SẢN XUẤT ENZYME PECTIN METHYLESTERASE từ nấm mốc ASPERGILLUS NIGER với CÔNG SUẤT 50 tấn năm

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG  ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC SẢN XUẤT ENZYME PECTIN METHYL

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG



ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

SẢN XUẤT ENZYME PECTIN METHYLESTERASE

TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

VỚI CÔNG SUẤT 50 TẤN/NĂM

HỒ THỊ THU SINH PHẠM THỊ THÙY TRANG ĐÀO LÊ PHƯƠNG UYÊN

TRẦN HOÀI NAM

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này, chúng em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của Quý Thầy, Cô và các bạn Với lòng biết ơn sâu sắc, chúng em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho chúng em thực hiện đề tài

Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Môi trường đã trang bị cho chúng em những kiến thức nền tảng trong suốt thời gian học tập tại trường Th.S Đào Thị Mỹ Linh đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ chúng

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các anh chị khóa 03DHSH, các bạn khóa 04DHSH đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ chúng em trong thời gian thực hiện đề tài

Do sự giới hạn về mặt thời gian và kiến thức, đề tài chắc chắn còn nhiều thiếu sót Mong nhận sự góp ý của Quý Thầy Cô để đề tài được hoàn thiện nhất

Nhóm sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHÓM i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về Enzyme Pectin Methylesterase 3

1.1.1 Tổng quan 3

1.1.2 Đặc điểm 3

1.1.3 Cơ chế tác dụng 4

1.1.4 Ứng dụng 5

1.1.5 Nguồn thu nhận 6

1.2 Tổng quan về nấm Aspergillus niger 7

1.2.1 Giới thiệu 7

1.2.2 Phân loại 8

1.2.3 Đặc điểm hình thái 8

1.2.4 Hình thức sinh sản 9

1.2.5 Đặc điểm sinh hóa 9

1.2.6 Phân bố 10

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất 10

1.3.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường 10

1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 11

1.3.4 Thời gian nuôi cấy 11

1.4 Các phương thức nuôi cấy 12

1.4.1 Phương pháp nuôi cấy bề sâu SmF 12

1.4.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt SSF 12

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH SẢN XUẤT 16

2.1 Quy trình sản xuất 16

2.2 Thuyết minh quy trình 17

2.2.1 Nguyên liệu 17

2.2.2 Phối trộn 18

2.2.3 Thanh trùng 18

2.2.4 Làm nguội 18

2.2.5 Nhân giống sản xuất 18

2.2.6 Gieo giống 19

2.2.7 Nuôi cấy 19

2.2.8 Nghiền 19

2.2.9 Trích ly 20

2.2.10 Kết tủa 20

2.2.11 Ly tâm 21

2.2.12 Lọc màng 21

2.2.13 Sấy thăng hoa (sấy đông khô) 21

2.2.14 Bao gói 22

CHƯƠNG 3: TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT 23

3.1 Kế hoạch sản xuất 23

3.2 Tính toán cân bằng vật chất cho từng giai đoạn 23

3.2.1 Bao gói 24

3.2.2 Quá trình sấy 24

3.2.3 Quá trình lọc 25

3.2.4 Quá trình ly tâm 25

3.2.5 Quá trình kết tủa 26

3.2.6 Quá trình trích ly 26

3.2.7 Quá trình nghiền 26

3.2.8 Quá trình lên men 27

3.2.9 Quá trình thanh trùng và làm nguội 27

3.2.10 Quá trình phối trộn 27

3.2.11 Quá trình chuẩn bị nguyên liệu 27

CHƯƠNG 4: TÍNH TOÁN THIẾT BỊ 29

4.1 Thiết bị nghiền nguyên liệu 29

4.2 Thiết bị phối trộn 30

4.3 Thiết bị thanh trùng 31

4.4 Thiết bị lên men 32

4.5 Thiết bị nhân giống 34

4.6 Thiết bị nghiền 36

4.7 Thiết bị trích ly 38

4.8 Thiết bị kết tủa 40

4.9 Thiết bị ly tâm 41

4.10 Thiết bị lọc 43

4.11 Thiết bị sấy 45

4.12 Thiết bị đóng gói 48

CHƯƠNG 5: TÍNH TOÁN KINH TẾ 50

5.1 Vốn cố định 50

5.1.1 Chi phí thiết bị 50

5.1.2 Chí phí nhà đất, xây dựng 51

5.2 Chi phí sản xuất trực tiếp 53

5.2.1 Chi phí nguyên liệu sản xuất 53

5.2.2 Chi phí nhân công 54

5.2.3 Chi phí năng lượng tiêu thụ 55

5.3 Chi phí sản xuất gián tiếp 55

5.3.1 Phí bảo trì thiết bị và công trình 55

5.3.2 Phí xử lý nước thải 55

5.3.3 Phí phát sinh 55

5.3.4 Chi phí bảo hiểm nhân công 56

5.3.5 Lãi vay vốn ngân hàng 56

5.3.6 Tổng khấu hao 57

5.4 Vốn lưu động 57

5.5 Tổng vốn đầu tư 57

5.6 Giá thành sản phẩm 57

5.7 Lợi nhuận hằng năm 58

5.8 Thời gian hoàn vốn của dự án 58

CHƯƠNG 6: TÍNH TOÁN RỦI RO 59

5.4 Đánh giá tính khả thi của dự án Error! Bookmark not defined 5.4.1 Giá trị hiện tại thuần (NPV) 59

