Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv , araliaceae)

Saponin: Hay còn gọi là sapogenin glycosid là dạng glycosid bao gồm phầnsapogenin có cấu trúc steroid hay triterpen gắn với một hay nhiều phân tử đường.Ginsenosid là nhóm saponin triterp

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quảnghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từngđƣợc công bố ở bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC ẢNG iv

DANH MỤC CÁC H NH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX 3

1.2 SÂM VIỆT NAM 15

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHUẨN HÓA SÂM VIỆT NAM 27

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

NGHIÊN CỨU 32

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57

3.1 XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG 57

3.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG 83

3.3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI 87

CHƯƠNG 4 ÀN LUẬN 112

4.1 XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG 112

4.2 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG 116

4.3 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI 118

KẾT LUẬN 135

KIẾN NGHỊ 137

DANH MỤC CÁC C NG TR NH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(2-amidinopropanehydrochloride))

EC50 Effective Concentration 50% Nồng độ kháng oxy hóa 50%

(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) piperazineethanesulfonic)

Từ viết tắt Từ đầy đủ Nghĩa tiếng việt

Q-TOF-MS Quadrupole Time of Flight Máy đo phổ khối tứ cực – thời

Sâm VN-MH Sâm Việt Nam mọc hoang

DANH MỤC CÁC ẢNG

Bảng 1.1 Các loài sâm được chấp nhận thuộc chi Panax 3

Bảng 1.2 Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dược điển 9

Bảng 1.3 Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam 18

Bảng 1.4 Một số tác dụng dược lý khác của Sâm Việt Nam 25

Bảng 2.5 Cách pha dung dịch đường chuẩn 38

Bảng 2.6 Nồng độ các giai mẫu mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-DAD 41

Bảng 3.7 Thông số của detector phổ khối áp dụng định lượng saponin 58

Bảng 3.8 Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu 60

Bảng 3.9 Hàm lượng saponin chiết bằng siêu âm và chiết lắc 61

Bảng 3.10 Saponin chiết với methanol tại 3 nồng độ định lượng bằng HPLC-MS 61 Bảng 3.11 Hàm lượng saponin chiết tại 3 nhiệt độ định lượng bằng HPLC-MS .61 Bảng 3.12 Hàm lượng saponin chiết tại 3 thời gian định lượng bằng HPLC-MS 62

Bảng 3.13 Tính tương thích của hệ thống HPLC-MS định lượng saponin 62

Bảng 3.14 Thời gian lưu của 5 saponin trên HPLC-MS sau 6 lần tiêm mẫu 63

Bảng 3.15 Dữ liệu xác nhận khối lượng ion của một số saponin chuẩn 63

Bảng 3.16 Kết quả phương trình tính tuyến tính 65

Bảng 3.17 Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC-MS 65

Bảng 3.18 Độ lặp lại liên ngày của phương pháp HPLC-MS 66

Bảng 3.19 Kết quả độ đúng trong định lượng G-Rg1 bằng HPLC-MS 67

Bảng 3.20 Kết quả độ đúng trong định lượng M-R2 bằng HPLC-MS 67

Bảng 3.21 Độ đúng của phương pháp định lượng V-R2 bằng HPLC-MS 67

Bảng 3.22 Kết quả độ đúng định lượng G-Rb1 bằng HPLC-MS 68

Bảng 3.23 Kết quả độ đúng của phương pháp định lượng G-Rd bằng HPLC-MS 68 Bảng 3.24 Giới hạn phát hiện và định lượng 5 saponin bằng HPLC-MS 68

Bảng 3.25 Hàm lượng saponin trong Sâm Việt Nam trồng 2 - 6 tuổi 69

Bảng 3.26 Hàm lượng 4 saponin chiết xuất bằng MeOH với hàm lượng khác nhau 72 Bảng 3.27 Hàm lượng 4 saponin chiết tại mức nhiệt độ khác nhau 72

Bảng 3.28 Hàm lượng saponin theo thời gian chiết xuất 73

Bảng 3.29 Hàm lượng 4 saponin từ số lần chiết xuất khác nhau 73

Bảng 3.30 Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rg1 trong mẫu chuẩn 73

Bảng 3.31 Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic M-R2 trong mẫu chuẩn 74

Bảng 3.32 Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rb1 trong mẫu chuẩn 74

Bảng 3.33 Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rd trong mẫu chuẩn 74

Bảng 3.34 Diện tích pic tương ứng với các nồng độ của mẫu đối chiếu 78

Bảng 3.35 Phương trình hồi quy của chất chuẩn G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2 79

Bảng 3.36 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng HPLC-DAD 79

Bảng 3.37 Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC-DAD 80

Bảng 3.38 Kết quả độ lặp liên ngày của phương pháp HPLC-DAD 81

Bảng 3.39 Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rg1 .81

Bảng 3.40 Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng M-R2 82

Bảng 3.41 Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rb1 .82

Bảng 3.42 Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rd 82

Bảng 3.43 Kết quả hàm lượng một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng 87

Bảng 3.44 Khối lượng cao toàn phần và saponin toàn phần 88

Bảng 3.45 Độ đúng của quy trình định lượng saponin trong cao Sâm VN 88

Bảng 3.46 Hàm lượng 5 saponin trong cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 89

Bảng 3.47 Thời gian bơi tuyệt đối các nhóm chuột thử nghiệm Brekhman 89

Bảng 3.48 Thời gian bơi tương đối các nhóm chuột trên thực nghiệm Brekhman 90 Bảng 3.49 Thời gian bơi tuyệt đối của thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng 91

Bảng 3.50 Thời gian bơi tương đối trên thực nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng 91

Bảng 3.51 Hoạt tính kháng oxy hóa trên tế bào Hep G2 93

Bảng 3.52 Hoạt độ AST, ALT trong huyết tương trên thực nghiệm CCl4 94

Bảng 3.53 Hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CCl4 96

Bảng 3.54 Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CY 97

Bảng 3.55 Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của các lô chuột trong thử nghiệm 98

Bảng 3.56 Hoạt độ AST, ALT trong huyết tương trên thực nghiệm ethanol 99

B ảng 3.57. Kết quả hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột vào tuần 8 100

Bảng 3.58 Tiềm thời và thời gian ngủ của các lô chuột sau các tuần thí nghiệm 101

Bảng 3.59 Tác dụng cao Sâm Việt Nam trên tiềm thời và thời gian ngủ 102

Bảng 3.60 Thời gian ra sáng và số lần ra sáng của các lô chuột liều duy nhất 104

Bảng 3.61 Thời gian ở sáng và số lần ra sáng điều trị sau 7 ngày 105

Bảng 3.62 Thời gian bất động của các lô chuột thí nghiệm liều duy nhất 106

Bảng 3.63 Thời gian bất động các lô chuột điều trị liều sau 7 và 14 ngày 107

Bảng 3.64 Thời gian ra ngăn sáng và số lần ra ngăn sáng trên thực nghiệm sáng tối 108 Bảng 3.65 Thời gian bất động của chuột trên thực nghiệm FST và TST 109

Bảng 3.66 Hàm lƣợng MDA, GSH tế bào não chuột trầm cảm do cô lập 110

Bảng 4.67 So sánh tác dụng dƣợc lý Sâm VN với Nhân Sâm và Sâm VN-MH .132

DANH MỤC CÁC H NH

Hình 1.1 Khung cơ bản của các saponin thuộc chi Panax 5

Hình 1.2 Bộ phận trên mặt đất (A) và bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam (B) 16 Hình 3.3 SKĐ thăm dò chương trình pha động điều kiện 1 57

Hình 3.4 SKĐ tổng ion (TIC) từ 5 saponin đối chiếu của HPLC-MS 59

Hình 3.5 SKĐ extract ion (EIC) của từng saponin đối chiếu trên HPLC-MS 59

Hình 3.6 Phổ MS của 5 saponin đối chiếu 60

Hình 3.7 Phổ MS của 5 saponin đối chiếu sau khi lần lượt cắt phân tử đường 64

Hình 3.8 SKĐ của mẫu thử tại điều kiện 3 72

Hình 3.9 SKĐ độ tinh khiết của 4 saponin trong hỗn hợp mẫu đối chiếu 76

Hình 3.10 SKĐ độ tinh khiết pic của 4 saponin định lượng trong mẫu thử 77

Hình 3.11 SKĐ mẫu trắng 77

Hình 3.12 SKĐ mẫu đối chiếu của 4 saponin 78

Hình 3.13 SKĐ của 4 saponin định lượng trong mẫu thử 78

Hình 3.14 SKĐ của mẫu thử thêm 4 saponin của mẫu đối chiếu 78

Hình 3.15 Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 83

Hình 3.16. Vi phẫu thân rễ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 84

Hình 3.17 Vi phẫu rễ củ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 85

Hình 3.18 Đặc điểm bột thân rễ và rễ củ của Sâm Việt Nam 86

Hình 3.19 Sắc ký lớp mỏng mẫu Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 86

Hình 3.20 SKĐ cao toàn phần Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi 88

MỞ ĐẦU

Sâm Việt Nam (còn gọi là Sâm Ngọc linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) đượctìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973 Đến năm 1985, được

xác định tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm

(Araliaceae) [3] Hiện nay, Sâm Việt Nam cũng được lựa chọn là cây thuốc hàngđầu trong danh mục sản phẩm quốc gia Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng

đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước vàcác sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030.Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”.Trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách Bêncạnh đó, theo Quyết định số 787/QĐ/TTg ngày 05/6/2017 của Thủ tướng chínhphủ, Sâm Việt Nam là sản phẩm thuộc chương trình phát triển sản phẩm quốc giađến năm 2020

Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trịcao như Nhân Sâm Hiện nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữunhư Kon Tum và Quảng Nam Trên thị trường, Sâm Việt Nam thường bị giả mạobởi những dược liệu khác, nhiều trường hợp không những không có tác dụng điềutrị mà còn có thể gây độc hại cho người dùng Vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giáchất lượng Sâm Việt Nam là cần thiết Bên cạnh đó, sự phát hiện một thứ của cây

Sâm Việt Nam là Panax vietnamensis var Fuscidiscus có hình thái giống Sâm Việt

Nam, mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung Quốc và Lai Châu của Việt Nam Câysâm này đã được đánh giá bước đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) cho thấy trong thành phần saponin có nhóm ocotillol như Sâm Việt Nam[33] Saponin nhóm ocotillol chỉ phát hiện trong Sâm Việt Nam mà không có trongNhân sâm gồm một số hợp chất tiêu biểu như majonosid-R2, vinaginsenosid-R1,vinaginsenosid-R2, Tuy nhiên, vài nghiên cứu trước đã công bố phương pháp địnhlượng một số saponin thuộc nhóm này bằng phương pháp HPLC với detector dãy diod quang (DAD) hay detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) [75] nhưng vẫn

chưa xác định chính xác hàm lượng riêng biệt từng chất như vinaginsenosid-R2.

