Tìm phương pháp khắc phục các bệnh đột biến mtDNA di truyền từ mẹ

Tìm phương pháp khắc phục các bệnh đột biến mtDNA di truyền từ mẹ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời đại khoa học phát triển đã giúp cải thiện chất lượng cuộc sống củacon người, một trong số đó là người ta đã nghiên cứu phòng ngừa các đột biến ditruyền và bệnh tật Các nhà khoa học đã chọn nhiều các phương pháp phòng ngừa,trong đó có kỹ thuật Reprogenetics và phương pháp PGD- Preimplantation geneticdiagnosis (chẩn đoán gien di truyền trước khi cấý), đây là 2 phương pháp và quy trìnhkiểm tra và ngăn ngừa các đột biến di truyền có thể xảy ra trước khi trứng của người

mẹ thụ tinh phát triển thành phôi thai Vấn đề này vẫn còn gây tranh cãi, vì không tuântheo quy luật tự nhiên và liên quan đến đạo đức Tuy vậy các kỹ thuật reprogenetics cónhiều ưu điểm giảm những bênh tật không mong muốn, cung cấp chất lượng cuộcsống tốt hơn cho người bị đột biến di truyền cũng như thế hệ con cái

Đột biến gen ở ty thể, gây ra nhiều bệnh như đái tháo đường và dẫn đến điếc,bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền của Leber, chứng động kinh co giật cơ Nhữngđột biến này do đột biến gen ty thể (mtDNA), nơi sản xuất năng lượng chính cho tếbào Đột biến gen ở ty thể, tạo ra các protein đột biến chức năng thay cho các proteinbình thường sản xuất năng lượng cho nhu cầu của tế bào Những bệnh liên quan đếnđột biến gen ở Ty thể làm giảm chất lượng cuộc sống cho những người bị bệnh, gâygánh nặng tài chính cho gia đình bệnh nhân, với chi phí chăm sóc sức khỏe suốt đờirất cao

mtDNA là một trong các thành phần quy định tính di truyền của tế bào chất.Đối với con người mtDNA là nhân tố di truyền theo mẹ, bởi vì chỉ ở tế bào trứng cóchứa khối tế bào chất lớn và chứa nhiều ty thể, ở tinh trùng ty thể chỉ có ở phần cổ, vàkhi thụ tinh chỉ có đầu tinh trùng xâm nhập vào tế bào trứng, còn phần cổ thì bị loại

bỏ, nếu nó được xâm nhập vào tế bào trứng cũng bị tiêu hủy bởi lizoxom Từ đó cácnhà khoa học đã đưa ra các phương pháp thích hợp để phòng những bệnh liên quanđến đột biến gen ty thể Trường hợp người mẹ có con bị bệnh đột biến gen ở ty thể, thì

người Mẹ đó đã mang gen đột biến ở ty thể và di truyền sang con, để làm sao đứa contiếp theo không bị bệnh, do đó tôi tiến hành đề tài tiểu luận tìm hiểu về vấn đề này Do

đó mục tiêu của tiểu luận này là “Tìm phương pháp khắc phục các bệnh đột biến mtDNA di truyền từ mẹ”

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tìm hiểu về Ty thể

1.1.1 Cấu tạo và chức năng

Ty thể là bào quan nhỏ của tế bào, là nơi tổng hợp các enzym hô hấp, có chứcnăng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh dưỡng thành năng lượng trong ATP, đảmbảo năng lượng cho toàn bộ quá trình trao đổi chất Ty thể có trong tất cả tế bào nhânchuẩn, Ty thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặttên là mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường

có dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường (Nguyễn Như Hiền,2010)

Hình 1 Cấu trúc và hình thái của ty thểTheo Green và cộng sự (1998), ty thể (mitochondria) được coi là trung tâmnăng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thànhnăng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP Ngoài ra, ty thể còn đóng vai tròquan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis (quá trình tự chết của

tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của tế bào, tổng

Theo SolanoA và cộng sự (2010) cho đến nay, người ta đã thống kê được trên

150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do DNA ty thể (mtDNA) quyết định Cácbệnh do đột biến DNA ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng, chúng có thể liênquan đến đột biến quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến dothay đổi các nucleotide

mtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5 µm, mtDNA củanấm men có thể đạt kích thước 26 µm Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 – 5% DNAcủa tế bào Ví dụ trong tế bào gan số phân tử mtDNA trong một ty thể la 5, chúng nằmtrong chất nền định khu cạnh các mào và thường liên kết với mào, mtDNA tự tái bảntheo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy ra ởgian kỷ của chu kỳ tể bào mtDNA có dạng vòng và không liên kết với histon, điểunày làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và tương tự với DNA của vikhuẩn