5.4.2 Tỷ suất hoàn vốn nội bộ (IRR) 61

CHƯƠNG 7: TÍNH TOÁN RỦI RO 62

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của cám 17

Bảng 2.2: Thành phần môi trường Czapek 18

Bảng 3.1: Tỷ lệ hao hụt trong từng công đoạn 23

Bảng 3.2: Khối lượng từng thành phần 28

Bảng 4.1: Bảng thông số thiết bị nghiền nguyên liệu 29

Bảng 4.2 :Bảng thông số thiết bị phối trộn 30

Bảng 4.3: :Bảng thông số thiết bị thanh trùng 31

Bảng 4.4: Thông số giá lên men 33

Bảng 4.5: Bảng thông số thiết bị nghiền 37

Bảng 4.6: Bảng thông số thiết bị trích ly 39

Bảng 4.7: Thông số thiết bị kết tủa 41

Bảng 4.8: Bảng thông số thiết bị ly tâm 42

Bảng 4.9: Thông số thiết bị lọc khung bản 44

Bảng 4.10: Bảng thông số thiết bị sấy 45

Bảng 4.11: Các thông số kỹ thuật của máy đóng gói 49

Bảng 5.1: Tính toán chi phí thiết bị 50

Bảng 5.2: Danh mục phương tiện vận tải 51

Bảng 5.3: Chi phí xây dựng các công trình 51

Bảng 5.4: Chi phí nguyên liệu và hóa chất cho 1 mẻ sản xuất 53

Bảng 5.5: Chi phí nhân công chi tiết 54

Bảng 5.6: Chi phí năng lượng tiêu thụ trong một năm 55

Bảng 6.1: Giá trị dòng tiền của dự án 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc không gian ba chiều của PME 4

Hình 1.3: Aspergillus niger 5

Hình 1.4: Bào tử của A.niger 8

Hình 1.5: Sự phát triển của nấm sợi khi nuôi cấy bề mặt 15

Hình 4.1: Thiết bị nghiền 2012GM 29

Hình 4.2: Thiết bị trộn Coulter Mixer LDH-2 30

Hình 4.3: Thiết bị thanh trùng nằm ngang 31

Hình 4.4: Khay lên men môi trường bán rắn trong phòng lên men 33

Hình 4.5: Máy nghiền DP28 37

Hình 4.6: Thiết bị trích ly Ruian Xuanli Machinery Co., Ltd 39

Hình 4.7: Sơ đồ cấu tạo thiết bị kết tủa enzyme 40

Hình 4.8: Thiết bị ly tâm DHC400 42

Hình 4.9: Thiết bị lọc khung bản XmaZ 20/800U 44

Hình 4.10: Thiết bị sấy FD300 Freeze Dryer 45

Hình 4.11: Thiết bị đóng gói SV-L 48

LỜI MỞ ĐẦU

Trong nhiều thế kỷ qua, enzyme đã được sử dụng nhiều trong các loại thực phẩm cũng như các ngành công nghiệp khác (Kashyap et al, 2001; Aehle, 2004) Việc sử dụng enzyme trong sản xuất thực phẩm giúp tạo ra các sản phẩm có năng suất và chất lượng cao với giá thành thấp, đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng hơn so với việc sử dụng các phụ gia mà lại thân thiện với môi trường Việc ứng dụng enzyme trong thực phẩm đặc biệt là chế biến nước quả và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là một trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn Trong lĩnh vực chế biến nước quả: Các nghiên cứu thị trường mới nhất cho thấy nước uống trái cây ngày càng được ưa chuộng Tốc độ tiêu dùng nước ép trái cây bình quân đầu người tăng nhanh so với nước uống có gas Theo số liệu Công ty

Cổ phần nước giải khát Tribeco năm 2004 thì thị trường nước không gas tăng 10%/năm trong khi thị trường nước ngọt có gas tiếp tục sụt giảm 5%/năm Theo đó, cho thấy xu hướng chuyển dịch tiêu dùng sang nước uống giải khát không gas có lợi cho sức khỏe Theo số liệu thống kê năm 2007 thì thị phần nước trái cây toàn cầu chủ yếu tâp trung ở Châu Âu (45,8%), Mỹ (37,7%) trong khi đó Châu Á còn rất khiêm tốn Với tiềm năng về nguồn nguyên liệu thì Việt Nam hoàn toàn có thể sản xuất các loại nước uống trái cây Việc sử dụng enzyme để tăng hiệu suất ép dịch quả cũng như tăng độ trong của dịch quả là hết sức cần thiết

Pectin methylesterase (PME) một enzyme thuộc nhóm pectinase đã được quan tâm sử dụng và phát triển ở nhiều quốc gia (Saurel et al., 2003; Suutarinen và Autio, 2004) với các mục đích hạn chế sự phá hủy cấu trúc của tế bào thực vật, tăng hiệu suất ly trích nước quả và thúc đẩy nhanh quá trình sấy rau quả (Van, 1979; Sajjaanantakul và Pitifer, 1991) Ngoài ra enzyme này còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp khác nhằm xử lý nguồn nguyên liệu giàu pectin, ví dụ ngành công nghiệp dệt, xử lý nước thải, công nghiệp giấy, bột giấy, khai thác dầu (Jayani

et al, 2005; Kashyap et al, 2001)

Bên cạnh PME từ thực vật, nguồn giàu PME và được sử dụng nhiều nhất trong các chế phẩm pectinase thương mại là các PME từ vi sinh vật (Solis – Pereira et

al.,1993) Khi so sánh khả năng sinh pectinase của Aspergillus niger và các nấm mốc khác, Aspergillus niger được xác nhận là nhóm có khả năng sinh enzyme

pectinase hoạt tính cao và là nguồn phổ biến nhất cho sản xuất enzyme này

(Taragano et al.,1997)

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cũng như việc nuôi cấy, thu nhận

enzyme PME từ Aspergillus niger Tuy nhiên, ở Việt Nam hoàn toàn không có

xưởng sản xuất chế phẩm enzyme, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối

lượng lớn các loại enzyme (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009) Do

đó việc xây dựng một quy trình cũng như nhà máy sản xuất enzyme pectin

methylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger với quy mô công nghiệp là hết sức

cần thiết Đó là lý do chúng em thực hiện đề tài “Sản xuất enzyme pectin

methylesterase từ nấm mốc Aspergillus niger với công suất 50 tấn/năm”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Enzyme Pectin Methylesterase 1.1.1 Tổng quan

Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân chất pectic có trong thực vật Chúng bao gồm: polygalacturonases, pectinlyase, và pectin methylesterase (Pooja Kohli và cộng sự, 2015) Những enzyme này có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và hoa quả Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạt động của enzyme cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2010) Đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau enzyme amylase và protease

Enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) còn có tên gọi khác là pectinesterase (PE) là enzyme thuộc nhóm pectinase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin, giải phóng methanol và hình thành pectin có độ methoxyl thấp là các acid peptinic hoặc các acid peptic Đây là enzyme đặc hiệu, hiệu suất phân giải pectin có thể đạt 98% (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2010) Pectinase được tìm thấy trong thực vật, vi khuẩn và nấm Các PME trong thực vật và vi khuẩn có pH tối ưu là 6 - 8, trong khi PME sản xuất bởi nấm độ pH tối ưu

là 4 – 6 Các enzyme pectinase thương mại được sản xuất bởi các chủng vi sinh an

toàn từ Aspergillus sp Chúng được sử dụng rộng rãi trong ngành chế biến đồ uống

nước trái cây (Samantha Lemke Gonzalez, Neiva Deliberali Rosso, 2011)

1.1.2 Đặc điểm

PME có kích thước trung bình hay phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa PME thu nhận từ những nguồn khác nhau có điểm đẳng điện (pI) không giống nhau Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đối với một số enzyme được sinh tổng hợp từ nấm mốc đến giá trị pI là 11 trong trường hợp PME ly trích từ cà chua Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp PME có pI mang tính acid (Marianne Bordenave, 1996)

Hình 1.1: Cấu trúc không gian ba chiều của PME (Fabienne Micheli, 2001)

Đặc điểm của pectineaterase thực vật: cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1

và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nông độ enzyme PE1 giảm xuống nhưng PE2 tích lũy dần đến khi quả có màu đặc trưng của trái chín PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M theo thứ tự

PE trong quả cam có hai loại: đó là isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36kD nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và >= 11,0 theo thứ tự

pH tối ưu của PE1 là 7,6 còn của PE2 là 8,0

Enzyme từ vi sinh vật: tất cả các enzyme vi sinh vật không phải là protein

kiềm PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid Hoạt động của enzyme PE sinh ra bởi A niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hóa có chất pectin theo cùng một kiểu PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hóa và pectin này có thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion calcium (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2010)

1.1.3 Cơ chế tác dụng

Vách tế bào thực vật có cấu trúc rất phức tạp quyết định kích thước, hình dạng, liên quan đến sự tăng trưởng và phát triển của tế bào Thành phần chủ yếu của vách tế bào là các polysaccharides: cellulose, hemicelluloses và pectin, pectin chiếm khoảng 35% trọng lượng khô của thành tế bào (Fabienne Micheli, 2001) Lớp pectin

có vai trò là liên kết các tế bào với nhau, do đó khi sản xuất nước dịch quả hàm lượng pectin cao sẽ làm nước dịch quả bị đục và rất nhớt gây ảnh hưởng lớn đến quá trình sản xuất Bổ sung enzyme vào khối thịt quả nghiền làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả Thêm vào đó, sự phân hủy một phẩn tế bào bởi enzyme tạo thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cảithiện chất lượng cảm quan của dịch quả (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2012)

Enzyme pectin methylesterase xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Ca2+ và Mg2+ (Nguyễn Đức Lượng

và cộng sự, 2010)

Hình 1.2: Phản ứng thủy phân của PME (Fabienne Micheli, 2001)

Các nghiên cứu đối với PME cũng cho thấy phản ứng PME thuộc trường hợp đơn giản nhất chỉ có một cơ chất theo phương trình:

nhất từ các nguồn nấm (Aspergillus niger) và được ứng dụng nhiều trong công

nghiệp thực phẩm (Pooja Kohli và cộng sự, 2015)

Trong sản xuất rượu vang, nước quả Làm tăng hiệu suất trích ly bằng cách phá vỡ cấu trúc của pectin làm giảm độ nhớt của các loại nước ép trái cây giúp tăng hiệu quả lọc và ly tâm Để giảm pectin, PME được sử dụng kết hợp với pectinase khác như polygalacturonases và pectinlyase Trong một số trường hợp, pectinase được kết hợp với cellulase và hemicellulases để phá vỡ hoàn toàn thành tế bào thực vật

Cải thiện cấu trúc rau quả: Trong công nghiệp, hầu hết các quá trình như chần, làm lạnh, khử nước, thanh trùng và tiệt trùng được áp dụng để bảo quản trái cây và rau quả Tuy nhiên, cách này tác động tiêu cực đến chất lượng rau quả, có thể khắc phục được tình trạng này bằng cách sử dụng PME và CaCl2 làm săn chắc rau quả

Cơ chế này dựa trên sự đề methyl hóa của pectin trong mô thực vật do tác động của PME và canxi Khi có mặt của ion Ca2+ các pectin đã bị khử ester sẽ tạo gel giúp thành tế bào trở nên cứng chắc hơn Khi không có Ca2+ kết hợp vào mạch pectin thì enzyme polygalacturonases và pectinlyase sẽ hoạt động và thủy phân ngẫu nhiên mạch polymer của pectin làm cho rau quả trở nên mềm hơn (Trần Thanh Trúc, 2013)

Trong sản xuất cà phê Người ta dùng pectinase để tách lớp keo trên bề mặt của hạt cà phê, trước đây dùng vi sinh vật để thực hiện nhưng quá trình xảy ra không đồng đều và khó kiểm soát nên hiện nay thường dùng các chế phẩm từ enzyme pectinase để thay thế Ngoài ra vỏ cà phê là một phế phẩm không thể tránh khỏi trong quá trình sản xuất cà phê Trong thành phần của nó chứa nhiều hợp chất

khó phân hủy tự nhiên Bằng việc sử dụng 2 chủng nấm mốc Trichoderma viride và Aspergillus niger để sinh tổng hợp cellulase và pectinase làm cho quá trình phân

hủy diễn ra nhanh hơn, góp phần làm giảm ô nhiềm môi trường (Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng, 2009)

1.1.5 Nguồn thu nhận

Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme đang rất được quan tâm Hiện có hơn 50% tổng lượng enzyme công nghiệp được sản xuất từ nấm men và nấm mốc, một phần ba được tổng hợp từ nguồn vi khuẩn và phần còn lại từ thực vật, động vật

Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinase chủ yếu là vi sinh vật hiếu khí, tiêu biểu là các dòng sau:

- Nấm men: Saccharomyces fragilis

- Nấm mốc: Aspergillus sp., Penicillium glaucum, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa,…

- Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Bacillus felineus, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes, Erwinia carotovora,

Với ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc được sử dụng phổ biến để

nuôi cấy thu enzyme pectinase thương mại, trong đó, A niger là chủng sinh enzyme

pectinase nhiều (Lê Thị thu Trang, 2011)

Enzyme pectin methylesterase được tìm thấy ở một số loài thực vật: cà chua,

cam, đu đủ, táo, kiwi, vỏ bưởi, cam quýt Các loại nấm và vi khuẩn (Aspergillus niger, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacearum ) được ứng dụng nhiều

trong sản xuất các loại rượu, nước trái cây và các ngành công nghiệp thực phẩm khác (Pooja Kohli và cộng sự, 2015)

PME là enzyme được sinh tổng hợp chủ yếu trong nhóm pectinase từ A niger

Các nghiên cứu về vai trò của dòng nấm mốc đến khả năng sinh enzyme cũng đã xác nhận hoạt tính của enzyme pectin methylesterase được thu nhận từ nấm mốc

Aspergillus niger cao hơn hẳn so với các loài nấm mốc khác Hơn thế nữa A niger

còn được công nhận là dòng nấm có đặc tính an toàn dễ phát triển và phân lập (Trần Thanh Trúc, 2013)

1.2 Tổng quan về nấm Aspergillus niger

1.2.1 Giới thiệu

Aspergillus niger là một trong những loài vi sinh vậy quan trọng được sử dụng trong công nghệ sinh học Là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng

rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng

địa lý khác nhau trên thế giới Hiện nay, Aspergillus niger được sử dụng chủ yếu

trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α -amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase ) trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic,…

1.2.2 Phân loại

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Cấu trúc vi thể: bào tử dính dài trơn không màu hay nâu, thể bình 2 đáy, túi

nấm tròn đầu xòe A.niger sinh sản bằng hình thức bào tử dính không có túi bao

bọc

Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium).Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:

 Khuẩn ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu trắng Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để hút dưỡng chất Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng

 Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt Khuẩn ty sinh sản hướng vào không khí để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già

Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen (Trần Thanh Trúc, 2013) Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính là chitin

và glucan

Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc Cuống bào tử trơn nhẵn, trong suốt hoặc nâu nhạt, cuống bào tử có phần phình to ở đầu tạo thành bọng lớn dạng hình cầu được gọi là bọng đỉnh giá hình cầu (vesicle), trên có mọc lên những thể bình là

Họ (Family): Trichocomaceae

Chi (Genus): Aspergillus

Loài (Species): Aspergillus niger

cơ quan tạo bào tử đính (conidi) và từ ngọn thể bình sinh ra các chuỗi bào tử đính (conidia) Loài A.niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen

1.2.4 Hình thức sinh sản

A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:

 Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệ sợi nấm Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triễn thành khuẩn lạc mới

 Sinh sản vô tính: A.niger sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidium) Hầu

như các bào tử trần là các bào tử ngoại sinh, nghĩa là được hình thành ở bên ngoài tế bào sinh bào tử trần (conidiogenóu cell) Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn

ty hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone)

1.2.5 Đặc điểm sinh hóa

 Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau

A.niger đồng hóa tốt các loại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose Đối với đường sorbose, galactose, A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn

đường lactose thì đồng hóa ở mức trung bình

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

A.niger có khả năng sử dụng ure làm nguồn N và chất điều chỉnh pH, duới tác

dụng của enzyme urease, ure phân hủy thành CO2 và NH3 A.niger đồng hóa các

muối amon Việc sử dụng nguồn N hữu cơ, urease và các muối amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hấp thu vào cơ thể Như vậy NH3 là trung tâm con đường dinh dưỡng nitơ của vi sinh vật

Hình 1.4: Bào tử của A.niger

 Nguồn dinh dưỡng khoáng phospho

Sự có mặt của các hợp chất phospho và nồng độ của chúng trong môi trường

có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật Thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào và chất nhân Ngoài ra, phospho có trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính

hệ enzyme đồng hóa các loại thức ăn cacbon

 Khả năng sinh tổng hợp enzyme

A.niger có khả năng sinh các enzyme như amylase, protease, peptinase, α

-amylase, glucoamylase

1.2.6 Phân bố

Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên, đất, xác bã thực vật, hoa quả

và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc ký sinh, không có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các loại chất hữu có sẵn qua bề mặt khuẩn ty

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất

1.3.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

 Nguồn carbon

Nguồn carbon là thành phần đóng vai trò đặc biệt trong sự phát triển của vi sinh vật Đối với quá trình sinh tổng hợp PME, cũng như các enzyme khác trong nhóm pectinase, nguồn carbon giàu pectin có độ methoxyl hóa cao và đơn phân tử như acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác thường được

sử dụng (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991) Các thành phần này không chỉ đóng vai trò đơn thuần là nguồn carbon cho sự phát triển của vi sinh vật, mà còn là một cơ chất cảm ứng, xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp PME (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Nguyễn Đức Lượng, 2004; Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

như quá trình sinh tổng hợp enzyme Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng lượng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

