ) và trong các loài Curcuma spp khác [2] Trong tự

nhiên, curcumin là thành phần chính của curcuminoid Curcuminoid là hỗn hợp gồm 3 thành phần trong đó curcumin chiếm khoảng 77%, demethoxycurcumin chiếm khoảng 17% và bisdemethoxycurcumin chiếm khoảng 3% [29]

1.3.2 Công thức

- Công thức phân tử: C21H20O6

- Khối lượng phân tử: 368,38

- Tên khoa học: 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5-dion

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của curcumin [29]

1.3.3 Tính chất lý hóa

- Đặc tính lý học

+ Hình thức: bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng

+ Độ tan: curcumin ít tan trong nước (độ tan 11 ng/ml trong môi trường pH 5,5) [27], tan một phần trong MeOH, tan tốt trong aceton, dimethylsulfoxyd, EtOH và cloroform [29]

+ Nhiệt độ nóng chảy 183ºC [11]

+ Dạng thù hình: curcumin kết tinh ở ba dạng thù hình, dạng 1 tồn tại dạng cấu trúc tinh thể đơn tà, dạng 2 và 3 tồn tại ở dạng cấu trúc tinh thể trục thoi Về hình thái tiểu phân, tiểu phân curcumin dạng đơn tà có hình kim, còn dạng trục thoi có hình thái tiểu phân giống hạt gạo hoặc hình cầu Ngoài ra, curcumin còn có thể ở dạng vô định hình [35]

+ Dung dịch curcumin trong MeOH hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 430

nm và dung dịch curcumin trong aceton hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng khoảng 425-420 nm [1]

- Đặc tính hóa học

+ Curcumin có tính acid, pKa của curcumin lần lượt là 7,8; 8,5 và 9,0 [27]

+ Curcumin là một hợp chất tautome tồn tại ở hai dạng enol và ceton (hình 1.6)

Sự chuyển dạng phụ thuộc vào pH Dạng bis-ceto tồn tại chủ yếu trong môi trường acid

và trung tính, còn dạng enol chiếm ưu thế trong môi trường kiềm [29]

Hình 1.6 Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin

+ Dung dịch curcumin có màu vàng tại pH 2,5 – 7 và màu đỏ ở pH > 7 [11]

Riêng đối với curcumin, hàm lượng curcumin trong các chế phẩm bào chế và trong môi trường thử độ hòa tan có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC [28]

1.3.6 Tác dụng dược lý

Curcumin đã cho thấy lợi ích trong việc điều trị các tình trạng viêm , hội chứng chuyển hóa, làm giảm đau, kiểm soát các tình trạng suy và viêm mắt [20] Curcumin cũng đã được chứng minh là có lợi cho thận [36] Ngoài ra, curcumin còn có tác dụng tiềm năng với hầu hết các bệnh mạn tính bao gồm cả ung thư, thần kinh, tim mạch, bệnh phổi [5]

1.3.7 Sinh khả dụng

Curcumin có SKD đường uống thấp, và là nguyên nhân chính dẫn đến việc bị hấp thu kém, bị chuyển hóa và đào thải nhanh Trong nghiên cứu trên chuột nhắt trắng của Yang và các cộng sự, nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống sau khi uống liều 500 mg/kg là 0,06 ± 0,01 μg/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉ khoảng 1% [40]

Sau hấp thu, curcumin bị chuyển hóa qua gan (chuyển hóa lần đầu) Sau đó, curcumin bị thải trừ nhanh ở dạng liên hợp với glucuronid và sulfat Khoảng 60 – 70% curcumin dùng đường uống được thải trừ qua phân [29]

Như vậy, hấp thu curcumin từ ruột kém có thể do độ tan thấp, tốc độ hòa tan chậm nên hoạt chất không tan hoàn toàn Ngoài ra, curcumin còn bị phân hủy trong môi trường sinh lý của hệ thống dạ dày – ruột, tốc độ chuyển hóa và thải trừ nhanh SKD của curcumin thấp, dẫn đến việc sử dụng trong điều trị bị hạn chế [1]

Một trong những biện pháp cải thiện SKD đường uống của curcumin đang được tập trung nghiên cứu hiện nay là tạo các hệ nano chứa curcumin sử dụng chất mang polyme thân thiện sinh học Trong đó, zein – một protein giàu prolin và có ái lực mạnh với curcumin – đã được sử dụng để bào chế hệ nano vận chuyển thuốc nhằm tăng sinh khả dụng và bảo vệ curcumin khỏi sự phân hủy ở đường tiêu hóa [22] Với những đặc tính hóa lý đặc biệt của zein, quá trình tạo các hạt nano zein chứa curcumin được tiến hành đơn giản, với hiệu suất cao và KTTP nhỏ Hệ nano zein – curcumin đã cải thiện

độ ổn định, tăng SKD của curcumin và có tiềm năng ứng dụng trong các dạng bào chế [7], [13], [22]

Mặc dù có nhiều ưu điểm như trên nhưng khả năng ứng dụng của hệ nano zein –

curcumin vào dạng thuốc dùng đường uống vẫn còn nhiều hạn chế Thứ nhất, hệ tiểu phân nano/micro zein có độ ổn định không cao và dễ bị kết tụ ở pH trung tính hoặc gần điểm đẳng điện của zein Thứ hai, quá trình đông khô thường làm hệ tiểu phân nano/micro zein bị kết tụ và không thể phân tán trở lại vào nước, trừ phi trong công thức

sử dụng chất diện hoạt thân nước Thứ ba, một số phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano/micro zein yêu cầu các quy trình và thiết bị phức tạp như thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao hay thiết bị phun sấy áp suất cao, dẫn tới khó nâng quy mô sản xuất Nhằm khắc phục những hạn chế trên, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để tạo ra những hệ nano/micro zein ổn định, đồng nhất hơn, có khả năng tái phân tán tốt sau khi đông khô

và sử dụng kỹ thuật bào chế đơn giản Một trong những giải pháp hiệu quả là sử dụng các các polyme sinh học khác để ổn định cấu trúc của hệ nano zein như NaCas và pectin [7]

Trong phạm vi của khóa luận tốt nghiệp này, đề tài sẽ nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ nano zein – curcumin sử dụng NaCas hoặc pectin để làm tăng

độ ổn định Phương pháp kết tủa nhờ thay đổi dung môi được lựa chọn do kỹ thuật đơn giản và hiệu quả cao

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

3 Natri caseinat FrieslandCampina DMV Nhà sản xuất

8 Kali dihydrophosphat Trung Quốc Nhà sản xuất

9 Acid phosphoric Trung Quốc Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Nước sản xuất Địa điểm nghiên cứu Máy đo kích thước tiểu phân và xác

định phân bố kích thước tiểu phân

Zetasizer Nano ZS90 – Malvern

Anh Trường ĐH Dược Hà Nội

Máy đo quang phổ UV-Vis U-5100

Spectrophotometer – Hitachi

Nhật Bản Trường ĐH Dược Hà Nội

Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi

Fourier FT/IR-6700 – Jasco

Nhật Bản Viện Công nghệ Dược

phẩm Quốc gia Máy đo pH FE20-KIT – Mettler Toledo Đức Trường ĐH Dược Hà Nội Thiết bị quét phổ nhiễu xạ tia X D8

Advance – Bruker AXS

Đức Khoa Hóa học – Trường

ĐH Khoa học tự nhiên Máy khuấy từ RH basic 1 – IKA Đức Trường ĐH Dược Hà Nội

Máy cất quay chân không R-210 –

BÜCHI Labortechnik AG

Thụy Sỹ Trường ĐH Dược Hà Nội

Máy ly tâm Z200A – Hermle Đức Trường ĐH Dược Hà Nội Máy siêu âm Ultrasonic Cleaner Set

WUC-A22H – Daihan

Hàn Quốc Trường ĐH Dược Hà Nội

Tủ lạnh sâu Unicryo Mỹ Viện Công nghệ Dược

phẩm Quốc gia Máy đông khô Alpha 1-2 Ldplus –

Hàn Quốc Trường ĐH Dược Hà Nội

Cân phân tích, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ

thuật và các thiết bị bào chế, kiểm

nghiệm khác

Trường ĐH Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng được công thức bào chế hệ nano zein – curcumin bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi

- Đánh giá một số đặc tính của hệ nano zein – curcumin như kích thước tiểu phân trung bình, khoảng phân bố kích thước tiểu phân, khả năng giải phóng in vitro và tương tác giữa các thành phần

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ Vis

UV- Trong môi trường MeOH:

► Quét phổ hấp thụ của curcumin trong môi trường MeOH:

Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,01 g curcumin hòa tan trong 30 ml MeOH, chuyển vào bình định mức 100 ml Sau đó thêm MeOH tới vạch, lắc kỹ, thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 100 µg/ml Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 20 lần bằng MeOH được dung dịch chuẩn nồng độ 5 µg/ml

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn 5 µg/ml trong khoảng bước sóng từ 260 – 600

nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của curcumin Mẫu trắng là MeOH