Do đó, việc nghiên cứu phương pháp định lượng các saponin thuộc nhóm ocotillolgóp phần tiêu chuẩn hóa và xây dựng thương hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam làvấn đề cấp thiết

Về mặt tác dụng dược lý, các kết quả nghiên cứu trước đây được tiến hànhtrên mẫu Sâm Việt Nam mọc hoang với nhiều tác dụng như: tăng lực, chống stress,bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ [3], [51], [53] Tuy nhiên, hiện nay nguồn sâm sử dụngtrên thị trường chủ yếu là từ nguồn sâm trồng Cho đến nay, chưa có nghiên cứumột cách hệ thống về tác dụng dược lý của Sâm Việt Nam trồng, nếu sử dụng cáckết quả nghiên cứu trước đây của sâm mọc hoang cho sâm trồng thì sẽ không thuyếtphục Vì các lý do cần thiết trên, tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tiêu chuẩnhóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam” Đề tài được thựchiện với các mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chínhtrong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối(HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC–DAD)

2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng

3 Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 năm tuổi:

- Tác dụng tăng lực của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng bảo vệ gan của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng chống stress tâm lý của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi

- Tác dụng chống stress tâm lý của một số saponin thuộc nhóm ocotillol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX

1.1.1 Phân loại thực vật chi Panax

Hiện nay, một số nhà thực vật học đã nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi

Panax Tuy nhiên, theo thời gian sự phân loại này có nhiều thay đổi Theo The

Plant list (Bảng 1.1), có 13 loài thuộc chi Panax được chấp nhận [146] Tại Việt

Nam có 4 loài thuộc chi Panax (P.) được công bố là Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus Seem.), Tam thất (P.notoginseng (Burkill) F.H.Chen), Tam thất hoang (P.

stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) và Sâm Việt Nam (P vietnamensis Ha et

Grushv.) [15]

ảng 1.1 Các loài sâm được chấp nhận thuộc chi Panax

Bắc Việt Nam

2 P bipinnatifidus var angustifolius (Burk

ill) J.Wen

3 P ginseng C A Meyer Nhân sâm Đông Bắc Á

4 P japonicus C A Meyer Sâm Nhật Nhật Bản và Nam

9 P stipuleanatus H T Tsai et K M Feng Tam thất hoang Bắc Việt Nam

10 P trifolius L. Sâm lùn Bắc Mỹ

11 P vietnamensis Ha et Grushv. Sâm Việt Nam Núi Ngọc Linh,

Việt Nam

12 P wangianus S.C.Sun.

13 P zingiberenusis C.Y Wu et K M Feng Sâm gừng Nam Trung Quốc

1.1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Panax

1.1.2.1 Thành phần hóa học

Trong các loài thuộc chi Panax, thành phần hoá học chủ yếu là saponin,polysaccharid, polyacetylen, acid béo, acid amin, nguyên tố đa và vi lượng [139]

Saponin: Hay còn gọi là sapogenin glycosid là dạng glycosid bao gồm phầnsapogenin có cấu trúc steroid hay triterpen gắn với một hay nhiều phân tử đường.

Ginsenosid là nhóm saponin triterpen của các loài thuộc chi Panax được nghiên cứu

rất nhiều hóa học cũng như tác dụng dược lý, kết quả cho thấy ginsenosid là thànhphần hoạt tính của sâm Saponin của sâm thường được sử dụng làm chất đánh dấu

để đánh giá chất lượng các loài sâm và các sản phẩm liên quan [32]

Polysaccharid: Nhóm hợp chất tan trong nước là những polysaccharid acid, có hoạttính chống phân bào và tăng cường miễn dịch Những nghiên cứu gần đây cho thấypolysaccharid acid như ginsan có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch [32]

Polyacetylen: Nhóm hợp chất hữu cơ với nối đôi và nối ba liên hợp Haipolyacetylen chính trong Nhân sâm là panaxynol và falcarintrol (panaxytriol).Ngoài ra, acetyl panaxydol and panaxydolchlorohydrin được phân lập từ Nhân sâm.Flavonoid và tinh dầu: Bên cạnh nhóm hợp chất liệt kê trên, một vài flavonoid và

tinh dầu đã được phân lập và định danh từ các loài thuộc chi Panax.

Thành phần saponin của các loài thuộc chi Panax

Các saponin trong chi Panax được phân loại cơ bản theo cấu trúc khung genin

(dammaran, olean) và theo mạch nhánh C-17 khác nhau Bên cạnh đó còn có mộtvài saponin không thuộc cấu trúc này được liệt kê vào mục saponin cấu trúc khác.Khung dammaran: Saponin nhóm này được phân chia thành 3 nhóm (Hình 1.1)gồm có nhóm Protopanaxadiol (PPD): Ginsenosid-Ra1, -Ra2, -Ra3, -Rb1, -Rb2, -Rb3, notoginsenosid-Rs1, -Rs2, quinquenosid-R1, malonyl-ginsenosid- Rb1, -Rb2,-Rc và -Rd Đây là nhóm ginsenosid có nhiều thành phần nhất trong các cấu trúc

dammaran của chi Panax Protopanaxatriol (PPT): Gồm các ginsenosid chính là

G-Re, -Rf, -Rg1 và N-R1, N-R2 Sự khác biệt chính của PPT và PPD là sự hiện diệncủa nhóm hydroxyl hay đường gắn vào vị trí C-6 của PPT Ocotillol (OCT): Nhómnày có vòng epoxy gắn vào vị trí C-20 Majonosid-R2 trong Sâm Việt Nam là đạidiện cho nhóm này Saponin cấu trúc acid oleanolic (OA): Saponin nhóm này cóphần aglycon có cấu trúc bao gồm các chikuset-susaponin và đại diện là G-Ro làtriterpen 5 vòng [32], [139] Saponin có mạch nhánh C-17 khác nhau chiếm hơn

50% các saponin phân lập từ các loài Panax Ngoài ra, còn có các saponin có khung

không phổ biến khác

Protopanaxadiol (PPD) Protopanaxatriol (PPT)

Hình 1.1 Khung cơ bản của các saponin thuộc chi Panax

Từ năm 1963 - 2014, có 289 saponin đã được phân lập từ các loài thuộc chi Panax Saponin có khung PPD và PPT phổ biến trong các loài Panax, trong khi nhóm

ocotillol ít hơn và còn lại rất ít là saponin có cấu trúc acid oleanolic [139], [140]

1.1.2.2 Phương pháp xác định saponin trong loài thuộc chi Panax

Saponin trong chi Panax được chứng minh là thành phần chính thể hiện tác dụng dược

lý Do đó, saponin được xem là chỉ số đánh giá chất lượng của sâm và sản phẩm đượcbào chế từ sâm Hiện nay, nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và phát

triển định lượng saponin trong chi Panax Saponin được định lượng bằng phương

pháp HPLC kết hợp với detector là UV [56] hay detector tán xạ bay hơi (ELSD) [66]

Saponin trong chi Panax có cấu trúc đa dạng, do có cấu trúc khá tương đồng chỉ khác

nhau cấu tạo phần đường, sắc ký lỏng kết hợp với detector phổ khối (LC-MS) làphương pháp hiện đại và hiệu quả để phân tích saponin [130]

1.1.2.3 Sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ginsenosid

Ginsenosid đã được xem là thành phần chính thể hiện tác dụng dược lý của chi

Panax, tác dụng chống oxy hóa của ginsenosid trên in vivo đã được công bố Tại

sao khả năng chống oxy hóa của các ginsenosid lại khác nhau, một số công bốnghiên cứu đánh giá về sự liên quan giữa cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa củaginsenosid Liu và cộng sự (CS.) đã nghiên cứu mối liên quan cấu trúc và tác dụngcủa 11 ginsenosid thuộc 2 nhóm PPD, PPT và sapogenin của chúng dựa trên AAPH(2,2‟- azobis (2-amidinopropane hydrochlorid)) – là yếu tố gây tán huyết hồng cầucủa người; AAPH cung cấp gốc tự do peroxyl (ROO•) với một tỷ lệ ổn định tạinhiệt độ 37 °C [86]

Tác dụng của sapogenin trên sự tán huyết hồng cầu của người gây bởi AAPH

Sapogenin (khung dammaran triterpen) sau khi loại bỏ các gốc đường, còn lại khung PPD và PPT Khi gia tăng nồng độ sapogenin nhóm PPD hay PPT đều làm tăng tỷ lệ tán huyết gây bởi AAPH, thậm chí khi không có AAPH thì sapogenin PPD cũng gây tán huyết trên hồng cầu Các sapogenin thể hiện tác dụng như chất tiền oxy hóa [86]

Tác dụng của các ginsenosid trên sự tán huyết hồng cầu của người gây bởi AAPH

Nhóm PPD có chuỗi đường gắn vào vị trí số 3 trên khung dammaran triterpen gồm

có ginsenosid Rg3, G-Rd, G-Rc, G-Rh2, G-Rb1 và G-Rb3 Nhóm PPT có chuỗi đường gắn vào vị trí số 3 trên khung dammaran triterpen gồm G-Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re và G-R1 Khi có sự gia tăng nồng độ của ginsenosid-Rg3 hay G-Rh2 thì

sự tán huyết cũng gia tăng; G-Rg2 ở nồng độ cao có thể ngăn chặn sự tán huyết Do

đó Rg3, Rh2 và Rg2 có tác dụng như là chất tiền oxy hóa Các Rb1,

G-Rc, G-R1, G-Rd, G-Re, G-Rb3, G-Rg1 và G-Rh1 có tác dụng giảm tỷ lệ tán huyết gây bởi AAPH Các ginsenosid này có tác dụng như chất chống oxy hóa [86]

So sánh cấu trúc của ginsenosid nhóm tiền oxy hóa và nhóm chống oxy hóa, chothấy khi không có mặt gốc đường gắn vào vị trí 20 trên khung dammaran triterpennhư G-Rh2, G-Rg3 và G-Rg2 là chất tiền oxy hóa Ginsenosid-Rh1 có 1 glucosegắn vào vị trí số 6 trên khung dammaran triterpen thể hiện tác dụng chống oxy hóa

Do đó, ginsenosid có gốc đường ở vị trí 20 hay glucose tại vị trí 6 trên khung genin

thể hiện tác dụng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự

G-Rc > G-Rb1, G-Re > G-Rd > G-R1 > G-Rg1 > G-Rb3 > G-Rh1 Các gốc đườnggắn vào vị trí khác nhau, thể hiện mức độ tán huyết gây bởi AAPH khác nhau, chothấy có sự tương tác phức tạp giữa các gốc đường và các sapogenin Để làm rõ hơn

về mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của ginsenosid, Liu và CS đã nghiêncứu tác dụng bảo vệ hồng cầu của ginsenosid toàn phần, 12 ginsenosid riêng biệtgồm có G-Rb1, G-Rb3, G-Rc, G-Rd, G-Re, G-Rg1, G-Rg2, G-Rg3, G-Rh1, G-Rh2,G-R1, pseudoginsenosid-F11 và sapogenin protopanaxadiol, protopanaxatriol trênhồng cầu người chống lại sự tán huyết gây ra bởi hemin [79]

Tác dụng bảo vệ hồng cầu chống lại sự tán huyết của sapogenin nhóm PPT tương tựnhư các ginsenosid trong nhóm; cho thấy vị trí gốc đường gắn vào vị trí số 6 hoặc 20trên khung genin không tác dụng đến tác dụng này Nhóm hydroxyl ở vị trí số 3 có vaitrò thể hiện tác dụng bảo vệ hồng cầu Đối với G-Re có chuỗi đường glucose

- rhamnose có tác dụng cao hơn G-R1 có chuỗi đường glucose - glucose, cho thấyvai trò của đường rhamnose thể hiện tác dụng chống lại sự tán huyết [79], [87].Sapogenin nhóm PPD thúc đẩy sự tán huyết do không có nhóm hydroxyl ở vị trí số

6 trên khung như nhóm PPT, cho thấy nhóm hydroxyl có vai trò bảo vệ hồng cầu.G-Rc và G-Rd thể hiện tác dụng bảo vệ hồng cầu chống lại tán huyết hiệu quả, cấutrúc G-Rc giống với G-Rd ngoại trừ G-Rc có đường xylose gắn với đường glucosetại vị trí 20 Ginsenosid-Rb1 khác với G-Rb3 trên kết nối của hai chuỗi glucose ở vịtrí số 20 trên khung và vị trí số 3 trên phân tử đường glucose trên G-Rb1, sự khácbiệt này giúp G-Rb1 thể hiện tác dụng trội hơn Liu và CS đã cung cấp thông tinchính nhóm hydroxyl hoặc các gốc đường gắn ở vị trí số 6 quan trọng đối với hiệuquả bảo vệ hồng cầu của ginsenosid trên tán huyết gây ra bởi hemin [79]

Tuy nhiên, nghiên cứu khác của Chae và CS đã công bố kết quả về khả năng chốngoxy hóa của các ginsenosid và sự liên quan quan giữa cấu trúc và tác dụng [28] Tácgiả cho rằng số gốc đường không tác dụng đến khả năng chống oxy hóa củaginsenosid như G-Rh1 và G-Rh2 có 1 phân tử đường trong khi đó G-Rf, G-Rg2, G-Rg3 có hai gốc đường nhưng khả năng ức chế gốc tự do không có khác biệt Bêncạnh đó, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng chống oxy hóa giữa

ginsenosid hai nhóm PPT và PPD: Ví dụ như ginsenoside-Rh1 và G-Rh2 sở hữu cógốc đường glucose tại C-6 và C-3 tương ứng, khác nhau vị trí gốc đường nhưngtác dụng chống oxy hóa của chúng không có khác biệt.

1.1.3 Kiểm nghiệm sâm thuộc chi Panax theo chuyên luận Dược điển

Saponin là thành phần chính trong các loài sâm thuộc chi Panax và có tác dụng sinh

học Vì vậy, các chuyên luận Dược điển của một số nước xây dựng chỉ tiêu địnhtính, định lượng dựa vào thành phần saponin chính như G-Rg1, G-Rb1 Các chỉtiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo một số Dược điển như: Châu âu (EP 80), Mỹ(USP 38, NF33), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc (CP 2015), Hàn Quốc (KP X) vàDược điển Việt Nam V được trình bày trong Bảng 1.2

ảng 1.2 Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dược điển

Đối tượng Dược Chỉ tiêu thông thường Định Định Hàm lượng

do làm khô, tro toàn phần,tro không tan trong HClUSP Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử SKLM HPLC G-Rg1 ≥ 0,20%

NF35 do làm khô

JP 17 Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử Phản HPLC G-Rg 1 ≥ 0,10%

tinh khiết, mất khối lượng ứng G-Rb1 ≥ 0,20%

do làm khô, tro toàn phần hóa học

SKLMCP2015 Mô tả, vi phẫu, soi bột, dư SKLM HPLC G-Rg1 + G-Re ≥

toàn phần

KP X Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử Phản HPLC G-Rg 1 ≥ 0,10%

tinh khiết, mất khối lượng ứng G-Rb1 ≥ 0,20%

do làm khô, tro toàn phần hóa học

SKLMDĐVN Mô tả, vi phẫu, soi bột, Phản HPLC G-Rg1 + G-Re ≥

khô, tro toàn phần, tro hóa học G-Rb1 ≥ 0,20%không tan trong HCl SKLM

khối lượng do làm khô, tro được khô kiệttoàn phần, tro không tan HPLC G-Rg1+ G-Rb1 +

DĐVN Mô tả, vi phẫu, soi bột, Phản Chất Không ít hơn

V mất khối lượng do làm ứng chiết 16% dược liệu

khô, tro toàn phần hóa học được khô kiệt

G-Rg1 + G-Rb1+ NR1 ≥ 5%

toàn phần, tỷ lệ vụn nát, G-Rg1≥ 1,5%

1.1.4 Sơ lược về loài sâm trồng thuộc chi Panax

1.1.4.1 Nhân sâm

Phân bố: Nhân sâm (Panax ginseng C A Meyer) mọc hoang trong rừng ở khu vực

khí hậu mát từ Hàn Quốc và phía bắc miền đông Trung Quốc cho đến phía đôngSiberia Hiện nay, Nhân sâm mọc hoang khan hiếm và rất đắt tiền nên Nhân sâmđược trồng thành công tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật Bản [105] Sản phẩmNhân sâm thương mại trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc trồng trọt từ các vùngtrên Sản phẩm từ Nhân sâm trồng (NS) đã được nghiên cứu và tiêu chuẩn hóa,thành một số sản phẩm thương mại trên thị trường như Ginseng 115

Phân loại Nhân sâm theo điều kiện trồng: Có 3 hình thức để canh tác Nhân sâm là:

Vườn sâm (Nhân sâm trồng), rừng sâm (Nhân sâm trồng trong rừng), cấy ghépNhân sâm mọc hoang Vườn sâm được trồng trong điều kiện nhân tạo với thời giantrồng và thu hoạch từ 4 -7 năm, rừng sâm dùng hạt giống của vườn sâm gieo vàomôi trường tự nhiên, không có bất kỳ tác động nhân tạo và có thời gian sinh trưởngtrên 10 năm Nhân sâm nuôi cấy mô: Cấy ghép cây giống Nhân sâm mọc hoang vàomôi trường nhân tạo hoặc bán nhân tạo

Hình thái thực vật: Bộ phận trên mặt đất của NS mọc hoang và NS chưa có công bố

có sự khác biệt Tuy nhiên, Choi và CS đã công bố kết quả nghiên cứu về một sốkhác biệt giữa NS trồng trên núi (địa lý của khu vực trồng giống với NS mọc hoang)

so với NS trồng trong vườn sâm [31] Nhân sâm núi có rễ kéo dài nhưng NS thì rễmọc thẳng, dày, ngắn hơn NS núi Về chiều dài, đường kính và trọng lượng của NSnúi thì nhỏ hơn NS trong vườn Trọng lượng NS núi 15 năm tuổi nhỏ hơn NS vườn

3 năm tuổi [31] Phân biệt Nhân sâm trồng và mọc hoang: Mặc dù có tên khoa họcgiống nhau nhưng giá trị của 3 loại Nhân sâm trồng trong vườn sâm, trồng trên núi

và mọc hoang có giá trị khác nhau đáng kể trên thị trường Để phân biệt 3 loại NStrên, Liu và CS đã dùng phương pháp quang phổ hồng ngoại để xác định một cáchkhá nhanh chóng 3 loại này Kết quả chỉ ra rằng hàm lượng tinh bột trong NS vườnnhiều hơn trong NS núi và NS hoang dại; hàm lượng canxi oxalat và chất béo trong

NS hoang dại nhiều hơn 2 loại NS còn lại và hàm lượng acid béo trong NS trồngtrên núi cao hơn hai loại NS trong vườn và mọc hoang [82]

So sánh thành phần ginsenosid trong Nhân sâm trồng và Nhân sâm mọc hoang:

Mizuno đã công bố ginsenosid tổng trong NS hoang dại thấp hơn NS trồng nhưngginsenosid-Re trong NS hoang dại cao hơn NS trồng Tuy nhiên nghiên cứu chưacông bố rõ về độ tuổi của hai loại NS này [94] Một nghiên cứu khác với phươngpháp định lượng bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng đã phát hiện có sự khác nhau vềthành phần ginsenosid của 12 mẫu NS trồng từ 4 - 5 tuổi và 4 mẫu NS mọc hoang từ

15 - 30 năm tuổi Có 4 ginsenosid phát hiện có trong NS trồng: acetyl-panajaponol

A, đồng phân G-Ra1, đồng phân quinquenosid-R1 và đồng phân G-Ra6 mà không

có trong NS rừng Ngược lại, có 12 ginsenosid phát hiện trong NS mọc hoang gồmcác đồng phân của acetyl G-Re, acetyl G-Rg1, acetyl G-Re, acetyl G-Re, 3 đồngphân G-Ro, G-F3/G-F5, malonyl koryoginsenosid-R2, acetyl panajaponol A, acetylG-Rg2, và một pic chưa xác định công thức; các ginsenosid này chưa phát hiệntrong NS trồng Sự khác nhau về thành phần ginsenosid do số năm tuổi khác nhau,khu vực trồng khác nhau, kỹ thuật canh tác khác nhau [130]

Yếu tố ảnh hưởng đến xu hướng biến động ginsenosid trong Nhân sâm:

Vùng trồng khác nhau: Có nghiên cứu báo cáo về hàm lượng ginsenosid trong NSkhác nhau theo từng vùng trồng Nhân sâm cùng tuổi nhưng trồng ở Hàn Quốc cóhàm lượng ginsenosid khác với NS ở Nhật Bản Mặc dù quá trình phát triển vềtrọng lượng rễ củ tương đồng nhau, năm thứ 4 và thứ 5 phát triển mạnh nhất, trọnglượng của rễ củ tăng gấp đôi [116] Về thành phần ginsenosid trong NS trồng tạiNhật Bản và Hàn Quốc từ 1- 6 tuổi Trong năm đầu tiên NS trồng tại Nhật có hàmlượng ginsenosid tổng cao hơn so với Hàn Quốc Nhưng ngược lại đến năm thứ 6thì NS Hàn Quốc có 3,11% hàm lượng tổng ginsenosid, còn NS trồng tại Nhật Bảnchỉ có 1,9% [116] Nhân sâm từ năm 4 - 5 năm tuổi hàm lượng ginsensid tăng từ

275 – 373 mg ở Nhật Bản, trong khi đó NS Hàn Quốc từ 148 mg lên 770 mg Chothấy điều kiện thổ nhưỡng các vùng khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng tích lũyginsenosid trong NS [116]

Ngoài ra, Wei Shi và CS công bố thành phần ginsenosid trong từng phần dưới mặtđất của NS và hàm lượng ginsenosid tổng tích lũy theo từng năm của NS trồng tạiCát Lâm - Trung Quốc [111] Trong rễ chính Nhân sâm, hàm lượng G-Rg1, G-Re,

G-Rb1, G-Rc, G-Rb2, G-Rb3 và G-Rd trong rễ chính tăng theo độ tuổi, tỷ lệ giatăng các ginsenosid khác nhau Năm thứ nhất hàm lượng G-Re cao hơn cácginsenosid khác và gia tăng theo độ tuổi Ginsenosid-Rc, G-Rb2 và G-Rb3 tăngtheo độ tuổi; G-Rg1, G-Rb1 và G-Rd tăng từ năm thứ 1 đến năm 4 sau đó giảm nhẹ.Hàm lượng ginsenosid thay đổi theo độ tuổi trong rễ tóc NS: G-Re chiếm hàmlượng cao nhất và hàm lượng các ginsenosid chủ yếu thì tăng theo năm tuổi, giaiđọan tăng mạnh từ năm thứ 3 đến năm thứ 5 Hàm lượng ginsenosid khác nhautrong các bộ phận khác nhau của NS trồng 5 tuổi đã được công bố Hàm lượng tổngginsenosid trong rễ con > lá > thân rễ > rễ chính > thân [111].

Thành phần acid amin trong Nhân sâm trồng và mọc hoang: Acid amin có vai trò quan

trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của các sinh vật Một vài nghiên cứu gần đâycho thấy rằng các acid amin của Nhân sâm có tác dụng chống trầm cảm, giảm huyết áp,tăng cường khả năng miễn dịch, bảo vệ gan Đã có công bố sự khác nhau về hàmlượng acid amin trong NS trồng với NS mọc hoang [118] Nhân sâm mọc hoang có sựtích lũy acid amin cao hơn Nhân sâm trồng Trong số 18 acid amin thì có 13 acid aminkhác nhau có ý nghĩa thống kê: Có 6 loại methionin, serin, glycin, threonin, alanin,lysin có hàm lượng cao trong Nhân sâm mọc hoang Ngược lại, arginin và glutamat cóhàm lượng cao trong NS trồng so với NS mọc hoang

[118] Hàm lượng acid amin trong NS mọc hoang nhiều hơn NS trồng Do đó,chính sự khác nhau về thành phần ginsenosid, acid amin góp phần tạo nên sự khácnhau về giá trị cũng như tác dụng sinh học giữa NS mọc hoang và NS trồng [118].Ngoài ra, Kim và CS công bố có sự biến đổi hàm lượng saponin và carbohydrattrong NS trồng theo mùa; hàm lượng saponin cao vào mùa hè, hàm lượngcarbohydrate chủ yếu là do sự gia tăng sucrose cao vào mùa đông [65]

So sánh một số tác dụng sinh học Nhân sâm trồng và mọc hoang

Trên thế giới trồng thành công 3 loại Sâm là Nhân Sâm, sâm Mỹ và sâm Tam thất,trên thị trường giá Nhân sâm mọc hoang đắt hơn NS trồng Mizuno đã đánh giá so

sánh thành phần ginsenosid và tác dụng kích thích miễn dịch trên in vivo giữa NS

trồng và Nhân sâm mọc hoang [94] Bằng phương pháp HPLC đã định lượng một

số ginsenosid chủ yếu trong NS mọc hoang và NS trồng Kết quả trong NS mọc

hoang có hàm lượng G-Rg1, G-Re, G-Rd nhiều hơn trong NS trồng Trong khi đó,hàm lượng G-Rc, G-Rb2, G-Rb1 ít hơn trong NS trồng Saponin toàn phần trong

NS mọc hoang chiếm 30,17 mg/g và hàm lượng G-Re nhiều nhất chiếm 45%; đốivới NS trồng chiếm 32,26 mg/g và hàm lượng G-Re chiếm 37% Kết quả NS mọc

hoang có tác dụng tác dụng kích thích miễn dịch trên in vivo còn NS trồng không

thể hiện tác dụng này trong điều kiện cùng liều và cùng điều kiện thí nghiệm [94].Pan và CS đã công bố so sánh tác dụng chống oxy hóa giữa NS tự nhiên (trồngdưới tán rừng mô phỏng như NS mọc hoang) và NS trồng Cao chiết methanol từ

NS tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả hơn cao chiết methanol từ NStrồng [104]

Young và CS đã công bố so sánh khả năng chống oxy hóa của cao chiết liều 1,5 và3,75 mg thì khả năng chống oxy hóa và bắt gốc tự do của NS trồng trong điều kiện

tự nhiên > NS mọc hoang > NS trồng trong vườn sâm Khả năng dập tắt gốc tự dogây bởi DPPH của NS trồng tự nhiên và NS mọc hoang không có sự khác biệt.Tácdụng ức chế sự peroxy hóa lipid trong ty thể của NS mọc hoang > NS trồng tựnhiên> NS trồng trong vườn sâm Khả năng ức chế ROS phụ thuộc nồng độ vàgiảm theo thứ tự Nhân sâm hoang dại > Nhân sâm trồng tự nhiên > Nhân sâm trồngvườn sâm [58] Như vậy, qua một số kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy tác

dụng kích thích miễn dịch cũng như tác dụng chống oxy hóa trên in vitro và in vivo

của NS trồng và NS mọc hoang thể hiện tác dụng khác nhau

1.1.4.2 Sâm Mỹ

Sâm Mỹ (Panax quinquefolius L.) được xem như là vị thuốc từ thảo mộc được sử

dụng rộng rãi trên thế giới Đã có nghiên cứu công bố tác dụng chống oxy hóa, hạ

đường huyết, cải thiện trí nhớ trên in vivo của sâm Mỹ [70], [115] Ban đầu sâm Mỹđược thu hoạch từ nguồn mọc hoang ở phía đông và trung tâm Bắc Mỹ để xuấtkhẩu chủ yếu sang Trung Quốc Đến thế kỷ thứ 18 đã được trồng tại Bắc Mỹ, cónhiều ở Minnesota, Wisconsin, Michigan, Ohio Trên thị trường giá của Sâm mỹmọc hoang cao hơn hiều so với sâm Mỹ trồng Năm 2002, rễ sâm Mỹ trồng xuấtkhẩu giá 12-42 USD/kg trong khi đó sâm Mỹ hoang dại giá từ 400 - 1250 USD/kg[34], [127]

