NGHIÊN cứu môi TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY TIÊN TRẮNG (dendrobium farmeri) và THỜI GIAN HUẤN LUYỆN ở GIAI đoạn vườn ươm

HCMNội dung nghiên cứu gồm 4 thí nghiệm về ảnh hưởng của các chất điều hòasinh trưởng BA kết hợp Kinetine trên môi trường MS và NAA kết hợp than hoạttính trên môi trường MS; ảnh hưởng củ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY TIÊN TRẮNG (Dendrobium farmeri) VÀ

THỜI GIAN HUẤN LUYỆN Ở GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

Người hướng dẫn: TS PHAN TƯỜNG LỘC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ THU TRINH

Lớp: 1406030

Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời nói đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phan Tường Lộc

đã tận tình hướng dẫn cũng như chỉ bảo, giải đáp mọi thắc mắc và hỗ trợ hết mìnhcho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin phép được tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Công ty TNHHNông Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận Đồng thời xin gửi lờicám ơn đến quý cô chú, anh chị công tác tại công ty đã giúp đỡ tôi trong thời gianthực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, quý thầy cô bộ mônCông nghệ sinh học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích về lý thuyết lẫn thực tiễn,tạo nền tảng cho kiến thức của tôi trong suốt thời gian học tập ở trường Đại học TônĐức Thắng

Xin cảm ơn tập thể lớp 14060301 và các bạn bè, anh chị đã động viên, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ đã cho con sắc vóc này, nuôi dưỡng và dạy

dỗ con thành người, cho con niềm tin và nghị lực để cố gắng trước mọi thử thách,khó khăn

TP Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2019

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Trinh

TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướngdẫn khoa học của TS PHAN TƯỜNG LỘC Các nội dung nghiên cứu, kết quảtrong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giáđược chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệutham khảo

Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như sốliệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồngốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình Trường đại học Tôn Đức Thắng không

liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trìnhthực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 01 năm 2019

Nguyễn Thị Thu Trinh

“ NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN THỦY

TIÊN TRẮNG (Dendrobium farmeri) VÀ THỜI GIAN HUẤN LUYỆN Ở GIAI

ĐOẠN VƯỜN ƯƠM“

Giảng viên hướng dẫn TS PHAN TƯỜNG LỘC

Đề tài được thực hiện tại công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Nông Vinh TP HCMNội dung nghiên cứu gồm 4 thí nghiệm về ảnh hưởng của các chất điều hòasinh trưởng (BA kết hợp Kinetine trên môi trường MS và NAA kết hợp than hoạttính trên môi trường MS); ảnh hưởng của môi trường Hyponex liquid 6-10-5 đến sự

sinh trưởng và phát triển của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) trong nuôi cấy in vitro; ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến sự sinh trưởng và phát triển

của lan Thủy tiên trắng ở giai đoạn vườn ươm

Các kết quả đạt được:

Môi trường MS kết hợp với BA ở nồng độ 0,5 mg/L và Kinetine ở nồng độ 0,5

mg/L là tốt nhất đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng in vitro với kết

quả: số chồi là 28,72; số lá 26,89 và chiều cao 2,03 cm

Môi trường Hyponex có nồng độ 0,6 ml/L là thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển chồi lan Thủy tiên trắng in vitro với kết quả: chiều cao chồi 3,63 cm, số lá

5,69, số rễ 5,69, chiều dài rễ 2,62 cm

Môi trường MS kết hợp với NAA ở nồng độ 0,5 mg/L và than hoạt tính 0,5 g/

L là tốt nhất đến khả năng tạo rễ của chồi lan Thủy tiên trắng in vitro với kết quả:

7,33 rễ và chiều dài rễ 2,90 cm

Ở giai đoạn vườn ươm, cây con với thời gian huấn luyện 15 ngày cho tỷ lệsống cao và phát triển tốt nhất

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Ý nghĩa 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về phong lan 3

2.1.1 Giới thiệu chung về họ lan 3

2.1.2 Phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 1

2.2 Giới thiệu về lan Thủy tiên trắng 2

2.2.1 Phân bố 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái 4

2.3.Kỹ thuật nhân giống in vitro 5

2.3.1 Vài nét về nhân giống in vitro 5

2.3.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 6

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân giống in vitro 9

2.4.Giới thiệu phân bón Hyponex liquid 6-10-5 18

2.5.Các nghiên cứu trước đây liên quan đến đề tài 19

2.5.1 Các nghiên cứu nước ngoài 19

2.5.2 Các nghiên cứu trong nước 20

CHƯƠNG 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1.Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 22

3.2.Nội dung nghiên cứu 22

3.3.Vật liệu nghiên cứu 22

3.3.1 Nguyên liệu nuôi cấy 22

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ 22

3.3.4 Môi trường nuôi cấy 22

3.3.5 Điều kiện nuôi cấy 23

3.4.Phương pháp thí nghiệm 23

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine .23 đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 23 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex .24

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 25

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến .25

CHƯƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine 27

đến khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 27 4.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex .31

