Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây thuốc thượng (phaeanthus vietnamensis ban; họ na annonaceace)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NGUYỄN TRUNG TƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG Phaeanthus vietn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

NGUYỄN TRUNG TƯỜNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC

CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG

(Phaeanthus vietnamensis Ban, họ Na – Annonaceace)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

NGUYỄN TRUNG TƯỜNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC

CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG

(Phaeanthus vietnamensis Ban, họ Na – Annonaceace)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 9720206

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Thanh Kỳ

TS Nguyễn Xuân Nhiệm

HÀ NỘI, NĂM 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án tại Viện Dược liệu, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Thanh Kỳ và TS Nguyễn Xuân Nhiệm, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ

và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận án

Xin bày tỏ lòng cảm ơn tới: PGS.TS Phạm Thanh Huyền, TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, ThS Nguyễn Quỳnh Nga, ThS Hoàng Văn Toán - Viện Dược liệu; TS Bùi Văn Thanh - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; TS Nguyễn Hoàng Ngân - Học viện Quân y đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thiện luận án

Xin trân trọng cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Tài nguyên dược liệu, Phòng Quản lý khoa học và đào tạo - Viện Dược liệu; Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Dược lý, Bộ môn Giải phẫu bệnh - Học viện Quân y; Khoa Dược - Viện YHCT Quân đội; Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và cộng tác để hoàn thành luận án

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, chia sẻ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án này

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Tác giả Nguyễn Trung Tường

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận

án này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

Mục lục I Danh mục các bảng VI Danh mục các hình VIII

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1- TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố chi Phaeanthus Hook f & Thomson 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Phaeanthus Hook f & Thomson 3

1.1.2 Phân bố và thành phần loài của chi Phaeanthus Hook f & Thomson 6

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Phaeanthus Hook f & Thomson 8

1.2 Thành phần hóa học 9

1.3 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian 16

1.4 Tác dụng sinh học 16

1.4.1 Tác dụng chống viêm 16

1.4.2 Tác dụng giãn mạch máu 17

1.4.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng 18

1.4.4 Tác dụng chống oxy hóa 20

1.4.5 Tác dụng gây độc tế bào ung thư 20

1.4.6 Tác dụng trên hệ miễn dịch 21

1.4.7 Tác dụng trong bệnh loét dạ dày và chống trầm cảm 22

1.5 Vài nét về cây thuốc Thượng ở Việt Nam 22

1.5.1 Phân bố 23

1.5.2 Công dụng theo dân gian 23

1.5.3 Những nghiên cứu về cây thuốc Thượng ở Việt Nam 24

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thẩm định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học 28

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 29

2.2.3 Thử độc tính và một số tác dụng sinh học 38

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 49

Chương 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 50

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 50

3.1.2 Thẩm định tên khoa học 51

3.1.3 Đặc điểm giải phẫu 52

3.1.4 Đặc điểm bột rễ, thân, lá 54

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 56

3.2.1 Hợp chất PV1: (7S,8R,8'R)-3,5,3′,5'-tetramethoxy-4,4',7-trihydroxy-9,9'-epoxylignan (chất mới) 57

3.2.2 Hợp chất PV2=TC5: 8R,8′R-bishydrosyringenin 64

3.2.3 Hợp chất PV3=TC6:(+)-5,5'-dimethoxylariciresinol 66

3.2.4 Hợp chất PV4: (+)-pinoresinol 68

3.2.5 Hợp chất PV5: 8α-hydroxyoplop-11(12)-en-14-on (chất mới) 70

3.2.6 Hợp chất PV6: spathulenol 77

3.2.7 Hợp chất PV7: 1αH,5βH-aromandendrane-4β,10α-diol 79

3.2.8 Hợp chất PV8 = TC1: 1αH,5βH-aromandendrane-4α,10α-diol 80

3.2.9 Hợp chất PV9: 1βH,5βH-aromandendrane-4α,10β-diol 82

3.2.10 Hợp chất PV10: 3α,4β-dihydroxybisabola-1,10-dien 84

3.2.11 Hợp chất PV11: nerolidol 86

3.2.12 Hợp chất PV12:(1R,2S,4S)-2-E-cinnamoyloxy-4-acetyl-1- methylcyclohexan-1-ol (chất mới) 88

3.2.13 Hợp chất PV13=TC2: N-methylcorydaldin 94

3.2.14 Hợp chất PV14=TC3: thalifolin 95

3.2.15 Hợp chất PV15 = TC4: moupinamid 97

3.3 Kết quả nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học 99

3.3.1 Độc tính cấp và bán trường diễn của CL1 và CL2 99

3.3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao lỏng CL1 và CL2 107

3.3.3 Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của cao lỏng CL1 và CL2 113

3.3.4 Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được 116

3.3.5 Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được 118

Chương 4- BÀN LUẬN 119

4.1 Về thực vật học 119

4.2 Về thành phần hóa học 120

4.3 Về độc tính và tác dụng sinh học 125

4.3.1 Độc tính cấp 126

4.3.2 Độc tính bán trường diễn 127

4.3.3 Tác dụng chống viêm 127

4.3.4 Tác dụng giảm đau 131

4.3.5 Hoạt tính của các hợp chất phân lập được từ cây thuốc Thượng 133

KẾT LUẬN 138

1.1.Về thực vật học 138

1.2.Về thành phần hóa học 138

1.3.Về độc tính và tác dụng sinh học 138

KIẾN NGHỊ 140

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 141

TÀI LIỆU THAM KHẢO 142

Danh mục chữ viết tắt

Cộng hưởng từ hạt nhân proton

cell

Tế bào ung thư phổi

System

Hệ thống phân loại thực vật có hoa hiện đại

NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory

drugs

Thuốc chống viêm không steroid

Tế bào ung thư gan người

leukemia cell

Tế bào ung thư bạch cầu người

Connectivity

Tương tác dị nhân đa liên kết

HSQC Heteronuclear Single-Quantum

Coherence

Tương tác dị nhân lượng tử đơn

thử nghiệm

carcinoma cell

Tế bào ung thư biểu mô người

người

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Phaeanthus 7

Bảng 1.2 Các alcaloid benzyl isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus 10 Bảng 1.3 Các alcaloid isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus 12

Bảng 1.4 Các alcaloid khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus 13

Bảng 1.5 Các hợp chất khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus 14

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV1 59

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV2 và hợp chất tham khảo 65

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV3 và hợp chất tham khảo 67

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV4 và hợp chất tham khảo 69

Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV5 và hợp chất tham khảo 71

Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV6 và hợp chất tham khảo 78

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV7 và hợp chất tham khảo 80

Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV8 và hợp chất tham khảo 81

Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV9 và hợp chất tham khảo 83

Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV10 và hợp chất tham khảo 85

Bảng 3.11 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV11 và hợp chất tham khảo 86

Bảng 3.12 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV12 90

Bảng 3.13 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV13 và hợp chất tham khảo 95

Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV14 và hợp chất tham khảo 96

Bảng 3.15 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV15 và hợp chất tham khảo 98

Bảng 3.16 Độc tính cấp theo đường uống của CL1 trên chuột nhắt trắng (n=12) 99

Bảng 3.17 Độc tính cấp theo đường uống của CL2 trên chuột nhắt trắng (n=12) 101

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với điện tim chuột cống (n=8) 103

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên một số chỉ tiêu huyết

học (n=8) 104

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với chức năng gan và

thận (n=8) 105Bảng 3.21 Đường kính khớp cổ chân của chuột cống trắng (n=10) 108

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới tỷ lệ % tăng thể tích bàn

chân chuột cống (n=10) 110Bảng 3.23 Tỷ lệ % ức chế phù bàn chân chuột cống (I%) (n=10) 111Bảng 3.24 Tác dụng giảm khối lượng u hạt của các cao lỏng (n=10) 112Bảng 3.25 Ngưỡng đau của tổ chức viêm cấp bàn chân chuột cống trong đánh

giá tác dụng của cao lỏng CL1 và CL2 (n=10) 113 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới số cơn đau quặn của

chuột nhắt trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic (n=10) 114

Bảng 3.27 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới thời gian đáp ứng đau

của chuột nhắt trắng (n=10) 115Bảng 3.28 Tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất 117Bảng 3.29 Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất 118

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây thuốc Thượng 36

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ thân cành cây thuốc Thượng 37

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái cây thuốc Thượng 50

Hình 3.2 Vi phẫu rễ cây thuốc Thượng 52

Hình 3.3 Vi phẫu thân cây thuốc Thượng 53

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá cây thuốc Thượng 54

Hình 3.5 Đặc điểm bột rễ cây thuốc Thượng 55

Hình 3.6 Đặc điểm bột thân cây thuốc Thượng 55

Hình 3.7 Đặc điểm bột lá cây thuốc Thượng 56

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của PV1 và hợp chất tham khảo (PV1a) 57

Hình 3.9 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV1 58

Hình 3.10 Phổ CD của hợp chất PV1 58

Hình 3.11 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV1 60

Hình 3.12 Phổ 1H-NMR của hợp chất PV1 60

Hình 3.13 Phổ 13C-NMR của hợp chất PV1 61

Hình 3.14 Phổ HSQC của hợp chất PV1 61

Hình 3.15 Phổ HMBC của hợp chất PV1 62

Hình 3.16 Phổ COSY của hợp chất PV1 62

Hình 3.17 Phổ NOESY của hợp chất PV1 63

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất PV2 64

Hình 3.19 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV3 66

Hình 3.20 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV4 68

Hình 3.21 Cấu trúc hóa học của hợp chất PV5 và hợp chất tham khảo 70

Hình 3.22 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV5 72

Hình 3.23 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV5 72

Hình 3.24 Phổ 1H-NMR của hợp chất PV5 73

Hình 3.25 Phổ 13C-NMR của hợp chất PV5 73

Hình 3.26 Phổ DEPT của hợp chất PV5 74

Hình 3.27 Phổ HSQC của hợp chất PV5 74

Hình 3.28 Phổ HMBC của hợp chất PV5 75

Hình 3.29 Phổ COSY của hợp chất PV5 75

Hình 3.30 Phổ NOESY của hợp chất PV5 76

Hình 3.31 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV6 77

Hình 3.32 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV7 79

Hình 3.33 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV8 80

Hình 3.34 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV9 82

Hình 3.35 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV10 84

Hình 3.36 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV11 86

Hình 3.37 Cấu trúc hóa học của hợp chất PV12 88

Hình 3.38 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV12 89

Hình 3.39 Phổ CD của PV12 và phổ tính toán ECD của PV12a, PV12b 89

Hình 3.40 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV12 90

Hình 3.41 Phổ 1H-NMR của hợp chất PV12 91

Hình 3.42 Phổ 13C-NMR của hợp chất PV12 91

Hình 3.43 Phổ HSQC của hợp chất PV12 92

Hình 3.44 Phổ HMBC của hợp chất PV12 92

Hình 3.45 Phổ COSY của hợp chất PV12 93

Hình 3.46 Phổ ROESY của hợp chất PV12 93

Hình 3.47 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV13 94

Hình 3.48 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV14 95

Hình 3.49 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV15 97

Hình 3.50 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 lên số chuột chết 100 Hình 3.51 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên thể trọng chuột cống 102

Hình 3.52 Hình ảnh giải phẫu mô bệnh học gan, lách, thận chuột (HE x 400) 107Hình 3.53 Hình ảnh vi thể (HE x 100) khớp cổ chân sau trái chuột cống 109

Hình 4.1 Cấu trúc của 15 hợp chất phân lập được từ Phaeanthus vietnamensis

thu hái ở Đà Nẵng - Việt Nam 121

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nguồn thực vật rất đa dạng

và phong phú Nhân dân ta đã biết sử dụng cây cỏ để phòng và chữa bệnh từ lâu đời, nhưng cho tới nay phần lớn các cây thuốc vẫn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian tùy theo từng địa phương, chưa được nghiên cứu một cách hệ thống đầy

đủ, nhất là về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) là 1 loài đặc hữu của Việt

Nam, được phân bố tại Trung Bộ Việt Nam: Thừa Thiên-Huế (Phú Lộc), Quảng Nam-Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn) Dân gian dùng nước của lá non nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ; vỏ rễ, vỏ thân, lá đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy; dùng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, cầm máu vết thương ngoài da…[8]

Từ trước tới nay chỉ có một vài nghiên cứu về cây thuốc Thượng P

vietnamensis cho các kết quả: Về thành phần hóa học đã phân lập được các hợp

chất: N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolon; N-methylcorydaldin; argentinin; atherosperminin; petalinemethin; 1S,1'R-(-)-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin, 1S, 1'R- (-)-7-O-methylgrisabin, pinoresinol, lyoniresinol và syringaresinol Về tác dụng

sinh học: Phát hiện alcaloid toàn phần chiết từ lá cây thuốc Thượng có hoạt tính

kháng khuẩn Trong đó, alcaloid phân lập được 1S,

1'R-(-)-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối

thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm [11] [70]

Với mục đích nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thuốc Thượng, luận án được thực hiện

với tên: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng

sinh học của cây thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban, Họ Annonaceae)” với 3 mục tiêu:

Na Thẩm định tên khoa học và xác định đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu

- Chiết xuất và phân lập một số chất trong các bộ phận của cây

- Thử độc tính và một số tác dụng sinh học (chống viêm, giảm đau, gây độc một số dòng tế bào ung thư)

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố chi Phaeanthus Hook f

& Thomson

1.1.1 Vị trí phân loại chi Phaeanthus Hook f & Thomson

Chi Phaeanthus được Hook f & Thomson (1855) đặt tên và mô tả lần đầu với loài chuẩn là Phaeanthus nutans Hook f & Thomson [43] Chi này có các

đặc điểm đặc trưng của họ Na-Annonaceae như lá nguyên, mọc cách, xếp thành

2 dãy, bao hoa mẫu 3, nhị nhiều, hướng ngoài; lá noãn nhiều, rời; quả gồm nhiều phân quả trên đế quả lồi [43]

Họ Na-Annonaceae có khoảng 2.400 loài thuộc 107 chi, phân bố ở vùng nhiệt đới trên toàn thế giới Do số lượng loài lớn, có khá nhiều hệ thống phân loại dành cho họ Na như các hệ thống của Bentham & Hooker (1872), King (1892, 1893), Boerlage (1899), Engler & Diels (1900), Hutchinson (1923, 1964), Sinclair (1955), Fries (1959), Walker (1971) Trừ hệ thống của Walker (1971) các tác giả trên đều xây dựng hệ thống của mình dựa trên đặc điểm của hoa và quả [1]

Hooker & Thomson (1855) xếp chi Phaeanthus vào tông Guatterieae trong

họ Annonaceae dựa trên các đặc điểm phân quả chín rời nhau; cánh hoa xếp van; nhị xếp dày đặc; gốc cánh hoa trong không thót lại thành móng, cánh hoa trong

không dày hơn cánh hoa ngoài Chi Phaeanthus phân biệt với các chi khác trong

tông ở đặc điểm cánh hoa phẳng, mỏng hoặc chất da, số lượng noãn xác định, cánh hoa ngoài nhỏ gần giống như lá đài [43]

Nhiều quan điểm khác nhau được đưa ra về mối quan hệ của chi trong họ Annonaceae Dựa trên các phân tích hoa và quả Van Zuilen (1996) đặt chi

Phaeanthus Hook.f & Thomson trong nhóm không chính thức cùng với các chi Annickia, Enicosanthum, Ephedranthus, Malmea, Marsypopetalum, Neo-uvaria, Pseudephedranthus, Trivalvaria và Woodiellantha, trong đó một số chi gần đây

đang được xem xét lại [64]

Ứng dụng phương pháp nghiên cứu phân tử, nhiều tác giả sau này đã nghiên cứu phát sinh chủng loại cho các bậc phân loại dưới họ cho họ Annonaceae [96], [105], [79] Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa được tiến hành toàn diện cho tất cả các nhóm của họ Annonaceae, hầu hết các hệ thống chưa được chấp nhận rộng rãi

và thiếu sự ổn định khi thêm các dữ liệu mới

Để nghiên cứu tất cả các bậc phân loại trong họ Annonaceae, Chatrou và cộng sự (2012) đã phân tích 8 chỉ thị gen lục lạp là rbcL, matK, ndhF, psbA-trnH, trnL-F, atpB-rbcL, trnS-G và ycf1 của 193 loài đại diện cho các nhóm trong họ

và 7 loài ngoài họ Kết quả đã đưa ra sự phân chia mới cho họ Annonaceae với 4 phân họ và 14 tông [58] Để nghiên cứu chi tiết hơn về các tông và chi trong họ, Xing và cs (2017) cũng tiến hành phân tích 8 chỉ thị gen tương tự như Chatrou và

cs đã thực hiện nhưng trên số lượng loài lớn hơn là 705 loài (29% tổng số loài của

họ Na) thuộc 105 chi Kết quả đã đề xuất thay đổi vị trí của 5 chi và đưa ra 1 tông

mới Phoenicantheae Trong đó chi Phaeanthus thuộc tông Miliuseae, phân họ

Malmeoideae [42]

Về vị trí phân loại của họ Annonaceae trong hệ thống phân loại, một số tác giả tách Annonaceae cùng 1 vài họ thành bộ riêng là Annonales (Hutchinson, 1934; Dalgren, 1980; Takhtajan, 2009) [32], [45], [84], trong khi số khác lại xếp vào bộ Magnoliales (Thorn, 1968; Cronquist, 1981) [31], [88] Hiện nay hệ thống phân loại thực vật có hoa hiện đại APG (Angiosperm Phylogeny Group System), dựa trên dữ liệu phân tích nhiều trình tự ADN thuộc các gen đặc trưng, phản ánh

sự tiến hóa của các loài như gen mã hóa lục lạp, ti thể và ribosome được nhiều vườn thực vật và phòng tiêu bản trên thế giới (bao gồm cả Kew) chấp nhận [47]

Hệ thống này cho phép dự đoán tốt hơn các hệ thống phân loại trước đó bởi các nhóm phản ánh được mối quan hệ tiến hóa của thực vật có hoa [47] Đối với các bậc phân loại trên bộ, APG sử dụng thuật ngữ “Nhánh - Clade” thay cho các bậc phân loại truyền thống (trên bộ, phân lớp, lớp, ngành…) vốn thường bị giới hạn

về số lượng Theo APG IV-là phiên bản mới nhất (2016), trong đó họ Annonaceae

nằm trong bộ Magnoliales thuộc các nhánh theo thứ tự là Magnoliids → nhánh Basal Agiosperms [48]

Vị trí phân loại của chi Phaeanthus Hook f & Thomson theo hệ thống

phân loại của Xing (2017) và họ Annonaceae theo hệ thống phân loại APG IV (2016) như sau [42,48]:

Nhánh (Clade): Basal Angiosperms

Cho tới nay nghiên cứu của Mols & Kessler (2000) về đặc điểm hình thái

của chi Phaeanthus trên thế giới vẫn được xem là đầy đủ nhất Khóa phân loại các

loài thuộc chi theo Mols & Kessler được trình bày dưới đây [64]:

la Lá có (13 -) 15-20 cặp gân bên

2a Cuống hoa dài 2,3-5 cm; cánh hoa dài 1,3-2,2(-3,3) cm, với lông ngắn ở mặt trong; lá đài có lông mềm và thưa hoặc nhẵn ở mặt trong; lá noãn 25-35; phân quả

4a Lá rất bóng ở mặt trên; cánh hoa dày như ; phân quả (2-)6-15, dài 1,9-3 cm, nhẵn; mào trung đới không trùm lên bao phấn

4 P splendens

4b Lá bóng màu xám bạc; phân quả 35-60, dài 1,8-2,2 cm, có lông

6 P tephrocarpus

3b Lá bóng; phân quả dài 0,8-1,8 cm

5a Lá đài dài 3-9 mm, có lông ở mặt trong; cánh hoa có 5-7 gân rõ; noãn đính

6b Lá có chất giấy; mào trung đới trùm lên bao phấn; noãn đính bên

7a Lá bắc dưới cùng dài 3-4 mm, lá bắc còn lại dài 1-2,5 mm; lá noãn 10-20

7 P vietnamensis

7 b Lá bắc dưới cùng giống các lá bắc khác dài 1-2,25mm; lá noãn 30-50

1 P ebracteolatus

1.1.2 Phân bố và thành phần loài của chi Phaeanthus Hook f & Thomson

Cho tới nay công trình của Mols & Kessler (2000) về các loài thuộc chi

Phaeanthus vẫn được xem là đầy đủ nhất Phaeanthus là một chi nhỏ với khoảng

9 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (từ Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Đông dương và các nước Đông Nam Á khác đến Niu Ghinê) [64]

Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Phaeanthus

1 P ebracteolatus (C Presl)

Merr

Malaysia: Sabah, Kalimantan Timur

Philippin, Sulawesi, Moluccas, Irian

Jaya, Papua New Guinea, Brunei

[64]

3 P nutans Hook.f &

Thomson

Sumatra, Riau, Malaysia, Singapore [64]

Singapore, Brunei, Sabah, Kalimantan

Loài thuốc Thượng có phân bố hẹp và là loài cây đặc hữu cho vùng Trung

bộ Việt Nam Loài được ghi nhận ở các tỉnh: Thừa Thiên Huế (Phú Lộc: Rừng Nông; Hương Phú: Sông Hai); Quảng Nam (Núi Thành; Duy Xuyên, Đại Lộc: Đại Lãnh; Quế Sơn: Quế Giằng: Hà Ra; Tiên Phước, Phước Sơn; Hiên) [1,2,8] Loài đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) với cấp phân hạng VU B2b,e+3b (loài sắp nguy cấp) [3]

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Phaeanthus Hook f & Thomson

Cây bụi hoặc gỗ nhỏ (trừ một vài loài có thể cao tới 25m) Cành có màu nâu đến xám tro khi khô, vỏ có sọc hình thoi; cành non tròn hoặc hơi phẳng, đen hoặc nâu hơi đỏ khi khô; có nhiều bì khổng và (đôi khi) có sẹo ngang Cuống lá màu

đen, có rãnh dọc hoặc phẳng (P tephrocarpus) Lá hình trứng ngược (hẹp) đến hình elip, chất giấy hoặc chất da (P impressinervius), thường mỏng khi non, bóng,

chuyển màu đen khi khô; gốc tù hoặc nhọn (hiếm khi tròn); chóp nhọn; gân giữa lõm ở mặt trên, lồi ở mặt dưới, gân bên thẳng, nối với nhau (vấn hợp); gân mạng khó thấy ở mặt trên Cụm hoa ở ngoài nách lá hoặc đôi khi ở tận cùng, dạng xim, cuống ngắn, có 1-4 hoa; cuống cụm hoa màu nâu hoặc đen khi khô; cuống hoa màu nâu hoặc nâu hơi đỏ khi khô Hoa lưỡng tính Lá bắc 1 (hoặc 2), hình tam giác, không cuống, chóp nhọn Cánh hoa ngoài 3, xếp van, như lá đài, nhỏ hơn cánh hoa trong; lá đài và cánh hoa ngoài thường tồn tại ở quả Cánh hoa trong 3, xếp van, có 3 cạnh, gốc rộng, chóp nhọn đến tròn, có cấu trúc giống như tuyến ở

gốc Đế hoa hình bán cầu Nhị 30-100, cụt, chỉ nhị ngắn, mào trung đới (trung đới

kéo dài) phẳng, hình xiên, mép gợn sóng; bao phấn 2, hướng ngoài với trung đới

rõ Lá noãn 15-60, hình trụ, có lông ráp nằm màu rỉ sắt hoặc màu nâu vàng; vòi

lá noãn ngắn hoặc vắng; núm lá noãn hình elip đến hình chùy; noãn 1 (hoặc 2),

đính bên hoặc đính gốc (P nutans) Quả gồm các phân quả, phân quả nhiều (tới

60), hình elip (đến cầu), có cuống, vỏ mỏng, màu đen khi chín Hạt 1 (hoặc 2),

hình elip, áo hạt mỏng, nội nhũ nhăn, rãnh nhăn hình phiến chia hạt thành 4 phần [64]

1.2 Thành phần hóa học

Qua các tài liệu thu thập được cho thấy các loài thuộc chi Phaeanthus chứa

nhiều alcaloid Cho tới nay đã phân lập được 21 alcaloid từ các loài trong chi, trong đó có 7 bisbenzyl isoquinolin alcaloid, 3 benzyl isoquinolin alcaloid, 1 secobenzyl isoquinolin alcaloid, 1 protoalcaloid, 7 isoquinolin alcaloid và 2 phenanthren alcaloid (xem các bảng 1.2-1.5)

Năm 1932, tác giả Santos đã phân lập được hợp chất phaeanthin từ vỏ cây

P ebracteolatus thu hái ở Philippin Năm 1951, Santos phân lập được một

alcaloid bậc 4 mới từ rễ và định tên là phaeantharin Cấu trúc của phaeantharin đã được Van Beek và cộng sự xác định lại dựa trên dữ liệu phổ vào năm 1983 [89]

Năm 1968, từ loài P macropodus, Johns và cộng sự xác định được hàm

lượng alcaloid toàn phần trong lá là 1,13% và trong vỏ thân là 1,12% Hai alcaloid chính được phân lập là phaeanthin và limacin (chiếm tỷ lệ 22,9% và 34,9% alcaloid toàn phần, giống nhau tại phần lá và vỏ thân) [52]

Năm 1991, Fasihudin và cộng sự đã xác định được hai alcaloid chính trong

P crassipetalus là phaeanthin và limacin [37] Từ vỏ cây P crassipetalus, Awang

và cộng sự công bố vào năm 2007 đã phân lập được 8 alcaloid: pecrassipine A và

B, doryphornin methyl ether, thalifolin, lanuginosin, (+)-vietnamin, methyldauricin và (+)-limacusin [20] Năm 2012, từ lá P crassipetalus, Zaima và cộng sự đã phân lập được 4 alcaloid gồm corydaldin, N-methylcorydaldin,

(-)-O-backebergin và petalinemethin [101]

Bảng 1.2 Các alcaloid benzyl isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus

(Miq.)Diels;

P ebracteolatus (C Presl) Merr;

Vỏ thân + lá P crassipetalus Becc

[37,52]

Vỏ thân + lá P macropodus (Miq.)

Diels

[20,37,52,101]

P opthalmicus (Roxb ex G Don) J

11 Petalinemethin Vỏ thân - lá P crassipetalus Becc;

Lá P vienamensis Ban;

P sumatranus

[20,70,101]

Năm 2011, Atan và cộng sự đã phân lập được bốn alcaloid từ dịch chiết cồn

vỏ cây P ophthalmicus gồm: O-methyl dauricin, limacin, corydaldin và

oxostephanin [18]

Theo kết quả nghiên cứu của Võ Duy Lê Sơn, P vienamensis Ban có chứa

3,925% alcaloid toàn phần [12] Năm 2014, Lê Thị Ngọc Ngân đã tiến hành định

tính P vietnamensis Ban thấy có chứa: alcaloid, tinh dầu, polyphenol, triterpenoid, acid hữu cơ Từ cao chiết ethylacetat của lá P vienamensis Ban, Lê

Thị Ngọc Ngân đã phân lập được 3 hợp chất: pinoresinol, lyoniresinol, syringaresinol [11] Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự đã phân lập được 7 alcaloid:

petalinemethin, doryphornin methyl ether, N-methylcorydaldin, argentinin,

1S,1'R-7-O-methylgrisabin [70] Từ loài P saccopetaloides, Qian và cộng sự đã phân lập

được 3 hợp chất lirioresinol C, moupinamid và daucosterol [74]

Bảng 1.3 Các alcaloid isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus

(Roxb ex G Don) J Sinclair

[18],

Bảng 1.4 Các alcaloid khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus

Phenanthren alcaloid

Protoalcaloid

Bảng 1.5 Các hợp chất khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus

22 4',5'-diformyl-2-methoxy

diphenyl ether

Vỏ thân P crassipetalus Becc [66,101]

1.3 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian

Các loài thuộc chi Phaeanthus đã được nhân dân một số nước sử dụng làm thuốc từ lâu đời Ở Malaysia, loài P crassipetalus được sử dụng để điều trị các vết thương và bệnh huyết áp cao [101], loài P ebracteolatus được dùng để giảm đau và loài P opthalmicus được sử dụng điều trị vết thương và vết loét [18] Vỏ thân hoặc lá loài P ebracteolatus, P splendens và P vietnamensis Ban được dùng

để chữa chứng đau mắt đỏ Tại Việt Nam, loài P vietnamensis Ban còn được sử

dụng làm thuốc trị mụn nhọt sưng tấy; dùng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ; cầm máu vết thương ngoài da [8]

1.4 Tác dụng sinh học

1.4.1 Tác dụng chống viêm

Viêm thần kinh là nguyên nhân chính gây tổn thương thần kinh trong các bệnh thoái hóa thần kinh Năm 2017, trong tìm kiếm các chất có tác dụng chống viêm thần kinh, Zhou và cộng sự đã phát hiện thấy chất syringaresinol (IC50 2,68 μM) thể hiện tác dụng chống viêm thần kinh hiệu quả hơn nhiều so với chất đối chứng minocyclin (IC50 19,89 μM) Syringaresinol là chất tiềm năng hàng đầu trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh [104]

Năm 2008, Manga tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm của

các chất sterol phát hiện thấy: chất daucosterol thể hiện hoạt tính chống viêm

mạnh hơn chất đối chiếu indomethacin trong mô hình phù tai chuột bằng cách sử dụng dầu Ba đậu với liều 90 μg/cm² [62]

Năm 2013, Yang và cộng sự tiến hành thử nghiệm chống viêm gây ra bởi kích thích LPS trên tế bào RAW264,7, kết quả cho thấy các hợp chất pinoresinol và syringaresinol thể hiện hiệu quả ở giá trị IC50 từ 4,1-413,8 μM [99]

Năm 2015, Ahmad tiến hành đánh giá hoạt tính của pinoresinol và syringaresinol Cả 2 chất đều thể hiện tác dụng chống viêm tốt với giá trị IC50 lần

lượt là 17,2±0,07 và 7,9±0,04 μM trong đánh giá khả năng ức chế giải phóng Leukotrien C4 (LTC4) [15]

1.4.2 Tác dụng giãn mạch máu

Năm 2002, tác giả Austin đã chứng minh loài P splendens có tác dụng hạ huyết áp, còn loài P ebracteolatus có tác dụng hạ huyết áp và giãn cơ trơn [19]

Ở Malaysia, loài P crassipetalus vốn được người dân địa phương sử dụng để

điều trị vết thương và huyết áp cao Năm 2007, Morita và cộng sự đã tiến hành khảo sát hiệu quả giãn mạch của 2 chất pecrassipin A và pecrassipin B trên động mạch chủ chuột cô lập Cả hai chất này ở nồng độ 100μM thể hiện khả năng giãn mạch chống lại tác dụng của norepinephrin (NE; 3 x 10-7 M) trên động mạch chuột với đáp ứng tối đa lần lượt là 82% và 70% Pecrassipin A thể hiện hoạt tính giãn mạch ở mức độ vừa phải, không mạnh bằng curin-một alcaloid bisbenzyl

isoquinolin từ loài Chondrodendron platyphyllum Pecrassipin B thể hiện hoạt

tính giãn mạch chậm [66]

Tới năm 2011, Zaima và cộng sự tiếp tục nghiên cứu khả năng gây giãn động

mạch chủ chuột của các chất phân lập từ loài P crassipetalus Kết quả cho thấy:

Tại vòng động mạch chủ đã được xử lý trước bằng phenylephrin (PE; 0,3 µM) các chất limacin, pecrassipin A và backebergin có tác dụng làm giãn động mạch chủ với nồng độ 30 µM Pecrassipin A và backebergin thể hiện tác dụng giãn mạch phụ thuộc vào thời gian Hơn nữa, tác dụng gây giãn mạch của limacin bị

ức chế bởi NG-monomethyl L-arginin (L-NMMA)-chất ức chế tổng hợp nitric oxid (NO), còn pecrassipin A và backebergin không bị ảnh hưởng Điều này gợi

ý cơ chế gây giãn mạch của limacin là kích thích giải phóng NO; còn pecrassipin

A và backebergin là tham gia vào quá trình giải phóng NO bên cạnh khả năng chẹn kênh Ca2+ và thụ thể của kênh này

Chất làm giãn mạch máu rất hữu ích cho việc điều trị co mạch và tăng huyết

áp, cũng như cải thiện tuần hoàn ngoại vi Một số chất giãn mạch phụ thuộc tế bào nội mô như bradykinin, acetylcholin và histamin đã được ghi nhận do tăng nồng độ ion Ca2+ trong tế bào nội mô và kích hoạt giải phóng NO dẫn đến giãn mạch Mặt khác, phản ứng co thắt cơ trơn là do ion Ca2+ đi qua kênh điện thế phụ thuộc Ca2+ (VDC) và/hoặc thụ thể vận hành kênh Ca2+ (ROC) Các thuốc giãn mạch độc lập với tế bào nội mô, chẳng hạn như nicardipin, nifedipin, diltiazem,

và verapamil, đã được báo cáo là ức chế VDC và làm giảm nồng độ ion Ca2+ trong

tế bào cơ trơn, dẫn đến giãn mạch Như vậy, limacin, pecrassipin A và backebergin gây giãn mạch, có thể được ứng dụng trong các bệnh liên quan đến tim mạch [101]

Năm 1996, trong nghiên cứu tác dụng của một số alcaloid đã phát hiện hợp chất atherosperminin ở nồng độ 100 µg/ml thể hiện hoạt tính giãn mạch và ức chế mạnh kết tập tiểu cầu [25]

1.4.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng

Từ năm 1983, tác giả Van Beek và cộng sự đã xác định phaeantharin phân

lập từ loài P ebracteolatus là một chất kháng khuẩn tiềm năng [89]

Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự: Phát hiện alcaloid toàn phần chiết từ lá cây

thuốc Thượng có hoạt tính kháng khuẩn Trong đó alcaloid phân lập được 1S, 7,7'-O,O'-dimethylgrisabin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm [70]

1'R-Fashihuddin và cộng sự đã phân lập được hai alcaloid limacin và

phaeanthin từ loài P crassipetalus đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở mức độ

trung bình trên cả hai dòng vi khuẩn gram (-) và gram (+) [37]

Trong tìm kiếm các chất từ thiên nhiên diệt động vật đơn bào-ký sinh trùng, phaeanthin thể hiện hiệu quả gấp 3 lần (IC50 2,41 µM) so với thuốc chuẩn

Pentostam trong diệt ký sinh trùng L donovani [23] Limacin và pheanthin thể hiện hiệu quả tương đối trong thử nghiệm diệt ký sinh trùng Trypanosoma cruzi

gây bệnh trên chuột (có thể thông qua việc chẹn kênh Ca2+ để kiểm soát sự xâm

nhập của T cruzi vào tế bào chủ hoặc các đặc tính ức chế miễn dịch chọn lọc của

chúng) [38]

Trong nghiên cứu in vitro, dimethylgrisabin có tác dụng kháng chủng kí sinh trùng Plasmodium falciparum K1 (đã kháng chloroquin) rất mạnh, với giá trị IC50

là 0,031 µM, so với chất chứng dương là chloroquin (0,090) [59] Phaeanthin thể

hiện khả năng kháng kí sinh trùng P falciparum K1 và P falciparum T9-96 (nhạy

cảm với chloroquin), với IC50 lần lượt là 365,85±11,41 nM và 704,87±81,48 nM

[36] Hợp chất atherosperminin cũng được đánh giá tác dụng kháng P falciparum

K1, thấy có hoạt tính yếu hơn, với giá trị IC50 5,80 μM [68] Limacin thể hiện tác

dụng kháng chủng kí sinh trùng P falciparum T9-96 với giá trị IC50 0,24 µg/ml,

mạnh hơn với P falciparum K1 (giá trị IC50 là 1,35 µg/ml) Điều này cho thấy limacin có cơ chế hoạt động tương tự như chloroquin (IC50 của chloroquin là 0,187 µg/ml và 0,01 µg/ml tương ứng với chủng ở K1 và T9-96) và limacin có thể bị

ảnh hưởng bởi cơ chế kháng chloroquin ở chủng P falciparum K1 [83]

Trong nghiên cứu in vitro, hợp chất oxostephanin thể hiện hoạt tính kháng

P falciparum K1 với giá trị IC50 là 2,96 µg/ml so với chứng dương dihydro artemisinin có IC50 là 1,19 ng/ml Oxostephanin thể hiện hoạt tính kháng virut (herpes simplex type 1) với giá trị IC50 là 12,6 µg/ml so với chứng dương acyclovir

có IC50 là 1,2 µg/ml [61]

O-methyldauricin, limacin, corydaldin phân lập từ loài P opthamicus đã

được đánh giá khả năng kháng khuẩn trên hai chủng gram (+) (Bacillus subtilis

và Staphylococcus aureus) và hai chủng gram (-) (Escherichia coli và Proteus

vulgaris) bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Ở nồng độ 103 ppm, hợp chất

limacin có hoạt tính kháng vi khuẩn gram (-) Ở nồng độ 10000 ppm,

O-methyldauricin có khả năng kháng vi khuẩn gram (-) trong khi limacin kháng lại

cả vi khuẩn (-) và (+) [18]

Hợp chất lanuginosin thể hiện tác dụng ức chế với chủng Candida albicans

với IC50 là 45 µg/ml [103]

Bên cạnh tác dụng ức chế chủng Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani và

P falciparum, hợp chất (+)-lyoniresinol thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng

đối với Trichomonas vaginalis ở giá trị giá trị IC50 17,57 µM (theo phương pháp

nuôi cấy của Cedillo-Rivera) [53]

Hợp chất dimethylgrisabin cũng được đánh giá khả năng chống oxy hóa trên

ba mô hình trên, cho kết quả IC50 lần lượt là 18,38, 44,31 và 64,31 µg/ml [59]

1.4.5 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Cao chiết ethanol từ lá cây P ophtalmicus có khả năng diệt tế bào ung thư

bạch cầu HL-60 trên 50% ở nồng độ 20 μg/ml [85]

Năm 2011, Pei Tan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các chất cảm quang

vòng tetrapyrrolic từ lá P ophthalmicus Kết quả thu được như sau: Các phân

đoạn chiết xuất đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở nồng độ 10 μg/ml

Dịch chiết ethanol từ lá P ophthalmicus làm giảm khả năng sống trong ống

nghiệm của tế bào HL-60 đến <50% khi tiếp xúc với ánh sáng phổ rộng 9,6 J/cm2

ở nồng độ 20 μg/ml Qua sàng lọc các phân đoạn đã xác định được một số chất cảm quang gây độc tế bào khác nhau Đây là nỗ lực đầu tiên để nghiên cứu các

chất cảm quang có trong P ophtalmicus, kết quả của nghiên cứu cho thấy các chất

cảm quang chính trong thực vật có cấu trúc vòng tetrapyrrole còn các chất cảm quang với các cấu trúc khác (nếu có) có ở một lượng rất nhỏ hoặc không có hoạt tính Chất cảm quang là các hợp chất được sử dụng trong quang động liệu pháp

để tạo ra các gốc tự do với sự có mặt của ánh sáng và oxy phân tử để loại bỏ các

tế bào và mô bất thường trong điều trị một số bệnh ung thư và các bệnh khác [85]

Chất oxostephanin (đã được phân lập từ loài P ophtamicus) thể hiện khả

năng gây độc tế bào ung thư, với giá trị IC50 lần lượt là 0,24 và 0,71 μg/ml trên dòng tế bao ung thư vú và dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp tính (MOLT-3) [61] Trên năm dòng tế bào ung thư OVCAR-8, HeLa, HepG2, MDA-MB-231 và H358, oxostephanin cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào với giá trị IC50 lần lượt là 0,34±0,02; 0,66±0,06; 0,7±0,05; 1,02±0,04 và 1,84±0,02 (µg/ml) [34] Trong điều tra khả năng gây độc tế bào ung thư, Kuete và cộng sự đã phát hiện hợp chất syringaresinol có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư bạch cầu HL-60, CCRF-CEM với giá trị IC50 lần lượt là 5,8 µM và 14,59 µM [56], cũng

như khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đại tràng SW480 và SW620 [63]

Trong thử nghiệm đánh giá tác dụng chống ung thư (bằng phương pháp MTT

và so sánh với chất đối chứng dương cisplatin (một hóa chất chứa platinum), daucosterol ức chế đáng kể sự tăng sinh của các tế bào A549 với giá trị IC50 là

95,19 và 17,46 μg/ml ở 24 và 48 h Sự kết hợp của β-sitosterol và daucosterol (1:

1) cho thấy hoạt tính chống ung thư tăng lên ở các tế bào A549 [76]

1.4.6 Tác dụng trên hệ miễn dịch

Trong nghiên cứu in vivo trên chuột, hợp chất lanuginosin và doryphornin

methyl ether được đánh giá khả năng kích thích miễn dịch ở ba mức liều uống là

0,3; 1,0 và 3,0 mg/kg Hợp chất doryphornin methyl ether thể hiện hiệu quả tốt hơn ở liều 3,0 mg/kg qua việc làm tăng sinh các dòng tế bào lympho B, lympho

T, lympho CD4+, CD8+, CD19+ cũng như kích hoạt chức năng đại thực bào và làm tăng sản xuất cytokin Th1 như IL-2 và IFN-γ Doryphornin methyl ether cho thấy khả năng kích thích miễn dịch tốt, có thể được sử dụng trên các bệnh suy giảm miễn dịch [82]

1.4.7 Tác dụng trong bệnh loét dạ dày và chống trầm cảm

N-methylcorydaldin ức chế hoạt động của H+ K+-ATPase ở dạ dày với giá trị

IC50 là 60,98 μg/ml, so với giá trị IC50 của omeprazol là 30,24 μg/ml Trên mô hình chuột bị viêm loét dạ dày do rượu, nồng độ của gastrin trong máu được xác định trong nhóm bệnh, nhóm chứng (dùng lansoprazol 30 mg/kg) và nhóm dùng

N-methylcorydaldin với mức liều 20 mg/kg lần lượt là 127,5±3,7; 39,6±8,6;

96,8±8,9 pg/ml Nồng độ PGE2 ở dạ dày cũng được đánh giá ở ba nhóm: nhóm bệnh, nhóm chứng (dùng omeprazol 10 mg/kg) và nhóm điều trị, giá trị lần lượt

là 2589,329±208,0; 2908,318±439,2 và 4253,415±404,7 pg/mg

N-methylcorydaldin cho thấy có tác dụng làm giảm viêm loét dạ dày [97]

Trong thử nghiệm in vitro khảo sát khả năng hấp thụ dopamin của các

alcaloid ở một số loài thuộc họ Na, dimethylgrisabin được đánh giá có hiệu quả cao trên hoạt tính chống trầm cảm với giá trị IC50 là 1,1 µM (tương đương với các chất đối chứng nomifensin, amineptin và dexamphetamin) [73]

Hợp chất O-methyldauricin ảnh hưởng đến hoạt động của các thụ thể

5-hydroxytryptamin 1A (qua cạnh tranh liên kết như chất chủ vận hoặc đối kháng), chứng tỏ chất này có tác dụng giảm lo âu và chống trầm cảm [29]

1.5 Vài nét về cây thuốc Thượng ở Việt Nam

Cây thuốc Thượng là một cây thuốc quen thuộc của vùng Quảng Nam-Đà Nẵng Theo DS Đống Việt Thắng, nguyên Trưởng Trạm Nghiên cứu Dược liệu

tỉnh Quảng Nam-Đà Nẵng cũ, thì cây thuốc này được ghi nhận lần đầu tiên năm

1979, trong đợt công tác triển khai phong trào “Thuốc nam tự túc ở xã”, tại huyện Duy Xuyên Qua nghiên cứu các mẫu (thu thập ở Quảng Nam-Đà Nẵng), lưu trữ ở Viện Dược liệu và mẫu do chính tác giả (Nguyễn Tiến Bân) thu thập ở tỉnh Bình Trị Thiên cũ, năm 1994, Nguyễn Tiến Bân đã xác định thuốc Thượng là loài mới,

tác giả đã định tên cho loài này là: Phaeanthus vietnamensis Ban [13] Cây còn

có các tên gọi khác là Thuốc mọi, thuốc dấu cà doong, da xà lắc [1]

1.5.1 Phân bố

Theo Nguyễn Tiến Bân thì đây là loài đặc hữu của Việt Nam Loài này đã được liệt kê trong sách đỏ Việt Nam 2007 [3] Cây thuốc Thượng thường mọc rải rác dưới tán rừng thưa, rừng thứ sinh nơi ẩm, ở độ cao dưới 300 m, được ghi nhận tại các tỉnh: Thừa Thiên-Huế (Phú Lộc), Quảng Nam-Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn) [1,2,8]

1.5.2 Công dụng theo dân gian

Theo kinh nghiệm của người dân ở xã Duy Tân (cũ) cho biết, lá tươi của cây thuốc Thượng sau khi rửa sạch, để vào cái ly/chén nhỏ, hấp trong nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt, chữa đau mắt đỏ rất công hiệu Về sau, trong các đợt điều tra ở huyện Hòa Vang và Đại Lộc (1983, 1984), các cán bộ nghiên cứu của Viện Dược liệu và Trạm Nghiên cứu Dược liệu, đã sưu tầm được thêm một số công dụng khác như: Chữa vết thương phần mềm, chữa ngộ độc thức ăn, rối loạn tiêu hóa, ỉa chảy, viêm ruột và dạ dày …

Bộ phận dùng của cây thuốc Thượng là lá, vỏ rễ, vỏ thân [8] Theo tài liệu

có công dụng chữa đau mắt đỏ, mụn nhọt sưng tấy; dùng chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, cầm máu vết thương ngoài da…[8]

Ngoài ra, theo kinh nghiệm gia truyền của một số lương y cao thuốc Thượng ngoài việc pha loãng trị đau mắt đỏ do dịch rất hiệu quả thì còn có thể uống để trị các

chứng đau bụng (do đau dạ dày, bệnh đường ruột, đau bụng không rõ nguyên nhân, thống kinh) và ngậm nuốt dần cao này cũng cắt được cơn hen suyễn Nhân dân cũng dùng cao nấu từ lá cây thuốc Thượng và cây găng voi để chữa các chứng sưng, nóng, đỏ, đau của bệnh khớp Nước sắc lá thuốc Thượng có hiệu quả trong điều trị bệnh viêm nhiễm phụ khoa, bệnh trĩ (theo đường uống và dùng ngoài) Cao nấu từ lá, cành non được dùng để giảm đau do khối u chèn ép, giảm đau thắt ruột sau cai nghiện cũng thể hiện tác dụng tốt

1.5.3 Những nghiên cứu về cây thuốc Thượng ở Việt Nam

Năm 1991, Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự đã phân lập được 7 alcaloid:

petalinemethin, doryphornin methyl ether, N-methylcorydaldin, argentinin,

1S,1'R-7-O-methylgrisabin Nhóm nghiên cứu phát hiện alcaloid toàn phần chiết từ lá cây

thuốc Thượng có hoạt tính kháng khuẩn Trong đó alcaloid phân lập được 1S, 7,7'-O,O'-dimethylgrisabin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm [70]

1'R-Theo kết quả nghiên cứu của Võ Duy Lê Sơn, P vienamensis Ban có chứa

3,925% alcaloid toàn phần [12] Năm 2014, Lê Thị Ngọc Ngân cũng đã tiến hành

định tính P vietnamensis Ban thấy có chứa: alcaloid, tinh dầu, polyphenol, triterpenoid, acid hữu cơ Từ cao chiết ethylacetat của lá P vienamensis Ban, Lê

Thị Ngọc Ngân đã phân lập được 3 hợp chất: pinoresinol, lyoniresinol, syringaresinol [11]

Từ những nghiên cứu đã tiến hành về các loài thuộc chi Phaeanthus, các hợp chất đã phân lập từ chi Phaeanthus, cùng những thông tin hiện có về loài thuốc

Thượng (đặc biệt là việc sử dụng để điều trị các chứng viêm, đau) tác giả nhận thấy việc nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, đánh giá độc tính và tác dụng chống viêm, giảm đau của cây thuốc Thượng là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

CÂY THUỐC THƯỢNG (lá và thân cành )

THỰC VẬT TÁC DỤNG SINH HỌC HÓA HỌC

Mô tả đặc điểm hình thái thực vật

Thẩm định tên khoa học

Xác định đặc điểm

vi học

Độc tính cấp và bán trường diễn

Chống viêm

Giảm đau

Gây độc tế bào.

Ức chế sản sinh NO

Chiết xuất, phân lập các hợp chất

Xác định cấu trúc hóa học

Chất tinh khiết

2.1 Vật liệu nghiên cứu

DL-✓ Nguyên liệu chiết xuất và thử tác dụng sinh học

- Cây thuốc Thượng thu hái vào tháng 6 năm 2015, tách riêng phần lá và phần thân cành rửa sạch, phơi âm can, sấy khô ở nhiệt độ 400C, bảo quản trong túi PE

và bao bì kín Trước khi đem ngâm chiết với methanol mẫu nghiên cứu được xay thành bột thô

- Dịch chiết dùng trong nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học: dược liệu được sắc với nước 3 lần rồi đem cô thành cao lỏng 1:1 (1 kg dược liệu khô:1 lít nước) Khi sử dụng được cô đặc thêm hay pha loãng với nước cất tùy theo yêu cầu thí nghiệm và được tính ra liều lượng tương đương với số gam dược liệu/kg

- Các hợp chất phân lập được từ thuốc Thượng dùng thử tác dụng gây độc tế bào ung thư và đánh giá hoạt tính kháng viêm

✓ Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Máy xét nghiệm sinh hoá tự động Chemix 180, hãng Sysmex (Nhật Bản)

- Máy xét nghiệm huyết học tự động XE 2100, hãng Sysmex (Nhật Bản)

- Máy đo thể tích bàn chân chuột Plethysmometer, Cat No 7140, hãng Ugo Basile (Ý)