Hình thái thực vật: Phần trên mặt của sâm Mỹ trồng so với mọc hoang chưa có

công bố có sự khác biệt Nhưng bộ phận dưới mặt đất có sự khác nhau Rễ sâm Mỹmọc hoang và bán hoang dại (được trồng trong môi trường tự nhiên) có nốt sần trên

rễ con hoặc cổ rễ hình vòng tròn tuy nhiên rễ hoang dại có nhiều rễ con và dài hơnsâm Mỹ bán hoang dại, nhưng sâm Mỹ trồng có rễ phát triển to và dài hơn, bênngoài nhẳn mượt hơn, đôi khi có hình dạng giống hình người có ít tua rễ và ngắnhơn rễ sâm mọc hoang [127] Thành phần hóa học gần giống với một số loài sâm

châu Á như Nhân sâm (Panax ginseng, C A.Meyer) Các thành phần có hoạt tính

sinh học chủ yếu là ginsenosid loại dammaran, phân thành 2 loại là loại protopanaxadiol và (20S) protopanaxatriol Các ginsenosid phong phú nhất trong

20(S)-SM thuộc nhóm PPD là G-Rb1, G-Rb2, G-Rc và G-Rd, còn nhóm PPT có G-Rg1 vàG-Re Ngoài ra, sâm Mỹ có chứa G-Ro là một ginsenosid loại oleanan Sâm mỹngoài ginsenosid còn có chứa polyacetylen và tinh dầu [132] Có nghiên cứu công

bố hàm lượng ginsenosid toàn phần trong sâm Mỹ trồng và mọc hoang 4 tuổi không

có khác biệt có ý nghĩa thống kê [20]

Wang và CS dùng HPLC để định lượng ginsenosid, đã công bố kết quả so sánh hàmlượng ginsenosid và polyacetylen giữa sâm Mỹ trồng và mọc hoang [132] Dựa vàothành phần 6 ginsenosid chủ yếu là G-Rg1, G-Re, G-Rb1, G-Rb2, G-Rc, G-Rd, G-Rotrong 16 mẫu sâm Mỹ trồng có hàm lượng Rg1 thấp/ Re cao và 18 mẫu sâm Mỹ mọchoang (loại thứ I có 8 mẫu hàm lượng Rg1 thấp/ Re cao, loại 2 có 10 mẫu kiểu hóa họcRg1 cao/Re thấp) Do đó, để hệ thống hóa chủ yếu so sánh sâm Mỹ trồng kiểu I vớinhóm sâm Mỹ mọc hoang kiểu I Hàm lượng G-Rg1 trung bình trong sâm Mỹ mọchoang (8,49 mg/g) cao gấp 7 lần so với sâm trồng (1,06 mg/g) Hàm lượng G-Re và G-Rb1 trong sâm mọc hoang cao gấp đôi trong SM trồng; ngược lại hàm lượng G-Rd(2,15 mg/g) trung bình trong sâm mọc hoang thấp hơn trong sâm trồng (4,35 mg/g).Bên cạnh đó, xu hướng biến đổi theo tỷ lệ giữa Rg1/Rd trái ngược nhau trong sâm Mỹmọc hoang kiểu I và trồng kiểu II Tỷ lệ trung bình Rg1/Rd (6,25) trong sâm Mỹ mọchoang, cao hơn 10 lần so với sâm Mỹ trồng (0,35); tỷ lệ G-Rg1/G-Rd đánh dấu đặctrưng để phân biệt sâm Mỹ kiểu I mọc

hoang và trồng Đồng thời xác định tỷ lệ giữa một số ginsenosid điển hình, xemnhư một đặc điểm để nhận định sâm Mỹ trồng và mọc hoang [132].

Chenling Qu và CS công bố thành phần ginsenosid trong các bộ phận khác nhaucủa sâm Mỹ trồng 5 tuổi ở Cát lâm –Trung Quốc [109] Dùng phương pháp địnhlượng bằng HPLC-ELSD, đánh giá về sự thay đổi của 12 ginsenosid (G-Rg1, G-Re,G-F11, G-Rf, G-RG2, G-Rh1, G-Rb1, G-Rc, G-Rb2, G-Rb3, G-Rd, G-Rh2) từ các

bộ phận khác nhau và độ tuổi khác nhau của sâm Mỹ Kết quả trong rễ sâm Mỹ pháthiện 8 ginsenosid là: G-Rg1, G-Re, G-F11, G-Rb1, G-Rc, G-Rb2, G-Rb3, G-Rd;các ginsenosid này khác nhau theo từng bộ phận khác nhau của cây, trong đó hàmlượng ginsenosid tổng cao nhất ở lá: Lá > rễ tóc > thân rễ > rễ > thân [109] Nhậnđịnh có sự khác nhau về thành phần ginsenosid trong sâm Mỹ trồng và mọc hoang

là do sự khác biệt trong thời gian thu hái, các vị trí của bộ phận mẫu được sử dụngnhư thân rễ, rễ phụ và do trình tự ADN của cây [20]

Nhìn chung, Nhân Sâm và Sâm Mỹ khi trồng thì đều có sự thay đổi về hình thái của

bộ phận dưới mặt đất cũng như có sự khác nhau về thành phần và hàm lượngsaponin so với sâm mọc hoang Cho đến nay, chưa có nhiều công bố so sánh vềthành phần hóa học và tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng và Sâm Việt Nammọc hoang Thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học chủ yếu trong chi

Panax là saponin Do đó, các tiêu chí để kiểm nghiệm cũng như tiêu chuẩn hóa đều

dựa vào thành phần này

1.2 SÂM VIỆT NAM

Sâm Việt Nam là một loài Panax mới của thế giới có tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae).

1.2.1 Thực vật học

Mô tả: Sâm Việt Nam là cây thảo, sống lâu năm, cao 40-80 cm, có khi tới 1 m.

Thân rễ nạc, mọc bò ngang, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30-40 cm, có thểhơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt,ruột trắng ngà, phần cuối là rễ củ hình con quay (Hình 1.2 B) Thân khí sinh mảnh,mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứngngược hoặc hình mác, dài 10-14 cm, rộng 3-5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài

thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, cócuống dài, hoa nhiều màu, đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu thượng 1 ô.Quả hạch hình trứng, màu đỏ, có một chấm đen (Hình 1.2 A) Hạt hình thận màutrắng, có vân Mùa hoa tháng 4-7, mùa quả tháng 9-10 [2], [3]

Hình 1.2 Bộ phận trên mặt đất (A) và bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam

(B) “Nguồn: Nguyễn Minh Đức”

1.2.2 Phân bố

Sâm Việt Nam là loài đặc hữu của Việt Nam, đến nay chỉ phát hiện được duy nhất

ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Sâm Việt Nam mọc

tự nhiên ở độ cao 1500-2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000 m thuộc địa bàn củahai huyện Đăk Tô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam)[2] Ngoài ra, có hai thứ của

Sâm Việt Nam là (Panax vietnamensis var fuscidiscus) được phát hiện ở Vân Nam (Trung Quốc) và Lai Châu (Việt Nam) và (Panax vietnamensis var langbianensis)

tìm thấy ở vùng núi Langbiang thuộc tỉnh Lâm Đồng [11] Hai thứ này của Sâm

Việt Nam đã được công bố về mối quan hệ di truyền với Sâm Việt Nam Panax

vietnamensis var fuscidiscus khác với Sâm Việt Nam về hình tái thực vật ở đế và

đài hoa [123], khác về trình tự nucleotid vị trí 100 và 104 trên vùng matK [11]

Panax vietnamensis var langbianensis khác với Sâm Việt Nam về hình thái thực

vật của lá, hoa và 5 vị trí trên trình tự ITS1-5.8S-ITS2 [123]

1.2.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của Sâm Việt Nam đa dạng với nhiều nhóm hợp chất: saponin,polyacetylen, các thành phần acid béo, acid amin, các nguyên tố đa lượng và vilượng Saponin được xem là nhóm hợp chất chiếm đa số và có nhiều công bố về tácdụng dược lý Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam được phân loại theo hệ

thống phân loại các saponin trong chi Panax, phân loại cơ bản theo cấu trúc khung

genin và theo mạch nhánh C-17 khác Bên cạnh đó còn có một vài saponin khôngthuộc cấu trúc này được liệt kê vào mục saponin cấu trúc khác [139]

Thành phần saponin trong bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam

Năm 1989, bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM), Nguyễn Thới Nhâm đãphát hiện thành phần saponin của Sâm Việt Nam có nhiều vết phù hợp với các vếtsaponin chính trong Nhân sâm và xác định Sâm Việt Nam có chứa majonosid-R2,một saponin dammaran có cấu trúc ocotillol không có trong Nhân sâm [103]

Năm 1992-1999, Nguyễn Minh Đức và CS đã nghiên cứu thành phần hóa học củaSâm Việt Nam và đã phân lập được 50 saponin trong Sâm Việt Nam, trong đó có

26 saponin đã biết được phân lập từ các dược liệu thuộc chi Panax và 24 saponin

mới đặt tên là vinaginsenosid-R1 đến vinaginsenosid-R24 [37],[38] Trần Lê Quan

và CS đã phân lập được 2 saponin mới từ Sâm Việt Nam là G-Rh5 vàvinaginsenosid-R25 [121] Cho đến nay đã có 53 hợp chất saponin được phân lập từphần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam [139]

Thành phần saponin trong bộ phận trên mặt đất của Sâm Việt Nam

Từ phần trên mặt đất Sâm Việt Nam, phân lập 19 saponin dammaran bao gồm 11saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenosid-L1 đếnvinaginsenosid-L8 [129] Khác với saponin từ phần dưới mặt đất của Sâm VN, cácsaponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol chiếm tỷ lệ cao với đại diện chính lànotoginsenosid-Fe, ginsenosid-Rb3, vinaginsenosid-L2 Các saponin có cấu trúcocotillol chiếm tỷ lệ thấp với đại diện chính là VG-R1 Như vậy, thành phầnsaponin trong Sâm Việt Nam có tổng số 61 saponin đã được công bố Bảng 1.3 tómtắt phân loại thành phần các saponin trong Sâm Việt Nam [3],[37],[38],[121]

ảng 1.3 Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam

Nhóm Tên saponin Công thức cấu tạo

Nhóm Tên saponin Công thức cấu tạo

Vina-ginsenosid-R1 [6-Ac]-Glc2-Rha -H

Vina-ginsenosid-R14 -Glc2-Xyl -OH

Vina-ginsenosid-R2 [6-Ac]-Glc2-Xyl -H

Nhóm Tên saponin Công thức cấu tạo

Thành phần hóa học khác trong Sâm Việt Nam

Ngoài saponin, nhiều thành phần khác trong Sâm Việt Nam đã được xác định nhưthành phần acid amin (có 18 loại với arginin, lysin, trytopan chiếm tỷ lệ cao), acidbéo, thành phần nguyên tố đa vi lượng [3] Trần Công Luận và CS đã phân lập vàxác định 7 hợp chất polyacetylen ở phân đoạn ít phân cực từ phần dưới mặt đất củaSâm VN, trong đó 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc là Pv1= Panaxynol, Pv3,Pv4, Pv6, Pv7 và có 2 hợp chất mới là Pv2=10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và Pv5= heptadeca-1,8(E), 10(E)-trien-4,6-diyn,3,10-diol [89]

1.2.4 Một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam

Sâm Việt Nam được phát hiện từ năm 1973, tuy nhiên có rất ít nghiên cứu ngoàinước về tác dụng sinh học của loài loài sâm này Năm 1998, Konoshima đã công bố

về tác dụng kháng khối u, kháng ung thư của thành phần majonosid-R2 trong SâmViệt Nam [71],[72].Yamasaki đã tóm tắt một số tác dụng quan trọng của Sâm ViệtNam mọc hoang đã công bố như tác dụng kháng khối u, kháng ung thư và chốngstress tâm lý [137] Đến năm 2018, có nghiên cứu tóm tắt về một số tác dụng dược

lý như trên thì có thêm nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, giải lo âu và cho thấycần có thêm nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý để làm rõ hơn giá trị của SâmViệt Nam [74] Gần đây, tác giả Pena và CS đã công bố về tác dụng giải lo âu,chống trầm cảm và cải thiện trí nhớ của Sâm Việt Nam trồng [35]

Như vậy cho đến nay, chỉ có vài nghiên cứu ngoài nước về Sâm Việt Nam, cácnghiên về tác dụng dược lý chủ yếu thực hiện trong nước và hợp tác với nướcngoài như Nhật Bản hay Hàn Quốc Tác dụng dược lý quan trọng của Sâm ViệtNam mọc hoang (Sâm VN-MH) như: Tăng lực, chống nhược sức; tác dụng điềuhòa các rối loạn chuyển hóa trong cơ thể, chống stress, bảo vệ gan, tăng sức đềkháng không đặc hiệu của cơ thể [3]

1.2.4.1 Tác dụng tăng lực

Cao chiết Sâm VN-MH thể hiện tác dụng tăng lực, chống nhược sức ở khoảng liều

từ 5-100 mg/kg So sánh ở cùng liều sử dụng 50 mg/kg trọng lượng chuột, cao chiếtSâm VN-MH thể hiện tác dụng tăng lực và chống nhược sức trên chuột nhắt trắngtốt hơn cao chiết NS Ngoài ra, trong các thực nghiệm stress nhiệt độ nóng hoặc

lạnh, cao chiết Sâm VN-MH liều 100 mg/kg làm phục hồi thể lực của súc vật thửnghiệm trong các thực nghiệm bơi tức thời và dài ngày (sau 7, 14 ngày bị stressnhiệt độ) [103].

1.2.4.2 Tác dụng của Sâm Việt Nam trên stress vật lý

Trên thực nghiệm gây nhiễm xạ tia Cobalt trên chuột nhắt trắng ở liều chiếu toànthân 4-5 Gy Cao chiết Sâm VN-MH liều uống 50 mg/kg có tác dụng bảo vệ cơ thểsúc vật thử nghiệm chống lại tác hại của tia xạ, làm phục hồi số lượng hồng cầu,bạch cầu, tiểu cầu và thể hiện rõ nhất ở thời điểm 14 ngày sau chiếu xạ [103] Caochiết Sâm VN-MH (liều 100 mg/kg) có tác dụng làm gia tăng ngưỡng đáp ứng củasúc vật thử nghiệm đối với stress nóng (37-42 oC) và lạnh (5 oC); làm kéo dài thờigian sống sót của súc vật thử nghiệm; duy trì sự phát triển nuôi chung của súc vậtthử nghiệm khi tiếp xúc dài ngày với stress nhiệt độ (stress nóng 37 oC trong 10ngày và stress lạnh 5 oC trong 10 ngày) [3], [103]

1.2.4.3 Tác dụng của Sâm Việt Nam trên stress tâm lý

Các nghiên cứu trước đây về tác dụng chống stress tâm lý của Sâm VN-MH sửdụng một số thực nghiệm gây stress: Stress cô lập, stress tâm lý sử dụng hộp truyềntin giao tiếp thực hiện trên chuột nhắt trắng và stress gây sợ hãi có điều kiện thựchiện trên chuột cống trắng

Tác dụng của Sâm Việt nam trên sự mất cảm giác đau gây bởi stress tâm lý

Cao chiết Sâm VN-MH, saponin toàn phần và majonosid-R2 được cho uống 1 giờhoặc tiêm phúc mô 30 phút trước khi tiếp xúc với stress có tác dụng hồi phục lạicảm giác đau trên súc vật thử nghiệm, tương tự như tác dụng của chất đối khángvới thụ thể opioid là naloxon Tuy nhiên, cao chiết Hồng sâm không thể hiện tácdụng hồi phục trên sự mất cảm giác đau trên súc vật bị stress tâm lý [50]

Tác dụng của Sâm Việt Nam trên sự loét dạ dày gây bởi stress tâm lý

Cao chiết Sâm VN-MH và majonosid-R2 (M-R2) có tác động bảo vệ đối với nhữngtổn thương ở dạ dày gây bởi stress tâm lý, tương tự như thuốc đối chiếu diazepam(chất chủ vận lên hệ thống GABA-A) và naloxon, cao chiết Hồng sâm chưa thểhiện tác dụng bảo vệ đối với những tổn thương ở dạ dày của súc vật bị stress [100]

Tác dụng Sâm Việt Nam trên giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress tâm lý

Cao chiết Sâm VN-MH, saponin toàn phần và M-R2 làm hồi phục lại giấc ngủpentobarbital bị rút ngắn bởi stress tâm lý nhưng không tác dụng lên giấc ngủpentobarbital ở súc vật nuôi chung không bị stress Tác động này của Sâm VN-MHkhác với thuốc đối chiếu diazepam: Làm kéo dài giấc ngủ pentobarbital ở cả 2 cơđịa súc vật nuôi chung và súc vật bị stress Cao chiết Hồng sâm và naloxon khôngthể hiện tác động hồi phục lại giấc ngủ pentobarbital gây bởi stress tâm lý [100].

Tác dụng chống trầm cảm

Thực nghiệm bơi bắt buộc của Porsolt (forced swimming test) được dùng để đánhgiá mức độ trầm cảm trên chuột bị stress tâm lý do cô lập xã hội Cao chiết SâmVN-MH (liều uống 100 mg/kg) và M-R2 (liều tiêm phúc mô 12,5 mg/kg) thể hiệntác dụng ức chế sự gia tăng mức độ trầm cảm gây ra do stress cô lập, tương tự nhưthuốc chống trầm cảm desipramin (20 mg/kg) và fluoxetin (30 mg/kg) Cao chiếtHồng sâm (liều uống 100 mg/kg) chưa thể hiện tác dụng ức chế sự gia tăng mức độtrầm cảm do stress cô lập [9],[100]

Tác dụng giải lo âu

Thực nghiệm buồng tối-sáng phối hợp với stress cô lập được dùng để nghiên cứutác dụng giải lo âu của M-R2 liều 12,5 mg/kg thể hiện tác động giải lo âu nguyênnhân do stress tương tự như thuốc đối chiếu diazepam [9]

1.2.4.4 Tác dụng chống oxy hóa

Những kết quả nghiên cứu in vitro đã chứng tỏ rằng các cao chiết rễ và lá Sâm

VN-MH đều thể hiện một số hoạt tính chống các gốc tự do, đặc biệt là hoạt tính đánh bắtgốc superoxid và hoạt tính chelat ion sắt Phân đoạn cao chiết ether và phân đoạnnước thể hiện tác dụng chống gốc tự do mạnh hơn so với các cao chiết khác Hoạttính chống gốc tự do 1,1-diphenyl-2-pictylhydrazyl của cao chiết Sâm VN-MH vớisaponin toàn phần và hoạt chất chính majonosid-R2 ở cùng khoảng nồng độ thử chothấy cao chiết Sâm VN-MH thể hiện tác dụng mạnh hơn Stress cô lập trong 4-6tuần làm tăng hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) tế bào não song song với tăng

sự hình thành gốc tự do nitric oxid (NO) và làm giảm hàm lượng chất chống oxyhóa nội sinh glutathion (GSH) Saponin Sâm VN-MH (liều uống 15-25 mg/kg) làmgiảm sự gia tăng hàm lượng MDA gây bởi stress Majonosid-R2 (liều

uống 10-50 mg/kg) ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA, NO và phục hồi lại hàmlượng GSH gây bởi stress tâm lý [52],[141].

1.2.4.5 Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng bảo vệ tế bào gan tránh tác động của độc chất

Cao chiết và saponin toàn phần Sâm VN cho chuột uống 7 ngày có tác dụng bảo vệgan trước thực nghiệm gây tổn thương gan cấp bằng CCl4 [3] Các gốc tự do là mộttrong những sản phẩm chuyển hoá ở gan của CCl4 hoặc ethanol khi được đưa vào

cơ thể bằng đường uống, các gốc tự do này là nguyên nhân gây ra sự peroxy hoálipid và kết quả của quá trình này là làm tăng MDA Cao chiết Sâm VN ở liều 100-

200 mg/kg có tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA gây bởi CCl4 hoặcethanol Saponin toàn phần ở liều 100-200 mg/kg và majonosid-R2 ở liều tiêm phúc

mô 10-50 mg/kg thể trọng cũng thể hiện tác dụng tương tự [99]

Tác dụng gia tăng hoạt năng cytocrom-P450: Trên thực nghiệm in vitro, Sâm

VN-MH ức chế hoạt năng của enzym CYP2E1 trong ty thể gan chuột nhắt trắng.Saponin toàn phần Sâm VN-MH cũng như hoạt chất chính majonosid-R2, làm giatăng hàm lượng của cytocrom P-450 trong ty thể, liên kết với cytocrom P-450 vàgia tăng hoạt năng của cytocrom P-450 trong các phản ứng oxy hóa khử Tác dụngcủa saponin toàn phần Sâm VN thể hiện mạnh hơn majonosid-R2 trên cả hai cơ địasúc vật nuôi chung và súc vật bị gây tổn thương gan bằng CCl4[99]

Tác dụng bảo vệ gan theo hướng ức chế sự tạo thành TNF-αGlc (tumor necrosisfactor) Majonosid-R2 (10-50 mg/kg) tương tự như silymarin (100 mg/kg) có tácdụng ức chế sự phân mảnh ADN, giảm đậm độ chromatin trong nhân tế bào, ức chế

sự gia tăng các transaminase và ức chế sự tạo thành TNF- αGlc trong huyết thanh chuột

bị gây hoại tử tế bào gan bởi D-GalN/LPS [120] Thực nghiệm in vitro trên sự hoại

tử gây chết tế bào gan bởi D-GalN/TNF- αGlc với IC50 của majonosid-R2 là 82,4 mM[121] Ngoài ra, SVN đã được nghiên cứu và công bố một số tác dụng khác [3]được trình bày trong bảng 1.4

ảng 1.4 Một số tác dụng dược lý khác của Sâm Việt Nam

Kích thích các hoạt động não bộ Suy nhược tinh thần

Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục Suy nhược sinh dục

Đặc hiệu với vi khuẩn Streptoccoci Chữa viêm họng hạt

Tăng cường chức năng gan và bảo vệ tế bào gan Chống xơ gan và giải độc ganGiảm cholesterol huyết, giảm lipid, tăng HDL Xơ vữa động mạch

Giảm đường huyết hiệp lực với thuốc hạ Bệnh đái tháo đường

đường huyết

Hoạt tính kháng ung thư thể hiện qua tác động ức Phòng chống các loại ung thưchế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển Hỗ trợ thuốc chữa ung thưcủa ung thư

Gia tăng sức đề kháng không đặc hiệu Suy giảm miễn dịch

1.2.5 Sâm Việt Nam chế biến

1.2.5.1 Thành phần hóa học

Sâm Việt Nam chế biến có thành phần hóa học thay đổi so với Sâm VN chưa chếbiến Lê Thị Hồng Vân và CS đã phân lập được 25 saponin từ Sâm Việt Nam chếbiến; trong đó có 12 saponin đã biết trong Sâm VN chưa chế biến và có 13 saponinmới được được tạo thành do quá trình chế biến Trong đó gồm có 8 saponin từ 4 cặp

đồng phân: G-Rk3 và G-Rh4, G-Rk1 và G-Rg5, 20 (S) G-Rh1 và 20 (R) G-Rh1, 20(S) G-Rg3 và 20 (R) G-Rg3; và 5 ginsenosid là: Notoginsenosid-R2, G-Ra1,

notoginsenosid-R4, notoginsenosid-D,3-O –β –β –β – D - xylopyranosyl-(12)- β-DDglucopyranosyl (12)-β-DD -glucopyranosyl-20 (S)- protopanaxadiol 20- O-Dβ-DD-xylopyranosyl (13) β-DD-xylopyranosyl (16) β-DD-Dglucopyranosid [17]

-1.2.5.2 Tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam chế biến

Sự thay đổi hoạt tính chống phân bào và chống oxy hoá; dựa trên nghiên cứu sựthay đổi hoạt tính chống phân bào của Sâm VN chế biến trên dòng tế bào ung thưphổi A549, cho thấy hoạt tính chống phân bào tăng nhanh trong quá trình hấp và đạttối đa sau 12 giờ [124], [125] Đáng chú ý là hoạt tính chống phân bào có thể có liênquan mật thiết với tổng lượng saponin nhóm protopanaxadiol kém phân cực G-Rg3,

G-Rg5 và G-Rk1 Thành phần saponin kém phân cực được chuyển hóa trong quátrình chế biến của Sâm VN thể hiện tác dụng kháng viêm; sử dụng đường uống hợpchất V-R2, M-R2 từ Sâm VN sẽ chuyển hóa thành hợp chất P-RT4 ngăn chặn biểuhiện các cytokin tiền viêm gây bởi lipopolysaccharid trên đại thực bào [59] Caotoàn phần Sâm VN chế biến liều 50 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương

do paracetamol; làm giảm hoạt độ AST, ALT trong máu, đồng thời giảm hàmlượng MDA và tăng GSH trong gan [97]

1.2.6 Sâm Việt Nam trồng

Sâm Việt Nam mọc hoang với sự đa dạng về thành phần hóa học và nhiều tác dụngdược lý đã được công bố nên được xem như là dược liệu quý hiếm Trên thịtrường nguồn cung cấp chủ yếu là Sâm Việt Nam trồng (Sâm VN) Sâm Việt Namthường trồng dưới tán rừng và trồng trong vườn trồng ở độ cao trên 1100 m trênvùng núi Ngọc Linh

Trước đây, các nhà khoa học đã ghi nhận rằng bộ phận dưới mặt đất của đa số các

loài thuộc chi Panax mọc hoang trên thế giới thường là một thân rễ phát triển, chứa

chủ yếu saponin thuộc nhóm olean và thường kém giá trị Ngược lại, một số loài

thuộc chi Panax được trồng thành công trên thế giới như Nhân sâm, Sâm Mỹ (Panax quinquefolius L.) và Tam Thất (Panax notoginseng) có bộ phận dưới mặt

đất là rễ củ dạng cà rốt và có giá trị hơn vì chứa chủ yếu saponin thuộc nhómdammaran

Sâm Việt Nam có thân rễ phát triển giống như một số loài thuộc chi Panax mọc

hoang khác, nhưng Sâm VN chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm dammaran và có rất

ít saponin nhóm olean Sâm Việt Nam chứa đầy đủ các saponin chủ yếu có trongcác loài sâm trồng như ginsenosid-Rb1, G-Rd, G-Re, G-Rg1 và notoginsenosid-R1,nhưng hàm lượng saponin toàn phần của Sâm VN lại cao hơn Mặc khác, Sâm VNchứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh ocotillol cao như majonosid-R2 (hiệu suất khoảng 5% và chiếm tỷ lệ khoảng 50% saponin toàn phần) Thành

phần đặc biệt này đã làm SVN trở thành một loài Panax độc đáo về mặt hoá phân

loại và tác dụng dược lý

Đối với Sâm Việt Nam, bộ phận trên mặt đất giữa Sâm VN trồng và Sâm VN mọchoang chưa có công bố có sự khác biệt, chỉ có phần dưới mặt đất có sự khác biệt.Khác với Sâm VN-MH có thân rễ phát triển, đối với Sâm VN thì có rễ củ phát triển

và có hình dạng không giống nhau do điều kiện địa lý trồng; rễ củ dạng con quaythường gặp ở Sâm VN trồng dưới tán rừng, hình dạng củ cà rốt và dạng củ chùmthường gặp ở Sâm VN trồng trong vườn ở độ cao 1100 m so với mặt nước biển [3].Nghiên cứu hoá học của cây Sâm Việt Nam trồng của Nguyễn Minh Đức và CS.bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

đã khảo sát so sánh Sâm VN-MH và Sâm VN trồng tại trại dược liệu Trà Linh –Quảng Nam Kết quả trên SKLM cho thấy phần dưới mặt đất của Sâm VN và SâmVN-MH đều chứa các saponin tương tự về số vết của các chất cũng như màu sắc vàgiá trị Rf, chủ yếu có các vết tương tự G-Rg1,G-Rb3, G-Rd, G-Re, G-Rg1, M-R1,M-R2 Tuy nhiên khảo sát bằng phương pháp HPLC, các pic chính trong Sâm VN

và Sâm VN-MH có thời gian lưu giống nhau nhưng diện tích pic không tươngđương nhau, cho thấy hàm lượng saponin Sâm VN và Sâm VN-MH không hoàntoàn giống nhau [7]