 Nguồn cơ chất

Đặc điểm chung của môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme pectinase cũng như PME là sự có mặt chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

 Nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Phospho cần để tổng hợp các thành phần quan trọng của tế bào và nhiều coenzyme Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi

và các vi sinh vật khác Cation Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme Lưu huỳnh có mặt trong các acid amin quan trọng như methionine, cysteine, có vai trò tích cực trong việc kích thích sự hình thành enzyme Ngoài ra, calcium, mangan, corban,… cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp sẽ ảnh hưởng đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc và làm giảm hoạt lực của enzyme Nhiệt độ tốt

nhất cho A.niger phát triển và lên men là 30-40oC

1.3.3 Ảnh hưởng của pH

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao

và hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thường ít thay đổi trong khoảng thời gian nuôi cấy Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trường ủ có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển cảu nấm mốc và sự tạo thành enzyme Khi pH môi trường chuyển dịch về phía acid hoặc kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme lại bị kìm hãm Giá trị pH tối ưu trong quá trình lên men là 4,0 (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

1.3.4 Thời gian nuôi cấy

Thời gian lên men ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp enzyme và hoạt tính của enzyme Vi sinh vật cần thời gian để phát triển và sản sinh enzyme Nếu thời gian ủ quá dài môi trường sẽ cạn dần dinh dưỡng vi sinh vật phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, ngoài ra việc tạo bào tử cũng sẽ làm

giảm hoạt tính của enzyme Đối với A niger quá trình sinh tổng hợp enzyme nhiều

nhất thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004) PME

được tổng hợp từ A niger được nuôi cấy trong thời gian 96 giờ (Vinod Kumar Joshi

et al., 2006)

1.4 Các phương thức nuôi cấy

Quá trình nuôi cấy A niger để thu nhận PME có thể được thực hiện bằng hai

phương pháp lên men khác nhau: lên men bề mặt trên môi trường rắn (SSF) và lên men bề mặt trên môi trường lỏng (SmF)

Các nghiên cứu trước đã cho thấy enzyme thu được từ phương pháp SSF có hoạt tính cao hơn so với phương pháp SmF khi nuôi cấy trên cùng loại vi sinh vật

và cơ chất lên men, hoạt tính của PME trong phương pháp SSF cao hơn 2,3 lần so với SmF (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

1.4.1 Phương pháp nuôi cấy bề sâu SmF

Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng dịch thể Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục Do hệ thống khuấy trộn tốt nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là một hệ thống nhất

 Ưu điểm

 Cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi

 Ít tốn kém mặt bằng, tiết kiệm diện tích sản xuất

 Dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình sản xuất

 Nhược điểm

 Đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị

 Cần phải khuấy và sục khí lên tục

 Đòi hỏi trang bị kỹ thuật cao, dễ nhiễn trùng toàn bộ

 Dễ hỏng cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn

 Phế liệu phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trường

1.4.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt SSF

Phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm Thông thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu

và bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosphate)

 Ưu điểm

 Môi trường nuôi cấy đơn giản;

 Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường rắn hoặc bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng;

 Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dàng tinh sạch;

 Sử dụng kết hợp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc tế bào;

 Độ ẩm thấp và mật độ nấm mốc lớn nên hạn chế được sự lây nhiễm của nhiều loại vi sinh vật khác;

 Lượng tạp chất sinh ra thấp hơn trong SmF;

 Enzyme ít nhạy cảm với các chất ức chế dị hóa hoặc cảm ứng;

 Trong điều kiện thiết bị đơn giản, không có thiết bị phản ứng sinh học, việc

lên men SSF là phương thức hiệu quả, dễ thực hiện, có tính khả thi cao

 Việc cung cấp oxy cho vi sinh vật thuận tiện hơn, do hàm lượng oxy trong không khí cao hơn nhiều so với hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men, diện tích tiếp xúc của vi sinh vật với không khí trong môi trường rắn cũng cao hơn sự tiếp xúc của vi sinh vật với bọt khí trong môi trường lỏng

 Có thể tạo được sản phẩm ở dạng rắn

 Chi phí năng lượng thấp hơn

 Vận hành quy trình lên men cũng đơn giản hơn, không đòi hỏi trình độ chuyên môn cao

 Nhược điểm

 Các vi sinh vật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào cản về độ

ẩm của môi trường;

 Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxy tự do, CO2 khó theo dõi và khống chế hơn Vì thế việc duy trì chế độ lên men tối ưu trong suốt thời gian lên men là khó thực hiện

 Sự đảo trộn khó, dẫn đến việc lên men khó được đồng nhất

 Trong nhiều trường hợp, việc thu sản phẩm khó khăn hơn so với lên men trong môi trường lỏng

Trong kĩ thuật nuôi cấy bề mặt có hai loại môi trường nuôi cấy, đó là môi trường bán rắn và môi trường lỏng Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt dung dịch lỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí Khi đó các tế bào

vi sinh vật sẽ tạo thành những ván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng Enzyme sẽ được tổng hợp trong tế bào và thoát khỏi tế bào vào trong dung dịch nuôi cấy Do đó việc thu nhận enzyme thô trong dịch nuôi cấy cũng rất đơn giản Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực của enzyme thu nhận được của phương pháp này không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bán rắn Một mặt phương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ số sử dụng môi trường nuôi cấy không cao Vì vậy phương pháp này ít được dùng

Chính vì những lý do trên mà nhóm quyết định chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn này thường kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt

đầu nuôi cấy Trong giai đoạn này có những thay đổi sau:

Nhiệt độ tăng chậm

Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

Khối môi trường còn rời rạc

Enzyme mới bắt đầu hình thành

Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được

để nhiệt độ cao hơn 300

C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

 Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 ÷ 18 giờ tiếp theo Trong giai đoạn

này có những thay đổi cơ bản sau:

Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường

Môi trường được kết lại khá chặt

Độ ẩm của môi trường giảm dần

Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 400C ÷ 450C

Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá của nấm sợi

Các loại enzyme được hình thành

Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 290C ÷ 300C

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 20 giờ Lúc này nhiệt độ khối môi

trường sẽ giảm dần kéo theo cường độ hô hấp giảm một cách rõ rệt Màu sắc của nấm sợi bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng Trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme Do đó cần dừng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này

Đối với A niger quá trình sinh tổng hợp enzyme nhiều nhất thường kết thúc

khi nấm bắt đầu sinh bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Theo Vinod Kumar Joshi

et al (2006) và kết quả nghiên cứu của Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười (2014) tìm ra được điều kiện lên men sinh tổng hợp PME tốt nhất là 96 giờ

Hình 1.5: Sự phát triển của nấm sợi khi nuôi cấy bề mặt

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002)

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH SẢN XUẤT 2.1 Quy trình sản xuất

Hòa tan bằng đệm citrate ở pH 4,0

Lọc màng

Nhân giống sản xuất Làm nguội

Thanh trùng khay Phân phối vào khay nuôi

Lên men ở 37oC trong 96 giờ

Thu nhận chế phẩm enzyme thô Trích ly Dung dịch đệm citrate

Bã

Kết tủa

Enzyme

kỹ thuật

2.2 Thuyết minh quy trình

2.2.1 Nguyên liệu

 Nguyên liệu bột cám

-Chức năng: Là nguồn cung cấp dinh dưỡng chính để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của cám

Thành phần Đơn vị tính Khối lượng

Protein Lipit Gluxit Cellulose Tro Calci Photpho Sắt Vitamin B1

12,2 22,7 40,3 6,3 6,5 30,0 4,6 14,0 0,96

- Cách tiến hành: Bột cám gạo được nghiền đạt kích thước cần thiết sau đó được định lượng vào thiết bị phối trộn

 Nguyên liệu trấu

- Chức năng: Bổ sung trấu với mục đích tạo độ tơi xốp và tránh nguyên liệu bị kết dính

- Cách tiến hành: Trấu được đưa đi làm sạch, sau đó được chuyển đi định lượng, và xả xuống thiết bị trộn

 Nguyên liệu bã táo

- Chức năng: Là cơ chất cảm ứng tạo tổng hợp enzyme pectin methylesterase

Bã táo là nguồn cơ chất rất thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme PME hoạt tính enzyme thô thu được là 4,83 U/g (Trần Thanh Trúc, 2013)

- Cách tiến hành: Bã táo được nghiền đạt kích thước cần thiết sau đó được định lượng vào thiết bị phối trộn

2.2.2 Phối trộn

Môi trường nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinmethylesterase gồm có 62% là bột cám, 25% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme tương ứng là 5% cám mì và 5% bã táo, bổ sung amonium sulfate và amonium chloride 1%, amonium phosphate 2% Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho thanh trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm cho quá trình nuôi cấy, độ ẩm tối ưu là 55% pH=5,0

2.2.3 Thanh trùng

 Mục đích: Làm cho môi trường được tinh khiết về phương diện vi sinh vật

 Cách tiến hành: Thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong vòng 15 phút

2.2.4 Làm nguội

 Làm nguội gần đến nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích hợp về mặt nhiệt độ cho vi sinh vật phát triển Đây cũng là giai đoạn kiểm tra và loại bỏ những thành phần quá nhão hoặc khô so với yêu cầu

 Cách tiến hành: Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội đến nhiệt

độ khoảng 330C ÷ 340C Yêu cầu thời gian thực hiện quá trình này phải ngắn để tránh bị nhiễm vi sinh vật tạp

2.2.5 Nhân giống sản xuất

Để phù hợp với môi trường được chọn ta chọn giống Aspergillus niger để nuôi

cấy có khả năng sinh tổng hợp PME cao

Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy chuyền mỗi tháng một lần trong các môi trường thạch Czapek

Bảng 2.2: Thành phần môi trường Czapek

Nhân giống trên máy lắc

Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường trên mốc giống được nuôi trong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc

Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển qua phòng nhân giống để nhân giống sản xuất Quá trình nhân giống sản xuất cũng được thực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nhân giống

2.2.7 Nuôi cấy

Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình, giai đoạn này cần được giám sát chặt chẽ Những thay đổi của các thông số sinh lý trong giai đoạn này

sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng enzyme thành phẩm

- Cách tiến hành: Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được chuyển canh trường qua cân định lượng và được đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy và tiến hành nuôi Thời gian nuôi cấy nấm mốc 96 giờ

2.2.8 Nghiền

Mục đích: vừa phá vỡ tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của tế bào Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào

Trong khi nghiền người ta thường bổ sung những chất trợ nghiền trong trường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô

cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát Trước khi được

sử dụng phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật

2.2.9 Trích ly

Mục đích: trích ly giúp PME có thể liên kết và khuếch tán ra ngoài dung môi ở mức tối đa, giảm mất hoạt tính của enzyme Vi lọc dùng để loại bỏ vi khuẩn, xác vi sinh vật, và các tạp chất trong dung dịch enzyme

Sử dụng dung dịch đệm citrate (pH= 3,6) với tỷ lệ dung dịch đệm : cơ chất 2:1 v/w Nhiệt độ trích ly 35oC, thời gian 50 phút Sau khi trích ly sử dụng vi lọc 0,2 micromet để lọc và thu được chế phẩm enzyme thô

2.2.10 Kết tủa

Kết tủa bằng muối là một trong các cách thức phổ biến nhất để tách protein Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Phương pháp kết tủa bằng muối dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định để loại bỏ một phần protein tạp của dung dịch enzyme (Scopes, 1994) Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau:

citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate

Đối với các cation muối hiệu quả kết tủa tăng dần theo thứ tự: Na+

< K+

<NH4+

Trong số các loại muối được sử dụng, người ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất Vì muối (NH4)2SO4 có độ hòa tan cao, rẻ tiền, đồng thời muối (NH4)2SO4

có độ ion hóa cao Thêm vào đó, kết tủa thu được bằng phương pháp này ổn định, ít

bị biến tính nhưng phải tiến hành quá trình loại muối Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước quanh phân tử Khi thêm muối ammonium

sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau

và tủa xuống (Mukherjee and Banerjee, 2006)

Theo nghiên cứu của Trần Thanh Trúc (2013) thì tỷ lệ (NH4)2SO4 : PME thô

từ 55 : 65 (w/v) khi đó đạt 6,87 U/mg protein độ tinh sạch 5,45 lần và hiệu suất thu hồi là 62,23%

2.2.11 Ly tâm

Trong quá trình ly tâm tách tủa enzyme ra khỏi hỗn hợp dung môi dung dịch chỉ cần tốc độ ly tâm thấp để thu cặn nên ta dùng máy ly tâm dạng đĩa để tiến hành thu cặn vì thể tích chứa của máy ly tâm đĩa cao hơn so với quá trình ly tâm ống nên

sử dụng máy ly tâm đĩa là phù hợp trong quá trình thu cặn Thể tích thùng của máy

ly tâm dạng đĩa lớn phù hợp với quy mô công nghiệp

Để tránh hiện tượng biến tính enzyme thường ly tâm ở 4oC với vận tốc 6500 vòng/phút trong 15 phút Sau đó thu kết tủa

2.2.12 Lọc màng

 Mục đích: Loại bỏ muối amonisulfat

 Mẫu enzyme được hòa tan trong dung dịch đệm citrate pH 4 sau đó được bơm qua hệ thống màng ở phân đoạn 20 kDa và tiến hành quá trình lọc khối lượng phân tử của PME khoảng 43 kDa do đó phần dịch lọc chứa muối amonisulfat đã tan trong dịch đệm bã lọc chứa enzyme ở dạng sệt được thu nhận và chuyển sang giai đoạn sấy tạo thành phẩm

2.2.13 Sấy thăng hoa (sấy đông khô)

Sấy đông khô sử dụng chân không và kết đông để loại bỏ nước Sấy đông khô chân không là một kỹ thuật sấy sản phẩm ưu việt Trước hết nguyên liệu được đông lạnh đột ngột, làm nước trong sản phẩm đóng thành thể rắn, rồi qua xử lý chân không thăng hoa (sublimes) thành dạng hơi rồi ngưng tụ thành nước và thải ra ngoài, sản phẩm trở thành dạng khô Sấy thăng hoa có ưu điểm rất lớn so với các phương pháp sấy khác đó là: sản phẩm có chất lượng cao giữ nguyên được màu sắc, cấu trúc, hoạt tính sinh học Tiêu hao năng lượng để bay hơi hàm ẩm thấp

Quá trình sấy thăng hoa thường gồm 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: lạnh đông nguyên liệu để chuyển một phần nước trong nguyên liệu sang dạng rắn

 Giai đoạn 2: tạo áp suất chân không rồi gia nhiệt nguyên liệu đã lạnh đông trong buồng sấy để nước thăng hoa

 Giai đoạn 3: do trong giai đoạn lạnh đông không thể chuyển toàn bộ lượng nước trong nguyên liệu sang dạng rắn nên sau giai đoạn sấy thăng hoa là giai đoạn sấy chân không để tách thêm một phần ẩm ở dạng lỏng trong nguyên liệu, đảm bảo độ ẩm trong nguyên liệu sau quá trình sấy đạt yêu cầu

 Nhiệt độ

Giai đoạn lạnh đông: nhiệt độ bắt đầu <20-250

C, nhiệt độ kết thúc từ -300C đến -200C

Giai đoạn sấy thăng hoa: nhiệt bắt đầu từ -300C đến -200C, nhiệt độ kết thúc từ -200C đến 300

C

 Phương pháp gia nhiệt: chọn phương pháp gia nhiệt bằng bức xạ (vì nguyên liệu được gia nhiệt đồng đều hơn và việc thoát hơi nước ra môi trường xung quanh diễn ra dễ dàng hơn)

 Áp suất trong buồng sấy: 27-133 Pa

 Độ ẩm nguyên liệu sau khi sấy: <5%

Năng suất của thiết bị thăng hoa tác động liên tục tính theo độ ẩm bốc hơi lớn hơn 200 kg/h Thời gian có mặt của sản phẩm trong máy sấy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cao nhất của sản phẩm cuối quá trình sấy nhỏ hơn 270C

2.2.14 Bao gói

Sau khi thu được chế phẩm enzyme dạng bột ta đem đi đóng gói bằng thiết bị bao gói tự động khối lượng định sẵn thu nhận thành phẩm enzyme kỹ thuật

CHƯƠNG 3: TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT

3.1 Kế hoạch sản xuất

Giả sử một năm làm việc 330 ngày

Thời gian lên men một mẻ là 96 giờ, 5 mẻ vệ sinh 1 lần trong 24 giờ

Thời gian lên men và vệ sinh trong 5 mẻ là: 96 x 5 + 24 = 504 giờ

Vậy số mẻ lên men trong một năm là:

𝑆ố 𝑚ẻ =330 x 24 x 5

504 = 78,6 (𝑚ẻ)

Do đó số mẻ sản xuất được trong một năm là 78 mẻ

Sản lượng sản xuất là 50 tấn/năm

Vậy năng suất thu sinh khối của nhà máy theo mẻ là:

𝑚𝑃𝑀𝐸 =50 x 1000

78 = 641,03 (𝑘𝑔/𝑚ẻ)

3.2 Tính toán cân bằng vật chất cho từng giai đoạn

Bảng 3.1: Tỷ lệ hao hụt trong từng công đoạn

Quá trình

Tỷ lệ tổn thất

Hiệu suất quá trình Tài liệu tham khảo

Chuẩn bị nguyên liệu 5%

Thanh trùng và làm nguội 1,5%

2013

Lượng sản phẩm sau khi sấy là PSS = PTB = 641,7 (kg/mẻ)

