Quy trình sàng lọc Vibrio_PCR

Nguyên tắc Sử dụng môi trường tạo màu Vibrio ChromagaCHROMagar để phát hiện các loại vi khuẩn Vibrio spp Môi trường Vibrio Chromagar có 2 cơ chất tạo màu: 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-g

Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát hiện nhanh các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm là rất cần thiết

để đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm cũng như phát hiện nhanh để xử lý kịp thời Các môi trường cũng như phương pháp lựa chọn phải có độ chính xác về khả năng phát hiện đúng vi khuẩn mà ít hoặc không xảy ra phản ứng chéo Các phương pháp truyền thống thường mất rất nhiều thời gian, gần đây việc ứng dụng hai phương pháp sau có nhiều ưu điểm hơn, đó là: môi trường tạo màu và phương

pháp PCR Trong thí nghiệm này sẽ dùng để phân lập Vibrio spp từ nhuyễn thể 2

mảnh vỏ

Vibrio là trực khuẩn Gram âm, hình que, không có bào tử, có 3 loài: V cholerae, V parahaemolyticus và V vulnificus, là các chủng gây bệnh ở người thường có trong đồ biển V cholerae là nguyên nhân các vụ lan truyền dịch tả

thường liên quan với điều kiện vệ sinh kém và nguồn nước ô nhiễm, nhưng nó

cũng có thể trở thành nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm V.parahaemolyticus

gây viêm ruột dạ dày cấp tính, nhiễm trùng huyết và thậm chí là liên quan đến

tính mạng V.vulnificus thường gây bệnh nhiễm trùng huyết.

Bài 1: Quy trình phân lập Vibrio ssp từ nhuyễn thể 2 mảnh

vỏ trên môi trường Vibrio Chromagar

I Nguyên tắc

Sử dụng môi trường tạo màu Vibrio Chromaga(CHROMagar) để phát hiện các loại vi khuẩn Vibrio spp

Môi trường Vibrio Chromagar có 2 cơ chất tạo màu:

5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-glucosidase và 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl-β-galactosidase dưới tác dụng của enzyme tạo sản phẩm không bền, sản phẩm này bị oxi hóa và tạo chất màu

STT Chủng Vibrio ssp

5-bromo-6-chloro-3-

indoxyl-β-glucosidase

5-bromo-4-cloro-3-

indoxyl-β-galactosidase

Màu khuẩn lạc

II Phương pháp thí nghiệm

- Mẫu thí nghiệm: Ngao

1 Hóa chất, dụng cụ cần thiết:

- Môi trường ASPW (Alkaline Saline Peptone Water) có thành phần:

o 20 g/L peptone: Cung cấp chất dinh dưỡng

o 20 g/L NaCl: Chủng Vibrio phát triển trong nước mặn

o pH = 8,6  0,2: ở pH này một số vi khuẩn khác không chịu được, Vibiro

chịu được kiềm

o Nước đệm: Duy trì môi trường kiềm

- Môi trường Vibrio Chromagar (CHROMagar) Cân 7,47 g môi trường cho vào

100 ml nước đã thanh trùng Đun sôi trong lò vi sóng Đổ đĩa (15 ml/đĩa)

- Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth)

Tác dụng: Là môi trường giàu dinh dưỡng để tăng sinh khuẩn lạc và theo thời

gian chủng Vibrio chết dần nên caanfmooi trường này để giữ chủng

Thành phần:

g

Dipo tissiumphossphate 2,5

g Ph: 7,3 ± 0,2

Cách tiến hành: Cân 3 g hòa tan trong 100 ml nước cất Đun trong lò vi sóng rồi

lắc đều để hòa tan hết Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút

- Nước cất thanh trùng

- Nước javen 2%

- Đĩa Petri

- Khay inox, dao mổ, kẹp

- Túi đồng hóa mẫu tiệt trùng

- Chai thủy tinh trung tính 250 ml

- Ống falcon 50 ml tiệt trùng

- Đầu côn 200, 1000 µl

- Pipet 200, 1000 µl

- Que trang, que cấy

- Cân có độ chính xác 0,01 g

- Máy dập mẫu (Stomacher)

- Bể ổn nhiệt

- Tủ cấy an toàn sinh học cấp II

2 Quy trình thí nghiệm và giải thích

2.1 Chuẩn bị mẫu

- Lấy khoảng 0,5 kg ngao

- Đốt cồn khay, dao mổ, thìa, kẹp

- Rửa sạch vỏ dưới vòi nước (có thể dùng bàn chải để đánh sạch)

- Tráng vỏ bằng nước javen 2% (pha loãng nước Javel đặc 5 lần)

- Tráng bằng nước cất thanh trùng (thao tác trong tủ cấy gió thổi ngang)

