Chuyển gen kháng sâu

Chuyển gen kháng sâu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO MÔN HỌC: VI SINH VẬT

“CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU………

 GVHD: TS Võ Thị Phương Khanh

 Học viên: Lớp: Sinh học thực nghiệm K2018

Chuyển Gen kháng sâu

Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm đáng kể năng suất cây trồng Việc phun thuốc trừ sâu gặp rất nhiều khó khăn vì sâu đục thân sống trong thân cây Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại Các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại

Việc c huyển nạp gen bằng cách gián tiếp thông qua vi khuẩn agrobacterium

Vi khuẩnBacillus thuringiensis (Bt)

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (viết tắt: Bt) là vi khuẩn Gram dương, và cũng là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức Bt được sử dụng để thử nghiệm chống sâu đục thân ở Ngô từ năm 1920

Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ Hình dạng tinh thể Bt rất đa dạng (một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài phụ) Phần lớn các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình tháp đôi, một số hình cầu và một số chủng có tinh thể với các hình dạng khác nhau

Đa dạng gen Cry

Để xác định sự tồn tại gen Cry trong các chủng Bt phân lập, người ta dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi được thiết kế từ gen Cry1 (mã hoá protein diệt côn trùng bộ cánh vẩy), gen Cry 3 (mã hoá protein diệt côn trùng cánh cứng) và Cry4 (mã hoá protein diệt côn trùng hai cánh) Các chủng Bt mang gen Cry nào thì ADN của chúng bắt cặp với cặp mồi đặc hiệu với gen đó

Đa dạng về gen Cry

Cho tới nay có hàng trăm gen Cry đã được công bố, tuy nhiên hầu hết mối quan tâm đều tập trung vào nhóm gen Cry1, Cry 3, Cry4

Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố: Ngoại độc tố α (α- exotoxin), ngoại độc tố β(β-exotoxin), ngoại độc tố γ(γ- exotoxin), nội độc tố δ (δ -endotoxin) Trong đó nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất

Đa dạng về thành phần protein

Thành phần protein tinh thể của Bt không những quyết định hoạt lực diệt côn trùng mà còn liên quan đến sự tồn tại các lớp gen Cry Các protein 130kDa, diệt côn trùng cánh vẩy do gen cry1 mã hoá Gen Cry 3 mã hoá protein có trọng lượng phân tử thấp hơn (66-73kDa), diệt côn trùng cánh cứng Protein tinh thể diệt côn trùng hai cánh đa dạng nhất bao gồm các protein 130 kDa, 128kDa, 67kDa, 28kDa do gen cry 4, cry 10, cry 11 mã hoá

Cơ chế tác động Bt

Bước 1: Xâm nhập vào các ấu trùng của côn trùng qua đường tiêu hóa

Bước 2: Protein Bt được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm (pH cao) trong ruột côn trùng Tinh thể độc bị thủy phân giải phóng các độc tố

Bước 3: Độc tố liên kết với tế bào ruột gây phân hủy tế bào ruột, chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương làm chúng ngừng ăn Sau đó một vài ngày chúng chết

Với khả năng sản sinh protein độc tố có khả năng diệt côn trùng, Bt đã và đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu và khám phá giá trị nông học của chúng Đến nay, hơn 200 loại protein của Bt đã được phát hiện với các nồng độ độc

tố diệt một số loài côn trùng khác nhau

Sản xuất Bt theo phương thức truyền thống

Bt có thể được nuôi cấu dễ dàng nhờ quá trình lên men Vì vậy, Bt đã được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt côn trùng từ hơn 40 năm nay ở nhiêu nơi trên thế giới Đặc biệt, Bt đã đem lại những lợi ích to lớn cho các nông trại hữu cơ vì

chúng được coi là một trong rất ít thuốc trừ sâu đạt tiêu chuẩn hữu cơ Tùy thuộc vào cấu trúc (dạng hạt hay dạng dịch) mà thuốc diệt côn trùng Bt được phun hay rắc

Tuy nhiên, vẫn tồn tại một số hạn chế nhất định đối với cả hai trường hợp ứng dụng này như thuốc diệt côn trùng Bt rất khó tiếp xúc với côn trùng đích ẩn sâu dưới lá, đất Những bất lợi này hoàn toàn được loại trừ nhờ công nghệ sinh học hiện đại

Phương pháp hiện đại

Các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen Bt mã hóa cho protein tinh thể độc

tố từ vi khuẩn Bt vào thực vật Cây trồng được chuyển gen Bt này sẽ có khả năng tự kháng lại sâu hại Các protein sản sinh trong thực vật không bị rửa trôi hay bị phân huỷ dưới ánh nắng mặt trời.Vì vậy, bất kể trong điều kiện sinh thái, khí hậu thế nào thì cây trồng vẫn được bảo vệ khỏi sự tấn công của sâu đục thân, hay đục quả

Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng trồng bắp cải cho thấy các chế phẩm Bt diệt được gần 90% sâu hại, so với gần 80% của thuốc

Biến nạp gen ở thực vật

Biến nạp gen (chuyển gen / kỹ thuật di truyền) ở thực vật là khái niệm dùng mô

tả quá trình chuyển một hoặc một số gen ngoại lai vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra một tính trạng mới mà trước đó cơ thể thực vật đó không có

Quá trình biến nạp gen được coi là thành công khi gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn định với ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp Tế bào biến nạp này sau đó được tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy trì ổn định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ tinh bình thường

Biến nạp gen

Giai đoạn 1 Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp) Trong giai đoạn này, gen mong muốn thường được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật

Giai đoạn 2 Giai đoạn tái sinh cây Trong giai đoạn này, các mô tế bào được

chuyển gen được chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây

Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công

Cấu trúc của véctơ chuyển gen

Có một đoạn ADN khởi động (promoter) Đây là một đoạn ADN có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã Nó thường có một vị trí bám cho enzym ARN

polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển / điều hoà quá trình phiên mã (CaMV-35S-promoter, nos-promoter …)

Thiết kế véctơ Ti plasmid mang gen biến nạp

Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

ADN nhân VK

Enzym giới hạn A Enzym giới hạn A

Tế bào cho gen biến

nạp

Hệ ADN gen

nhân mang gen

biến nạp

Gen biến nạp

Plasmid trống (đã được loại bỏ các gen gây khối u - Onc)

Ti plasmid mang gen biến nạp

Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật và tái sinh cây

Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Ti plasmid mang gen biến nạp

Tế bào thực vật

ADN nhân

Gen chuyển nạp

QUÁ TRÌNH BIẾN

NẠP

Tế bào mang gen chuyển nạp phân chia

Cây chuyển gen

Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Bđã được biến nạp các plasmid mang gen Bt.

Các bước thực hiện phương pháp chuyển gen Bt nhờ Agrobacterium

Thiết kế véctơ mang gen biến nạp

 Nhân (tách dòng – cloning) véctơ nhờ vi khuẩn E coli

Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E coli sang Agrobacterium

Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào/mô thực vật

để tiến hành quá trình chuyển gen biến nạp sang mô/tế bào đích

Chọn lọc các tế bào/mô đã được biến nạp thành công

Tái sinh mô/tế bào đã được biến nạp thành công thành cây biến nạp hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp)

1 Số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp Do

vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả

năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao.

2 Tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm.

3 Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện

4 Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

Nhược điểm

Ưu điểm

Phương pháp này được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm Nhưng hiệu quả chuyển gen ở các cây một lá mầm còn thấp

Trong khi nhiều cây một lá mầm là những cây lương thực quan trọng như lúa, ngô, lúa mỳ

Phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn Agrobacterium