Độ ẩm vật liệu trước khi sấy là W1 = 50% (lượng enzyme sau khi lọc ở dạng sệt)

Độ ẩm vật liệu sau khi sấy là W2 = 3%

Lượng ẩm bay hơi là W:

Ta có công thức tính lượng ẩm dựa theo “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2” do Nguyễn Bin và cộng sự biên soạn (2006)

PTS = PSS + W Và:

Tỷ lệ tổn thất 1,5% và hiệu suất quá trình đạt H = 90%

Ta có lượng sản phẩm trước khi sấy là :

PTS = (641,7 + 603,198) × 100

100 − 1,5×

100

90 = 1404,3 (kg/mẻ)

3.2.3 Quá trình lọc

Tỷ lệ tổn thất 2% và hiệu suất quá trình đạt H = 80%

Lượng sản phẩm trước khi lọc:

PTLo = 1404,3 × 100

100 − 2×

100

80 = 1791,2 (kg/mẻ)

Ta có khối lượng của enzyme là 1791,2 kg/mẻ kèm theo lượng muối đã kết tủa

enzyme là 1764,7 kg được tính từ quá trình kết tủa

Khối lượng riêng của enzyme là 1,05 kg/l, thể tích của enzyme là:

 VMuối tủa = 997,00565 lit

 Vậy nên ta sẽ sử dụng lượng muối để kết tủa enzyme là: 997,1 lit

Tổng thể tích vật chất trong quá trình lọc là:

VL = VMuối tủa + VEnzyme = 997,1 + 1705,9 = 2703 (lit)

3.2.4 Quá trình ly tâm

Tỷ lệ tổn thất 1,8% và hiệu suất quá trình đạt H = 85%

Lượng sản phẩm trước khi ly tâm:

PTLy = 1791,2 × 100

100 − 1,8×

100

85 = 2145,93 (kg/mẻ) Sau quá trình kết tủa ta thu được 2145,93 kg enzyme trong đó còn khối lượng muối bổ sung vào là M(NH4)2SO4 = 2835,72 (kg)

Khối lượng riêng của enzyme là 1,05 kg/l, thể tích của enzyme là:

Tổng thể tích vật chất trong quá trình ly tâm là:

VLT = VMuối + VEnzyme = 1602,102 + 2043,743 = 3645,845 (lit)

3.2.5 Quá trình kết tủa

Tỷ lệ tổn thất 2% và hiệu suất quá trình đạt H = 62,23%

Lượng sản phẩm trước khi kết tủa:

PTKT = 2145,93 × 100

100 − 2×

10062,23 = 3518,8 (kg/mẻ) Giả sử sau quá trình trích ly toàn bộ dung dịch đệm đã được loại bỏ hoàn toàn,

do đó trong quá trình kết tủa có bổ sung thêm muối để thu nhận enzyme mà tỷ lệ (NH4)2SO4 : PME thô từ 55 : 65 (w/v) [Trần Thanh Trúc, 2013]

Khối lượng riêng của enzyme là: 1,05 kg/l, thể tích của enzyme là:

VEnzyme =3518,8

1,05 = 3351,3 (lit) Vậy khối lượng muối cần sử dụng là:

Tỷ lệ tổn thất 3% và hiệu suất quá trình đạt H = 80%

Lượng canh trường trước khi trích ly:

PTTL= 3518,8 × 100

100 − 3×

100

80 = 4534,54 (kg/mẻ) Trong quá trình trích ly ta bổ sung thêm dung dịch đệm citrate với tỷ lệ dung dịch đệm : cơ chất là 2 : 1 v/w [Lê Thị Thu Trang, 2011]

Thể tích của dung dịch đệm citrate cần dùng là: 4534,54 x 2 = 9069,08 (lít)

3.2.7 Quá trình nghiền

Tỷ lệ tổn thất 0,5% và hiệu suất quá trình đạt H = 85%

Lượng sản phẩm trước khi nghiền

PTN = 4534,54 × 100

100 − 0,5×

100

85 = 5361,56 (kg/mẻ)

3.2.8 Quá trình lên men

Tỷ lệ tổn thất 2%, giả xử hiệu suất quá trình đạt H = 70% lượng môi trường (không tính đến khối lượng giống và nước) được sử dụng để tạo ra 4103,4 kg enzyme thô

Khối lượng môi trường

3.2.11 Quá trình chuẩn bị nguyên liệu

Bao gồm các quá trình nghiền nguyên liệu thô tới kích thước cần thiết

Tỷ lệ tổn thất là 5%

Ta có khối lượng môi trường trước khi nghiển là:

MNg = 7958,6 × 100

100 − 5= 8377,48 (kg/mẻ)

Từ khối lượng tổng của các nguyên liệu và tỷ lệ từng thành phần ta có khối lượng từng nguyên liệu như bảng sau:

= 4,61 (m3)

16,5 × 8377,48100

= 1382,3 (l)

9 Tổng

Khối lượng nguyên liệu = 8377,488 (kg) Thể tích nước, giống = 5,9923 (m 3 )

CHƯƠNG 4: TÍNH TOÁN THIẾT BỊ

4.1 Thiết bị nghiền nguyên liệu

Chọn thiết bị nghiền 2012GM Sản phẩm của công ty CPĐT Tuấn Tú

Hình 4.1: Thiết bị nghiền 2012GM Bảng 4.1: Bảng thông số thiết bị nghiền nguyên liệu

Trọng lượng máy không động cơ 1500 kg

Thành phần nguyên liệu trước khi nghiền bao gồm: bột cám 5194,04 kg, cám

mì 418,847 kg, bã táo 418,874 kg Tổng khối lượng nguyên liệu nghiền là:

M = 5194,04 + 418,847 + 418,847 = 6031,734 (kg)