BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007. “PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk. IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”. The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007. Supervisor: BUI MINH TRI, PhD. Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast. Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests. By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular. This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest. The obtained results were:  Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R. mucronata.  Optimize RAPD analysis protocol for R. mucronata. It was indicated that Primer OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers. From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands.  Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R. mucronata and cultivated R. mucronata populations was in a range from 46 to 79 %. Another

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU

MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG

(Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007

Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ MINH THÙY

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**********************

BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU

MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG

(Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

ii

LỜI CẢM ƠN

Con thành kính ghi ơn Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi nấng con thành người Con xin cảm

ơn gia đình về tất cả

Em xin chân thành cảm ơn:

Các Thầy, Cô trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học

Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận

Thầy TS Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu

Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu Các bạn cùng thực hiện đề tài đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học Đặc biệt cảm ơn tất cả các bạn cùng phòng đã ủng hộ tinh thần và đồng hành với tôi trong suốt thời gian học tập Chúc mọi người đều hạnh phúc và thành đạt

Xin chân thành cảm ơn!

Trương Thị Minh Thùy

iii

TÓM TẮT

TRƯƠNG THỊ MINH THÙY, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, 9/2007

“BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ

TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

Giáo viên hướng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ

Khóa luận được tiến hành tại Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ 7 / 5 / 2007 đến 31 / 8 / 2007

Rừng ngập mặn là hệ sinh thái gồm nhiều loài cây khác nhau, trong đó có Đưng

Rhizophora mucronata Lamk., một loài chiếm số lượng lớn ở vùng nước mặn, đồng

thời quần thể Đưng cũng là hàng rào bảo vệ bờ biển các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới Tuy ý nghĩa kinh tế và môi trường của rừng ngập mặn ngày càng được công nhận, song diện tích của chúng trên khắp thế giới đang giảm dần theo thời gian do ô nhiễm và nạn phá rừng Trên cơ sở đó, cần có những kế hoạch hợp tác nhằm cải thiện hệ sinh thái, thiết lập sự phát triển bền vững cho rừng ngập mặn nói chung và khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng Khóa luận này nhằm mục đích thiết lập quy

trình thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền cây Đưng Rhizophora mucronata

tại rừng ngập mặn Cần Giờ

Kết quả đạt được:

 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đưng tươi

 Xây dựng được quy trình phản ứng RAPD đối với cây Đưng Xác định được OPAC10 là mồi tạo độ đa hình cao nhất trong số những mồi tiến hành khảo sát Từ

14 mẫu, OPAC10 đã khuếch đại 18 locus, trong đó có 2 band đồng hình (trọng lượng phân tử: 300 bp và 400 bp) và 13 band đa hình

 Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, hệ số đồng dạng di truyền giữa các cá thể trong quần thể Đưng tự nhiên và Đưng được trồng biến thiên từ 46 đến 79

% Kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, chúng tôi nhận thấy hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 68 đến 100 % Điều này cho thấy giữa các cá thể trong

iv

quần thể Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có mối quan hệ di truyền tương đối gần, tuy nhiên chúng lại phân bố rải rác khắp các tiểu khu vì vậy giữa các cá thể vẫn thể hiện được tính đa dạng sinh học cao

Tp HCM, ngày 7 tháng 9 năm 2007

Trương Thị Minh Thùy

v

ABSTRACT

TRUONG THI MINH THUY, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, September 2007

“PREMILINARY RESEARCH ON METHOD DEVELOPMENT AND

GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Rhizophora mucronata Lamk IN

CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA BY RAPD”

The thesis was carried out in Chemical and Biological Analysis and Experiment Center at Nong Lam University from May to August in 2007

Supervisor: BUI MINH TRI, PhD

Mangrove is an ecological term referring to a taxonomical diverse assemblage of

trees, including Rhizophora mucronata Lamk., that forms the dominant plant

communities in tidal, saline wetlands along sheltered tropical and subtropical coast Although the economic and environmental significance of mangroves is being increasingly recognized, it is in fact, decreasing around the world because of pollution and deforestation of the mangrove forests By those reason, it is necessary to set up an integrated plan improving the ecosystem in order to establish a sustainable development for the mangrove forest in general and Can Gio Biosphere reserve are in particular This research was aimed to set up appropriate protocols for evaluating genetic diversity of

Rhizophora mucronata in Can Gio mangrove forest

The obtained results were:

 Set up suitable protocol for extracting genomic DNA of fresh leaves of R

mucronata

 Optimize RAPD analysis protocol for R mucronata It was indicated that Primer

OPAC10 gave highest polymorphic level among tested primers From 14 samples, primer OPAC10 amplified at 18 loci, those included 2 monomorphic bands (with molecular weight: 300 bps & 400 bps) and 13 polymorphic bands

 Analysing with NTSYS 2.1, similarity between the natural R mucronata and cultivated R mucronata populations was in a range from 46 to 79 % Another

vi

analysis on 14 randomized samples, we obtained similarity ranged from 68 to 100%

The result also suggested that R mucronata at Can Gio biosphere reserve area have

not had closed relation but scattered in to various groups

vii

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Abstract vi

Mục lục viii

Danh sách các chữ viết tắt xii

Danh sách các bảng xiii

Danh sách các hình xiv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Giới hạn của đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh 3

2.1.1 Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển 3

2.1.2 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4

2.1.2.1 Điều kiện tự nhiên 4

2.1.2.2 Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh 6

2.1.2.3 Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ 7

2.1.3 Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay 8

2.2 Cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) 9

viii

2.2.1 Phân loại 9

2.2.2 Hình thái học 10

2.2.3 Phân bố 11

2.2.4 Giá trị kinh tế 11

2.3 DNA (Deoxyribonucleic acid) 12

2.3.1 Quy trình ly trích DNA thực vật 13

2.3.2 Các phương pháp định lượng, định tính DNA 14

2.3.2.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ 14

2.3.2.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 15

2.4 Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme) 16

2.4.1 Các loại enzyme giới hạn 16

2.4.2 Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn 16

2.4.3 Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA 16

2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction) 18

2.5.1 Khái niệm 18

2.5.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 18

2.5.3 Quy trình phản ứng PCR 19

2.6 Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng 20

2.7 Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) 21

2.8 Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền 21

2.9 Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 22

2.9.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 22

2.9.1.1 Khái niệm 22

2.9.1.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP 23

2.9.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 24

2.9.2.1 Khái niệm 24

2.9.2.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP 26

2.9.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 27

2.9.3.1 Khái niệm 27

ix

2.9.3.2 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 29

2.9.3.3 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 29

2.9.3.4 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD 29

2.9.4 So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 30

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 31

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 31

3.1.1 Thời gian thực hiện 31

3.1.2 Địa điểm thực hiện 31

3.2 Vật liệu thí nghiệm 31

3.2.1 Nguyên tắc thu thập mẫu 31

3.2.2 Cách ký hiệu mẫu 31

3.2.3 Cách lấy mẫu 32

3.2.4 Cách bảo quản mẫu 32

3.3 Phương pháp thí nghiệm 32

3.3.1 Quy trình ly trích DNA 32

3.3.1.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA 32

3.3.1.2 Quy trình ly trích DNA 33

3.3.1.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phương pháp quang phổ 35

3.3.1.4 Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 35

3.3.2 Kỹ thuật RAPD 35

3.3.2.1 Vật liệu dùng trong RAPD 35

3.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 37

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Kết quả thu thập mẫu Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 42

4.2 Bảo quản mẫu 43

4.3 Kết quả OD (Optical Density) 44

x

4.4 Kết quả điện di 45

4.4.1 Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 1 45

4.4.2 Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 2 45

4.4.3 Kết quả điện di DNA thu được theo quy trình ly trích 3 47

4.5 Kết quả phản ứng RAPD 49

4.5.1 Kết quả khảo sát Primer OPAC10 49

4.5.2 Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đưng cùng một số cây ngập mặn khác 50 4.5.3 Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 53