► Xây dựng đường chuẩn:

Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch có nồng độ trong khoảng

từ 1 – 6 µg/ml và tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin trong môi trường MeOH

 Trong môi trường Tween 80 0,05%:

► Quét phổ hấp thụ của curcumin trong môi trường Tween 80 0,05%:

Pha dung dịch Tween 80 0,05%: cân 0,5 g Tween 80 vào cốc có mỏ, thêm nước tinh khiết và đun nóng đến khi tan hoàn toàn Để nguội và thêm nước vừa đủ 1000 ml Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,01 g curcumin hòa tan trong 10 ml MeOH, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch Tween 80 0,05% đến vạch, lắc kỹ, thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 100 µg/ml Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 25 lần bằng dung dịch Tween 80 0,05% được dung dịch chuẩn nồng độ

4 µg/ml

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn 4 µg/ml trong khoảng bước sóng từ 260 – 600

nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của curcumin Mẫu trắng là dung dịch Tween

80 0,05%

► Xây dựng đường chuẩn

Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch có nồng độ trong khoảng

từ 1 – 5 µg/ml và tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin trong môi trường Tween 80 0,05%

2.3.2 Phương pháp bào chế

2.3.2.1 Bào chế hệ nano zein – curcumin

Qua tham khảo các nghiên cứu [13], [22] kết hợp với khảo sát sơ bộ, hỗn dịch nano zein – curcumin được bào chế bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi Ở đây, dung môi ban đầu là EtOH 80% được dùng để hòa tan zein và curcumin tạo pha nội Đối dung môi tạo pha ngoại là dung dịch nước chứa các thành phần chất ổn định NaCas hoặc pectin trong đệm pH 4,0

Các mẫu HD nano được tiến hành theo một trong hai phương pháp sau:

 Phương pháp 1:

Công thức bào chế theo phương pháp 1 được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần các mẫu HD nano zein – curcumin bào chế theo phương pháp 1

STT Thành phần Thể tích hoặc tỷ lệ % (kl/tt)

Pha nội

2 Curcumin Thay đổi theo khảo sát

Pha

ngoại

4 Chất ổn định (NaCas hoặc pectin) Thay đổi theo khảo sát

5 Nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm phosphat pH 4,0 Thay đổi theo khảo sát Quy trình bào chế theo phương pháp 1 được tiến hành như trong sơ đồ hình 2.1 Zein,

Chất ổn định (NaCas/ pectin)

khuấy trộn

Loại EtOH bằng phương pháp cất quay

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế HD nano zein – curcumin theo phương pháp 1

Mô tả quy trình:

- Chuẩn bị pha nội:

+ Pha dung môi EtOH 80%

+ Cân zein và curcumin với nồng độ zein thay đổi theo khảo sát, tỷ lệ khối lượng curcumin : zein luôn cố định là 1:5

+ Hòa tan zein và curcumin vào 5,00 ml dung môi EtOH 80% Siêu âm cho đến khi tan hết, thu được dung dịch pha nội

- Chuẩn bị pha ngoại

+ Đối với chất ổn định NaCas: cân và hòa tan NaCas vào nước để thu được dung dịch NaCas Nồng độ NaCas thay đổi theo khảo sát

+ Đối với chất ổn định pectin: chuẩn bị dung dịch đệm phosphat pH 4,0 bằng cách hòa tan 6,8 g KH2PO4 trong 1000 ml nước, điều chỉnh về pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric 0,1N Cân và hòa tan pectin trong dung dịch đệm trên để thu được dung dịch pectin nồng độ 0,1% (kl/tt)

- Rót nhanh 5,00 ml dung dịch zein – curcumin pha nội vào dung dịch pha ngoại (tỷ

lệ pha nội : pha ngoại thay đổi theo khảo sát) Trong quá trình rót, sử dụng khuấy từ ở mức 1500 vòng/phút trong vòng 1 phút

- Các tiểu phân nano zein – curcumin được hình thành ngay lập tức, tạo ra hỗn dịch nano

- Đem cất quay hỗn dịch nano để loại EtOH dưới áp suất 0,09 – 0,1 MPa, nhiệt độ 45ºC, tốc độ quay khoảng hơn 220 vòng/phút (mức 8) Quá trình cất quay khoảng 15 –

20 phút và kết thúc khi thể tích hỗn dịch còn khoảng 15 ml

 Phương pháp 2:

Công thức bào chế theo phương pháp 2 được trình bày trong bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần các mẫu HD nano zein – curcumin bào chế theo phương pháp 2