- Mổ mẫu trong tủ cấy gió thổi ngang, tách vỏ và lấy phân thịt của ngao

- Cân 20 g mẫu (bao gồm cả dịch) cho vào túi dập mẫu chứa 225 ml môi trường ASPW, cũng tiến hành trong tủ gió thổi ngang

2.2 Tăng sinh

- Đồng hóa mẫu bằng Stomacher trong thời gian 3 phút, tốc độ 230

- Ủ ở 41,510C trong 61h

- Hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào ống falcon 50 ml đựng 10 ml môi trường ASPW mới

- Ủ ở 41,510C trong 181h

Chú thích: Môi trường ASPW để phân lập vi khuẩn đường ruột ( ưa ấm) nên ủ ở

41,5 0C cũng loại được một số vi khuẩn khác Tiền tăng sinh mục đích để hồi

phục lại các tế bào Vibrio bị tổn thương Sau 6h ủ lần đầu thì môi trường có thể hết chất dinh dưỡng, tăng sinh lần 2 để tăng lượng Vibrio phát triển, loại bỏ ảnh

hưởng của nền mẫu

2.3 Cấy lên môi trường tạo màu CHROMagar

- Cấy theo 2 cách:

 Cấy ria (10 µl) lên môi trường CHROMagar

 Cấy trang: Pha loãng dịch mẫu trên (10µl dịch + 90µl nước muối sinh lý)

và tiến hành cấy trang

Chú thích: Cấy ria để làm sạch các dòng khuẩn lạc riêng biệt, sau mỗi lần cấy

phải tiệt trùng que cấy trên đèn cồn để giảm nồng độ dần, bắt đầu từ nồng độ thấp nhất rồi cấy tiếp để thu được các khuẩn lạc riêng biệt; Cấy trang thì lợi dụng được toàn bộ bề mặt thạch Thao tác ở trong tủ cấy an toàn sinh học cấp II

- Ủ ở 37oC trong 243h

2.4 Đọc kết quả

 Khuẩn lạc màu tím: V parahaemolyticus

 Khuẩn lạc màu xanh: V cholerae hoặc V vulnificus

 Khuẩn lạc màu trắng: V alignolyticus

- Để thu nhận chủng, các khuẩn lạc màu xanh và màu tím được nuôi cấy trong 1

ml môi trường TSB ở 37oC trong 24 h Do theo thời gian thì chủng này sẽ chết dần nên cần môi trường này để giữ chủng

III Kết quả và thảo luận

1 Kết quả

- Trên đĩa petri cấy ria quan sát được:

+ Khuẩn lạc màu xanh khá nhiều: V.cholerae hoặc V.vulnificus + Khuẩn lạc màu trắng V.alignolyticus

Có thể đưa ra kết luận là trong mẫu ngao phân tích có khuẩn lạc V.cholerae hoặc V.vulnificus và V.alignolyticus.

2 Thảo luận

Hình 2: Đĩa cấy trang Hình 1: Đĩa cấy ria

Trên đĩa cấy ria so với các nhóm khác thì ít xuất hiện khuẩn lạc màu xanh, có thể do thao tác cấy ria chưa đúng, cấy khi que cấy

còn nóng nên Vibrio bị chết.

Đĩa cấy trang thì các khuẩn lạc phân bố khá đều và không dính lấy nhau, thao tác tương đối chính xác

Ưu nhược điểm của phương pháp sử dụng môi trường tạo màu CHROMagar

- Ưu điểm:

 Rút ngắn quy trình và thời gian phân tích so với phương pháp truyền thống;

 Thao tác khá đơn giản;

 Đối với người phân tích: Dễ đọc kết quả do tạo màu rõ ràng, ngay cả khi mật độ vi sinh vật lớn, vẫn đọc được do màu khác hẳn màu môi trường;

 Cho kết quả tương đối chính xác, tránh hiện tượng âm tính giả;

 Bền màu lâu hơn so với phương pháp truyền thống

- Nhược điểm: Chưa phân biệt được V.cholerae với V.vulnificus.

Bài 2 : Quy trình phát hiện Vibrio ssp từ nhuyễn thể 2 mảnh

vỏ bằng kỹ thuật PCR

I Nguyên tắc

Mỗi chủng Vibrio ssp đều có những đoạn gen đặc trưng riêng Xác định được

đoạn gen đặc trưng này ta sẽ xác định được chủng Vibrio ssp Dựa vào phản ứng PCR, các đoạn gen đặc trưng của mỗi chủng Vibrio ssp sẽ được khuếch đại (nhân lên) đến số

lượng đủ lớn để chạy điện di, từ đó sẽ xác định được các chủng Vibrio ssp riêng biệt

- Kỹ thuật PCR gồm có 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn biến tính DNA: tăng nhiệt độ lên 94-950C, làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA Mạch DNA kép sẽ tách rời ra tạo thành hai mạch DNA đơn

+ Giai đoạn gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống 55-650C, các đoạn mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn

+ Giai đoạn tổng hợp: nâng nhiệt độ lên 70-720C, enzyme Taq DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn tạo nên mạch DNA mới

II Phương pháp thí nghiệm

Mẫu thí nghiệm: Ngao

Nhóm 4: làm 4 mẫu với gen ctxA trong đó có một mẫu kiểm chứng âm tính

1 Hóa chất, dụng cụ cần thiết:

- Môi trường ASPW (Alkaline Saline Peptone Water) có thành phần 20 g/L peptone; 20 g/L NaCl; pH = 8,6  0,2

- Nước cất thanh trùng

- Nước javen 2%

- Khay inox, dao mổ, kẹp

- Túi đồng hóa mẫu tiệt trùng

- Chai thủy tinh trung tính 250 ml

- Ống falcon 50 ml tiệt trùng

- Đầu côn 200, 1000 µl

- Pipet 20, 200, 1000 µl.

- Que trang, que cấy

- Cân có độ chính xác 0,01 g

- Chelex 10%

- Taq DNA Polymerase, dNTP, MgCl2, nước, đệm

- Agarose

- TAE 1x là đệm để chạy điện di

- Thang chuẩn DNA

- Ống eppendorf 0,5, 1,5 ml

- Đầu côn lọc 200µl và 20 eppendoff

- Micropipette 20µl, 200µl

- Máy li tâm

- Máy vortex

- Máy PCR

- Hệ thống điện di ngang

- Hệ thống chụp ảnh gel

- Máy dập mẫu (Stomacher)

- Bể ổn nhiệt

- Tủ cấy an toàn sinh học cấp II

Danh sách trình tự mồi:

Vibrio vulnificus vvhA Vvh-785F : 5'-CCGCGGTACAGGTTGGCGCA-3'Vvh-1303R: 5'-CGCCACCCACTTTCGGGCC-3' Vibrio cholerae ctxA VCctxAF : 5’-CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-3’VCctxAR : 5’-TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG-3’ Vibrio cholerae ompW VCompWF : 5’-CACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG-3’

VCompWR : 5’-GAACTTATAACCACCCGCG-3’

Vibrio

parahaemolyticus toxR

VPtoxRF : 5’-AGCCCGCTTTCTTCAGACTC-3’ VPtoxRR : 5’-AACGAGTCTTCTGCATGGTG-3’

2 Quy trình thí nghiệm và giải thích

2.1 Chuẩn bị mẫu và tăng sinh

Các bước chuẩn bị mẫu và tăng sinh giống bài 1

2.2 Tách chiết DNA

- Hút 1ml dịch tăng sinh chuyển vào ống eppendorf 1,5ml (trong tủ cấy)

Chú thích: Tránh hút các mảnh thực phẩm vì sẽ lắng xuống cùng DNA; chú ý

trước khi hút là phải khuấy lên rồi để lắng lại mới hút; khư trùng tay bằng cồn

- Ly tâm 10000 g (12000 rpm) trong 1 phút và loại bỏ hoàn toàn dịch nổi Dịch nổi loại bỏ thì đổ vào nước Javen, sau khi đổ dịch nổi lại ly tâm nhanh lần nữa

- Hút 100 µl TE (5 mM Tris-Cl pH 8,5; 0,5 mM EDTA) cho vào ống và đảo trộn bằng máy vortex 15 giây

Chú thích: Hỗn hợp TE là chất có khả năng tạo đệm ởPh 7.5- 9 giúp DNA dễ tan;

EDTA tạo phức với ion, bảo vệ DNA kháng lại sự tấn công của các enzyme bởi

vì nó lấy cofactor

- Ủ 950C trong 20 phút Phá vỡ màng tế bào để thu DNA (TE giải phóng DNA ra môi trường)

- Đảo trộn bằng máy vortex 15 giây

- Ly tâm 10000 g (12000 rpm) trong 1 phút

- Chuyển 70 µl dịch nổi vào ống eppendorf 1,5ml mới, để ống ở trong đá lạnh

2 PCR.

- Chuẩn bị master mix cho các phản ứng PCR phát hiện các vi khuẩn Vibrio với thành phần một phản ứng như sau:

Pha hỗn hợp Master mix cho 4 mẫu cùng 1 lần Tiến hành phối trộn hỗn hợp H2O, đệm, dNTP, hỗn hợp mồi xuôi + mồi ngược, Taq DNA trước Hút 55 µl H2O vào ống eppendoft vô

