Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ cây ngải cứu (artemisia vulgaris l ) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ..... Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH

TRÍCH LY TINH DẦU TỪ CÂY NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN

HƠI NƯỚC, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO

SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh

TP Hồ Chí Minh, 2018

i

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Trịnh Thị Lan Anh

Các số liệu, kết quả được trình bày trong Đồ án là trung thực, khách quan

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Phan Phú Thắng

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể Quý Thầy, Cô Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản, đã tạo điều kiện thuận lợi để em có cơ hội tiếp cận với môi trường làm việc thực tế qua thời gian học tập đầy ý nghĩa này

Đồng thời nhà trường đã tạo cho em có cơ hội được làm việc, cho em bước ra đời sống thực tế để áp dụng những kiến thức mà các thầy cô đã giảng dạy Qua đề tài tốt nghiệp này em nhận ra nhiều điều mới mẻ và bổ ích để giúp ích cho công việc sau này của bản thân

Đặc biệt, em xin gởi đến cô TS.Trịnh Thị Lan Anh, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành đề tài đồ án tốt nghiệp này lời cảm ơn sâu sắc nhất Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy, Cô, Ban Lãnh Đạo, các phòng ban đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được tìm hiểu thực tiễn trong suốt quá trình làm

đề tài tại phòng thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh, chị làm việc tại Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, hướng dẫn cho em cách làm việc, ghi chú công việc rõ ràng cụ thể để thuận lợi cho việc làm việc nhóm và báo cáo công việc

Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình làm việc và hoàn thiện

đề tài em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ cô cũng như quý thầy, cô, anh, chị

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, đã tạo điều kiện giúp em có cơ hội học tập nâng cao kĩ năng của bản thân Chúc Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM phát triển và ngày càng trở thành nơi tin cậy của nhiều sinh viên

TP.HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện Phan Phú Thắng

iii

MỤC LỤC

CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Giới thiệu về Ngải cứu 7

1.1.1 Vị trí phân loại 7

1.1.2 Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) và chi ngải (Artemisia) 7

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố 8

1.1.4 Công dụng và dược lý của Ngải cứu 10

1.2 Giới thiệu về tinh dầu 11

1.2.1 Khái niệm về tinh dầu 11

1.2.2 Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên 12

1.2.3 Quá trình tích luỹ tinh dầu 12

1.2.4 Tính chất vật lý của tinh dầu 13

1.2.5 Tính chất hoá học của tinh dầu Ngải cứu 14

1.2.6 Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu Ngải cứu 16

1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu trong các ngành công nghiệp 18

1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu 18

1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu 18

1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu 19

1.3 Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 24

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 25

1.3.2 Giới thiệu về ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng của tinh dầu Ngải cứu 26

iv

1.4 Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất

kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 27

1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 27

1.4.2 Các cơ chế kháng khuẩn 27

1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid ở thực vật 29

1.4.4 Một số nhóm hợp chất glycoside ở thực vật 31

1.4.5 Nhóm tinh dầu 33

1.5 Giới thiệu về các chủng vi khuẩn gây bệnh 34

1.5.1 Staphyllococcus aureus 34

1.5.2 Escherichia coli (E.coli) 36

1.5.3 Shigella 38

1.5.4 Salmonella 39

1.6 Giới thiệu về tình hình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu và các loại tinh dầu khác từ thực vật 41

1.6.1 Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu 41

1.6.2 Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá 41

1.7 Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) 42

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 48

2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 48

2.1.2 Thời gian thực hiện 48

2.2 Vật liệu 48

2.2.1 Nguyên liệu 48

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 49

2.2.3 Hóa chất 50

2.3 Phương pháp nghiên cứu 51

2.3.1 Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 52

2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 53

v

2.3.3 Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu 58

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 62

2.4 Thống kê và xử lý số liệu 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 65

3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 65

3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 67

3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 68

3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 70

3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 71

3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 74

3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 75

3.2 Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu 77

3.2.1 Đánh giá cảm quan 77

3.2.2 Định lượng tinh dầu Ngải cứu 77

3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 78

3.2.4 Chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu 79

3.2.5 Độ hòa tan trong ethanol 79

3.3 Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu 80

vi

3.4 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu thu

được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 83

3.4.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 83

3.4.2 Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 85

3.4.3 Kết quả hoạt tính kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 87

3.4.4 Hoạt tính kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 89

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

4.1 Kết luận 92

4.2 Kiến nghị 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC

RNA : Ribonucleic Acid SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) 7

Hình 1.2 Một số cây thuộc chi Ngải 8

Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) 9

Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 14

Hình 1.5 Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol 15

Hình 1.7 Cấu trúc 3D phân tử α-pinene 15

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol 16

Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 16

Hình 1.9 Máy ép tinh dầu 19

Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước 20

Hình 1.11 Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng 23

Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước và nguyên lý hoạt động 25

Hình 1.13 Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật 28

Hình 1.14 Cấu trúc Morphine 29

Hình 1.15 Cấu trúc Quinine 30

Hình 1.16 Sơ đồ phân loại saponin 32

Hình 1.17 Staphyllococcus aureus 35

Hình 1.18 Vi khuẩn E.coli 36

Hình 1.19 Vi khuẩn Shigella 38

Hình 1.20 Vi khuẩn Salmonella 39

Hình 1.21 Sắc đồ của sắc ký khí 44

Hình 1.22 Mô hình khối phổ 45

Hình 1.23 Mass-spectrum 46

Hình 2.1 Vườn Ngải cứu và nhánh Ngải cứu khô 48

Hình 2.2 Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước Clevenger 50

Hình 2.3 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 51

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương

ix

pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 52

Hình 3.1 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 66

Hình 3.2 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 67

Hình 3.3 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 68

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 69

Hình 3.5 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 71

Hình 3.6 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 72

Hình 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 73

Hình 3.8 Tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 73

Hình 3.9 Kết quả kháng E.coli 78

Hình 3.10 Kết quả kháng Staphylococcus aureus 79

Hình 3.11 Kết quả kháng Salmonella 80

Hình 3.12 Kết quả kháng Shigella boydii 81

x

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm

lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 65

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 66

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 67

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 68

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 70

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 71

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được 72

Bảng 3.8 Kết quả định lượng tinh dầu Ngải cứu 74

Bảng 3.9 Kết quả xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 74

Bảng 3.10 Kết quả xác định chỉ số hóa học của tinh dầu Ngải cứu 75

Bảng 3.11 Kết quả xác định độ hòa tan của tinh dầu Ngải cứu trong ethanol 75

Bảng 3.12 Kết quả xác định thành phần hóa học và hàm lượng tương đối các hợp chất trong mẫu tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp GC – MS 76

Bảng 3.13 Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu Ngải cứu 77

Bảng 3.14 Kết quả kháng E.coli của tinh dầu Ngải cứu 78

Bảng 3.15 Kết quả kháng Salmonella typhimurium của tinh dầu Ngải cứu 79

Bảng 3.16 Kết quả kháng Shigella boydii của tinh dầu Ngải cứu 80

đề nóng của nền y học hiện đại Vì lẽ đó trên thế giới hiện nay đang có xu hướng quay về sử dụng các bài thuốc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Nền y học dân gian dùng cây cỏ để trị bệnh là hình thức chữa bệnh cổ xưa nhất của nhân loại, đã có từ hàng ngàn năm về trước Việt Nam cũng là một trong những nước có nền y học cổ truyền sử dụng nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên để chữa bệnh từ rất lâu và được nhiều bạn bè các nước biết đến Do điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng của Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên hệ thực vật phong phú và đa dạng, đó là nguyên nhân tạo nên nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được với nhiều cây thuốc quý đầy đủ chủng loại và số lượng Nhưng nhiều năm trở lại đây, có một số nhận định từ một

số nhà khoa học, bác sĩ: “Người Việt ra ngõ gặp cây thuốc, nhưng lại chết trên đống thuốc”, phải chăng nhận định này đang ám chỉ cho chúng ta: “Tại sao không chịu tìm hiểu và học cách sử dụng những cây thảo dược để chữa bệnh?”

Trong quá trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặc biệt quan tâm đến tinh dầu Tinh dầu có nhiều đặc tính sinh học và dược học cao, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và được sử dụng trong việc tạo ra một số loại chế phẩm để làm thuốc

Trong rất nhiều loài thực vật có thể chiết xuất tinh dầu như chanh, sả, quế, bạc hà,… thì Ngải cứu cũng là một nguyên liệu rất được quan tâm và cần phải đề cập đến

2

1.2 Tầm quan trọng của đề tài

Ngải cứu còn có tên thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh li, tên

khoa học Artemisia vulgaris, là một loài thực vật thuộc họ Cúc có sẵn, dễ tìm,

thu hoạch quanh năm và có tiềm năng to lớn để sản xuất tinh dầu và kháng sinh

tự nhiên

Từ lâu, Ngải cứu được biết đến qua nhiều bài thuốc trong dân gian với các công dụng đặc trưng như bổ huyết, điều kinh hay trong cuộc sống thường ngày Ngải cứu được dùng để nấu canh, làm rau sống ăn kèm để tăng thêm khẩu

vị

Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất có dược tính từ tinh dầu Ngải cứu và thử hoạt tính sinh học là vấn đề mới mẻ, chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều Tinh dầu được sản xuất từ thân, lá cây bằng nhiều phương pháp: phương pháp cơ học, phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi và không bay hơi, phương pháp trích ly bằng CO2, phương pháp vi sóng, phương pháp sinh học, Ngoài ra, còn một phương pháp trích ly tinh dầu khá phổ biến là phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Ưu điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước là quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo, không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh, thu được tinh dầu ít bị lẫn tạp chất, giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu và thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình trích ly tinh dầu từ cây Ngải cứu ( Artemisia vulgaris L.) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn” nhằm bước đầu tìm hiểu, khảo sát thành phần hóa học và

những ứng dụng của cây Ngải cứu từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng loại cây này

1.3 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa về mặt kinh tế của đề tài

Tạo ra được nhiều sản phẩm từ tinh dầu Ngải cứu thiên nhiên

Có giá thành rẻ, mà lại có ứng dụng nhiều trong đời sống và an toàn

Tạo ra nhiều sản phẩm có chứa tinh dầu trên thị trường chưa từng có

Tinh dầu Ngải cứu sẽ thay thế phần nào các loại hóa chất độc hại và các

loại kháng sinh thương mại trên thị trường

Ý nghĩa về mặt sức khỏe

Đối với Tây Y

Ngải cứu là dược liệu sử dụng rộng rãi với thành phần hóa học cũng khá

đa dạng tập trung ở các bộ phận khác nhau của cây như cụm hoa, lá và cây chứa tinh dầu, flavonoid, phenolic,… Bên cạnh đó, Ngải cứu có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, dùng trong bệnh lý về

huyết áp, hen suyễn và có tác dụng bảo vệ gan

Trong y học hiện đại, Ngải cứu được sử dụng trong hỗ trợ cân bằng hệ probiotic trong đường ruột, giúp làm giảm táo bón, loại bỏ giun và ký sinh trùng

đường ruột

Ngoài ra một số hoạt chất trong Ngải cứu còn giúp kháng viêm và đặc biệt qua nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong Ngải cứu có chứa hoạt chất artemisinin có

tác dụng chữa sốt rét

Đối với Đông Y

Trong Đông y Ngải cứu có tính hơi hàn, vị cay, dùng làm thuốc ôn khí huyết, trục hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng do hàn, kinh nguyệt

không đều, thai động không yên, thổ huyết, máu cam

Ý nghĩa trong thực phẩm - mỹ phẩm

Xay nhuyễn thành bột để làm bột gia vị như ngũ vị hương, hồi, quế…

Làm se da, sáng da, tẩy tế bào chết và kháng khuẩn, kháng nấm, giảm

thâm nám

Được sử dụng như nguyên liệu của một số món ăn phổ biến ở miền Bắc

Việt Nam như: Trứng rán Ngải cứu, bánh ngải,…

4

2 Tình hình nghiên cứu

Hiện nay, các nghiên cứu về tinh dầu Ngải cứu còn ít, chủ yếu tập trung vào phân tích thành phần hóa học, dược tính, hoạt tính trong dịch chiết Ngải cứu

hoặc phối chế với các loại dược liệu, thực vật khác

Theo Đỗ Tất Lợi (2004), trong ngải cứu có tinh dầu, ít tannin, thành phần chủ yếu trong tinh dầu ngải cứu là cineole và α-thujone Tinh dầu Ngải cứu có tính chất làm kích thích cho say do α-thujone có tác dụng hưng phấn, nhưng lại

có tác động mạnh đến hệ thần kinh, dùng quá liều có thể gây điên cuồng

Năm 1979, những nghiên cứu ở Trung Quốc đã cho thấy tác dụng chữa

bệnh sốt rét của loài Thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.), từ đó nghiên cứu

của Đinh Huỳnh Kiệt, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (1989; 1990) trên cây Thanh cao hoa vàng dại cho kết quả như sau:

 Có khoảng 0,6 % tinh dầu

 Tỷ trọng d25 là 0,9011

 Tinh dầu màu vàng nhạt, gồm 35 thành phần trong đó nhận dạng được khoảng 20 chất với 12 cấu tử chính chiếm trên 73% tổng hàm lượng tinh dầu

Tinh dầu Ngải cứu còn có hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể ở vi khuẩn

Staplylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis đường kính vòng kháng

lần lượt là 23 mm và 13 mm Ở chủng Salmonella typhimurium đường kính vòng kháng là 8 mm và ở chủng E.coli vòng kháng có đường kính là 11 mm (Erel et

al., 2012)

Mới đây nhất tác giả Lê Thị Thanh Thảo và cộng sự (2018) đã chỉ ra tinh

dầu Ngải cứu có tính kháng mạnh với chủng Staphylococcus aureus với đường

kính vòng kháng là 23 mm, ngoài ra tinh dầu còn có hoạt tính kháng đối với các

chủng nấm men Candida Điều này đã chứng tỏ tiềm năng của tinh dầu Ngải cứu

trong tìm kiếm chất có hoạt tính kháng nấm Nghiên cứu cũng chỉ ra khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu là có, tuy nhiên lại yếu hơn rất nhiều so với cao chiết

5

3 Mục đích nghiên cứu

 So sánh hàm lượng tinh dầu của 2 loại lá Ngải cứu: lá già, lá non

 Xác định được các điều kiện tối ưu của việc trích ly tinh dầu, và xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến việc trích ly tinh dầu

 Xác định được thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu ở TP HCM

 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với các chủng

vi sinh vật (Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureaus, E.coli,

Shigella boydii)

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Nghiên cứu cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài

 Tiến hành thực nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

 Định danh và định lượng các thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

 Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp khuyết tán trên đĩa thạch

5 Phương pháp nghiên cứu

 Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu

 Phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger

 Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu

trên các chủng vi khuẩn : Salmonella typhimurium, Staphylococcus

aureus, E.coli, Shigella boydii

 Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.1 và Excel 2016 ®

6 Các kết quả đạt được của đề tài

 Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng

cất lôi cuốn hơi nước

 Định danh và định lượng thành phần hóa học có trong tinh dầu Ngải cứu

thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS

6

 Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu trên các chủng vi

khuẩn: Salmonella typhimuirium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella

boydii

7 Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp

Đồ án gồm 4 chương:

 Chương 1: Tổng quan tài liệu

Tổng quan về Ngải cứu, các khái niệm về tinh dầu, nguyên tắc sản xuất và ly trích tinh dầu Giới thiệu về các chủng vi khuẩn và khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Giới thiệu nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị sử dụng Thiết kế thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Các phương pháp xác định chỉ

số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu và đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của tinh dầu

 Chương 3: Kết quả và thảo luận

 Chương 4: Kết luận và kiến nghị

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Ngải cứu

1.1.1 Vị trí phân loại

Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thuộc:

Giới (regnum) : Plantae

Chi (genus) : Artemisia

Loài (species) : A vulgaris

Ngải cứu có tên khoa học là: Artemisia vulgaris L., Mugwort

Tên thông thường là: thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh li

Hình 1.1: Hình ảnh cây Ngải cứu (Artemisia Vulgaris)

1.1.2 Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) và chi ngải (Artemisia)

Họ Cúc (Asteraceae) gồm 115 chi với khoảng 325 loài, phần lớn ở dạng thân cỏ, lá đơn, mọc cách hoặc mọc đối Hoa lưỡng tính hay đơn tính, mọc đều, đối xứng 2 bên Họ Cúc có nhiều giá trị kinh tế hơn Nhiều loại được trồng rộng

rãi làm cây cảnh như thược dược (Dahlia pinnata), các loại cúc vàng, cúc trắng thuộc chi Chrysanthenum làm thuốc trừ sâu Một số được dùng làm rau như rau diếp (Lactuca indica), rau khúc tẻ (Gnaphalium affine), rau khúc nếp (G

8

polycaulon), cây có dầu như hướng dương (Helianthus annuus), cây làm thuốc

như Ngải cứu (Artemisia vulgaris), cây chữa bệnh sốt rét như thanh hao hoa vàng (A annua)

Chi ngải (Artemisia) là một chi lớn của họ Cúc với khoảng 185 loài,

thường là cây thân thảo hay cây bụi , có mùi tinh dầu đặc trưng Môi trường sinh sống khô hay bán khô thường là các khu vực nhiệt đới và ôn đới bắc bán cầu Lá ngải tương tự lá dương xỉ, thường có nhiều lông trắng nhỏ bao phủ Ở Việt Nam,

có bốn loài thuộc chi ngải là ngải thanh cao (A carvifolia), ngải hoa vàng (A

annua), ngải đắng (A absinthium) và Ngải cứu (A vulgaris)

Hình 1.2 Một số cây thuộc chi Ngải

a Ngải Thanh Cao (A carvifolia)

b Ngải Hoa Vàng (A annua)

c Ngải Đắng (A absinthium)

d Ngải cứu (A vulgaris)

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố

Ngải cứu còn gọi là cây thuốc cứu, cây thuốc cao, ngải điệp Tên khoa

học: Artemisia vulgaris L., thuộc họ Cúc (Asteraceae)

9

Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.)

Thân: là cây thân cỏ, sống lâu năm, cao khoảng 1 m Thân thẳng có rãnh dọc màu tía nhạt, cành non có lông

Lá: lá xẻ nhiều kiểu từ xẻ lông chim đến xẻ thùy theo đường gân lá, mặt trên nhẵn màu nâu đậm, mặt dưới trắng xanh do có nhiều lông màu trắng, lá mọc

so le, không có cuống (nhưng phía dưới thường có cuống), vò nát có mùi hắc, vị đắng

Hoa: thường có vào tháng 7 – 9, hoa có màu vàng lục nhạt hoặc màu đỏ nhạt, mọc thành chùy kép, dài từ 2 – 10 cm, đứng ở nách lá, mỗi hoa hình đầu rộng từ 3 – 4 mm bao gồm 2 loại hoa hình ống: hoa cái và hoa lưỡng tính

Quả bế không có mào lông Ngải cứu là cây của miền Âu, Á ôn đới Cây phát triển trên vùng có nhiều cỏ dại, ở những vùng đất giàu nitơ như vùng bỏ hoang nơi có nhiều ánh nắng, vùng đất không canh tác, ven đường và trên các bờ dậu Mọc hoang ở nhiều nơi trong nước ta và cũng mọc ở nhiều nước khác Cây cũng được trồng nhiều nơi trên qui mô nhỏ ở các vườn thuốc vườn gia đình từ vùng thấp đến vùng cao

10

1.1.4 Công dụng và dược lý của Ngải cứu

Ở một vài nước phương đông, người ta sử dụng một lượng lớn Ngải cứu trong thực phẩm như sử dụng trong trà, tạo mùi vị dễ chịu cho một số loại bánh

Ở phương tây, người ta sử dụng để nấu các món từ gia cầm, thịt heo, cũng được

sử dụng để ủ bia Phổ biến hơn, Ngải cứu còn được dùng trong châm cứu bấm huyệt giúp lưu thông huyết mạch, thư giãn xóa tan căng thẳng mệt mỏi

Trước đây, người ta sử dụng Ngải cứu như một phương thuốc chống sự mệt mỏi cho đôi chân và khớp gối, ngoài ra còn giúp khử mùi cho đôi giày giống như quế

Người dân ở các nước phương tây còn dùng Ngải cứu như 1 loại trà tăng lực, khoảng 2 – 3 tách trà mỗi ngày gồm 150 ml nước nóng và từ 2 đến 3 g lá Ngải cứu khô ngâm ngập trong nước khoảng 5 phút và dùng trước bữa ăn để tăng khẩu vị chống đầy hơi Rễ cây Ngải cứu được sử dụng để bổ huyết, an thần, trị chứng mất ngủ và ứng dụng làm thuốc ngừa thai

Người Ấn Độ cũng sử dụng Ngải cứu làm trà tăng lực Bên cạnh đó Ngải cứu còn được dùng để làm thuốc trị co thắt, long đờm, ho gà và các chứng bệnh

về đường ruột và tiết niệu

Đông y coi Ngải cứu là một vị thuốc có tính hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng do hàn, kinh nguyệt không đều, khí hư, động thai, ngăn chặn sảy thai, băng huyết, chảy máu cam, lỵ ra máu, nôn mửa, đau dây thần kinh, thấp khớp, ghẻ lở, thổ huyết Ngoài ra nó cũng giúp tiêu hóa, trị giun, kháng sinh, sốt rét, chữa rối loạn kinh nguyệt, dùng ngoài trị lạnh bụng, đau dạ dày, đau khớp, eczema, ngứa

Một số bài thuốc từ Ngải cứu

Mùa hè, nhất là từ sau ngày hạ chí, thời tiết bắt đầu có những thay đổi thất thường, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe Đây cũng là thời điểm bùng phát nhiều loại bệnh, tấn công cơ thể và gây phiền phức cho nhiều nhóm người Đông y có câu nói nổi tiếng "Mùa hè chữa bệnh mùa Đông", với ý rằng, mùa nóng không chỉ cần chăm sóc sức khỏe tốt để vượt qua thời tiết, mà còn phải chăm chỉ dưỡng sinh để chuẩn bị sức khỏe cho mùa đông lạnh giá, khắc nghiệt hơn

11

Một trong những giải pháp phòng chữa bệnh nổi tiếng của Đông y đó chính là ngâm chân Có lẽ không cần nhấn mạnh thì hầu như chúng ta đều biết tác dụng của việc ngâm chân đối với sức khỏe

Quan trọng hơn, việc ngâm chân với lá Ngải cứu – thứ lá quen thuộc, phổ biến và dễ dàng mua được còn mang lại nhiều tác dụng hơn những gì xưa nay chúng ta vẫn nghĩ

Lá Ngải cứu còn được Đông y gọi là Ngải khao, vốn chỉ là một loài rau dại nhưng sau đó được nghiên cứu và sử dụng như một loại dược liệu quý, được gọi là "rau của bậc Danh y" Ngải cứu được người dân Châu Á sử dụng phổ biến trong đời sống hàng ngày

Theo Đông y, Ngải cứu có vị đắng, cay, ấm, khi ăn sẽ tác động chính vào

3 kinh mạch là tỳ, gan và thận Nghiên cứu cho thấy lá Ngải cứu có thể làm giảm hàn trừ ẩm, ấm kinh và cầm máu Rất phù hợp dùng cho những người hay bị mất máu, đau bụng, đau bụng kinh, tử cung chảy máu, các bệnh phụ khoa khác

1.2 Giới thiệu về tinh dầu

1.2.1 Khái niệm về tinh dầu

Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Cần phân biệt rõ tinh dầu với dầu béo (hỗn hợp các triglicerid) và dầu mỏ (hỗn hợp các hydrocarbon) Rất khó khăn khi có một định nghĩa tuyệt đối chính xác cho tinh dầu Về mặt thực hành, tinh dầu có thể như “một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật” Tinh dầu thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi hoàn toàn mà không bị phân hủy

Trong thiên nhiên, rất nhiều tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít trạng thái tiềm tàng Ở trạng thái tiềm tàng, tinh dầu không có sẵn trong nguyên liệu mà chỉ xuất hiện trong những điều kiện gia công nhất định trước khi tiến hành ly trích Còn ở trạng thái tự do, tinh dầu hiện sẵn trong nguyên liệu có thể

thu trực tiếp dưới những điều kiện ly trích bình thường (Abegaz et al., 1983)

12

1.2.2 Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên

Các loại cây có tinh dầu được phân bố rộng trong thiên nhiên Kết quả thống kê cho thấy có khoảng 2.500 loài cây có chứa tinh dầu

Trữ lượng tinh dầu trong cây phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Cây mọc ở vùng nhiệt đới có trữ lượng tinh dầu cao hơn ở vùng ôn đới Ngay trong một cây, thành phần và lượng tinh dầu trong các bộ phận khác nhau cũng khác nhau Ngoài ra lượng tinh dầu thu được còn phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách chiết, Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng rất khác nhau: Hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25%; bạc hà hàm lượng khoảng 1%; quả hồi và nụ Đinh hương thì hàm lượng tinh dầu tương ứng có thể đạt giá trị 5% và 15% (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014)

1.2.3 Quá trình tích luỹ tinh dầu

Trong thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô Hình thành các mô này thay đổi tùy theo vị trí của chúng trong cây Những mô này có thể hiện ở tất cả mọi nơi trong cây như rễ, thân, lá, hoa và quả, dưới những tên gọi khác nhau như:

Tế bào tiết: tế bào tiết ra tinh dầu rồi giữ luôn trong tế bào (mô tiết) như trong cánh Hoa hồng, trong củ Gừng,

Lông tiết: cũng là tế bào tiết nhưng nằm nhô ra ngoài bề mặt thực vật, thường bắt gặp ở lá các họ Hoa môi, Cúc, Cà,

Túi tiết: tế bào tiết ra tinh dầu nhưng không chứa lại bên trong mà dồn chung chứa vào một xoang trống, tạo ra bởi cơ chế ly bào hay tiêu bào Túi tiết

thường năm bên dưới biểu bì Thường có ở vỏ quả các giống Citrus,

Eucalyptus,

Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong

phần gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các giống Dipterocarpi,

Artemisia,

Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ Hoa môi, Họ Cam, Họ Sim, họ Hoa tán

1.2.4 Tính chất vật lý của tinh dầu

Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như menthol, camphor, là ở thể rắn

Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm,

Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu như: tinh dầu Quế có màu nâu sẫm, tinh dầu Xạ hương màu đỏ, tinh dầu Ngải cứu màu vàng lục Tinh dầu thường có vị cay và hắc

Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu nặng hơn nước như tinh dầu Đinh hương, tinh dầu Quế Tỷ trọng thay đổi theo thành phần hóa học Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon terpenic thì tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn

Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56 Chỉ số khúc

xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc có nhân thơm Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao

Vì tinh dầu là một hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất Ví dụ, hợp chất terpen có điểm sôi là 150 – 160oC, hợp chất sesquiterpen có điểm sôi cao hơn, khoảng 250 – 280oC, còn các hợp chất polyterpene có điểm sôi trên 300oC Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn

14

Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu Hồi, tinh dầu Bạc hà, tinh dầu Xá xị, (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.2.5 Tính chất hoá học của tinh dầu Ngải cứu

Năm 2008, Govindaraj và cộng sự đã khảo sát tinh dầu Ngải cứu, kết quả cho thấy tinh dầu chứa các chất camphene, camphor, 1,8-cineole, p-cymene, β-eudesmol, α-pinene, terpene-4-ol

Camphor:

Camphor (Long não hay băng phiến) là một chất rắn kết tinh, có màu trắng hoặc trong suốt giống với sáp, mùi hăng mạnh đặc trưng Camphor là một monoterpenoid với công thức hóa học C10H16O Camphor có tác dụng xua đuổi côn trùng, đồng thời là hoạt chất được sử dụng trong một số loại thuốc chống côn trùng, chống ngứa

Tuy nhiên khi sử dụng một lượng lớn camphor có thể dẫn đến ngộ độc, gây ra tai biến, rối loạn tương tự chất kích thích Năm 1980, FDA Hoa Kỳ đã đặt giới hạn 11% camphor được phép sử dụng trong các sản phẩm tiêu dùng và cấm toàn bộ các sản phẩm chứa các chiết xuất camphor

Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 1,8-cineole

1,8-cineole hay còn được biết đến dưới tên gọi eucalyptol là một hợp chất hữu cơ tự nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phòng là một chất lỏng không màu Đây là thành phần chủ đạo của tinh dầu bạch đàn Eucalyptus globulus, chiếm tới 90% trong dầu bạch đàn Ngoài ra Eucalyptol còn được tìm thấy trong Long não, Ngải cứu, Húng quế, Hương thảo và một số loài thực vật lá có hương thơm khác Eucalyptol được ứng dụng trong nhiều loại nước súc miệng và thuốc ho, ngoài ra còn được sử dụng như là thuốc trừ sâu và thuốc xua đuổi côn trùng Ở liều lượng

là thuốc giải độc chống ngộ độc organophosphate

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol α-pinene

Ở mức độ sử dụng thấp, α-pinene được coi như thuốc điều trị các bệnh liên quan đến phế quản đặc biệt là hen suyễn, ngoài ra đây còn là chất chống viêm và kháng khuẩn Một số nghiên cứu còn chỉ ra khả năng hỗ trợ trí nhớ và

Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 1.2.6 Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính

chất của tinh dầu Ngải cứu

Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không cố định mà luôn thay đổi theo hướng phát triển của cây cũng như ảnh hưởng của những yếu tố khác

Nguyên liệu chế biến và bộ phận dùng để chế biến

Mỗi loại cây tinh dầu, ở mỗi bộ phận chứa tinh dầu, có thành phần nhất định trong những điều kiện nhất định, các giống khác nhau thì thành phần tinh

Hướng phát triển của cây

Trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến đổi và những chuyển hóa này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh dầu nhất và có chất lượng cao nhất để thu hoạch và chế biến

Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có 1 lượng cố định mà biến đổi liên tục theo hướng phát triển của cây Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng tích tụ nhiều những hợp chất có chứa oxy

Trong các bộ phận khác nhau của cây, tinh dầu tạo thành và tích lũy không giống nhau mà luôn luôn chuyển hóa lẫn nhau (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Độ tươi

Nguyên liệu bị khô, dập, úng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu Nên tránh để dồn đống nguyên liệu đưa đến sự phát nhiệt bên trong làm thối rữa nguyên liệu Cần phơi héo nguyên liệu thích hợp, tốt nhất phơi héo trong bóng mát vì nếu nhiệt độ lên quá 40oC một số cấu phần trong tinh dầu

sẽ bay hơi Nhưng độ héo cũng ảnh hưởng đến hàm lượng và chất lượng tinh dầu Do đó, nếu để nguyên liệu héo trong một thời gian dài sẽ đưa đến giảm khối lượng tinh dầu chứa trong nguyên liệu Mặt khác, việc này cũng sẽ dẫn đến một

số cấu phần không bền trong tinh dầu bị phân hủy làm cho tinh dầu thu được không còn chất lượng tự nhiên Do đó, trước khi ly trích tinh dầu, nguyên liệu cần được phơi héo, cần phải khảo sát hiệu suất và thành phần hóa học của tinh dầu theo thời gian để héo để biết cần để héo trong thời gian bao nhiêu lâu là thích hợp nhất (Phùng Thị Ái Hữu, 2012)

18

Độ sạch

Nguyên liệu càng sạch thì chất lượng tinh dầu thu được càng cao Do đó khi ly trích cần phải làm sạch, loại bỏ bẩn, các đối tượng không phải nguyên liệu cần ly trích ra khỏi nguyên liệu, không được để lẫn vào (Phùng Thị Ái Hữu, 2012)

1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu trong các ngành công nghiệp

Tinh dầu Ngải cứu đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm không chỉ từ giới khoa học mà cả trong sản xuất công nghiệp hiện đại khi mà xu hướng đang dần quay trở về sử dụng các hợp chất thiên nhiên

Trong bảo quản thực phẩm, tinh dầu Ngải cứu được sử dụng như một chất

ức chế sự phát triển cũng như xua đuổi côn trùng, các loại vi khuẩn từ đó có thể giữ thực phẩm không bị xâm hại bởi các loại côn trùng, vi khuẩn khác nhau (Judzentinene và Buzelyte, 2006)

Ở thời điểm mà ung thư đang là một trong những nỗi ám ảnh với con người thì các nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống ung thư của tinh dầu Ngải cứu

xuất phát từ hoạt chất Artemisin (Sun et al., 1992) Đây cũng là một tín hiệu cho

thấy khả năng ứng dụng cao của tinh dầu Ngải cứu trong ngành công nghiệp Dược phẩm

Với thành phần chính gồm có camphor, tinh dầu Ngải cứu đã được chứng minh là có thể sử dụng trong bảo quản dược phẩm và mỹ phẩm

1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu

Theo Mai Thị Anh Tú (2009), nguyên tắc để sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên như sau:

 Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

 Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu

 Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất

 Đơn giản, thuận tiện và nhanh chóng

1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu

Theo Phùng Thị Ái Hữu (2012), nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như:

19

 Dễ bay hơi

 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC

 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ

 Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí

1.2.10 Các phương pháp trích ly tinh dầu

Do những yêu cầu về nguyên tắc trích ly nên khi khai thác hợp chất thơm

từ thực vật, động vật, người ta thường dùng một trong các phương pháp sau đây:

Phương pháp cơ học

Hình 1.9 Máy ép tinh dầu

Đây là phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự

do bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu (thường là ép) Phương pháp

này được dùng phổ biến đối với các loại vỏ quả họ Citrus như cam, chanh, quýt,

bưởi, Vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp

tế bào mỏng trong biểu bì Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, các tế bào có chứa tinh dầu bị vỡ ra giải phóng tinh dầu

Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu, các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi

20

Nhược điểm của phương pháp ép tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu là các hợp chất hữu cơ hòa tan vật liệu đem ép (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước

1 Bình cấp hơi nước

2 Bình chứa nguyên liệu chưng cất

3 Lớp tinh dầu

4 Lớp nước Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng vào bình chưng cất Ngày nay thường dùng phương pháp này để chung cất tinh đầu từ các nguyên liệu thực vật Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy

Việc sử dụng phương pháp cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế, yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phân hủy nhưng cấu phần có độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt Nếu hơi nước quá ẩm sẽ dẫn đến hiện tượng hơi nước ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt, trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng

Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger

Theo Lã Đình Mỡi (2001), phương pháp chưng cất lôi cứu hơi nước bằng

bộ chưng cất Clevenger có những ưu, nhược điểm như sau:

Ưu điểm

 Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

 Thiết bị gọn, dễ chế tạo

 Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ

 Thời gian tương đối nhanh

Nhược điểm

 Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

 Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy

 Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn

 Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

Phương pháp trích bằng dung môi dễ bay hơi

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong với dung môi bên ngoài do chênh lệch nồng

độ Sau khi trích ly phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu (Mai Thị Anh Tú, 2009)

22

Trích ly bằng dung môi không bay hơi

Dựa vào tính chất có thể hòa tan trong chất béo động vật và thực vật của tinh dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật hoặc thực vật, tinh dầu sẽ khuếch tán qua màng tế bào, hòa tan vào dầu, sau đó tách riêng dầu để thu tinh dầu

Phương pháp ngâm bằng dung môi không bay hơi có nhiều ưu điểm hơn phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi ở chỗ thu dầu được dầu ít tạp chất hơn Tuy nhiên, phương pháp này rất thủ công, khó cơ giới hóa và có nhược điểm lớn là chất béo dùng làm dung môi rất khó bảo quản và chế biến, giá thành cao Chính vì vậy hiện nay phương pháp này rất ít được sử dụng (Mai Thị Anh

Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt

CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi khác

Dễ loại và không để lại vết dung môi

Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phân hủy

Quá trình kín ít bị hao tốn

Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí cho CO2 còn đắt, nên chưa được phổ biến (Mai Thị Anh Tú, 2009)

23

Phương pháp vi sóng

Hình 1.11 Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Phương pháp vi sóng có đặc điểm: vi sóng (micro – onde, microwave) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng Sóng điện từ này được đặc trưng bởi:

 Tần số f, tính bằng Hertz (Hz = cycles/s ), là chu kỳ của trường điện từ trong một giây, nằm giữa 300 Hz và 30 GHz

24

có tần số rất cao 2,45 x 109 Hz, điện trường này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất

Với một cơ cấu có bất đối xưng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do

đó nước là một chất rất lý tưởng để đun nóng bằng vi sóng Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2, trong các hợp chất hữa cơ cũng

là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ

Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng Việc này liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó Tóm lại,

sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Phương pháp sinh học

Phương pháp này được ứng dụng cho các nguồn nguyên liệu có tinh dầu ở trạng thái kết hợp (glucosid) Để phân lập tinh dầu, người ta phải xử lý bằng cách lên men hoặc dùng enzyme, sau đó kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu giống như các loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.3 Giới thiệu về phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sự chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm

cho sự khuếch tán trở nên khó khăn (Phùng Thị Ái Hữu, 2013)

25

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp chưng cất lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước được dựa trên nguyên

lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, cả hai chất đều bay hơi Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất môi trường thì hỗn hợp

sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước (Phùng Thị Ái Hữu, 2012)

Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

Nguyên liệu và nước được cho vào cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước ra Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản,

rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ ở địa phương, nhất là ở những nơi mới bắt đầu khai thác tinh dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất

Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm:

 Chất lương tinh dầu sản phẩm không cao

 Nguyên liệu dễ bị cháy khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị

 Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài

 Tiêu tốn nhiều năng lượng

Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước và nguyên lý hoạt động

26

Chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp

Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi nước riêng hoặc sử

dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác nhau

Do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của tinh

dầu thu được tốt hơn

Do hơi nước cấp từ bên ngoài nên dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp với từng loại nguyên liệu, giúp nâng

cao hiệu suất cũng như chất lượng tinh dầu thu được (Phùng Thị Ái Hữu, 2012) 1.3.2 Giới thiệu về ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng của tinh dầu Ngải cứu

Ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu được

Đối với yếu tố khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu được, tác giả Nguyễn Thị Hồng thực hiện chưng cất lôi cuốn hơi nước với

100 g lá Ngải cứu già trong vòng 7 giờ, sau khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,

4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ đọc thể tích tinh dầu thu được bên nhánh hứng

Kết quả khảo sát cho thấy thời gian chưng cất tối ưu là 5 giờ, sau khoảng thời gian đó lượng tinh dầu tăng không đáng kể Thể tích tinh dầu thu được ở 5 giờ là 1,4 ml Từ đó, tác giả đã nhận xét để lượng tinh dầu thu được là tối ưu thì

ta tiến hành chưng cất trong khoảng thời gian là 5 giờ với nguyên liệu lá Ngải

cứu già (Nguyễn Thị Hồng, 2011)

Ảnh hưởng của lượng dung môi trích ly

Ở thực nghiệm khảo sát yếu tố lượng dung môi trích ly, tác giả Nguyễn Thị Hồng đã tiến hành khảo sát trên 100 g mẫu lá Ngải cứu già với thể tích nước lần lượt là 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml đun trong 5 giờ bằng phương

pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng thể tích dung môi dùng để ly trích thì lượng tinh dầu càng tăng Do đó, thể tích dung môi dùng để ly trích tỷ lệ thuận với hàm lượng tinh dầu ly trích Hàm lượng tinh dầu thu được cao nhất là 1,2%

ở thể tích nước cất là 300 ml Khi tăng lượng dung môi, lượng tinh dầu có xu hướng không tăng thêm Vì vậy tác giả đã nhận xét bổ sung 300 ml nước tương

27

đương tỷ lệ nguyên liệu / thể tích nước là 1:3 là tỷ lệ dung môi tối ưu khi ly trích

tinh dầu với lượng mẫu như trên (Nguyễn Thị Hồng, 2011)

Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu làm mẫu

Tác giả Nguyễn Thị Hồng đã khảo sát yếu tố mẫu nguyên liệu ảnh hưởng

đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được

Kết quả cho thấy tại các điều kiện ly trích tối ưu, khối lượng tinh dầu lá Ngải cứu già thu được nhiều hơn so với lá Ngải cứu non là 1,23 lần Điều này chứng tỏ hàm lượng tinh dầu trên lá Ngải cứu già nhiều hơn so với lá Ngải cứu

non (Nguyễn Thị Hồng, 2011)

1.4 Khả năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật

1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

Hợp chất kháng khuẩn ở thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi sinh vật Các hợp chất kháng khuẩn thường có khả năng tác dụng đặc hiệu lên vi sinh vật với một

nồng độ rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010)

Các hợp chất này thường thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau như alkaloid,

glucoside, phenolic và tinh dầu

1.4.2 Các cơ chế kháng khuẩn

Hình 1.13 Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật

28

Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn:

Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

Ức chế chức năng của màng tế bào:

Gồm colistin, polymycin, gentamicin và amphoterricin Cơ chế sẽ làm mất chức năng của màng, làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát

ra ngoài

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide

Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic:

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao

mã tạo thành mRNA

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA

và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự, 2010)

29

1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid ở thực vật

Morphine

Morphine là alkaloid chủ yếu trong nhựa của cây anh túc còn xanh

(Papaver somniferum) Morphine tinh sạch được thu được lần đầu vào năm 1806

và xác định cấu trúc hóa học vào năm 1927

Morphine có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, gây nghiện Morphine

có khả năng giảm đau, tạo cảm giác lâng lâng dễ chịu Hiện nay rất nhiều hợp chất tổng hợp giống morphine nhưng ít độc hơn được sử dụng trong y tế như linol, lerit hay phenazone,…

Hình 1.14 Cấu trúc Morphine Quinine

Từ rất lâu, quinine đã được sử dụng làm thuốc trị sốt rét Quinine có trong

cây Cinchona officinalis có nguồn gốc từ Peru, Bolivia Cấu trúc hóa học của

quinine được xác định vào năm 1907 và tổng hợp hóa học từ năm 1945 Quinine

ức chế quá trình sao chép DNA và phiên mã tạo RNA của tác nhân gây sốt rét