Ngoài ra bộ mã của gen trong mtDNA có ít nhiều khác với bộ mã chung, ví dụcodon UAG là codon kết thúc ở bộ mã chung thì đối với ty thể (người) thì đó lại làcodon của triptophan Đột biến xảy ra trong mtDNA gây nên nhiều bệnh tật, nhất làđối với hệ thần kinh và hệ cơ Tần số sai lệch trong mtDNA cũng tăng theo tuổi già.Trong vài năm trở lại đây, những đột biến ty thể liên quan đến các bệnh ty thể đượcxem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học Đặcbiệt, hướng nghiên cứu sử dụng DNA ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triểnnhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếmgặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyềncủa mẹ

1.1.2 Hệ genome ty thể

Theo Ander son (1981), ty thể có chứa DNA, DNA của ty thể có khả năng nhânđôi độc lập với quá trình tự nhân đôi của DNA (nhiễm sắc thể) trong nhân tế bào, cókhả năng tổng hợp các protein đặc trưng của ty thể DNA ty thể là phân tử sợi kép,dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide:chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine Chuỗi nặng mã hóa

cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể Trong 37gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphorylhóa oxy hóa Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mãcủa ty thể Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của tythể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của tế bàochất

Theo TaylooR.W và cộn sự (2005), các nghiên cứu trên DNA ty thể cho thấy hệgen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân Hệ gen ty thể có đặctính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào.Các tế bào khác nhau có số lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu nănglượng trong mô Hệ gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất

ít các bazo không mã hóa ở giữa chúng Trong nhiều trường hợp không xuất hiện cáccodon kết thúc mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã D- Loop là vùng duy nhấttrong hệ gen ty thể không tham gia mã hóa

Theo LeeH C và cộn sự Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tốquan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗinặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã DNA ty thể…Khi vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được

mã hóa trong ty thể

Hình 2 Sơ đồ cấu tạo DNA ty thể người

Theo Modica- Napolitanoj S và cộng sự (2007), các đặc điểm của hệ gen ty thểnhư không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóaoxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đãlàm cho khả năng bị đột biến của DNA ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) BởiDNA ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại(wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy).DNA ty thể có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome

ty thể là như nhau Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ranhững biểu hiện lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tớingưỡng đột biến Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến DNA tythể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể

1.2 Những nghiên cứu trên thế giới về đột biến DNA ty thể và bệnh ty thể

Theo Wallace D.C (1998) ,những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từđầu những năm 1980, và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới cácbệnh đã được tìm thấy Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnhgây ra do các hư hại trong quá trình tạo ATP Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhucầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein thamgia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa Số lượng các phân tử DNA ở các mô, các cơquan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởngnhiều nhất của đột biến DNA ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim,thận, gan, tụy Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái

và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi vàkhởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ Tuynhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh

ty thể đã có nhiều khả quan Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây chothấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến ở người,ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong quần cư dân ,theo Chinnery P.E (2000)

Hình 3 Các bệnh liên quan đến đột biến DNA ty thể [64]

Theo SolanoA (2001) Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến DNA ty thể gây racác bệnh ở người được phát hiện Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nàotrong cuộc đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi Ngoài ra,nhiều đột biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho mộtngười có thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình Các nghiên cứu cho thấy độtbiến DNA ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch Các đột biến

ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh

ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và ngoại biên

Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến DNA ty thể:

- Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểmgây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,G11778A và T14484C Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hôhấp Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giácchung giảm kèm chứng loạn màu sắc

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi độtbiến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V Người bệnh có biểu hiện chậm pháttriển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh

- Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hộichứng Leigh Người bệnh có biểu hiện đột biến thoái hóa thần kinh tiến triển, biểuhiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của hệthần kinh trung ương