4.5.4 Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn 53

4.5.5 Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD 56

4.6 Bước đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS 56

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Đề nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetic Acid

GPS : Global Position System

MAB : Man and Biosphere

OD : Optical Density

PCR : Polymerase Chain Reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphism of DNA

RE : Restriction Enzyme

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA : Ribonucleic Acid

Rnase : Ribonuclease

SSCP : Single – strand Conformation Polymorphism

SSR : Simple Sequence Repeat

STS : Sequence – tagged Sites

xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và

phát hiện chỉ thị phân tử 30 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 37 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 37 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 38 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 38 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 39 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 39 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 40 Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4 40

xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5

Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đưng 10

Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid 12

Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn 17

Hình 2.5 Phản ứng PCR 20

Hình 2.6 RFLP trong trường hợp có đột biến điểm 23

Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 25

Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 28

Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đưng được thu thập trên bản đồ Cần Giờ 42

Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1 45

Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2 45

Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3 46

Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3 47

Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3 47

Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD 49

Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1 50

Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2 50

Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8 51

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi 51

Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14 và 7.12 53

Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD 53

Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD 54

Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD 54

Hình 4.16 Cây phân loại 6 cây Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 57

Hình 4.17 Cây phân loại 14 cây Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 59

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong quá trình tồn tại và phát triển, con người không ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên và môi trường Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công nghiệp đã tạo một lượng khí thải vô cùng lớn, gây ô nhiễm không khí góp phần tàn phá

sự sống trên trái đất Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới,

đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vượng và phát triển bền vững [41]

Từ thực tế trên, các khu dự trữ sinh quyển được ra đời, nhằm thực hiện nhiệm vụ trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh quyển - một hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo sự cân bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển và duy trì các giá trị văn hóa truyền thống Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam được UNESCO công nhận [22] Với cảnh quan thiên nhiên tươi đẹp, thành phần các loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn Cần Giờ không những là rừng phòng hộ mà còn là điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mô hình học tập và nghiên cứu lý tưởng [22], [43] Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là nguồn tài nguyên vô giá, có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với đời

sống cộng đồng dân địa phương và các vùng phụ cận Quần thể Đưng (R mucronata)

cùng những quần thể thực vật khác góp phần điều hòa khí hậu [30], chắn gió, chống xói

lở, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nước ven biển, nuôi dưỡng, cung cấp thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế cho ngư dân [21] Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế và môi trường cao hơn, chúng ta cần lập kế hoạch phát triển lâu dài và bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene

và mức độ đa dạng di truyền các quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó có quần thể Đưng, nhằm tìm được những chỉ thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc

nhanh giống Đưng, góp phần đảm bảo công tác trồng và phát triển rừng đạt hiệu quả cao nhất Phương pháp tốt nhất đáp ứng yêu cầu này là sử dụng các marker phân tử

Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM, dưới sự hướng dẫn của Thầy TS Bùi Minh Trí chúng tôi đã tiến hành

thực hiện đề tài: “BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ

MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƯNG (Rhizophora mucronata Lamk.)

TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

1.2 Mục đích

 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA đối với cây Đưng

 Xây dựng quy trình RAPD và bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đưng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

 Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đưng để lai tạo và xây dựng tiền đề cho những nghiên cứu chuyên sâu về sự đa dạng di truyền, nhận diện chỉ thị phân tử

1.3 Yêu cầu

 Thu thập mẫu lá từ những cây Đưng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh, cây mọc tự nhiên hay được trồng

 Ly trích DNA có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD

 Thực hiện kỹ thuật RAPD và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1

1.4 Giới hạn của đề tài

 Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu quần thể Đưng tại một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh

 Thời gian thực hiện ngắn

 Chưa đủ điều kiện để thực hiện nhiều thí nghiệm tối ưu, chưa khảo sát nhiều primer đối với kỹ thuật RAPD nhằm đạt được kết quả chính xác hơn

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,

Tp Hồ Chí Minh

2.1.1 Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển

Sinh quyển là lớp vỏ trái đất có các sinh vật sống trên đó, kể cả đại dương, ao

hồ, sông suối, đất và phần dưới của khí quyển Sinh quyển cùng với khí quyển, địa quyển và thủy quyển tác động qua lại với nhau trong “Hệ thống trái đất” [45]

Sinh quyển là một hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm các hệ sinh thái nhỏ hơn trên

bề mặt trái đất Việc bảo tồn nguyên vẹn tất cả hệ sinh thái là điều không thể, nên người

ta chỉ có thể lựa chọn ra một số đại diện của các hệ sinh thái này để bảo tồn với ý nghĩa

là các khu dự trữ vốn gene, loài và hệ sinh thái cho toàn bộ sinh quyển [45]

Khu dự trữ sinh quyển là những vùng có các hệ sinh thái trên cạn hoặc ven biển được quốc tế công nhận trong phạm vi chương trình Con người và Sinh quyển (Man and Biosphere – MAB) của UNESCO, nhằm thúc đẩy và trình diễn mối quan hệ giữa con người với thiên nhiên Các khu dự trữ sinh quyển là mô hình mẫu của các hệ sinh thái trên trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái đem lại lợi ích cho người dân địa phương mà không gây hại đến môi trường [45]

Mỗi khu dự trữ sinh quyển có 3 chức năng [45]:

 Chức năng bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh thái và cảnh quan

 Chức năng phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững về sinh thái cũng như các giá trị văn hóa truyền thống

 Chức năng hỗ trợ: tạo điều kiện cho các hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo dục và trao đổi thông tin giữa các địa phương, quốc gia, quốc tế về bảo tồn và phát triển bền vững

2.1.2 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

2.1.2.1 Điều kiện tự nhiên

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn đổ ra biển Đông ở cửa Xoài Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái, đồng thời nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 300 km [8], [29], [44]

Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mưa

từ tháng 5 – 11, gió hướng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – 4 năm sau, gió hướng Đông Nam Nhiệt độ trung bình 25,8 0C Lượng mưa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200

mm / năm [27]

Dân số khoảng 63.000 người (2003), sống chủ yếu bằng nghề đánh bắt và nuôi trồng thủy sản Dân cư phân bố không đều trên địa bàn 7 xã, phần đông tập trung ở xã Bình Khánh, Long Hòa, Cần Thạnh và An Thới Đông [17]

Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha (2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp Theo định hướng qui hoạch phát triển của huyện Cần Giờ đến năm 2010, cơ cấu đất đai về cơ bản vẫn giữ vai trò nồng cốt là rừng phòng hộ, rừng sinh quyển trên diện tích khoảng 38.000 ha (1993 - 1999) [29], mở mang thêm diện tích nuôi trồng thủy sản (6.990 ha [23]) với nguyên tắc gắn bó chặt chẽ với các hệ sinh thái rừng ngập mặn

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Ghi chú:

Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp

2.1.2.2 Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần

Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh

a Vùng lõi (4.721 ha)

Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13 Vùng này đặc trưng cho các hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật cùng cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn [28], [45] Các chức năng chính bao gồm:

 Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên

 Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trường sống của động vật hoang

Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22 23 và 24 Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, dựa trên các quần

xã chiếm ưu thế [28], [45], bao gồm:

 Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển

 Tạo không gian lớn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết

 Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái

 Các mô hình lâm ngư kết hợp với môi trường cũng được ứng dụng trong vùng này cho cư dân địa phương

c Vùng chuyển tiếp (29.880 ha)

Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, cả các khu lúa nước và vườn cây ăn trái cùng thảm cỏ dọc theo bờ biển Cần Thạnh, Long Thành,

Lý Nhơn [28], [45] Chức năng chính của vùng này:

 Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cư dân địa phương Việc sử dụng đất và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không được mâu thuẫn với mục tiêu của khu

dự trữ sinh quyển do UNESCO qui định Mối quan hệ giữa con người và thiên nhiên phải được hài hòa

 Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu

mở rộng không gian có sẵn như môi trường sống cho các loài thú hoang dã từ vùng đệm

2.1.2.3 Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính đa dạng sinh học cao

Hệ thực vật, có trên 158 loài thực vật thuộc 76 họ, các loài chủ yếu như Đước, Bần trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu ổi, Trang, Đưng (Đâng hay Đước xanh) và các loài nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – Ô rô, Dừa

lá, Ráng Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia

sp., đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa, vườn cây ăn trái

Thảm thực vật này là môi trường sống cho nhiều loài động vật [29], [40], [44], theo thống kê năm 1999 như sau:

 Khu hệ động vật thủy sinh không xương sống có trên 700 loài thuộc 44 họ, 19

bộ, 6 lớp, 5 ngành Điển hình: Tôm sú (Penaeus monodon), Cua biển (Scylla

serrata)

 Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ, 13 bộ Điển hình: cá Dứa (Pangasius

polyurandon), cá Thòi lòi (Periophthalmus schosseri)

 Khu hệ động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: Tắc kè

(Gekko gekko), Kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn Đất (Python molurus), trăn Gấm (Python reticulatus), rắn Cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn Hổ mang (Naja

naja), rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), Vích (Chelonia mydas), cá Sấu hoa cà

2.1.3 Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay

Sau 29 năm tái tạo (1978 - 2007) và 7 năm là khu dự trữ sinh quyển (2000 - 2007), chất lượng rừng tại rừng ngập mặn Cần Giờ đã có chiều hướng giảm Sâu bệnh phát triển mạnh Đặc biệt khi mật độ cây quá dày, tán cây bao kín như hiện nay thì sự tấn công của sâu bệnh sẽ càng thuận lợi hơn Sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân làm cho cây sinh trưởng chậm và chết hàng loạt Hiện ở rừng Cần Giờ, cây khỏe và cây bệnh đang sống chen nhau [50] Ngoài ra, do bịt kín bờ đê, không cho nước ra vào tự nhiên như trước nên gây ra hiện tượng cả khu vực nước bị tù đọng, sẫm màu, rễ cây ngày càng phát triển nên sự lắng tụ càng nhiều làm cho vùng đất gò cao hơn Bên cạnh đó, việc xây dựng tuyến đường xuyên Bắc – Nam rộng lớn như hiện nay đã phân rừng thành 2 khu rõ rệt tạo sự cách ly địa lý, nên hệ sinh thái cũng có sự khác biệt Một số loài động vật (chuột, ếch, nhái) cũng hạn chế qua lại Tuyến đường này không những làm ô nhiễm không khí, mà còn ngăn cản dòng chảy ở một số nơi, làm hạn chế nước triều ngập vào rừng hoặc gây tình trạng ứ nước, làm cây chết, chủ yếu là đước Rừng ngập mặn Cần Giờ không chỉ là rừng phòng hộ mà còn là khu dự trữ sinh quyển, khu

bảo tồn thiên nhiên Cho nên nhất thiết phải có chủ trương về quản lý và những tác động lâm sinh, cũng như cơ chế chính sách phù hợp cho khu rừng này [39]

2.2 Cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.)

Loài: mucronata Lamk

Tên thông dụng tại một số quốc gia Đông Nam Á [47]

Brunei: Lengayong

Campuchia: Doeum prasak

Indonesia: Bakau bakau hitam

Malaysia: Bakau jangkar

Mianma: Pyoo

Philipine: Bakßuan

Singapore: Belukap

Thái Lan: Phangka

Việt Nam: Đưng, Đâng, Đước xanh

Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đưng [18], [37], [28]

(A) lá, (B) hoa, (C) trái, (D) hệ thống rễ

Đài hoa không rụng cho đến khi thành trái [12] Có 4 đài hoa, nhiều lá đài, lá đài hình ovan, nhọn, có nhiều thịt, dày, màu xanh lá, không có lông tơ Đài hoa dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,7 cm, chiều dài các đài hoa bằng nhau

Cánh hoa màu trắng, có 4 cánh hoặc nhiều hơn, nhọn, cánh hoa đều, mọc thẳng, không theo quy luật, có lông tơ, mép nguyên hơi cong, dày, đầy thịt Các cánh hoa mọc

so le với đài hoa Mặt lưng cánh hoa có lông thưa, uốn cong vào ôm lấy nhị Nhị 8 chiếc, chỉ nhị ngắn, bao phấn 3 khía, bầu trung hoặc bầu dưới hình nón 2 ô, mỗi ô 2

noãn, vòi chẻ đôi [12] Hoa có cuống dài khoảng 0,5 cm, dẹt, màu xanh lá, không có lông tơ

Trái non hình trứng phía dưới phình rộng, màu lục hoặc màu xám, có đài rủ xuống Trụ mầm dài 35 – 70 cm, phía dưới hơi phình to, một hạt Trái Đưng nảy mầm ngay trên cây mẹ, trái chín rơi xuống, trụ mầm cấm vào trong bùn như một cái cọc, tránh cho cây con khỏi bị nước biển cuốn trôi, cây con tự cấm rễ xuống bùn để tiếp tục phát triển [2], [12]

2.2.3 Phân bố

Đưng được tìm thấy ở nhiều nơi, dọc bờ biển Ấn Độ Dương, Tây Thái Bình Dương như Ấn Độ, Campuchia, Trung Quốc (đảo Hải Nam, Đài Loan), Malaysia, Indonesia, Philipin, Nhật Bản, Madagascar, Ustralia, Melanesia Ở Kenya (Đông Phi), Đưng là loài cây đặc trưng cho Rhizophoraceae [2], [47]

Ở Việt Nam Đưng được trồng trên các bãi bồi ven biển, chịu ảnh hưởng thường xuyên của thủy triều giàu mùn hay trên các bãi đang ổn định ở vùng ngập mặn ven biển Cây trưởng thành nhanh, tái sinh hạt tốt, ra hoa vào khoảng tháng 5 – 6, tạo trái vào tháng 10 – 11

2.2.4 Giá trị kinh tế

Gỗ Đưng màu đỏ vàng sẫm, nặng, rắn nên được sử dụng trong xây dựng, làm đồ nội thất, làm củi rất tốt, than đốt tỏa nhiệt lượng cao [26], [32] Vỏ cây giàu tannin, được dùng trong công nghiệp thuộc da, nhuộm lưới đánh cá [46] Bột vỏ cây Đưng còn được dùng làm thuốc trị bệnh thiếu máu, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm họng, bệnh xuất huyết, chứng huyết niệu, urê máu, lá cây còn được dùng làm thuốc cao đắp rất tốt [33] Ngoài ra, Đưng còn giữ chức năng điều hòa khí hậu, chắn gió, chống xói lở đất ven sông, ven biển, mở rộng diện tích bãi bồi ra biển, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nước ven biển, nuôi dưỡng và cung cấp thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao [43] Trong quá trình phân giải lượng protein trong lớp thảm mục nhờ quá trình hoạt động của vi sinh vật, quần thể Đưng đã giúp tạo ra nhiều mùn bã hữu cơ là nền tảng của chuỗi thức ăn đặc trưng của vùng ven biển cửa

http://www.bioteach.ubc.ca/quarterly/

Hình 2.3 Cấu trúc mạch đôi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid.[25]

sông Những thảm mục giàu dinh dƣỡng này là thức ăn quan trọng của ấu trùng, nhiều loài tôm, cá và các loài động vật khác có giá trị kinh tế cao [40], [41], [42]

2.3 DNA (Deoxyribonucleic acid)

Tế bào là đơn vị của sự sống, đƣợc phân ra làm 2 loại: tế bào tiền nhân (Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote) Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên đƣợc hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid) Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau Các nucleotide trong cùng một mạch đơn đƣợc nối với nhau bằng liên kết phosphodieste và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với nhau theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với T bằng 2 liên kết hydro, G liên kết với C bằng 3 liên kết hydro [4], [6]

2.3.1 Quy trình ly trích DNA thực vật

Gồm ba bước [5]

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân giải phóng DNA ra môi trường bằng

phương pháp cơ học (nghiền), đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA Thông thường người ta nghiền tế bào trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K)

Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thủy phân nội bào, người ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (- 196 0C) Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học)

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các

protein theo nguyên tắc các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) sẽ tạo thành các pha không hòa tan (phenol, chloroform / nước) riêng biệt Mẫu được lắc nhẹ trong dung dịch phenol / chloroform / iso amylalcohol (tỷ lệ 25 / 24 / 1) Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid Protein đã bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid nhờ vậy mà khi ly tâm sẽ tạo được một lớp tủa nằm giữa pha nước và pha phenol chloroform Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

 Bước 3: Tủa nucleic acid Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhưng

thông thường người ta dùng isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70 % để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu Việc tủa giúp thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

2.3.2 Các phương pháp định lượng, định tính DNA

2.3.2.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ

Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine Dựa vào sự hấp thụ này người ta có thể định lượng được hàm lượng DNA

có trong mẫu ly trích [11], [14]

Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density) Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tương ứng với:

 50 g / ml DNA sợi đôi

 40 g / ml DNA sợi đơn hay RNA

 20 g / ml oligonucleotide sợi đơn

Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra được nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích

DNA (ng / l) = [(62,9 * OD 260nm ) – (36 * OD 280nm )] * n

Với

 OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260 nm

 OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm

 n: Độ pha loãng (thường n = 100)

Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleoic acid và làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleoic acid Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích người ta tính tỷ lệ OD260nm / OD280nm

 Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích được xem là sạch

 Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều

Tuy nhiên, việc định lượng bằng phương pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lượng của DNA ly trích Để biết chính xác chất lượng DNA ly trích, người

ta sử dụng phương pháp điện di trên gel

2.3.2.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Trong một điện trường, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thước của chúng Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn [11], [14]

Đối với phân tử DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn là gel Gel

là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm Có hai loại gel được sử dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử acid nucleic: gel agarose và gel polyacrylamide

 Gel agrose: Lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300 - 10000 bp Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

 Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thước dưới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide

Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta

sử dụng một số phương pháp phát hiện như sau:

 Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA, phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel

 Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng

vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Ngoài

ra, các phân tử DNA còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết được chất lượng của DNA ly trích như gãy, lẫn tạp, hay cho band sáng rõ

2.4 Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme)

2.4.1 Các loại enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn là những endonuclease, có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định Chính vì đặc tính đó mà chúng được chia làm 3 loại (type) [5]

 Type I: khi một enzyme nhận biết được một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân

tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide

 Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó

 Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide

Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt

có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật biến đổi di truyền

2.4.2 Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn

Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng, các trình tự này thường bao gồm 4 – 8 nucleotide Từ đó, DNA hệ gene sẽ được cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thước khác nhau Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác [5]

Một đặc trưng quan trọng của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau nếu chúng được đọc theo chiều 5’ – 3’ Như vậy vị trí cắt giống nhau trên 2 mạch DNA

2.4.3 Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA

Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lượng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C Hoạt tính của các enzyme được biểu hiện bằng đơn vị (unit) Đó là lượng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA trong 1 giờ ở 37 C Phần lớn các thí

nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số trường hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt được

sự phân cắt không hoàn toàn [5]

Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end) Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc tính được quan tâm

nhất là khả năng cắt tạo đầu dính, được ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in

vitro Hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau được cắt bởi cùng một RE sẽ có khả

năng kết hợp thành một phân tử tái tổ hợp

http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/

Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn [48]

2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.5.1 Khái niệm

Phương pháp PCR được nhà khoa học Mỹ Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học năm 1993)

Đây là phương pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách

đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng DNA mẫu

rất nhỏ PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản, hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận [5], [10]

2.5.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR

PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này Hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên người, động vật, thực vật và kiểm nghiệm thực phẩm [5]

Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt

2.5.3 Quy trình phản ứng PCR

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5] Mỗi chu kỳ gồm 3 bước

 Bước 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các

thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều kiện nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây

 Bước 2 (lai, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ

nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

 Bước 3 (kéo dài, elongation - extension): dưới tác động của DNA polymerase,

các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106

bản sao Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

Andy Vierstraete, 1999

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif

Hình 2.5 Phản ứng PCR [20]

2.6 Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng

Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài

và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường” Đa dạng sinh học được xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền [13]

Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vượng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho

nông nghiệp, dược học, công nghệ Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con người, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lượng cuộc sống của chúng ta Vì vậy, việc duy trì được tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài người bảo vệ môi trường sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con người gián tiếp tạo nên như hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trường đất, môi trường nước bị nhiễm độc phóng xạ Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con người đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trường làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất Trước thực tế như hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững

2.7 Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity)

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene

đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là sự đa dạng di truyền

2.8 Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con người

Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người

2.9 Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử

Từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học với độ tin cậy cao hơn Hiện nay, con người đã tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau [7]:

 Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…

 Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP

2.9.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism)

2.9.1.1 Khái niệm

Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [7], [9]

RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng

và chất lượng rất cao Do đó, người ta có xu hướng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase

Hình 2.6 RFLP trong trường hợp có đột biến điểm

2.9.1.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP

a Nghiên cứu lập bản đồ gene

Mc Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên cây lúa gồm 135 loci [9], [10] Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389

cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica)

Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica) được công bố (Mc Couch 1991, Tanksley và ctv 1991)

Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica)

và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci

Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định được mối tương quan di truyền giữa các giống lúa nói trên

Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP

Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ như

vỏ trấu màu tím, lá không có lông, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với marker RFLP

b Một số ứng dụng khác

 Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu đục thân

 Marker phân tử trong di truyền và chọn giống

 Phân tích tương quan di truyền giữa các cá thể

 Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể

2.9.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism)

2.9.2.1 Khái niệm

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra Sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt bằng RE từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài khoảng từ 60 –

500 bp Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1], [3], [15], [16]

Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản [24]

 Bước 1: Tách chiết DNA AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao

 Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter Bước này gồm có hai giai đoạn:

Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những đoạn DNA vừa được cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau người ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn

Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và gắn adapter được xem như một

http://www.iowalivingroadway.com/ResearchProjects/images/409b.gif

Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP [36]

 Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification)

Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn

có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’

Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter

MseI + 1 nucleotide (thường là C)

Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter

EcoRI + 1 nucleotide (thường là A)

Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc) Việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn bổ sung với adapter

Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %

 Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification)

Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình

tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’ Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt giới hạn

và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ sung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả

Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI

+ 2 hay 3 nucleotide

Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter

EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm

khi điện di)

 Bước 5: Điện di và phân tích kết quả

Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide

2.9.2.2 Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP

a Nghiên cứu đa dạng di truyền

Sử dụng AFLP để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống điều

(Anacardium occidentale L.) đang được trồng ở Đông Nam Bộ (Hồ Bích Liên và ctv.,

2006) đã thu được một số kết quả [7]:

Xác định được 7 / 64 tổ hợp mồi cho sản phẩm khuếch đại có mức đa hình cao

Tổ hợp primer AM – CTG / E – AGC cho tính đa hình cao nhất (139 / 141 sản phẩm