NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CHLOROPHYLL, CAROTENOID VÀ XÁC ĐỊNH ALEN KHÁNG MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA TRONG ĐIỀU KIỆN MẶN Lã Tuấn Nghĩa, Lê Thị Thu Trang I.. Chính vì vây, việc tìm ra
Trang 1NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CHLOROPHYLL, CAROTENOID VÀ XÁC ĐỊNH ALEN KHÁNG MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA TRONG ĐIỀU KIỆN MẶN
Lã Tuấn Nghĩa, Lê Thị Thu Trang
I MỞ ĐẦU
Lúa là cây lương thực rất mẫn cảm với môi trường mặn (Ashraf, 2009) Chính vì vây, việc tìm ra giống lúa có khả năng chịu mặn, năng suất cao và có phẩm chất gạo ngon là vấn đề không đơn giản cần phẩn tập trung đầu tư nghiên cứu với nhiều biện pháp đồng bộ; trong đó tạo giống chống chịu là khâu then chốt
Mặn làm ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh hóa của cây đặc biệt là quá trình quang hợp của lúa Hai chất chlorophyll (chlorophyll a, chlorophyll b) và carotenoid đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình quang hợp của cây, trong đó có cây lúa Qua các nghiên cứu cho thấy rằng khi bị mặn (xử lý mặn), quá trình quang hợp của cây bị suy giảm; sự suy giảm này là do khí khổng bị đóng hoặc có sự tác động trực tiếp của các ion muối lên bộ máy quang hợp Kết quả là làm ức chế sự phát triển của cây, nhất là đối với lá và đặc biệt người ta quan sát thấy sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll cũng như carotenoid Chính vì vậy hai chất này đã được xem như là một yếu tố quan trọng trong phân tích tính chịu mặn ở các giống lúa (N.T.T.Hoai, 2005)
Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, các nhà chọn tạo giống cây trồng đang ứng dụng công nghệ chỉ thị phân tử để nâng cao hiệu quả và nhanh chóng chọn ra những giống cây trồng có đặc tính mong muốn Công nghệ chỉ thị phân tử cũng đang được áp dụng trong chọn tạo giống lúa chịu mặn và đã đạt được kết quả rất khả quan (Lang và cs., 2001) Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gien chịu mặn đã được xác định, chúng ta có thể xác định được những alen kháng mặn trong các giống lúa truyền thống hoặc các dòng lúa chọn tạo mới, từ đó chọn được các giống/dòng
có khả năng kháng mặn phục vụ cho sản xuất
Để góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, chúng tôi đã tiến hành:
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng chlorophyll, carotennoid và xác định alen kháng mặn ở một
số giống lúa trong điều kiện mặn, với mục tiêu là xem xét sự thay đổi hàm lượng các chất
chlorophyll, carotennoid trong điều kiện xử lý mặn và sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen/QTL kháng mặn để tìm trong số các giống lúa nghiên cứu những giống nào mang alen kháng, từ đó lựa chọn chúng phục vụ cho công tác chọn tạo giống láu chịu mặn
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 Vật liệu nghiên cứu
54 giống lúa (bảng 1) sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên thực vật; hai giống đối chứng là: IR28 (giống chuẩn nhiễm) Pokkali (giống chuẩn kháng)
Chỉ thị RM223 liên kết với gen/QTL kháng mặn trên nhiễm sắc thể số 8 được sử dung để ác định alen kháng mặn