Kỹ thuật trồng Sâm Việt Nam

Sâm Việt Nam là loài đặc hữu hẹp, phân bố trong vùng xuất xứ núi Ngọc Linh.Nhân giống trồng thích hợp trong các điều kiện đặc trưng của vùng xuất xứ nhưsau: Nhiệt độ thích hợp trung bình trong năm từ 14 -18 oC (thấp nhất 8 -11 oC, caonhất 20- 25 oC), độ cao so với mực nước biển từ 1.500 m trở lên, thuận lợi ở độ cao

từ 1.800 m trở lên Hai thời vụ gieo trồng trong năm là vào tháng 4 và tháng 10.Trồng bằng hạt thu được từ cây từ 4 năm tuổi trở lên, trồng từ đầu mầm đối với cây

từ 2 năm tuổi trở lên Quả thu được phải ủ từ 5 - 10 ngày trước khi gieo, môitrường gieo hạt là mùn núi, độ sâu gieo hạt phù hợp nhất là 2 - 5 cm Khoảng cáchtrồng tốt nhất là 20 x 30 cm, nên trồng dưới tán rừng có độ che phủ 75 – 90% [3]

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHUẨN HÓA SÂM VIỆT NAM

Cho đến nay chưa có nghiên cứu ngoài nước liên quan đến tiêu chuẩn kiểm nghiệmSâm Việt Nam Các phương pháp định tính, định lượng saponin trong Sâm ViệtNam đa số thực hiện trong nước hay liên kết nghiên cứu ngoài nước Hiện nay,

chuyên luận kiểm nghiệm Sâm Việt Nam chỉ có trong Dược Điển Việt Nam V,Dược điển các nước khác không có Chuyên luận này gồm các chỉ tiêu: Mô tả, viphẫu, soi bột, định tính 3 saponin (G-Rb1, G-Rg1, M-R2) bằng SKLM, định lượngđồng thời 4 saponin (G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, M-R2) bằng HPLC, độ ẩm, tro toànphần, tỷ lệ vụn nát, tạp chất [1] Trong khi đó, tiêu chuẩn kiểm nghiệm Nhân sâm cótrong Dược điển của Châu Âu, Mỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản Do đó, vấn

đề xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Sâm Việt Nam bằng phương pháp hiện đại,chính xác đáp ứng với xu thế phát triển của thế giới đang là vấn đề cấp thiết

1.3.1 Nghiên cứu hình thái thực vật Sâm Việt Nam

Năm 1983, Sâm Việt Nam mọc hoang đã được nghiên cứu về hình thái thực vậtcũng như vi phẫu thân, lá, thân rễ, rễ củ, rễ phụ Kết quả phiến lá của Sâm VN-MH

mỏng nhất so với các loài khác trong chi Panax [3] Hiện nay, Sâm VN về phần mô

tả và vi học của bộ phận dưới mặt đất được xây dựng tiêu chuẩn theo chuyên luậnriêng trong Dược Điển Việt Nam V [1]

1.3.2 Phương pháp định tính, định lượng saponin trong Sâm Việt Nam1.3.2.1 Định tính

Phương pháp định tính saponin trong Sâm VN bằng SKLM được xây dựng trongDĐVN V Dịch chiết methanol từ dược liệu được so sánh với chuẩn M-R2, G-Rg1,G-Rb1 và dung dịch dược liệu đối chiếu, hệ dung môi n- butanol - nước - acidacetic (4 : 5 : 1, lớp trên) Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được lấy ra để khô,phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol và sấy ở 110 °C trong 3 phút

1.3.2.2 Phương pháp định lượng saponin trong Sâm Việt Nam

Phương pháp cân: Vào những năm 80, việc nghiên cứu kiểm nghiệm Sâm VN-MH

và chế phẩm đầu tiên từ Sâm VN-MH được tiến hành bằng phương pháp cân củaNamba

Phương pháp đo quang: Kết quả hàm lượng saponin toàn phần trong rễ củ Sâm VN

cao hơn thân rễ Ngoài ra, bằng phương pháp này, Trần Công Luận và CS đã cónghiên cứu bước đầu định lượng và so sánh hàm lượng saponin toàn phần trong

Sâm VN trồng và Sâm VN-MH, Sâm VN năm 6 tuổi có hàm lượng saponin tăngcao hơn Sâm VN -MH [3].

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC-DDAD: Nguyễn Minh Đức và CS sử dụng phương pháp HPLC

với các chất chuẩn để định lượng các saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng[36] Hàm lượng của các saponin chủ yếu trong Sâm VN tăng theo tuổi Hàm lượngsaponin cao hơn nhiều (gấp 3-4 lần) so với Nhân sâm cùng tuổi Hàm lượng cácsaponin chủ yếu trong thân rễ cao hơn trong rễ củ trong cùng năm tuổi Majonosid-R2 chiếm khoảng 50% tổng cộng các saponin chính Nghiên cứu về thành phầnsaponin nói trên đã chứng tỏ cây Sâm VN rất giống với Sâm VN-MH NguyễnMinh Đức và CS dùng phương pháp HPLC đánh giá chất lượng Sâm VN di thực

từ trạm Dược liệu Trà Linh tỉnh Quảng Nam đến Lâm Đồng và đến các vùng núikhác nhau của tỉnh Quảng Nam [98]

Để kiểm soát chất lượng dược liệu nhanh chóng, hiệu quả, xu hướng định lượng đồngthời nhiều ginsenosid trong một số loài sâm đang phát triển Vũ Bình Dương và CS đãxây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời G-Rb1, G-Rd và G-Rg1 trongsinh khối Sâm Việt Nam bằng HPLC với điều kiện sắc ký là cột C18, pha độngacetonitril và nước theo chương trình gradient, detector UV bước sóng 203 nm.Phương pháp này có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng cao, có thể địnhlượng các ginsenosid ở nồng độ 5 µg/ml [4] Tuy nhiên, trong công bố các tác giả đãkhông xác định M-R2, thành phần quan trọng của Sâm Việt Nam

Bùi Thế Vinh và CS đã nghiên cứu định lượng đồng thời G-Rg1, G-Rb1 và M-R2trong Sâm VN bằng phương pháp HPLC sử dụng cột Supelco C18 (250 × 4,6 mm,

5 µm), tốc độ dòng 0,5 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 203 nm (G-Rg1, G-Rb1),

190 nm (M-R2) nhiệt độ cột 27 °C với chương trình rửa giải gradient, thời gian 100phút Khi phát hiện ở 190 nm, tín hiệu M-R2 cao hơn ở 196 nm mặc dù có hiệntượng trôi đường nền Tuy nhiên, có thể khắc phục nhược điểm này khi đối chiếusong song mẫu thử với mẫu trắng Mẫu thử được chiết siêu âm bằng MeOH (tỉ lệ1:10, 3 lần), lọc và cô giảm áp đến cắn Cắn được hòa với nước, chiết phân bố vớidiethyl ether để loại tạp kém phân cực, sau đó lắc với n-BuOH để lấy phần đoạn

saponin Phương pháp được thẩm định đều đạt các chỉ tiêu tương thích hệ thống,tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, khoảng tuyến tính [18].

Lê Thị Hồng Vân và CS đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồngthời G-Rg1, G-Rb1, G-Rd và M-R2 trong saponin toàn phần Sâm Việt Nam bằngphương pháp HPLC sử dụng cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm), detector DAD,bước sóng phát hiện 203 nm (G-Rg1, G-Rb1, G-Rd) và 196 nm (M-R2), nhiệt độcột 40 °C, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút với chương trình rửa giải gradient, thời giantriển khai là 71 phút/mẫu [126]

Lê Quốc Việt và CS dùng phương pháp SPE (Solid phase extraction) chiết xuất vàdùng HPLC định lượng một số saponin chủ yếu trong Sâm VN được thu hái tại TràLinh thuộc tỉnh Quảng Nam Điều kiện HPLC cho định lượng đồng thời G-Rg1, G-Rb1, G-Rd như sau: Cột Kyatech HiQ sil C18 ( 250 × 4,6 mm, 5 µm), chương trìnhrửa giải gradient với pha động là acetonitril : nước, phát hiện ở bước sóng 203 nm;Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng, tốc độ dòng: 0,7 ml/ phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl.Tuy nhiên, phương pháp này chưa tách được hoàn toàn G-Rg1 và G-Re Song song

đó, định lượng majonosid-R2 điều kiện tương tự nhưng phát hiện bước sóng 190

nm Phương pháp xử lý mẫu qua SPE đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm dung môi

so với phương pháp chiết mẫu qua Diaion HP-20 [128]

Phương pháp HPLC/ELSD

Đã có nghiên cứu công bố dùng phương pháp HPLC định lượng một số ginsenosidnhóm PPD, PPT và OCT trong các phần khác nhau từ bộ phận dưới mặt đất củaSâm VN 6 năm tuổi được thu hái tại trạm dược liệu Trà linh Các saponin nhómPPT không có sự khác biệt với nhau nhiều giữa thân rễ, rễ củ và rễ phụ Nhưng hàmlượng saponin nhóm OCT có sự khác biệt rõ ràng, trong thân rễ có hàm lượng caonhất > rễ củ > rễ phụ Mặc dù hàm lượng saponin nhóm PPD và PPT trong rễ phụchiếm hàm lượng cao hơn trong thân rễ và rễ củ nhưng tổng saponin toàn phần thìthấp, do có saponin nhóm OCT có hàm lượng thấp Trong khi đó sâm Mỹ và Nhânsâm có hàm lượng saponin trong rễ con cao hơn trong rễ chính và rễ phụ; Sâm VNthì tổng saponin trong rễ con ít hơn trong rễ củ và thân rễ [75] Tỷ lệ nhóm saponintheo khung genin trong Sâm VN với tỷ lệ PPT: PPD: OCT trong thân rễ là (1: 1,7: