Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn staphylococcus aureus và escherichia coli của tinh dầu lá tràm gió (melaleuca cajeputi powell)

Tinh dầu tràm là một trong ít những tinh dầu có tính kháng khuẩn vì khángvirus, có thể bôi trực tiếp lên da mà không cần pha với dầu nền, được sử dụng rộng rãitrong ngành y để điều trị c

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

TÓM TẮT vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1 TỔNG QUAN VỀ TRÀM GIÓ 2

1.1 Mô tả 2

1.2 Phân bố sinh thái 3

1.3 Trồng trọt và khai thác 3

1.4 Bộ phận dùng 3

1.5 Thành phần hóa học 3

1.6 Công dụng của tinh dầu tràm 3

2 TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU 4

2.1 Khái niệm tinh dầu 4

2.2 Phân loại tinh dầu 4

2.3 Phân loại tinh dầu theo cấu trúc hóa học 5

2.4 Tính chất lý hóa của tinh dầu 5

2.5 Tác dụng sinh học và ứng dụng của tinh dầu trong y học như: 5

3 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT TINH DẦU 6

3.1 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu như: 6

3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 6

3.3 Pháp pháp vi sóng 9

3.4 Phương pháp siêu âm 11

4 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN 13

4.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus 13

4.2 Vi khuẩn Escherichia coli 16

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20

1.1 Thời gian nghiên cứu 20

1.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.2 Thiết bị 20

1

2.3 Dụng cụ 21

2.4 Hóa chất 21

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Trích ly tinh dầu 21

3.2 Xác định thành phần hóa học tinh dầu 21

3.3 Khả năng kháng vi khuẩn 21

3.4 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu thực nghiệm 21

4 THỰC NGHIỆM 22

4.1 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 22

4.2 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của tinh dầu tràm gió 24

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

1 KẾT QUẢ TRÍCH LY TINH DẦU BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÔI CUỐN HƠI NƯỚC 25

1.1 Đánh giá cảm quan 25

1.2 Kết quả thành phần hóa học GC - MS (tiểu luận tốt nghiệp Đinh Lê Khánh Hậu 8G) 25

2 KẾT QUẢ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TRÀM GIÓ 28

2.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu tràm gió 28

2.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió .29

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

1 KẾT LUẬN 31

2 ĐỀ NGHỊ 31

2

DANH MỤC

Hình 2.1 Lá tràm gió 2

Hình 2.2 Cây Tràm gió 2

Hình 2.3 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 6

Hình 2.4 Phương pháp chưng cất bằng vi sóng 9

Hình 2.5 Hình thái của Staphylococcus aureus 14

Hình 2.6 Quan sát dưới kính hiển vi 14

Hình 2.7 Escherichia coli 17

Hình 2.8 Quan sát dưới kính hiển vi 17

YHình 3.1 Lò vi sóng……… 20

Hình 3.2 Tủ ủ vi sinh 20

Hình 3.3 Tủ cấy vi khuẩn 20

Hình 3.4 Nồi khử trùng 20

Hình 3.5 Tủ sấy 21

Hình 3.6 Tủ hút 21

Hình 3.7 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu 22

Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu 22

YHình 4.1 Tinh dầu tràm gió……… 25

Hình 4.2 Kết quả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu tràm gió 28

Hình 4.3 Vòng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 20 và 40 của tinh dầu tràm gió 29

Hình 4.4 Kết quả kháng vi khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió 29

Hình 4.5 Vòng ức chế vi khuẩn Escherichia coli ở từng nồng độ 20 và 40 30

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió 30

3

DANH MỤC BẢ

Bảng 2.1 Đặc tính của S aureus 14

Bảng 2.2 Đặc tính của E.coli 18

YBảng 4.1 Kết quả thành phần hóa học GCMS……… 26

Bảng 4.2 Công thức phân tử trong tinh dầu tràm gió 27

Bảng 4.3 Kết quả kháng khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu tràm gió 28

Bảng 4.4 Kết quả kháng khuẩn Escherichia coli của tinh dầu tràm gió 29

4

khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia Coli, sau đó là khảo sát độ kháng khuẩn

của tinh dầu tràm gió sau chưng cất

Tràm gió trong nghiên cứu này được thu hái ở Cái Răng, Thành phố Cần Thơđược đem trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Sau đóđem khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt

Kết quả thu được tinh dầu tràm gió với hàm lượng khoảng 0,18 % (tươngđương 1,8 mL/kg), tinh dầu thu được có màu vàng nhạt, thơm tự nhiên, tỷ trọng là0,9130 kết quả GCMS tinh dầu tràm gió Các hợp chất chính trong đó 1,8-cineol làthành phần chính (1,34%) Các hợp chất khác có hàm lượng đáng kể gồm α¬terpineol(1,90%) limonen (0,97%), ledol (10,60%)

Qua nghiên cứu tinh dầu tràm gió có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia Coli cao với nồng độ tinh dầu 20 và 40.

Từ những kết quả trên giúp ta có thể xác định được độ kháng khuẩn của tinhdầu tràm giúp nghiên cứu bào chế ra các loại dược phẩm, thực phẩm chức năng từ tinhdầu tràm thiên nhiên an toàn và đạt hiểu quả cao nhưng ít tác dụng phụ

5

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Nằm tại một vị trí tự nhiên hiếm có, khí hậu có nhiều nét độc đáo và đa dạng,Việt Nam được ưu đãi với hệ thống sinh thái phong phú, đa dạng về chủng loại các câydược liệu với hơn 12 nghìn loại thực vật, trong đó gần 4 nghìn loại có công dụng làmthuốc được xếp vào loại quý hiếm trên thế giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tamthất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanhthiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú…theo số liệu thống kê từ năm 2001, số loài có chứa tinhdầu trong hệ thực vật nước ta gồm 657 loài thuộc 357 chi và 114 họ (chiếm 6,3% tổng

số loài, 15,8% tổng số chi, 37,8 tổng số họ) Do vậy Việt Nam có nguồn tài nguyênthực vật chứa tinh dầu rất tiềm năng Tràm gió cũng là một trong những loải thực vậtchứa tinh dầu với tác dụng chữa bệnh và mang lại nhiều lợi ích so với tác dụng làmđẹp của tinh dầu của loại tràm thông thường

Tinh dầu đã sớm được sử dụng từ thời xa xưa, có khả năng ngăn ngừa và giảiquyết các trường hợp nhiễm trùng, được dùng để làm lành vết thương và xoa bóp trịliệu Rất nhiều người lại không biết đến tác dụng tiêu diệt vi khuẩn, nấm, virus của rấtnhiều tinh dầu được ứng dụng để phòng chống bệnh tật và điều trị các bệnh lí về da,khử trùng bề mặt đồ dùng nhà cửa và loại bỏ vi khuẩn đang tồn tại lơ lửng trong khôngkhí

Tinh dầu tràm là một trong ít những tinh dầu có tính kháng khuẩn vì khángvirus, có thể bôi trực tiếp lên da mà không cần pha với dầu nền, được sử dụng rộng rãitrong ngành y để điều trị các ca nhiễm trùng da như mụn nhọt, eczema, mụn cóc vàvẩy nến (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Do Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm cũng là yếu tốthuận lợi cho vi khuẩn phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các chủng vi khuẩn thường gây

hư hỏng và ngộ độc thực phẩm Gần đây WHO công bố danh sách các vi khuẩn đềkháng kháng sinh cần ưu tiên nghiên cứu và phát triển kháng sinh mới trong đó có

Staphylococcus aureus kháng Erythromycin ở mức độ ưu tiên cao Chính vì vậy chúng

tôi thực hiện đề tài này “Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus

và Escherichia coli của tinh dầu lá tràm gió (Melaleuca cajeputi Powell)” việc làm

này cần thiết góp phần vào việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên trong lĩnh vực thựcphẩm, dược phẩm nhằm hỗ trợ cho việc điều trị cho bệnh nhân tốt hơn

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu:

 Trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli của tinh dầu tràm gió.