Trang 2Bảng 1 Danh sách các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu
3 148 Lốc mỡ Hà Tĩnh 30 3443 Nước mặn Quảng Trị
10 1234 Ré quảng Hà Tĩnh 37 6182 Hom râu
18 3365 Lúa chùm đỏ dạng 1 45 6234 Lúa chăm biển
2 Phương pháp nghiên cứu
- Đánh giá khả năng kháng mặn: được tiến hành theo phương pháp của IRTP,1988 và Lee,
1995 ở giai đoạn mạ 20 ngày tuổi
- Xác định hàm lượng chlorophyll, carotenoid: Nồng độ chlorophyll (chlorophyll a,
chlorophyll b) và carotenoid được đo theo phương pháp của Chappelle và cs (1992) và Lichtenthaler (1987)
Phương pháp cơ bản như sau: ngâm lá mạ trong dung dịch dimethyl sulfoxide ở 30oC trong tối trong 24 giờ Nồng độ của các sắc tố được tính dựa theo độ hấp thụ ở bước sóng 662, 644 và 470nm và được tính theo công thức:
Trang 3Chla = 9.784D662 - 0,99D644 Chlb = 21.42D644 – 4.65D662
TC = Chla + Chlb
Cx+c = (1000D470 – 1.90Chla – 63.14 Chlb)/ 214 (D: Độ hấp thụ; nồng độ của sắc tố được tính mg/ml dịch chiết)
- Tách chiết ADN tổng số: theo phương pháp của Keb- Lbanes (2002)
- Phương pháp PCR: Phản ứng PCR với mồi SSR được thực hiện trong thể tích 20 µl với
các thành phần: 12,5 µl nước, 2µl PCR buffer 10X có 15 mM MgCl2; 2µl dNTP mix 1mM; 1µl
đoạn mồi xuôi (nồng độ 5µM), 1µl đoạn mồi ngược (nồng độ 5µM), 0,5µl Taq DNA polymerase (5
đơn vị/µl) và 1µl ADN (20ng/µl); được tiến hành trên máy chu trình nhiệt B Vertity theo chu trình nhiệt sau: 95 C trong 5 phút; 35 chu trình: 94 C trong 1 phút, 55 C trong 1 phút, 72 C trong 1 phút,
để ở 72 C trong 7 phút, sau đố bảo quản tại 4 C Sản phẩm PCR được điện di trên gel garose 3% ở điều kiện 100V trong 120 phút Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide và soi chụp ảnh bằng máy soi UV Transilluminator
- Phương pháp phân tích số liệu: sử dụng Excel 2007, IRRIST R 5.0 để phân tích thống kê
(Nguyễn Huy Hoàng và CS, 2011)
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Xác định hàm lƣợng chlorophyll, carotenoid
1.1 Khả năng kháng mặn của các giống lúa nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng phương pháp của IRTP,1988 và Lee, 1995 để tiến hành đánh giá khả năng kháng mặn của các giống lúa nghiên cứu khi mạ được 3 tuần tuổi trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida với nồng độ 100mM NaCl Kết quả đánh giá được ghi nhận ở hai thời điểm sau: 06 ngày và 12 ngày sau khi xủ lý mặn:
- Sau 6 ngày xử lý các giống lúa đã thể hiện khả năng chống chịu khác nhau và được xếp vào các nhóm như sau:
+ Nhóm có khả năng chịu mặn tốt (điểm 1), gồm 16 giống: Lốc mỡ Hà Tĩnh, Chiêm trắng,
Hom trụ, Lúa ngoi1, Bầu quái, Nước mặn Huế, Su dạng 1, Chành trụi, Hom râu 2, Nếp ngoi, Cườm dạng 1, Cườm dạng 2, Nếp cúc, Dự thơm, Hẻo tía, Pokkali
+ Nhóm có khả năng chịu mặn khá (điểm 3), gồm 19 giống lúa: Chớp Thanh Hóa, Chiêm
râu, Chanh 162, Hom râu 1, Lúa ven dạng 1, Quảng trắng, Chiêm rong, Lúa chăm biển, Mành ré, Ré quảng Hà Tĩnh, Nước mặn, Hau trắng, Nước mặn dạng 2, Nếp râu, Ngoi tía, Nếp nàng mây, Ré trắng, Nếp quắn , Chiêm cũ
+ Nhóm có khả năng chịu mặn trung bình (điểm 5), gồm 16 giống: Câu Thái Bình, Tẻ tép,