4.3.iThí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến 35

khả năng tạo rễ của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 35

4.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm 39

CHƯƠNG 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1.Kết luận 43

5.2.Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 48

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của Kinetine 16 Hình 2.5 Công thức cấu tạo của NAA 16 Hình 2.6 Phân bón Hyponex liquid 6-10-5 17 Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi

của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 29

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến số lá và số

rễ của chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 33

Hình 4.3 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày 37

Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến chiều cao và chiều dài rễ

của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo 7

trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 23

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) 24

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây in

vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm 25

Bảng 4.1 Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng

nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 26

Bảng 4.2 Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng

nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 27

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh

trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 30

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh

trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 31

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 34

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 35

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng

nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 27

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine số lá và số rễ của chồi

lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 28

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh

trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 31

Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến chiều cao

và chiều dài rễ chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy

33

Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của

lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy 35

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của

lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 60 ngày nuôi cấy 36

Biểu đồ 4.7 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây con đến sự phát triển

của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm.39

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây việc trồng và kinh doanh lan nói chung và đặc biệt

là lan rừng ở nước ta phát triển rất mạnh Trước đây việc trồng và sưu tầm lan rừngchỉ dành cho các nghệ nhân hay những người có đam mê Tuy nhiên hiện nay đờisống của người dân không ngừng được cải thiện nhu cầu về tinh thần cũng tăng lên,người dân có khuynh hướng tìm những cái quý hiếm, đẹp và lạ

Với vẻ đẹp quyến rũ và mùi thơm thanh cao của lan rừng đã đáp ứng đượcđiều này, nắm bắt được nhu cầu đó nhiều người đã khai thác lan rừng một cách bừabãi số lượng lớn để cung cấp cho thị trường Chính điều này cùng với việc diện tíchrừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp đã làm cho nhiều giống lan rừng trở nên hiếm và

có nguy cơ tuyệt chủng Thủy tiên trắng được mệnh danh là nàng Kiều mang mộtmàu trắng tinh khôi làm lay động lòng người cùng với hương thơm dịu nhẹ, pháthoa buông thoảng với chiều dài 30cm Đây là loài lan quý rất có giá trị về thẩm mỹ

và tiềm năng kinh tế Hiện nay giống lan này được khá nhiều người sưu tầm và khaithác do hoa thường nở vào mùa xuân, đặc biệt lại thích hợp với điều kiện khí hậucủa khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận, nên ngày càng đượctrồng rộng rãi và phổ biến

Tuy nhiên, nhu cầu thưởng hoa của người dân ngày càng tăng mà số lượngcây giống khai thác từ rừng hiện không cung cấp đủ Vì vậy việc nghiên cứuphương pháp và xây dựng quy trình nhân giống nhằm bảo tồn nguồn gen và cungcấp cho thị trường là yêu cầu bức thiết Các phương pháp nhân giống truyền thốngthường được áp dụng đối với lan là tách, chiết, giâm tuy nhiên cho hệ số nhân giống

thấp và cây dễ bị thoái hóa Hiện nay phương pháp nhân giống in vitro được nghiên

cứu và áp dụng thành công trong sản xuất giống nhiều loại cây trồng khác nhau đặcbiệt là đối với nhân giống lan Nhưng chưa có nhiều nghiên cứu đối với giống lanthủy tiên trắng trong các loài lan rừng Việc nhân giống lan này khá khó khăn vàchủ yếu là dùng phương pháp truyền thống nên hệ số nhân thấp và kém hiệu quả Vì

vậy việc áp dụng nhân giống in vitro đối với lan thủy tiên trắng để phục vụ cho

công tác bảo tồn nguồn gen và nghiên cứu lai tạo đồng thời cung cấp giống cho thị

trường là điều rất cần thiết Do đó đề tài “Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu

Xác định được môi trường thích hợp cho sự phát triển chồi và tăng trưởng

trong quá trình nuôi cấy in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri); đồng

thời xác định thời gian huấn luyện thích hợp để tạo ra cây con có chất lượng tốt nhất

ở giai đoạn hậu cấy mô

1.3 Ý nghĩa

Giúp việc nhân giống lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) hiệu quả với

môi trường tối ưu tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo và tạo

ra nguồn cây giống có chất lượng tốt để đáp ứng nhu cầu của thị trường

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về phong lan

2.1.1 Giới thiệu chung về họ lan

Trong thế giới các loài hoa, hoa lan là một trong những loài hoa đẹp nhất Hoalan được coi là loài hoa tinh khiết, hoa vương giả cao sang, vua của các loài hoa.Hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hình dáng lẫn hương thơmquyến rũ Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa tao nhãđến dạng hình thân, lá, cành duyên dáng ít có loài hoa nào sánh nổi Hoa lan đượcnhiều người yêu thích và đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong thếgiới thảo mộc Với 750 chi và 20.000 - 25.000 loài (theo A.L Takhtajan 1978), cùngvới những loài mới được khám phá và mô tả theo hàng năm Họ phong lan chỉ đứngthứ hai sau họ cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong lớp một lámần Chính vì thế, hình thái, cấu tạo cũng như hệ thống phân loại của loài này hếtsức đa dạng và phức tạp [9] Những nhà sang lập ngành Lan đáng kể nhất là triết giangười Hy Lạp Theophrastus (372 - 287 TCN), và sau này là nhà thực vật học ThụyĐiển Linnaeus (1707 - 1778) Chính Theophrastus là người đầu tiên sử dụng từ Hylạp “Orchis” để chỉ nhóm lan

2.1.2 Phân bố

Họ lan phân bố rất rộng từ 680 vĩ bắc đến 560 vĩ nam, tuy nhiên trung tâm phân

bố là ở các vùng nhiệt đới đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á Càng đi xa vùngnhiệt đới đến vùng cực thì sự phân bố họ lan cũng giảm dần Việt Nam chúng tanằm trong khu vực Đông Nam Á là một trong hai trung tâm phát sinh của hoa lan

Có vị trí địa lí đặc biệt nên nhìn chung họ phong lan của Việt Nam rất phong phú và

đa dạng Theo thống kê sơ bộ, phong lan Việt Nam có khoảng 137 - 140 chi và trên

800 loài trong đó có nhiều chi loài mới hệ thực vật toàn cầu [9]

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cơ quan dinh dưỡng

Giả hành (thân giả): chỉ xuất hiện trên các loài đa thân Giả hành là bộ phận

rấtcần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Khác với thực vật có hoa khác,giả hành là thân nhưng lại chứa diệp lục Đây là bộ phận chứa nhiều chất dinhdưỡng rất cần thiết cho sự phát triển giả hành mới sau khi trổ hoa và nghỉ ngơi Giảhành cũng là cơ quan dự trữ nước Có sự biến động lớn về hình dạng giả hành củacác loài khác nhau

Thân: Chỉ có ở loài lan đơn thân và một số loài của giống Dendrobium và

Epidendreum vừa có giả hành vừa có thân Thân thường mang rễ và lá Thân là cơ

quan chứa nước chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá, trên thân có đốt, trên mỗiđốt mọc một nhánh lá hoặc bao lá

Lá: Có sự biến động lớn về hình dáng cũng như kích thước tùy chủng loại

khác nhau Đây là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, lá có thể mọc đối xứng qua gânchính hay không Đuôi lá có thể tròn, nhọn hay khuyết Tuy nhiên, điểm chung nhất

ở các loài lan là lá thường dài hơn rộng gắn vào thân hay giả hành bởi cuống lá

Căn hành (thân-rễ): Chỉ gặp lan đa thân là nơi cấu tạo các cơ quan dinh

dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết hoặc hưu niên Do đó căn hành là

bộ phận quan trọng cho việc duy trì và phát triển số lượng lan theo phương phápchiết tách nhánh thông thường

Rễ: Hệ rễ làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ cây gỗ, hấp thu chất

dinh dưỡng, địa lan thì rễ mang nhiều lông hút

Cơ quan sinh sản

Hoa: cấu trúc của hoa lan gồm 7 bộ phận: 3 lá đài, 3 cánh hoa và một trụ

mang hoa Môi là một cánh hoa biến thái thành ở mức dộ cao chứ không phải cấutrúc riêng Hoa lưỡng tính đối xứng hai bên, bao hoa dạng cánh rời xếp thành haivòng Hoa thường tập hợp thành cụm hoa hay chùm bông [15]

Quả: thuộc loại quả nang nở thành 3 - 6 đường nức dọc, hạt rất nhỏ và nhiềunên phát tán chủ yếu nhờ gió Thường không có nội nhủ nên phôi hạt phát triển yếukhông phân hóa thành cơ quan Hạt muốn nảy mầm cần có nấm cộng sinh [9]

2.2 Giới thiệu về lan Thủy tiên trắng

Lan Thủy tiên trắng thuộc

Lan Thủy tiên là loài lan thích nắng, phát triển tốt ở khí hậu nhiệt đới ẩm,siêng ra hoa, có nhiều loại, mang nhiều màu sắc khác nhau Một số loài phổ biếnnhư:

Thủy tiên tím (Dendrobium amabile)

Giả hành trắng, có màu nâu hoặc xanh đen, dài khoảng 40 – 100 cm, lá mọc so

le, thuôn nhọn và dài cứng, hoa mọc từ gốc lá, phát hoa màu tím, cánh trắng họngvàng, chùm hoa buông thõng, dài 25 – 35 cm, nở vào cuối mùa xuân

Thủy tiên vàng (Dendrobium palpebrae)

Thân vuông, cánh đài ngắn, giả hành hình thoi, lá xoan thon, dài 8 – 10 cm,hoa mọc thành chùm, dài 25 – 30 cm, mỗi hoa to cỡ 5 cm, cánh hoa màu trắng, môihoa màu vàng Thời điểm nở hoa vào khoảng tháng 1 âm lịch

Thủy Tiên mỡ gà (Dendrobium densiflorum)

Giả hành có 4 cạnh, màu lục đậm, thân cây dài, lá to, rộng nhưng hơi mỏng.Phát hoa dày, màu vàng, môi đậm Đây là loài lan được trồng với mục đích sưu tầm

là chính bởi rất khó trồng và chăm sóc

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Thân cây trung bình, gốc nhỏ, có khoảng 3 - 5 lá, không rụng lá Hoa mọcthành từng chùm, cánh trắng môi vàng, có mùi thơm dịu Vì là loài lan dễ trồng,không có mùa nghỉ nên nhiều người chơi lan thường chọn giống lan này cho vườnlan của mình [30]

Hình 2.1. Một số loài lan Thủy tiên

A Lan Thủy tiên vàng (Dendrobium thyrsiflorum)

B Lan Thủy tiên tím (Dendrobium amabile)

C Lan Thủy tiên mỡ gà (Dendrobium densiflorum)

Hình 2.2 Cấu tạo hoa lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

2.2.1 Phân bố

Thủy tiên trắng hay còn gọi là Hoàng thảo thủy tiên trắng hoặc Kiều vuông cónguồn gốc xuất sứ từ rất nhiều nơi đặc biệt vùng Đông Nam Á Ở Việt Nam phân

bố chủ yếu ở Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam [33]

2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái

Lá: Loại này ra rất ít lá, lá có bẹ lá ôm sát thân, có khoảng từ 3 - 5 lá, lá dài từ

7 - 10 cm và rộng khoảng 5 - 7 cm (hoặc có thể to hơn 7 cm, loại đặc biệt, dạng lámít), màu của lá thường có màu xanh đậm, màu xanh vàng tùy thuộc vào tình trạngcây đủ nắng hoặc thiếu nắng Lá mọc dạng so le và cách nhau từ 1 – 2 cm Cổ láthường có khấc màu xanh trắng, trên lá cây có thể sẽ có nhiều gân và có thể có sọctrắng mờ dọc theo lá, cuối từng chiếc lá sẽ có những vết khuyết nhỏ chéo giữa nửa

lá này và nửa lá bên kia Thường cây đến cuối năm sẽ ngừng phát triển và rụng lá từdưới sau đó lan dần lên ngọn nhưng cây vẫn hút nước qua rễ để nuôi thân và chohoa năm tới

Rễ cây: thuộc loại rễ chùm, đầu rễ có màu xanh trắng Thân rễ thường có màutrắng ngà và ít khi có màu khác Cây ra rễ ở gốc và ở các cây ki con mọc ra trênthân cây cũ Với khí hậu nóng và không lạnh thì rễ mọc quanh năm, còn nếu có mùađông rễ cây sẽ ngừng phát triển hoăc phát triển rất chậm Rễ cây bắt đầu ra sẽ có rấtnhiều đầu rễ sau đó theo năm tháng sẽ dài ra và tiếp tục ra nhiều rễ phân nhánh conbám vào chất trồng để đi tìm hơi ẩm

Hoa: Chùm hoa ở gần ngon, thường ở trên các giả hành đã rụng lá, hoa mọcriêng lẻ xung quanh phát hoa thành chùm dài khoảng 25 – 30 cm Hoa có màu trắng

ở cánh, họng có nhiều lông tơ mịn, môi màu vàng tươi có vành trắng ở mép, cũng

có loại hoa phớt hồng nhưng ít gặp hơn

Đặc điểm sinh thái

Đây là loài thuộc giống Dendrobium ra hoa nhưng không rụng lá Thủy tiên

trắng nở hoa thường vào mùa xuân, ra hoa vào khoảng từ tháng 1 đến tháng 3 Hoa

nở rải rác và có cây cho tận 2 lần hoa trong 1 năm Độ bền của hoa khoảng 5 - 7ngày nếu ở trong điều kiện nóng và khô, cũng có thể lên đến đến khoảng > 7 ngàynếu thời tiết mát mẻ [32]

Hoa lan Thủy tiên trắng là loại hoa lan ưa ẩm và thoáng gió Ánh sáng từ 20 50% và độ ẩm trong không khí 70% - 80% là cây phát triển tốt [33]

-2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro

2.3.1 Vài nét về nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào

thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các môphân sinh của cây Theo các công trình thí nghiệm của Amato (1977), chỉ có đỉnhsinh trưởng của chồi mới đảm bảo sư ổn định về di truyền, tiếp đến là mô phân sinhvới kích thước nhỏ, xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống.[1]

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng phục vụ cho các mục đích chính như:-Tạo quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, các điều kiện hóa lý được kiểm soát

-Tạo được những cây con từ các loại mô như lóng thân, phiến lá, hạt phấn, pháthoa…, mà nhân giống in vivo không thực hiện được

-Tạo nguồn gen giống cây trồng sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

-Cải tiến giống, lai vô tính hay tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen

2.3.2 Các kỹ thuật nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tinh từ chóp của chóp đỉnh sinh

trưởng Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như vậy rất khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích là làm sạch virut cho cây trồng Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng phong lan, dứa, mía đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước 5-10mm [1] Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi, thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và mức độ ổn định di truyền tăng nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại Nếu xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ nuôi cấy nguyên liệu ban đầu là mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn); cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; cây phát triển từ chồ mới phát sinh Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh [17]

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài khả năng tái sinh từ mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng, tế bào thực vật còn có thể tái sinh từ các bộ phận sau: đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh; mảnh lá như thuốc lá, cà chua, bắp cải; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì; nhánh củ ở hành tỏi

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy chứa nhiều auxin, mô sẹo được hìnhthành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng Trong môi trườngphù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo đượcthực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinhtrưởng hoặc đối với những loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi.Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo

có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuynhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo [2]

2.3.3 Quy trình nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro đã được chia thành 5 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có

một chức năng riêng:

Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ

Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

Bảng 2.1 Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo

Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuyvậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lầnthử chắc chắn sẽ đạt kết quả

Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô cấy.Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chấtauxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnhđiều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa

phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu.Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng nhanh của câytrong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi Để tăng hệ sốnhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòasinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa,dịch chiết nấm men,…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùythuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sựhình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồinách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.

Giai đoạn 3: Sự ra rễ in vitro

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giaiđoạn 2 sang môi trường tạo rễ Thường từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽxuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sungvào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chứcnăng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quátrình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình nàytrong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống

dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoạicảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống caotrong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.3.4 Ưu thế của nhân giống in vitro

Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Từ một cây trongvòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây Nhân được số lượng cây lớn trongmột diện tích nhỏ, trong 1m2 có thể đến 18000 cây [19]

Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng vơi nguồn bệnh, vì vậy đảm bảogiống sạch bệnh; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản (cây giống giữ ở 400 C

trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95%) Đồng thời, có thể sản xuất quanh năm

mà không phụ thuộc vào mùa vụ, có tiềm năng công nghiệp hóa cao

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân giống in vitro

Ảnh hưởng từ mẫu cấy

Tùy vào mục đích thí nghiệm mà lựa chọn mẫu nuôi cấy sao cho phù hợpđểđạt được hiệu quả cao nhất Các nhân tố khi lựa chọn để chọn lựa mẫu nuôi cấybao gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏecủa mẫu và nguồn mẫu Mẫu được chọn phải được khử trùng, đảm bảo sạch bệnh,không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus và hoàn toàn sạch bệnh, mang đầy đủ nguồn gencần thiết và đảm bảo khả năng di truyền cho các cây con

Ảnh hưởng từ nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy mô là từ 20 - 27º C Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan

Ảnh hưởng từ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng trong quang hợp,

ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh Tuy nhiên, ảnh hưởng đầu

tiên đến sự quang hợp là ảnh hưởng sinh lý Ảnh hưởng quan trọng đến chồi, nhưnglại tối cần thiết đến khả năng tạo rễ, cường độ ánh sáng cao hay thấp quá cũng đều ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi [7]

Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng

kể cả cây ngày ngắn đến những cây ngày dài và những cây thân gỗ Đối với cây

trồng in vitro, thời gian chiếu sáng khoảng từ 10 – 15 h/ngày.

Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro vì ánh sáng cao hơn

ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa,

chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro bằng cách

xử lý cây mẹ với ánh sáng đỏ, ánh sáng đỏ và cao hơn ánh sáng đỏ ảnh hưởng đến

khả năng ra rễ của cành cắt in vitro.

Ảnh hưởng từ môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của sự phát triển và tăng trưởng hình thái tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô và thành phần môi trường nuôi

cấy.Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy thuộc theo loàivà bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi Môi trường còn thay đổi tùy theo các giai đoạn phát triển của mẫu cấy Môi trường nuôi cấy thông thường luôn đầy đủ năm thành phần sau:

-Khoáng đa lượng

-Khoáng vi lượng

-Vitamin

-Nguồn Cacbon

-Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Tuy nhiên dựa theo mục đích thí nghiệm, người ta còn có thể bổ sung một số các chất hữu cơ bổ sung như: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cùng với chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại agar

Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là

nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt

a Nguồn nitrogen

Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium

và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid Tỷ lệ ammonium và nitrate thay đổi tùy theo loại cây và trạng thái phát triển của mô Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3 Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH2)2SO4 hoặc NH4NO3 Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea Tổng nồng độ của NO3+ và

NH4- trong môi trường thay đổi tùy theo đối tượng nghiên cứu mục đích nghiên cứu thí nghiệm [13]

b Nguồn Phosphorus

Phosphorus là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vàovận chuyển và chuyển hóa năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và thamgia vào cấu trúc màng Trong môi trường nuôi cấy, P được cung cấp dưới dạngmono hay dihydrogenphosphate potassium hoặc sodium Ion phosphate hóa trị 1 và

2 có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy thuộc vào độ pH

c Potassium

Kali là cần thiết để kích hoạt một số hệ thống enzyme, sự chuyển vị củacarbohydrate K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cân bằng các anion vô

cơ và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò chính

là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào [13]

d Magnesium

Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và đồngthời nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme như enzyme vận chuyểnphosphate Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuếch tán vào trong tế bào nhưK+ vì vậy nó cũng có vai trò như một cation và có thể trung hòa anion và các acidhữu cơ Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thayđổi nhiều (trung bình 6,8 mM hoặc 5,3 mM) Thường MgSO4 là nguồn duy nhất bổsung nguồn ion Mg2+ cho mô nuôi cấy

e Calcium

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây.Calcium có chức năng như một thành phần cấu trúc của thành tế bào, trong sự phânchia và kéo dài tế bào Calcium có khả năng liên kết các phân tử sinh học lại vớinhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lý màng tế bào và ởphiến giữa thành tế bào Sự hoạt động của nhiều loại enzyme khác của thực vậtcũng phụ thuộc vào ion Ca2 vì calcium là đồng yếu tố với những enzyme phân giảiATP

Trong nuôi cấy tế bào ion Ca2 đảm nhiệm vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời là sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt là

cytokinin và auxin.

f Sắt

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O,

Fe2SO4.7H2O, Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelatkết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA) Ở dạng này sắt không bịkết tủa và giải phóng từ từ ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật

Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực ít

được nghiên cứu Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thểthiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào Để an toàn, các tác giả đã cungcấp hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô trong môi trườngnuôi cấy Vì vậy, có những trường hợp một số khoáng vi lượng có thể là không cầnthiết

Vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng vàphát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác

nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy trong in vitro thì một vài vitamin trở thành

yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng nhiềunhất trong nuôi cấy mô: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol

Nguồn Carbon

Các nguồn carbon (sucrose, glucose hoặc fructose) là một thành phần quantrọng trong môi trường nuôi cấy mô Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiệndiện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhânchồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con Nồng độ đường 1 - 3 % được sử dụngphổ biến Nồng độ đường sucrose cao hơn 3 % tỏ ra độc ở một số trường hợp Nồng

độ sucrose (20 g/l và 30 g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực nuôicấy mô lan Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để đẩy mạnh sự tăngnhanh protocorm và sự phát triển của cây con Theo (Debergh,1991), sự vắng mặt

của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các câytăng trưởng một cách tự dưỡng trong điều kiện in vitro khi nồng độ CO2 và mật độánh sáng tăng lên Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng.

Các chất điều hòa sinh trưởng

Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thựcvật: auxin, gibberellin, cytokinin và acid abscisic

Nhóm các auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyêntrong nuôi cấy mô tế bào thực vật Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phânchia tế bào Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinhdưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sựphát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin Cáchormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng tínhhướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Những auxindùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3-indole aceticaxid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4 - D (2,4 – D - Dichlorophenoxyaxeticaxid) và 2,4,5 - T (Trichlorophenoxyacetic axid) Trong số các auxin, IBA và NAAchủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môitrường ra chồi 2,4 - D và 2,4,5 - T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và pháttriển callus

Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Điều chỉnh ưu thế ngọn ức chế chồi bên

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem andphloem)

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụtrong nuôi cấy mô

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sựphát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sựsinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhómchất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppmkích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng

sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1

Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả

về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển(transfer RNA) Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tínhenzyme và protein trong các mô nhất định Trong cơ thể sống không có kinetin tồntại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếuphối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân

chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa Trong tự nhiên cũngtồn tại một hormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế

và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạngsữa của hạt ngô Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin Cytokinin liênquan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi Trong môi trường nuôi cấy mô,cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơquan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

Nghiên cứu này sử dụng:

BA

Hình 2.3 Công thức cấu tạo của BA

Công thức hóa học: C12H11N5 (6-Benzyladenine)

Chức năng:

- Có hiệu quả cao trong việc tăng kích thước hoa và trái; được sử dụng trongnuôi cấy mô, trồng hạt giống và thúc đẩy phát triểm bông, chồi nhánh và chiều dàithân nhánh.

- BA thúc đẩy sự phân hóa mầm hoa, ngăn chặn thất thoát protein vàChloropyl, thúc đẩy phân chia tế bào và phân hóa mô Có tác dụng kích thích câycho ra nhiều nhánh mới, tăng số lượng trái và phẩm chất nông sản đạt chất lượngcao

- Tăng tỷ lệ đậu quả và giữ cho rau tươi, giảm tình trạng ngủ của hạt mầm vàphá vỡ tình trạng ngủ của ngọn

- Thúc đẩy phát triển chồi nhanh, và tăng khả năng chống lại yếu tố gây hại

Kinetine

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của Kinetine

Công thức hóa học: C10H9N5O (N6-furfuryladenine)

Chức năng: thúc đẩy sự phân chia tế bào với điều kiện là auxin đã có mặttrong môi trường Kinetin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật cho gâyhình thành mô sẹo (kết hợp với auxin) và tái sinh bắn mô từ mô sẹo (với thấp hơnauxin tập trung) [34]

NAA

Hình 2.5 Công thức cấu tạo của NAA

Công thức hóa học: C12H10O2

Chức năng: Làm tăng đáng kể sự hình thành sợi cellulose ở thực vật khi kếthợp với một phytohormone khác gọi là axit gibberellic Trong nhân giống vi mô củacác loại cây khác nhau, NAA thường được thêm vào môi trường chứa các chất dinhdưỡng thiết yếu cho sự sống của cây Nó được thêm vào để giúp tạo ra sự hìnhthành rễ trong các loại cây khác nhau Nó cũng có thể được áp dụng bằng cách phun

nó lên cây và đó là điển hình trong sử dụng nông nghiệp [35]

Các chất hữu cơ

Nước dừa (CW - coconut water) được dùng thông dụng trong nuôi cấy môNước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chấtkích thích sinh trưởng [23] Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa vànhân nhanh chồi ở nhiều loài cây, nước dừa thường dùng ở nồng độ 5 - 20% [8]Ngoài việc sử dụng nước dừa còn sử dụng dịch nghiền các loại trái cây, củ và dịchchiết mạch nha, dịch chiết nấm men để bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tácdụng kích thích sự phát triển cây Thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trêncác loài cây trồng không cùng nguồn gốc [16]

Than hoạt tính

Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định Nó có tác dụnghấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường Sự kết hợp của 0.3 % than hoạt tính trongmôi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi Ngoài ra việc bổsung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sựphát triển của cây con [13]

2.4 Giới thiệu phân bón Hyponex liquid 6-10-5

Hình 2.6 Phân bón Hyponex liquid 6-10-5

Nhà sản xuất: Hyponex japan corp.,ltd - Nhật Bản

Địa chỉ: Yodogawa - Ku Osaka 532-0003 Japan

Thành phần hóa học bao gồm: N 6%, P2O5 10%, K2O 5%, Mg 0,05%,

Mn 0.001%, Bo 0.005%

Công dụng: Là phân bón dạng lỏng rất thích hợp để bón cho các loại câykiểng, bonsai và các loài lan được trồng trong nhà hay ngoài trời Thành phần dinhdưỡng tối ưu, dinh dưỡng dạng chelate dễ tiêu và phân giải nhanh, giúp cây phụchồi rất nhanh chỉ sau vài ngày Tăng cường Nitơ, Canxi rất tốt cho cây trồng khi rahoa, làm sinh động màu sắc hoa, lá cây, chứa 15 loại dưỡng chất và vitamin giúp:

- Tăng cường khả năng quang hợp, tăng khả năng hấp thu các chất dinhdưỡng

- Kích thích cây phát sinh nhánh, nảy chồi, ra hoa

- Thúc đẩy sự sinh trưởng của cây, làm đậm màu sắc cho hoa và lá

- Giúp rễ sinh trưởng tốt, cây trồng phát triển vững chắc khỏe mạnh

- Tăng khả năng đề kháng với sâu bệnh và thời tiết bất lợi

- Có thể sử dụng cho đa số cây trồng từ hoa, rau củ đến cây xanh

Hướng dẫn sử dụng: Pha loãng với nước theo tỷ lệ hướng dẫn trước khi sửdụng cho cây trồng Bonsai, hoa lan, địa lan, xương rồng: 5mL (1/4 nắp chai) cho

10 lít nước Phun 2 tuần/1 lần [36]

2.5 Các nghiên cứu trước đây liên quan đến đề tài

Các nghiên cứu nước ngoài

Sử dụng môi trường MS cơ bản, Martin và cộng sư (2005) bổ sung kinetin6,97µM hoăc BAP 13,3µM, nước dừa 15 %, than hoạt tính 2,0g/l sẽ tạo điều kiện

cho sự nảy chồi của giống lan Dendrobium Sonia Tỷ lệ sống của cây con đạt 80 %.

[26]

Năm 2007, Jian-Ping Luo và cs đã nghiên cứu quy trình vi nhân giống

Dendrobium densiflorum Lindl.ex Wall từ hạt Kết quả cho thấy, nồng độ BAP 5

mg/l, Kin 0.5 mg/l đạt được số lượng PLBs tái sinh cao nhất Khi kết hợp với NAA,kết quả thu được cho thấy: so với thí nghiệm sử dụng BAP riêng lẻ không có gì

khác biệt Những kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Martin và Madassery

(2006) trên giống Dendrobium lai Sonia và nghiên cứu của Nayak và cs (2002) trên giống D nobile [24]

Năm 2012, Murilo Goulart Berka cùng với các cs tiến hành thử nghiệm nuôi

cấy loài lan được lai giữa hai loại lan là Cattleya amethystoglossa và nobilior trên

môi trường chứa phân bón thương mại chi phí thấp để so sánh với cây được nuôitrong môi trường nuôi cấy truyền thống ½ MS (Murashighe Skoog với thành phầncác chất khoáng giảm đi một nửa) Sau 80 ngày, kết quả cho thấy loài lan lan nàyphát triển tốt nhất khi được nuôi cấy trong môi trường Kcal-ban, môi trường chứa0,92 g/L phân bón Kristalon (N-P-K 6-12-36) kết hợp với 0,51 g/L Calcinit (N-P-K15,50-0 + Ca 19,0%) Phát triển tốt thứ hai là nuôi cấy cây lan lai trong môi trườngchứa phân bón Hyponex 1,33 g/L (N-P-K 6.5-6-19) cho kết quả tốt hơn là khi nuôicấy trong môi trường ½ MS [27]

Selvaraju Parthibhan và cs (2015) đã nghiên cứu tái sinh in vitro từ protocorms ở Dendrobium aqueum Lindley trên môi trường ½ MS bổ sung

cytokinin (BA, IBA, KIN và TDZ) ở 1, 3, 5, 7, 10 mg/L, HA và CW ở mức 1 %, 3

%, 5 %, 7 %, 10 % và các chất bổ trợ (IBA, NAA, 2,4-D) ở mức 1, 3, 5, 7, 10 mg/L

để nghiên cứu hiệu quả của chúng đối với sự phát triển của cây hoàn chỉnh Kết quảđạt được 9,4 chồi trên mỗi mẫu khi bổ sung 3 mg/L − 1 NAA sau đó là 3 % HA (7,0chồi) Chiều cao chồi tăng nhiều nhất (1,52 cm) khi bổ sung NAA 7 mg/L sau đó làTDZ 7 mg/L (1,37 cm) Chồi được nuôi cấy trên môi trường ½ MS được bổ sungIBA 5 mg l − 1 tạo ra trung bình 8,75 rễ mỗi chồi, tuy nhiên, rễ dài nhất (1,48 cm)được ghi nhận trong NAA 7 mg/L [4]

Các nghiên cứu trong nước

Năm 2010, Trần Đông Hạ đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số Hyponex

bổ sung đến sự hình thành và phát triển chồi lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) và lan Dendrobium Sonia trên 8 loại Hyponex đang có bán phổ biến trên thị trường trong

nước và trên thế giới Kết quả xác định được một số Hyponex ảnh hưởng đến sự

hình thành và phát triển của chồi của giống lan Phalaenopsis Yubidan và lan Dendrobium Sonia [6]

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra được môi trường thích hợp cho

nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/L,agar 8g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/L Môi trường nhân nhanh protocorm tốtnhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/L, agar 8,0g/L, nước dừa 15% và BAP2,0mg/l Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/L, agar 8,0g/L, than hoạttính 1,0g/L, nước dừa 15 %, BAP 2,0 mg/L và NAA 1,0 mg/l thích hợp nhất cho tái

sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS cơ bản, bổ

sung saccharose 20 g/L, agar 8,0 g/L, nước dừa 15 % và NAA 1,0 mg/L là thích

hợp cho tạo rễ của chồi in vitro [18]

Năm 2017, Nguyễn Văn Việt nghiên cứu vi nhân giống lan Hoàng thảo kèn

(Dendrobium lituiflorum Lindley) cho kết quả mẫu tạo đa chồi trên môi trường

BAP 0.8 mg/L, NAA 0.1 mg/L, dịch chiết khoai tây 100 ml/L, nước dừa 100 ml/L,sucrose 30 g/L, agar 5 g/L cho hệ số nhân chồi cao nhất 10,3 sau 5 tuần nuôi cấy.Chồi ra rễ 100%, số rễ trung bình 4,8 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 3,6 cm khinuôi trên môi trường Knops bổ sung IBA 0,2 mg/L, NAA 0,3 mg/L, dịch chiếtkhoai tây 100 ml/L, sucrose 20 g/L sau 5 tuần nuôi cấy Cây con hoàn chỉnh đượchuấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể dớn trắng, xử lý giá thể 2 ngày trongnước, cho tỉ lệ cây sống 89% [21]

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Nông Vinh, Quận 10, Thành phố HồChí Minh

Thời gian thực hiện: 9/2018 –12/2018

3.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi của

lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh

trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm.

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Nguyên liệu nuôi cấy

Chồi và cây con in vitro của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmer).

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Trang thiết bị: Cân phân tích, nồi hấp vô trùng autoclave, tủ cấy vô trùng, máy

đo pH, máy lạnh, tủ lạnh, bếp điện từ, nồi, máy nước cất, kệ để mẫu, bóng đèn chiếusáng,…

Dụng cụ: Ống nghiệm, bình nuôi cấy thể tích 500mL, khay cấy, kẹp gắp, daocấy, ống đong 1L, pipet, becher, đèn cồn, bình đựng cồn, hột quẹt,…

3.3.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige-Skoog, 1962) Môi trường được thêm 30 g/Lđường và 6 g/L agar pha trong nước cất Tùy theo mục đích các thí nghiệm mà tiếnhành bổ sung thêm một số chất cần thiết

Môi trường trong nuôi cấy mô đều được chỉnh pH trong khoảng 5,5 bằngNaOH 1N và HCl 1N trước khi đem đi hấp khử trùng

Môi trường trước khi đưa vào nuôi cấy mô phải được hấp khử trùng trongAutoclave ở 1210C trong vòng 20 phút, trong các bình thủy tinh 500 mL

3.3.5 Điều kiện nuôi cấy

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến

khả năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Môi trường thí nghiệm: Môi trường MS bổ sung 30 g/L đường, 6g/L agar

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Mẫu cấy: cụm chồi in vitro gồm 3 - 4 chồi cao trung bình 0,5 cm

- Chiều cao chồi (cm) tính từ gốc tới ngọn

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex

6-10-5 đến sự sinh trưởng chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Môi trường thí nghiệm: Môi trường MS bổ sung 30g/L đường, 6g/L agar Môi trường Hyponex liquid 6-10-5 (N 6%, P2O5 10%, K2O 5%, Mg 0,05%,

Mn 0.001%, Bo 0.005%) + đường 30g/L, agar 6 g/L pha trong nước cất, gọi tắt làmôi trường H

Bảng 3.3.Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Hyponex 6-10-5 đến sự sinh trưởng

chồi lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Mẫu cấy: chồi đơn in vitro cao trung bình 1cm, có từ 3-4 lá

Số cây con/bình: 3 cây

- Chiều cao chồi

- Số lá (số chồi/số lá)

- Số rễ (số rễ/mẫu cấy)

- Chiều dài rễ (cm)

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến

khả năng tạo rễ của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Môi trường thí nghiệm: Môi trường MS bổ sung 30 g/L đường, 6 g/L agar

Bảng 3.4.Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của lan

Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Mẫu cấy: cây con in vitro cao trung bình 2-2,5cm, có từ 2-3 lá

Số cây con/bình: 3 cây

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến

khả năng sống của cây in vitro lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai

đoạn vườn ươm

Cây con in vitro cao từ 3 – 4 cm có từ 4 lá trở lên và có từ 2 - 4 rễ dài từ 2 cm

trở lên được giữ kín trong bình nuôi cấy, đưa ra vườn ươm dưới điều kiện nhiệt độ

240 ± 2, ánh sáng 2000 - 3000 lux trong các khoảng thời gian khác nhau để thíchnghi trước khi ra cây trên giá thể là xơ dừa.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây in vitro

lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) ở giai đoạn vườn ươm

độ tin cậy 0,05 Dùng phần mềm excel để vẽ biểu đồ

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả

năng nhân chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri)

Nhân nhanh chồi là công đoạn có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với việc tạo

ra số lượng lớn cây con in vitro BA có vai trò thúc đẩy sự phân chia tế bào, tác

động đến sự phân hóa cơ quan ở thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi Kinetin có chứcnăng kích thích sự phát sinh chồi của thực vật Nồng độ của các chất trên được sửdụng khác nhau tùy đối tượng nuôi cấy khác nhau, chẳng hạn BA ở nồng độ 1,5 mg/

L là thích hợp cho sự hình thành chồi lan Miltonia hay Kinetine ở nồng độ 2 mg/L thì thích cho sự cảm ứng tạo đa chồi ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) [1]

[10] [14]

Ở thí nghiệm này, BA được bổ sung vào môi trường MS có Kinetin (1 mg/L)kết hợp với nồng độ BA lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 mg/L

Bảng 4.6 Ảnh hưởng ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetine đến khả năng nhân

chồi của lan Thủy tiên trắng (Dendrobium farmeri) sau 30 ngày nuôi cấy