Đệm phản ứng 10X ( có ion Mg2+) 2

trùng trước, lần lượt thêm 8µl đệm, 6.4µl dNTP, 3.2µl hỗn hợp mồi ctxA, 2µl Taq DNA Spindown để kéo toàn bộ dịch xuống đáy ống Sau đó phân phối 3 lần, mỗi lần

18 µl vào các ống eppendoft, thu được 4 ống, lần lượt thêm 2µl các mẫu chứa DNA theo thứ tự vào 3 ống

- Với mẫu âm tính: thay 2 µl DNA cần phân tích bằng 2 µl nước cất

thanh trùng

Chú thích:

- Việc pha Master mix sẽ rút ngắn được thời gian nhờ rút ngắn các thao tác hút

nhiều lần; giảm được dụng cụ dùng; quản lý được quá trình thí nghiệm vì nếu thao tác saai thì mẫu kiểm chứng dương sẽ không lên; Giảm được sai số vì nếu hút từng lượng nhỏ thì sai số càng lớn

- Hút nước trước và chú ý không để găng tay chạm vào nắp trong của ống; hút đệm

thì sau mỗi lần hút thì hút lên hút xuống để trạo trộn nhẹ

- Đối với Taq DNA polymerase thì luôn để trong đá, tránh mất hoạt tính enzyme,

và tay cũng cầm ở trên( phần không chứa enzyme) vì nhiệt độ cơ thể có thể gây biến tính Enzyme

- Sau khi pha hỗn hợp xong thì cho vào chạy máy Spin down để kiểm tra lượng thể

tích mình hút vào có đủ không Kiểm tra lượng dịch cuối bằng cách đặt pipet ở mức 70µl và hút từ từ, nếu hút hết và còn dư thì các chất đã được cho đầy đủ Hút lên xuống 2-3 lần để đảo trộn

- Mẫu kiểm chứng âm tính luôn phải có, nếu mẫu âm tích mà lên thì phải chạy lại

PCR

- Mẫu kiểm chứng dương tính là mẫu có DNA cần phát hiện để kiểm soát quá trình

trộn hóa chất, nếu mà chạy không lên có thể do lỗi hút hóa chất sai hoặc thiếu Mẫu này chạy PCR luôn lên Nhưng có thể có hoặc không mẫu này

 Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen mục tiêu với chu trình nhiệt như sau:

 Gen ompW

1 chu kì: 94oC, 3 phút đây là giai đoạn biến tính

25 chu kì: (95oC 30s, 55oC 1 phút, 72oC 30s ); lặp lại quá trình biến tính để tách hẳn hết thành mạch đơn

1 chu kỳ : 72oC 3 phút Kéo dài và mồi sẽ bắt cặp hoàn toàn vì ở 550C có thể chưa bắt cặp hết

 Gen vvh, gen ctxA và gen toxR

1 chu kì: 94oC, 3phút

30 chu kì: (95oC 30s, 63oC 1 phút, 72oC 30s)

1 chu kỳ : 72oC 3 phút

Tương tự chỉ khác nhiệt độ bắt cặp khác nhau nên giai đoạn 2 có nhiệt độ khác nhau

3.Điện di

Cho 3 Žl chất DYE 6X vào mỗi ống eppendorf mẫu đã PCR để tăng trọng lượng

để khi bơm vào giếng DNA không chạy tràn ra Đảo trộn nhẹ nhàng Lấy 8Žl mỗi mẫu cho vào các giếng để điện di trên gel agarose 2%, chạy điện di 15 phút Ngâm gel trong dung dịch EtBr trong 20 phút Chụp ảnh gel và đọc kết quả

Chú thích: EtBr có cấu trúc tương tự với bazo nito, có khả năng tương tác với

DNA mạch kép, khi chiếu ánh sáng UV vào thì sẽ phát quang

Vị trí các mẫu trong một nhóm:

III Kết quả và thảo luận

1 Kết quả

Hình 3: Kết quả chạy điện di

Kết luận: Nhóm 4 phân tích mẫu ngao với gen ctxA là gen của loài Vibrio

cholerae,kết quả chạy điện di là âm tính, có thể kết luận trong mẫu mang đi phân

tích không có chủng này

2 Thảo luận

Ảnh chụp gel điện di khá mờ, có thể do thao tác thí nghiệm chưa thành thạo

Ưu nhược điểm của phương pháp này:

Ưu điểm:

- Thời gian nhanh hơn cả môi trường tạo màu;

- Độ chính xác cao;

- Phân biệt được chủng V cholerae gây bệnh và V cholerae không gây

bệnh, cũng như phân biệt được loài V cholerae và V vulnificus;

Nhược điểm:

- Chi phí cho phương pháp này tương đối cao;

- Khá nhiều thao tác;

- Điện di có thể gây lây nhiễm chéo;

- Chưa an toàn vì sử dụng Ethidium bromide- chất gây ung thư.