Cút Hải Dương, Tép Hải Dương, Tép trắng, Bầu Hà Đông, Bầu Hải Dương, Lúa chùm đỏ dạng 1, Lúa đỏ, Tẻ chăm, Su trắng, Hom đỏ, Nước mặn Quảng trị, Nước mặn dạng 1, Lúa ngoi 2, Lúa chăm
+ Nhóm gồm 3 giống chịu mặn kém (điểm 7), gồm 03 giống: Tiêu mặn, Ven đỏ, IR28
- Sau 12 ngày xử lý các giống lúa đã thể hiện khả năng chống chịu khác nhau và được xếp vào các nhóm như sau:
Trang 4+ Nhóm có khả năng chịu mặn tốt (điểm 3), gồm 22 giống: Lốc mỡ Hà Tĩnh, Chiêm trắng,
Lúa ngoi1, Bầu quái, Nước mặn Huế, Su dạng 1, Chành trụi,Hom râu 1, Hom râu 2, Nếp ngoi, Cườm dạng 1, Cườm dạng 2, Nếp cúc, Dự thơm, Hẻo tía, Pokkali, Lúa ven dạng 1, Quảng trắng, Chiêm rong, Lúa chăm biển, Mành ré, Chiêm cũ
+ Nhóm có khả năng chịu mặn trung bình (điểm 5), gồm 15 giống: Hom trụ, Ré quảng Hà
Tĩnh, Nước mặn, Hau trắng, Lúa đỏ, Su trắng, Nước mặn dạng 2, Nước mặn dạng 1, Nếp râu, Lúa ngoi 2, Ngoi tía, Nếp nàng mây, Ré trắng, Nếp quắn, Tẻ chăm
+ Nhóm có khả năng chịu mặn kém (điểm 7), gồm 11 giống: Chớp Thanh Hóa, Tẻ tép, Cút
Hải Dương, Chiêm râu, Tép Hải Dương, Chanh 162, Bầu Hà Đông, Bầu Hải Dương, Lúa chùm đỏ dạng 1, , Nước mặn Quảng Trị, Lúa chăm
+ Nhóm bị nhiễm mặn, hầu hết các cây đều chết (điểm 9), gồm 6 giống: Câu Thái Bình, Tiêu
mặn, Tép trắng, Hom đỏ, Ven đỏ, IR28
Bên cạnh một số giống giảm nhẹ khả năng chống chịu mặn như Bầu quái, Nước mặn Huế, Chành trụi, Hom râu 2, Hẻo tía.v.v., một số giống lúa có mức chống chịu không cao (trung bình) lại khá ổn định trong điều mặn như: Tẻ chăm, Lúa đỏ, Su trắng, Nước mặn dạng 1.v.v
1.2 Hàm hàm lương chlorophyll, carotenoid
Chúng tôi tiến hành đo hàm lượng cholorophyll và carotenoid trong lá để xem xét mối quan
hệ giữa hàm lượng này và khả năng chịu mặn của các giống lúa theo phương pháp của Chappelle và
cs (1992) và Lichtenthaler (1987) Kết quả thu được thể hiện qua bảng 2a, 2b và 2c
Trang 5Bảng 2a Khả năng chịu mặn, hàm lƣợng chlorophyll ( Chl a, Chl b ) và carotenoid ( C x+c ) của các giống lúa nghiên cứu
TT Tên giống
Điểm đánh giá
Khả năng chịu mặn sau 12 ngày xử lý mặn
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 0mM NaCl
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 100mM NaCl Sau 6
ngày
xử lý mặn
Sau 12 ngày
xử lý mặn
Trang 6Bảng 2b Khả năng chịu mặn, hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c của các giống lúa nghiên cứu (tiếp theo)
TT Tên giống
Điểm đánh giá
Khả năng chịu mặn sau 12 ngày xử lý mặn
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 0mM NaCl
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 100mM NaCl Sau 6
ngày
xử lý mặn
Sau 12 ngày
xử lý mặn
Trang 7Bảng 2c Khả năng chịu mặn, hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c của các giống lúa nghiên cứu (tiếp theo)
TT Tên giống
Điểm đánh giá
Khả năng chịu mặn sau 12 ngày xử lý mặn
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 0mM NaCl
Hàm lƣợng Chl a, Chl b và C x+c
Trong điều kiên xử lý 100mM NaCl Sau 6
ngày
xử lý mặn
Sau 12 ngày
xử lý mặn
Trang 8Quan sát ở các bảng 2a,2b và 2c chúng tôi thấy nồng độ các sắc tố quang hợp trong các giống lúa nghiên cứu giảm đáng kể trong điều kiện mặn (khi xử lý với nồng độ 100mM NaCl) Tuy nhiên, ở những giống có khả năng chịu mặn từ khá trở lên như: Bầu quái, Lúa ngoi, Hom râu 2,.v.v hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid giảm ít hơn và được duy trì tốt hơn so với những giống mẫn cảm như Ven đỏ, Hom đỏ, Tiêu mặn, IR28 v.v
Tỷ lệ suy giảm hàm lượng chlorophyll a ở các giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau là khác nhau Ở nhóm giống kháng mặn tốt tỷ lệ suy giảm hàm lượng Chlorophyll a biến động từ 11,38- 26,82%, trong khi đó nhóm giống mẫn cảm (nhiễm mặn) tỷ lệ này biến động từ 19,09- 45.36% Bên cạnh đó, tỷ lệ suy giảm Chlorophyll b trong nhóm giống chịu mặn tốt biến động là 11.08- 26.82%, còn ở nhóm giống mẫn cảm thì tỷ lệ này biến động là 11.56 – 45.36% (Bảng 2) Điều này chứng tỏ có mối liên hệ giữa hàm lượng chlorophyll và carotenoid của các giống lúa với khả năng chịu mặn của chúng Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của: Kongake Siringam và cs., 2009; Cha-um và cs., 2007; N.T.T.Hoai và cs., 2005, Pinheiro và cs., 2008 cho thấy các sắc tố quang hợp trong lá bị giảm trong điều kiện bị tác động mặn
2 Xác định alen kháng mặn ở các giống lúa nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử RM223 liên kết với gen/QTL Saltol kháng mặn trên nhiễm sắc thể số 8 (Lang và cs., 2001) để xác định sự có mặt của alen kháng mặn trong bộ giống lúa nghiên cứu
Hình 1 Sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu sử dụng mồi RM223 liên kết với gen
kháng mặn trên nhiễm sắc thể số 8
Ghi chú: Băng ADN nằm phía trên ảnh điện di có kích thước là 160bp và phía dưới có kích là 140bp Thứ tự các cột gồm: 1 là giống IR28; 2 là giống Pokkali; từ 3-54 là các giống lúa nghiên cứu tương ứng với số thứ tự giống từ 1- 52 trong bảng 1
Kết quả đã xác định 37 giống có alen kháng mặn (xuất hiện băng ADN có kích thước 140bp
tương ứng với giống chuẩn kháng Pokkali), đó là các giống: Lốc mỡ Hà Tĩnh, Lúa ngoi
1(SĐK2371), Bầu quái, Nước mặn Huế, Su dạng 1, Chành trụi, Hom râu 2, Nếp ngoi, Cườm dạng 1, Cườm dạng 2, Nếp cúc, Dự thơm, Hẻo tía, Chiêm trắng, Hom trụ, Ré quảng Hà Tĩnh, Nước mặn, Hau trắng, Lúa đỏ, Lúa ven dạng 1, Nếp râu, Lúa ngoi 2 (SĐK 4705), Hom râu 1, Chiêm rong, Ngoi tía, Lúa chăm biển, Nếp nàng mây, Ré trắng, Nếp quắn, Mành ré, Chiêm cũ, Tẻ chăm 37 giống này
có sự biểu hiện kiểu hình kháng mặn từ trung bình trở lên 17 giống còn lại không có alen kháng mặn (xuất hiện băng có kích thước 160bp tương ứng với giống chuẩn nhiễm IR28), phần lớn các giống này biểu hiện kiểu hình từ nhiễm đến rất nhiễm
Trang 9Kết quả này cho thấy một số giống lúa có thể mang gen/QTL Saltol kháng mặn và chúng có thể sử dụng trong khai thác và phát triển nguồn gen trong công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn mới
IV KẾT LUẬN
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng các chất chlorophyll (chlorophyll a, chlorophyll b), carotenoid và xác định các alen kháng mặn ở các giống lúa chúng tôi đã rút ra các kết luân sau:
1 Hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid của các giống lúa nghiên cứu giảm đáng kể trong điều kiện bị tác động mặn (với nồng độ xử lý 100mM NaCl trong 6 và 12 ngày)
Ở những giống lúa có khả năng chịu mặn từ khá trở lên như: Bầu quái, Lúa ngoi, Cườm dạng 2, Hom râu.v.v nồng độ chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid giảm ít hơn so với những giống mẫn cảm như: Ven đỏ, Tiêu mặn,.v.v Nồng độ chlorophyll a đã giảm tối đa 26,82% ở những giống chịu mặn tốt và 45,36 % ở những giống nhiễm mặn
2 Sử dụng chỉ thị RM223 liên kết gen/QTL Saltol kháng mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 8
đã nhận dạng được 37 giống có alen kháng mặn (xuất hiện các băng ADN có kích thước 140bp tương ứng alen/băng DN ở giống chuẩn kháng Pokkali) Các giống này có sự biểu hiện kiểu hình
từ kháng mặn trung bình trở lên 17 giống không có alen kháng mặn (xuất hiện băng ADN có kích thước 160bp tương ứng với giống chuẩn nhiễm IR28), phần lớn các giống này có biểu hiện kiểu hình từ nhiễm đến rất nhiễm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ashraf, M 2004 Some important physiological selection criteria for salt tolerance in plants
Flora, 199(5): 361-376
2 Chappelle EW, Kim MS, Mc Murtrey JE (1992), “Ratio analysis of reflectance spectra
(RARS): an algorithm for the remote estimation of the concentrations of chlorophyll a, chlorophyll b, and carotenoids in soybean leaves”, Remote Sens Environ 39: 239-247
3 Cha-um, S., K Supaibulwatana and C Kirdmanee 2007a Glycinebetaine accumulation,physiological characterizations and growth efficiency in tolerant and
salt-sensitive lines ofindica rice (Oryza sativa L ssp indica) in response to salt stress J Agron
Crop Sci., 193: 157-166
4 IRTP (International Rice Testing Programme) (1988), “Standard Evaluation System for
Rice”, IRRI, Manila, Philippines, pp 123
5 Keb- Llanes et al (2002), “Plant DNA Extraction Protocol”, Plant Molecular Biology
Reporter 20, 229a-299 pp
6 Kongake Siringam, Niran Juntawong, Suriyan Cha-um and Chalermpol Kirdmanee (2009)
“Relationships between sodium ion accumulation and physiological characteristics in rice
(Oryxa sativa L SPP Indica) seedlings grown under iso-osmotic salinity stress”, Pak.J.Bot.,
41(4): 1837-1850
7 Lang NT, S Yanagihara, BC Buu 2001a A microsatellite marker for a gene conferring salt tolerance on rice at the vegetative and reproductive stages SABRAO 33(1):1-10
Trang 108 Lee K (1995), “Variability and genetics of salt tolerance in japonica rice (Oryza sativa L.)”, Doctor Thesis University of Philipines
9 Lichtenthaler, H.K 1987 Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic
biomembranes Method Enzymol., 148: 350-380
10 N.T.T Hoai, I.S Shim, K Kobayashi, K Usui 2005 The effects of salt stress on ion
accumulation and antioxidative enzyme activities of Oryza sativa L and Echinochloa
oryzicola Vasing Weed Biology and Management; 5: 1-7
11 Pinheiro, H.A., J.V Silva, L Endres, V.M Ferreira, C.A Camara, F.F Cabral, J.F Oliveira,L.W.T de Carvalho, J.M dos Santos and B.G dos Santos Filho 2008 Leaf gas
exchange, chloroplast pigments and dry matter accumulation in castor bean (Rinicus
communis L) seedlings subjected to salt stress conditions Ind Crop Prod., 27: 385-392