1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ TRÀM GIÓ

1.1 Mô tả

Tên thường gọi: Tràm gió

Tên khoa học: Melaleuca cajeputi Powell

Họ khoa học: thuộc họ Sim – Myrtaceace

Hình 2.1 Lá tràm gió

Hình 2.2 Cây Tràm gióCây gỗ nhỏ hay trung bình, thường xanh, cao 10-15 m (đôi khi tới 20 - 25 m),

và đường kính có thể đạt 50 – 60 cm Đôi khi là cây bụi, cao 0,5 – 2 m, nếu mọc ởvùng đồi cằn cỗi Thân thường không thẳng, vỏ ngoài mỏng, xốp, màu trắng xám,thường bong thành nhiều lớp Hệ rễ phát triển mạnh Lá đơn, mọc so le; phiến lá hìnhmác hay hình trái xoan hẹp, thường không cân đối, kích thước (4 - 8)-10 x (1 - 2)-2,5 cm;đầu nhọn hoặc tù, gốc tròn hoặc hơi hình nêm, dày, lúc non có lông mềm màu trắng

2

bạc, sau nhẵn, màu xanh lục, gân chính 5 (đôi khi 6), hình cung, cuống lá ngắn, cólông (Đỗ Tất Lợi, 2006).

Cụm hoa bông mọc ở đầu cành hay nách lá Hoa nhỏ, trắng xanh nhạt, trắngvàng nhạt hoặc trắng kem; đài hợp ở gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, 5 thuỳ đàirất ngắn; cánh tràng 5, có móng rất ngắn (các thuỳ đài và cánh tràng đều sớm rụng),nhị nhiều, hợp thành 5 bó, xếp đối diện với thuỳ đài, đĩa mật chia thuỳ, có lông mềm,bầu ẩn trong ống đài

1.2 Phân bố sinh thái

Phân bố rộng rãi khắp nước ta cụ thể theo từng khu vực như:

Phía bắc: Bắc Kạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hải Dương, Hà Tây, Nghệ An, HàTĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên

Phía nam: Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu,Vĩnh Long, Đồng Tháp, Long An, An Giang, Kiên Giang, Cà Mau

1.6 Công dụng của tinh dầu tràm

Hoạt chất α- Terpineol chiết xuất từ tinh dầu tràm có tính sát trùng (diệt khuẩn, nấm và siêu vi) tốt, do đó α- terpineol là một nguyên liệu quý để bào chế nhiều loại thuốc bôi xức

trực tiếp hoặc dầu khí dung bay hơi

Nhiều nghiên cứu khoa học cho thấy α- Terpineol có rất nhiều ưu điểm:

- Không độc với con người ở liều có tác dụng kháng khuẩn

- Có thể dùng cho mọi lứa tuổi, kể cả trẻ em và trẻ sơ sinh

- Có tác dụng sát trùng khá rộng trên vi khuẩn, nấm và siêu vi

3

- Theo nghiên cứu cấp Bộ Y tế, thực hiện tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, 2008 của

Hãng dược phẩm OPDIS PHARMA thì hoạt chất α-terpineol có tác dụng ức chế diệt cả hai vi

rút cúm A H5N1 và A H1N1

- Nguyên liệu α- Terpineol (Tiêu chuẩn dược điển Anh) dùng làm thuốc đã được

Bộ Y tế cấp mã số đăng ký sản xuất VNA-2686-99

- Từ năm 2008, Bộ Y tế đã cho phép đưa dầu tràm vào danh mục thuốc thiết yếu

để kiểm soát bệnh địa phương (local diseases control) trong chương trình chăm sócsức khoẻ ban đầu (Đỗ Tất Lợi, 2006)

2 TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU

2.1 Khái niệm tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước

Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cáchchưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc nhữngthành phần khác của thực vật

Tinh dầu được ví như nhựa sống của cây, vì vậy nó mang sức sống, năng lượng

và mạnh hơn 100 lần các loại dược thảo sấy khô

Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên Trữ lượng tinhdầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Cây mọc ở vùng nhiệt đới

có hàm lượng tinh dầu nhiều hơn ở vùng ôn đới Ngay trong một cây, thành phần vàlượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau Ngoài ra, lượng tinh dầucòn phụ thuộc vào môi trường sống của cây, phương pháp thu hoạch, bảo quản, táchchiết

Về phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ long não, họ hoa môi, họcam, họ sim, họ hoa tán

Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây, như ở hoa (hồng, nhài, cam,chanh,…), ở lá (bạch đàn, bạc hà, hương nhu,…), ở thân cây (hương đàn, peru,…), ở

vỏ cây (quế), ở rễ (gừng, nghệ, hương bài,…)

Trong cây, tinh dầu có thể ở dạng có sẵn hoặc chỉ tạo thành trong một điều kiệnnhất định nào đó Khi đó, tinh dầu không phải là những bộ phận bình thường trong cây

mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện nhất định khi một số bộ phận bị chết

2.2 Phân loại tinh dầu

Có hai loại là tinh dầu nguyên chất và tinh dầu không nguyên chất

- Tinh dầu nguyên chất: hoàn toàn không có độc tố, không có chất bảo quản hóahọc nên rất an toàn cho người sử dụng và mang lại kết quả nhanh khi điều trị

4

- Tinh dầu không nguyên chất: là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất vớicác chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu Vì vậy với lịch sử pháttriển hàng ngàn năm, tinh dầu được mệnh danh là báu vật của thiên nhiên, được pháttriển thành phương pháp trị liệu, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trên toàn thế giới Giữathế kỉ 19, tinh dầu được tập trung nghiên cứu và trở thành một phương pháp trị liệutổng thể và phổ cập tại nhiều nước như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Autralia, Nhật Bản,Anh Quốc, Pháp.

2.3 Phân loại tinh dầu theo cấu trúc hóa học

Theo cấu trúc hóa học, có thể chia làm 4 loại tinh dầu:

- Các dẫn chất của monoterpen: Myrcen, lymonen, α- pinen, β- pinen, geraniol,

linanol, nerol…

- Các dẫn chất của sesquiterpen: zingiberen, curcumen, nerolidol,…

- Các dẫn chất có nhân thơm: eugenol, p-cymen, thymol…

Các hợp chất có chứa nitơ (N) và lưu huỳnh (S): mythyl isothiocyanat, alicin…

2.4 Tính chất lý hóa của tinh dầu

* Thể chất: đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin

* Màu sắc: không màu hoặc vàng nhạt Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫmlại Một số có màu đặc biệt: các hợp chất azulen có màu xanh mực

* Mùi: đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinhdầu giun)

* Vị: cay, một số có vị ngọt: tinh dầu quế, hồi

* Bay hơi được ở nhiệt độ thường

* Tỷ trọng: đa số nhỏ hơn 1 Một số lớn hơn 1 như: Quế, đinh hương, hươngnhu

Tỷ lệ thành phần chính (aldehyd cinnamic, eugenol) quyết định tỷ trọng tinhdầu Nếu hàm lượng các thành phần chính thấp, những tinh dầu này có thể trở nên nhẹhơn nước

* Độ tan: không tan, hay đúng hơn ít tan trong nước, tan trong alcol và các dungmôi hữu cơ khác

* Độ sôi: phụ thuộc vào thành phần cấu tạo, có thể dùng phương pháp cất phânđoạn để tách riêng từng thành phần trong tinh dầu

* Năng suất quay cực cao, tả tuyền hoặc hữu tuyền

* Chỉ số khúc xạ: 1,4500 - 1,5600

* Rất dễ oxy hoá, sự oxy hoá thường xảy ra cùng với sự trùng hợp hoá, tinh dầu

sẽ chuyển thành chất nhựa

5

* Một số thành phần chính trong tinh dầu cho các phản ứng đặc hiệu của nhómchức, tạo thành các sản phẩm kết tinh hay cho màu, dựa vào đặc tính này để định tính

và định lượng các thành phần chính trong tinh dầu

2.5 Tác dụng sinh học và ứng dụng của tinh dầu trong y học như:

- Tác dụng trên đường tiêu hoá

- Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn

- Tác dụng kích thích thần kinh trung ương

- Tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun, sán, diệt ký sinh trùng sốt rét

- Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ v.v khi sử dụng ngoài da

Ngoài ra tinh dầu còn được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền, qua các bàithuốc từ rất lâu đời

3 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT TINH DẦU

3.1 Các phương pháp chiết xuất tinh dầu như:

- Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

6

Hình 2.3 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

3.2.2 Lý thuyết chưng cất

Chưng cất có thể được định nghĩa là: ”Sự tách rời các cấu phần của một hỗnhợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Trong trường hợpđơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suấthơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp

sẽ tương ứng với áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần báchphân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại Nếu vẽ đường cong ápsuất hơi của từng chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứngvới một áp suất, ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy lànhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất Thí dụ, ở

áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100oC và benzen sôi ở 80oC và chúng là hai chất lỏngkhông tan vào nhau Thực hành cho thấy, nếu đun hỗn hợp này dưới áp suất 760mmHg nó sẽ sôi ở 69oC cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng với bất kì tỉ lệ nào.Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 69oC, áp suất hơi của nước là 225mmHg và benzen là 535 mmHg

Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cấthơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật(Nguyễn Văn Minh, 2017)

3.2.3 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất lôi cuốn hơi nước

3.2.3.1 Sự khuếch tán

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ

và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu cònlại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan vàthẩm thấu Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt

7

độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật.Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi Cònnước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vàolượng nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát rangoài hết.

Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưngcất sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô Nhưng nếulượng nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu

có chứa những cấu phần tan dễ trong nước

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cholớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp nàyđồng đều và dễ dàng

Vì các cấu phần trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nóitrên cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốntrước Thí dụ, khi chưng cất hơi nước hạt caraway nghiền nhỏ và không nghiền, đốivới hạt không nghiền thì carvon (nhiệt độ sôi cao nhưng tan nhiều trong nước) sẽ ratrước, còn limonen (nhiệt độ sôi thấp, nhưng ít tan trong nước) sẽ ra sau Nhưng vớihạt caraway nghiền nhỏ thì kết quả chưng cất ngược lại

3.2.3.2 Sự thủy giải

Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcolkhi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sựchưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

3.2.3.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nướcquá nhiệt (trên 100oC) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưngcất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầuđều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độcao của tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng

có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, sự khuếchtán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũngtăng theo

Trong công nghiệp, dựa trên thực hành, người ta chia các phương pháp chưngcất hơi nước ra thành ba loại chính:

- Chưng cất bằng nước

- Chưng cất bằng nước và hơi nước

- Chưng cất bằng hơi nước

8

3.2.3.4 Chưng cất bằng nước

Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảngkhông gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văngchất nạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặcbằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chấtnạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộnđều bên trong trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Nhữngnguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần cónhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy,khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này Thí dụ điển hình là mùi tinh dầuhoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích vìeugenol và alcol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùngphương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác

* Ưu điểm

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

- Thiết bị gọn, dễ chế tạo

- Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ

- Thời gian tương đối nhanh

* Khuyết điểm

- Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

- Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấuphần dễ bị phân hủy

- Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chấtđịnh hương thiên nhiên rất có giá trị)

- Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn

- Nhưng tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

3.2.3.5 Thu hồi thêm tinh dầu từ nước chưng

Thường tinh dầu trong nước chưng nằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan.Dạng phân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phảichưng cất lại Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thểthêm NaCl để gia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng

Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu, người ta thường dùng

bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger (hình vẽ phần phụ lục) với hai loại ống hứng tinh dầu,tùy theo tinh dầu nặng hay nhẹ

3.3 Pháp pháp vi sóng

9

Hình 2.4 Phương pháp chưng cất bằng vi sóng

đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất.

Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do

đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm địnhchức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 … trong các hợp chất hữu cơ cũng là nhữngnhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ

Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của

vi sóng Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó Tóm lại, sự đunnóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng

10

3.3.3 Tính chất

Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua được không khí, gốm sứ, thủy tinh,polimer và phản xạ trên bề mặt các kim loại Độ xuyên thấu tỉ lệ nghịch với tần số, khitần số tăng lên thì độ xuyên thấu của vi sóng giảm Đối với một vật chất có độ ẩm 50%với tần số 2450 MHz có độ xuyên là 10 cm Ngoài ra, vi sóng có thể lan truyền trongchân không, trong điều kiện áp suất cao …

Năng lượng của vi sóng rất yếu, không quá 10-6 eV, trong khi năng lượng củamột nối cộng hóa trị là 5 eV, do đó bức xạ vi sóng không phải là một bức xạ ion hóa

Có một số công trình đã khẳng định được tính vô hại của vi sóng đối với sinhvật Chẳng hạn, khi nghiên cứu sự phát triển của enzim trong điều kiện vi sóng, người

ta nhận thấy rằng ảnh hưởng của vi sóng rất giống ảnh hưởng của các gia nhiệt thôngthường

Vi sóng cung cấp một kiểu đun nóng không dùng sự truyền nhiệt thông thường.Với kiểu đun nóng bình thường, sức nóng đi từ bề mặt của vật chất lần vào bên trong,còn trong trường hợp sử dụng vi sóng, vi sóng xuyên thấu vật chất và làm nóng vậtchất ngay từ bên trong Vi sóng tăng hoạt những phân tử phân cực, đặc biệt là nước.Nước bị đun nóng do hấp thu vi sóng bốc hơi tạo ra áp suất cao tại nơi bị tác dụng, đẩynước đi từ tâm của vật đun ra đến bề mặt của nó

3.3.4 Ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suấtbên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra Tinh dầu thoát ra bênngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơinước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phươngpháp tẩm trích)

Lưu ý là mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giốngnhau do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ Kếtquả này được phản ánh qua thời gian ly trích

Trong sự chưng cất hơi nước, việc ly trích tinh dầu có thể thực hiện trong điềukiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệuchứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợcủa vi sóng) Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục (trường hợp lượngnước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự lytrích chấm dứt

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất cóchứa oxigen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng Ngược lại cáccấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém)

11

nên sự ly trích chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vậntốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng.

Trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã nghiên cứu, sữa chữa và cải tiến lò visóng gia dụng để cho lò này có thể sử dụng trong cả việc ly trích tinh dầu bằng phươngpháp chưng cất hơi nước, lẫn cho phương pháp tẩm trích ở áp suất thường

Năm 1998, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêu điểm hỗtrợ cho sự ly trích bằng Soxhlet (FMASE – Focused Microwave Assisted SoxhletExtraction) theo hình vẽ trong phần phụ lục Hệ thống này giúp cho thời gian ly tríchhợp chất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệ nhữnghợp chất dễ bị phân hủy tăng lên (Nguyễn Văn Minh, 2017)

3.4 Phương pháp siêu âm

3.4.1 Nguyên tắc

Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16 Hz –

18 kHz) Về mặt thực hành, siêu âm được chia làm hai vùng:

- Vùng có tần số cao (5 – 10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoánbệnh

- Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 kHz), ứng dụng trong các ngành khác(kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt gọt, …) dựa trên khả năngcung cấp năng lượng của siêu âm

Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt” (khoảngcách liên phân tử) Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳđầu và vở trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn Năng lượng này

có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vị trí không thể tẩy rửa bằng phươngpháp thông thường, khoan cắt những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóahọc, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựanhiệt dẻo,…

3.4.2 Hiện tượng tạo bọt và vỡ bọt.

Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ chophương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian ly trích Trong một số trường hợp,phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ Trong trường hợptinh dầu vi sự ly trích bằng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩmluôn có mùi thơm tự nhiên

Các thiết bị siêu âm hiện nay chủ yếu bao gồm hai dạng:

- Bồn siêu âm (40 kHz)

- Thanh siêu âm (20 kHz)

Hiện nay trong phòng thí nghiệm chúng tôi chỉ sử dụng bồn siêu âm trongphương pháp tẩm trích (Nguyễn Văn Minh, 2017)

12

3.4.3 Bồn siêu âm

Bồn thường làm bằng inox, bên dưới đáy bồn có gắn những bộ phận phát rasiêu âm Một số bồn có trang bị thêm bộ phận gia nhiệt nhưng không cho phép tăngnhiệt độ lên cao Bồn siêu âm có ưu điểm là năng lượng được phân bố đồng đều, thuậntiện thao tác, và dễ sử dụng nhưng lại có khuyết điểm là chỉ có một tần số cố định, đôikhi không kiểm soát được nhiệt độ (khi siêu âm trong một thời gian dài), không thựchiện được ở nhiệt độ thấp

Hiện nay bồn siêu âm được chế tạo với nhiều kích thước lớn nhỏ khác nhau đểphù hợp với vật chứa bên trong Khi sử dụng bồn siêu âm, nhớ cho một ít chất hoạtđộng bề mặt vào lượng nước trong bồn để gia tăng khả năng siêu âm Bình chứanguyên liệu cần đổ ngập dung môi với mức dung môi nên thấp hơn hoặc ngang bằnglớp nước bên ngoài

4 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN

4.1 Vi khuẩn Staplylococcus aureus

4.1.1 Giới thiệu chung

Staphylococcus aureus, hay tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩndươngkỵ khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trongcác loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở

Gram-cả mũi và da Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S aureus Sắc

tốcarotenoidstaphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của 'S aureus', vốn có thể

thấy được từ các khúm cấy trên thạch của vi khuẩn này Sắc tố đóng vai trò là một tácnhân độc hại có tính chất chống ôxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết bởi cácchủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch Các tụ cầu thiếu sắc tố

sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ

Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bàytại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng

khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,

phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời

kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa

sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gâybệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộngrãi

4.1.2 Phân loại khoa học

Giới (Kingdom): Eubacteria

13

Nghành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Staphylococcaceae

Chi (Genus): Staphylococcus

Loài (Species): Staphylococcus aureus.

4.1.4 Đặc điểm sinh hóa

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu,

vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so

với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các

sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôicấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diệnlactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng(Collin C.H và cs, 1995)

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu

đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5

mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứngcủa lethinase) (Rosamund M B và cs, 1995; Mary K S và cs, 2002) Trên môi trườngMSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều

và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc(do lên men đường manitol) (Mary K S và cs, 2002)

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của S aureus

14Hình 2.5 Quan sát dưới kính hiển vi

Hình 2.6 Hình thái của

Staphylococcus aureus

4.1.5 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng S aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng,

từ 7 – 48 oC, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 45 oC; khoảng pH 4,2 - 9,3, với độ pH cựcthuận là 7 - 7,5, và trong môi trường chứa trên 15 % NaCl Tụ cầu bền vững khi cónồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60 %, nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu

vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế.

Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết

bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm Chính nhờ những

đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng S aureus được cho là vi khuẩn khá

mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi

và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất

diệt khuẩn Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60 oC từ 2 - 50phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vậtkhác ức chế (Bremer P.J và cs, 2004)

Có 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S aureus (Bremer P.J và cs, 2004) Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S aureus cũng rất

lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố Tụ cầu nhiễm thực phẩmvào chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người Sự

hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12 kiện vệ sinh

của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến khôngtốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc,

điều đó chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ với một

lượng nhỏ S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W B và cs, 2001)

Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ chânlông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ : mụnnhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đềkháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em

và người suy giảm miễn dịch Đinh râu có thể gây nên những biến chứng nguy hiểm

- Nhiễm khuẩn huyết

Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất Do chúnggây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây vi khuẩnxâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết Ðây là một nhiễm trùng rấtnặng Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các

ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các viêm tắc tĩnhmạch Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương

- Viêm phổi

Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp

do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầuvàng ở trẻ em hoặc người suy yếu Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân này khá cao, vìthế nó được coi là bệnh nguy hiểm

- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc

do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế Nguyên nhân là sau một thời gian dàibệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí bình thườngcủa đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng

Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính Sau ănphải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phânlẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và chấtđiện giải nên có thể dẫn tới sốc Ngoài bệnh nguyên nhân do tụ cầu một số trường hợp

có thêm vai trò của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng

- Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu

Thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng từ đó đẫn tớinhiễm khuẩn đường huyết Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rấtmạnh và phải dùng đến vancomycin Tỷ lệ tử vong ở bệnh này rất cao

- Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồngrộp Bệnh này thường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu

- Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)

16