Tạp chí New Scientist của Anh số ra ngày 27/9/2016, đăng tải công trình củabác sỹ John Zhang và cộng sự thuộc Trung tâm New Hope Fertility ở thành phố NewYork, phát triển thành công kỹ thuật mới cho ra một em bé đã chào đời khỏe mạnh nhờ

kỹ thuật mới, kết hợp DNA của 3 người gồm cặp bố mẹ và một người hiến tặngtrứng.Mẹ của bé là người Jordan, không may mang các gen gây hội chứng Leigh -chứng đột biến hệ thần kinh có thể gây tử vong hoặc di truyền sang thai nhi, và đãtừng sảy thai 4 lần

Cặp vợ chồng này sau đó đã tìm đến bác sỹ John Zhang thuộc Trung tâm NewHope Fertility ở thành phố New York với mong muốn có thể mang thai đứa con mangchính gen của họ nhưng không mắc căn bệnh di truyền nói trên Bác sỹ Zhang cùngcộng sự đã phát triển kỹ thuật mới có tên là truyền nhân non (spindle nuclear transfer),theo đó kết hợp ADN hạt nhân của người mẹ với ty thể của người hiến tặng trứng.

Các bác sỹ sau đó đã hút nhân trứng của người mẹ và chèn vào trứng của ngườihiến tặng vốn trước đó cũng đã được loại bỏ nhân Trứng kết hợp này, với ADN hạtnhân của người mẹ và ADN ty thể của người hiến tặng trứng, sau đó sẽ được thụ tinhvới tinh trùng của người bố

Các bước thực hiện gồm: Gỡ bỏ nhân của trứng hiến tặng, giữ lại toàn bộ bàoquan và ty thể; Chuyển nhân của trứng của mẹ vào trứng trên; Thụ tinh với tinh trùngcủa bố Em bé sinh tại Mexico vào ngày 6/4/2016, và sau hơn 5 tháng, bé phát triểntốt, không có dấu hiệu bệnh tật

Kỹ thuật này đã được nhóm nghiên cứu của ông khởi sự từ cuối những năm

1990 thực hiện trên động vật và đến nay mới áp dụng cho người Tất nhiên vớimtDNA ghép thì truy tìm phả hệ theo dòng mẹ sẽ gặp lúng túng

Cũng theo công trình nghiên cứu, kết quả xét nghiệm mới nhất cho thấy chỉ cóchưa đến 1% ty thể của bé trai ra đời bằng phương pháp kết hợp ADN này mang genđột biến

- Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu) Bệnh có các triệuchứng đột biến thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa

- Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây rabởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys) Người bệnh có biểu hiện taibiến, co giật

1.3.Tình hình nghiên cứu ở trong nước về đột biến mt DNA

Phạm Văn Chi (2006), cho đến nay các nghiên cứu về đột biến DNA ty thể ởngười Việt Nam vẫn chưa nhiều, số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống Phan

Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam

đã tìm thấy một số biến đổi của DNA ty thể ở người Việt Nam thuộc vùng D-loop, cácgen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII,COXIII, ATP6, ATP8 Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm thấy đột biến A3243G ởbệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến)

Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giảitrình tự DNA và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnhnhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếpDNA ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12

ca có đột biến DNA ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biếnnặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giảitrình tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop

ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa Liên quan đến xácđịnh đột biến DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết quả thu được cònrất ít Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân ungthư vú Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân) Kết quả phântích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop củabệnh nhân ung thư vú người Việt Nam

Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã chothấy đột biến DNA ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể vàbệnh ung thư cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não vànhược cơ

1.4 Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh

Các đột biến DNA ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), cácđặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến mộtmức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào Bởi vậy để chẩn đoán được bệnh

chính xác và kịp thời, người ta thường sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp DNA tythể.

- Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotideđoạn DNA mang đột biến Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiệnnay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi làphương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) Theo phươngpháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗiDNA bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với trình tự củamẫu tại vị trí đó Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ tác dụng của enzymeDNA polymerase Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, Ctrong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi Các đoạnngắn DNA mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnhthu được sẽ được dùng để phân tích trình tự DNA Ngày nay, phương pháp giải trình

tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bảnvẫn áp dụng nguyên lý như trên Người ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnhquang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạyrất cao

Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm độtbiến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm