Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin và đánh giá khả năng sản xuất insulin của tế bào biệt hóa

i Tiểu ñường loại 1 là một bệnh tự miễn, gây ra bởi các tế bào miễn dịch tấn công tế bào beta của tuyến tụy dẫn ñến sự thiếu hụt insulin ñiều hòa lượng ñường trong máu.. Bằng cách biệt h

Trang 1

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA

TẾ BÀO BIỆT HÓA

MSSV: 3064379 LỚP: CNSHTT K32

Cần Thơ, tháng 11/2010

Trang 2

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA

TẾ BÀO BIỆT HÓA

MSSV: 3064379 LỚP: CNSHTT K32

Cần Thơ, tháng 11/2010

Trang 3

i

(ký tên) (ký tên)

Phạm Văn Phúc Nguyễn Thị Phương Dung

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Trang 4

ii

Luận văn này không những là kết quả của sáu tháng nghiên cứu tại phòng Thí nghiệm và Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên mà còn là tâm huyết của em sau hơn 4 năm ñại học mà em ñã không ngừng cố gắng ở viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ

Lời cảm ơn chân thành trước tiên em xin gửi ñến thầy Phan Kim Ngọc, người ñã

ñem ñến cho em ý tưởng cũng như khơi dậy niềm ñam mê nghiên cứu về lĩnh vực tế

bào gốc

Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Phúc ñã hướng dẫn tận tình và tạo

ñiều kiện tốt nhất ñể em thực hiện ñề tài này

Rất cảm ơn anh Đoàn Chính Chung, người ñã tận tình chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm làm việc và giúp ñỡ em xuyên suốt thời gian em làm việc ở phòng thí nghiệm

tế bào gốc

Cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tâm, anh Phạm Quốc Việt, chị Vũ Bích Ngọc cùng các anh chị và các bạn ñang làm việc ở lab tế bào gốc ñã nhiệt tình giúp ñỡ chia sẽ kinh nghiệm làm việc cũng như kinh nghiệm sống ñể em hoàn thiện mình

Cảm ơn các thầy cô viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học ñã tích cực hỗ trợ, nhắc nhở và giúp ñỡ em trong thời gian làm ñề tài

Cảm ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 32 ñã quan tâm, chia sẽ ñộng viên em vượt qua khó khăn ñể hoàn thành công việc của mình

Trên hết, con xin gửi lời tri ân sâu sắc ñến ba mẹ, người ñã cho con ñược sinh ra,

ñược nuôi dạy và lớn lên trong tình yêu thương vô bờ bến Cảm ơn ba mẹ ñã luôn ủng

hộ mọi quyết ñịnh của con và luôn bên cạnh ñộng viên cổ vũ cho con trong bất cứ hoàn cảnh nào

Sáu tháng làm việc ở phòng thí nghiệm tế bào gốc là quãng thời gian em sẽ không bao giờ quên ñược khi vừa phải ñối mặt với bao ñiều khó khăn vừa ñược nếm trải bao nhiêu vui buồn và mới mẻ Cuộc sống mới, môi trường làm việc mới, bạn bè mới và kiến thức hoàn toàn mới ñã từng là trở ngại lớn nhất ngăn cản em theo ñuổi

Trang 5

iii

theo ñuổi ñam mê dù biết phía trước vẫn còn nhiều khó khăn vất vả Điều mà em ñạt

ñược sau khóa luận này không những là kinh nghiệm làm việc mà còn là kiến thức về

những thành tựu mới, kỹ thuật mới mà trước nay em chưa từng ñược tiếp xúc Hơn thế nữa, ñiều ñáng quý nhất mà em học ñược nơi ñây là phong thái làm việc tích cực

và năng ñộng, phương pháp ñối mặt và giải quyết tình huống khó khăn trong nghiên cứu khoa học, cách cư xử với bạn bè, ñồng nghiệp và mọi người trong xã hội Em tin rằng tất cả những gì em góp nhặt ñược nơi ñây sẽ là hành trang vững chắc ñể em bắt

ñầu cho một tương lai mới tươi sáng nhưng cũng ñầy thử thách sau này

Trang 6

i

Tiểu ñường loại 1 là một bệnh tự miễn, gây ra bởi các tế bào miễn dịch tấn công tế bào beta của tuyến tụy dẫn ñến sự thiếu hụt insulin ñiều hòa lượng ñường trong máu Cho ñến nay, tuy có rất nhiều phương pháp chữa trị tiểu ñường nhưng nói chung ñều

có tính chất tạm thời kèm theo những tác dụng không mong muốn, không thể sử dụng

ñể ñiều trị dứt ñiểm cho bệnh nhân Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn là nguồn

tế bào gốc ñầy tiềm năng trong ứng dụng ñiều trị tiểu ñường, ñặc biệt là tiểu ñường loại 1 Bằng cách biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin và chuyển vào cơ thể bệnh nhân, liệu pháp tế bào gốc có thể giúp ñiều trị triệt ñể bệnh tiểu ñường trong tương lai gần

Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô ñược thu nhận từ máu cuống rốn trẻ sơ sinh và ñược ñánh giá thông qua hình thái, khả năng tăng sinh và sự biểu hiện marker bề mặt Các tế bào này sau ñó ñược cảm ứng tiền biệt hóa trong L- DMEM có

bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide và FBS trong 48 giờ, sau ñó ñược biệt hóa trong H- DMEM bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide và FBS Hiệu quả biệt hóa ñược ñánh giá thông qua 3 tiêu chuẩn: sự thay ñổi hình thái, sự sản xuất insulin

và sự biểu hiện các gen chuyên biệt của tế bào tiết insulin Kết quả phân tích cho thấy

tế bào ñược phân lập từ máu cuống rốn chính là các tế bào gốc trung mô cần thu nhận Sau 4 ngày biệt hóa, tế bào ñược cảm ứng bắt ñầu co lại và hình thành cụm Cụm tế bào có hình thái giống cụm tiểu ñảo và bắt màu ñỏ thẫm với DTZ vào ngày biệt hóa thứ 12 Khi phân tích Real Time PCR, các tế bào này biểu hiện các gen

Insulin, Ngn 3, sau 4 ngày biệt hóa và biểu hiện các gen Insulin, Pdx1, Ngn 3 sau 8

ngày và 12 ngày biệt hóa Kết quả nhuộm dithizon và hóa miễn dịch tế bào sau 12 ngày biệt hóa với kháng thể kháng insulin cho thấy tế bào biệt hóa có khả năng sản xuất insulin như tế bào beta của ñảo tụy

Từ khóa: Tiểu ñường loại 1, tế bào gốc trung mô, máu cuống rốn, tế bào tiết

insulin, Reverse Transcription Realtime PCR

Trang 7

ii

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1- GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu ñề tài 2

CHƯƠNG 2- LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 3

2.2 Máu cuống rốn 3

2.3 Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn 4

2.3.1 Tế bào gốc trung mô 4

2.3.2 Đặc ñiểm của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn 4

2.3.3 Ưu thế của việc sử dụng tế bào gốc trung mô máu cuống rốn 8

2.4 Bệnh tiểu ñường 8

2.4.1 Tình hình phát triển bệnh tiểu ñường trên thế giới và việt nam 9

2.4.2 Phân loại bệnh tiểu ñường 9

2.4.3 Các phương pháp ñiều trị tiểu ñường 11

2.4.4 Tế bào tiết insulin 15

2.5 Một số phương pháp biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin 19

Trang 8

iii

2.5.2 Biệt hóa bằng chuyển gen 21

CHƯƠNG 3- PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 23

3.1.1 Vật liệu 23

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 24

3.1.3 Hóa chất 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Thu nhận máu cuống rốn 29

3.2.2 Nuôi cấy và chọn lọc tế bào gốc trung mô ứng viên từ máu cuống rốn người 30

3.2.3 Đánh giá ñặc ñiểm tế bào gốc trung mô ứng viên ñược thu nhận từ máu cuống rốn người 33

3.2.4 Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin 34

3.2.5 Đánh giá hiệu quả biệt hóa 35

CHƯƠNG 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô ứng viên bằng Ficoll từ máu cuống rốn người 40

4.2 Xác ñịnh ñặc ñiểm tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn 44

4.2.1 Hình thái tế bào ứng viên 44

4.2.2 Khả năng tăng sinh và tự làm mới 45

4.2.3 Sự biểu hiện một số marker bề mặt 46

4.3 Đánh giá sự biểu hiện gen và sự sản xuất inlulin của tế bào ñược cảm ứng biệt hóa 49

4.3.1 Sự thay ñổi kiểu hình và khả năng bắt màu với Dithizon ở tế bào

Trang 9

PHỤ LỤC

Trang 10

v

Bảng 3.1 Thông tin primer dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.2 Danh sách dụng cụ dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 3.3 Danh sách thiết bị dùng trong nghiên cứu 25

Bảng 4.1 Kết quả phân tích marker bề mặt tế bào ứng viên 46

Bảng 4.2 Kết quả biểu hiện gene của tế bào sau khi phân tích Tm sản phẩm khuếch ñại bời RT-qPCR 56 Bảng 4.3 Kết quả phân tích melting curve SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.4 Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.5 Kết quả phân tích +/- SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.6 Kết quả phân tích melting curve gen của tế bào 4 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.7 Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào 4 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.8 Kết quả phân tích +/- Assay SYBR gen của tế bào 4 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.9 Kết quả phân tích melting curve gen của tế bào 8 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.10 Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào 8 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Bảng 4.11 Kết quả phân tích +/- Assay SYBR của tế bào 8 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Trang 12

vii

Hình 2.1 (a) Nguyên tắc nhận diện Markers bề mặt tế bào bằng chất nhuộm

huỳnh quang; (b) Nguyên tắc hoạt ñộng của máy flow cytometer 7

Hình 2.2 Phương pháp cấy ghép tiểu ñảo 13

Hình 2.3 Sự sản xuất insulin trong tuyến tụy 15

Hình 2.4 Quá trình hình thành insulin 17

Hình 2.5 Quá trình glucose kích thích tế bào beta tiết insulin 18

Hình 2.6 Quá trình insulin kích thích sự hấp thu glucose 19

Hình 3.1 (a) Flask nuôi tế bào; (b) Màng lọc vô trùng; (c) Đĩa 6 giếng; (d) Electric pipetteman 24

Hình 3.2 (a) Máy ly tâm lạnh; (b) Kính hiển vi ñảo ngược; (c) Tủ thao tác vô trùng; (d) Tủ nuôi cấy tế bào 25

Hình 3.3 Khái quát quy trình thí nghiệm 29

Hình 3.4 Thao tác lấy máu từ cuống rốn 30

Hình 3.5 Khái quát quy trình thu nhận tế bào ñơn nhân từ máu cuống rốn 30

Hình 3.6 Phương pháp thu nhận tế bào ñơn nhân từ máu cuống rốn; (a) Hút máu bằng kim tiêm; (b) Pha loãng máu với PBSA; (c) Bơm dung dịch máu vào Ficoll (d) Dung dịch máu trên lớp Ficoll 31

Hình 3.7 (a) Thao tác thay môi trường trên flask, (b) Thao tác thay môi trường trên ñĩa 6 giếng 32

Hình 3.8 Khái quát quy trình biệt hóa 35

Hình 3.9 Các chu kì nhiệt trong thiết lập phản ứng RT-qPCR 38

Hình 3.10 (a) Thao tác xử lý mẫu với trizol; (b) Thao tác chuyển mẫu ñã xử lý với trizol vào tube sạch; (c) mẫu sau khi hòa ñều với chloroform; (d) Mẫu tách lớp sau khi ly tâm với chloroform; (b) Thao tác hút phase trong; (f) Thao tác chuyển phase trong vào tube mới 39

Trang 13

viii

(b) kết quả ñược ñưa ra bởi Tunku Kamarul Zaman 40

Hình 4.2 Tế bào sau khi huyền phù vào môi trường nuôi cấy (X10) 41

Hình 4.3 Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy (X20) 42

Hình 4.4 Tế bào sau 20 ngày nuôi cấy (X10) 42

Hình 4.5 Tế bào sau 3 lần cấy chuyền (X40) 44

Hình 4.6 Kết quả nuôi cấy MSC từ các mô khác nhau của R A Musina et al (a) MSC tủy xương (b) MSC từ mô mỡ (c) MSC từ da (d) MSC từ bánh nhau 45

Hình 4.7 Tế bào hình thành colony (X40) 46

Hình 4.8 Kết quả phân tích marker bởi hệ thống FACS – Calibur: (a) CD44-PE; (c) CD90-PE; (d) CD105-FITC; (f) CD34-FITC; (g) CD45-FITC; (h) HLA-DR-FITC 47

Hình 4.9 Sự thay ñổi hình thái tế bào trong quá trình biệt hóa (a) MSCs trước khi biệt hóa (b) MSCs sau 4 ngày biệt hóa (b) MSCs sau 6 ngày biệt hóa (d) MSCs sau 8 ngày biệt hóa (c) MSCs sau 10 ngày biệt hóa (e) MSCs sau 12 ngày biệt hóa 51

Hình 4.10 MSC trước khi biệt hóa, tế bào sau 5 ngày biệt hóa, tế bào biệt hóa sau khi nhuộm dithizon; (a)(b)(c) Kết quả nghiên cứu của Huijuan Yuan et al; (d)(e)(f) Kết quả biệt hóa của nghiên cứu này 52

Hình 4.11 So sánh kết quả nhuộm DTZ (a) Tế bào tiết insulin biệt hóa từ tế bào gốc từ da (W Guo et al) (b) Bào tiết insulin biệt hóa từ MSC tủy xương chuột (Zeinab Neshati et al) (c) Tế bào tiểu ñảo nhuộm với dithizon 53

Hình 4.12 Kết quả hóa miễn dịch tế bào (a) cụm tế bào trước khi nhuộm; (b) cụm tế bào phát sáng xanh sau khi nhuộm nhân; (c) cụm tế bào phát sáng ñỏ sau khi nhuộm màng 54

Trang 14

ix

(a) mẫu tế bào chưa biệt hóa; (b) tế bào sau 4 ngày biệt hóa; (c) tế bào sau

8 ngày biệt hóa; (d) tế bào sau 12 ngày biệt hóa 55

Hình 4.14 Kết quả phân tích Real-time PCR: (a ) tế bào ñược chưa cảm ứng biệt hóa; (b) tế bào 4 ngày biệt hóa; (c) tế bào 8 ngày biệt hóa; (d) tế bào 12 ngày biệt hóa 56

Hình 4.14 Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Ngn3 57

Hình 4.15 Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Pdx1 58

Hình 4.16 Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Glut2 58

Hình 4.17 Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Insulin 59

Hình 4.18 Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào trước khi biệt hóa (xem phụ chương)

Hình 4.19 Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào 4 ngày biệt hóa (xem phụ chương)

Trang 15

EDTA Ethylamin Tetraacetic Acid Disodium

EGF Epithelial Growth Factor

eIF Eukaryotic Initiation Factor

EPC Endothelial Progenitor Cells

FBS Fetal Bovine Serum

FCS Fetal Calf Serum

GADPH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogen

GLUT Glucose Transproter

H-DMEM High Glucose Dulbecco’s Modied Eagle’s Medium HLA Human Leukocyte Antigen

HSC Hematopoietic Stem Cells

IMDM Iscove’s Modified Dulbecco Medium

L-DMEM Low Glucose Dulbecco’s Modiied Eagle’s Medium MafA Mammalian Homologue Of Avian

MPB Mobilized Peripheral Blood

MSC Mesenchymal Stem Cells

Ngn Neurogenin

NIH National Institutes Of Health

PBS Phosphate Buffer Saline

Pdx Pancreatic and Duodenal Homeobox

PSC Pluripotent Stem Cells

Trang 16

xi

TGF-β Transforming Growth Factor- Β

UCB Umbilical Cord Blood

USSC Unrestricted Somatic Stem Cells

USSC Unrestricted Somatic Stem Cell

HSCT Hematopoietic Stem Cell Transplantation

RT-qPCR reverse transcription quantitative polymerase chain reaction ICC immunocytochemistry

Trang 17

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU

Tiểu ñường loại 1 hiện ñang trở thành một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất

ở người Tiểu ñường loại 1 là một căn bệnh ñặc biệt nguy hiểm không kém AIDS vì

bệnh có thể xuất hiện ở mọi lứa tuổi và có khả năng di truyền; hơn nữa, những triệu chứng lâm sàng của bệnh thường không ñược nhận ra ñến sau khi hệ miễn dịch của

bệnh nhân phá hủy hơn 90% tổng tế bào beta của tuyến tụy Bệnh có liên quan ñến sự

kháng insulin hay sự ñào thải của hệ miễn dịch cơ thể ñối với tế bào β- tế bào có vai trò chính trong việc tiết insulin ñiều hòa lượng ñường trong máu Cho ñến nay, ñã có rất nhiều nghiên cứu ñược thực hiện nhằm tìm kiếm phương pháp hữu hiệu nhất cho việc chữa trị căn bệnh này như ñiều chỉnh chế ñộ ăn uống và vận ñộng, sử dụng thuốc, tiêm insulin, hay cấy ghép cơ quan nhưng ñều mang tính chất tạm thời và có thể gây di chứng nguy hiểm về sau cho bệnh nhân Hướng ñiều trị lý tưởng ñối với bệnh nhân tiểu ñường loại 1 là bổ sung những tế bào beta bị mất trong ñảo tụy ñồng thời ñảm bảo

tế bào mới cấy ghép không bị hệ miễn dịch của bệnh nhân ñào thải Một phương pháp hiện ñược ñánh giá rất cao về hiệu quả chữa trị tiểu ñường loại 1 là sử dụng tế bào gốc biệt hóa thành tế bào tiết insulin và chuyển vào cơ thể bệnh nhân Phương pháp này không những có nhiều ưu ñiểm vượt bậc mà còn khắc phục ñược những nhược ñiểm

cố hữu của những phương pháp trước ñây Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn ñã

và ñang ñược quan tâm nghiên cứu do nguồn thu nhận dồi dào và không vướng phải các rào cản về ñạo ñức sinh học Các nhà khoa học hy vọng rằng với tính chất ña tiềm năng, khả năng phù hợp miễn dịch cũng như khả năng tự làm mới của mình, MSC hứa hẹn sẽ là một liệu pháp hữu hiệu trong y học Tuy nhiên, trên thế giới cho ñến nay ñã

có rất nhiều nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thành tế bao tiết insulin nhưng vẫn chưa tạo ra tế bào tiết insulin có khả năng ñiều trị lâm sàn

Từ những lý do nêu trên, tôi thực hiện ñề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào tiết insulin từ tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người và ñánh giá khả năng tiết insulin của tế bào biệt hóa” nhằm góp phần nghiên cứu tạo ra tế bào tiết insulin có thể ñược

Trang 18

ứng dụng trong y học cho việc ñiều trị các bệnh nhân tiểu ñường nói chung và tiểu ñường loại 1 nói riêng

1.2 Mục tiêu ñề tài

- Phân lập tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

- Biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin bằng hóa chất

năng tiết insulin của tế bào biệt hóa

Trang 19

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Một cách khái quát, tế bào gốc (stem cell_SC) là những tế bào chưa có chức năng, có khả năng phân chia liên tục và biệt hóa thành những kiểu tế bào khác nhau trong cơ thể Theo thông tin ñược báo cáo từ viện sức khỏe quốc gia Mỹ (National institutes of health_NIH), SC có hai tính chất ñặc biệt mà tế bào biệt hóa không có:

- Một là, SC là tế bào có khả năng tự làm mới (self- renewal) và phân chia liên tục trong một thời gian dài mà vẫn duy trì ñược trạng thái không biệt hóa

- Hai là, tế bào gốc có khả năng biệt hóa (differentiate) hay chuyển biệt hóa

(transdifferentiate) thành những tế bào có chức năng khác nhau ở ñiều kiện in vivo hay

in vitro phù hợp

Theo “Chương trình máu cuống rốn quốc gia” (National cord blood program) của

Mỹ, sau khi trẻ sơ sinh ra ñời, phần máu còn ñọng lại trong mạch máu của bánh nhau

và cuống rốn ñi kèm ñược gọi là máu cuống rốn (umbilical cord blood_UCB) Sau khi

ñứa trẻ ra ñời, phần máu này không cần thiết cho trẻ cũng như người mẹ, nên thường

bị xem là chất thải

UCB chứa tất cả các thành phần của máu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương Từ hơn hai năm trước ñây, UCB ñã ñược ñánh giá có thể là sự lựa chọn cho nguồn mô máu dùng trong dị ghép cứu chữa cho bệnh nhân mắc bệnh thiếu kháng nguyên bạch cầu UCB còn là nguồn khác của tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem cells_HSC) có thể thay thế tủy xương và máu ngoại vi Gần ñây, UCB ñược sử dụng ngày càng nhiều trong việc lưu trữ tế bào máu không những dùng trong ñiều trị cho bệnh nhân rối loạn chức năng máu mà còn cho những bệnh nhân mắc bệnh kháng miễn dịch di truyền, những bệnh về trao ñổi chất và khối u rắn

Ca cấy ghép máu cuống rốn ñầu tiên ñược thực hiện năm 1988 bởi Gluckman et

al Từ thành công của ca cấy ghép này, việc lưu trữ UCB càng có ý nghĩa quan trọng Ngân hàng UCB ñầu tiên ñã ñược thành lập dùng cho dị ghép vào năm 1993 bởi

Trang 20

Rubinstein ở trung tâm máu New York UCB hiện nay ñang trở nên rất có giá trị trong

y học, cho ñến nay, có ñến hơn 80 bệnh khác nhau ñược ñiều trị bằng UCB

Ngoài khả năng ñiều trị các bệnh về máu, UCB còn là nguồn SC quan trọng hiện nay ñang ñược các nhà khoa học ñầu tư nghiên cứu Trong máu cuống rốn, có rất nhiều kiểu SC khác nhau bao gồm: tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem cells_HSC), tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn (unrestricted somatic stem cell_USSC), tế bào tiền thân nội mô (endothelial progenitor cell_EPC), tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell_MSC), tế bào gốc tiền thân ña năng máu cuống rốn (cord blood multipotent progenitor cell_CB-MPCs)

2.3.1 Tế bào gốc trung mô

Thuật ngữ Mesenchymal Stem Cell (MSC) ñược ñề xuất bởi Maureen Owen và cộng sự dựa trên một phần nghiên cứu của Alexander Friendenstein (1924) Khái niệm này ñược phổ biến hơn bởi Arnold Caplan vào những năm cuối thập niên 80 và trong suốt thập niên 90 MSC ñược xác nhận là nguồn tế bào gốc ña tiềm năng (Pluripotent Stem Cell- PSC) vì chúng có thể biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau có nguồn gốc từ trung phôi bì

MSC có thể ñược thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau trong cơ thể như tủy xương, mô mỡ, các lớp nội mô lót thành tĩnh mạch và ñộng mạch, chất nhầy Wharton’s Jelly của cuống rốn người, trong ñó nguồn thu nhận ñược quan tâm nhiều nhất hiện nay là máu cuống rốn

2.3.2 Đặc ñiểm của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn

2.3.2.1 Hình thái tế bào

MSC có hình dạng rất ñặc trưng, có thể nhận ra bằng cách quan sát dưới kính hiển vi Tế bào có thân nhỏ và dài chứa một nhân to dạng tròn, hạch nhân rất rõ rệt

Trang 21

Chuyên ngành Cơng nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học

2.3.2.2 Kiểu hình miễn dịch của MSC

MSC khơng thể được nhận diện bởi chỉ một phương pháp riêng lẻ mà phải bằng

sự phối hợp một loạt các tiêu chí khác nhau Tuy nhiên, MSC cĩ thể được nhận biết bởi tập hợp các marker (marker profiles) là các kháng nguyên bám trên bề mặt tế bào Trong quyển “Principles of regenerative medicine”, Anthony Atala nhấn mạnh những phân tử CD (cluster designation or cluster of differentiation) bám trên bề mặt tế bào là marker phổ biến nhất cĩ thể dùng để nhận ra MSC Trong đĩ, các phân tử Stro-

1, SH2(CD105), SH3, SH4(CD73), CD29, CD44, CD54, CD105, CD133, CD166 dương tính với MSC, cịn các phân tử CD11, CD 14, CD19, CD31, CD34, CD45, CD79, HLA- DRđược xác định là âm tính với MSCs (Dean et al, 2000) Thêm vào đĩ,

kết quả nghiên cứu củaOscar K Lee et al (2004) cho thấy trong quần thể tế bào trung

mơ máu cuống rốn, các marker CD29, CD 38, CD44, CD48, CD49, CD51, CD58, CD73 dương tính đặc trưng cho MSC Ngồi ra, cĩ một số các marker khác như GD2 (Caridad Martinez et al, 2007), BMPR, CD34+Sca1+ Lin- profile, Sca-1 trong các nghiên cứu gần đây cũng được xác định là dương tính với MSC

Trên thực tế, chỉ cĩ một số marker được dùng để nhận ra MSC trong quần thể tế

SC từ UCB Vì trong UCB cĩ chứa nhiều kiểu tế bào gốc khác nhau, nên khi muốn nhận diện MSC từ quần thể này, việc cần thiết là phải tìm các marker thể hiện dương tính với MSC nhưng âm tính với các loại tế bào gốc cịn lại, và ngược lại nếu các marker được chọn âm tính với MSC thì phải dương tính với các loại tế bào gốc khác trong quần thể tế bào được xét

Trong nghiên cứu này, tơi sử dụng một số marker tiêu biểu như sau: CD34,CD44,CD45, CD90,CD105, HLA-DR

Kiểu hình miễn dịch dự đốn của MSC đối với các marker này là: CD44+CD90+CD105+ CD34-CD45-HLA-DR-

Marker dương tính (trên 90% số tế bào trong tổng số tế bào khảo sát biểu hiện)

- CD44 là một loại glycoprotein bám dính trên bề mặt tế bào, nĩ cĩ vai trị quan

trọng trong trao đổi chất và tiến triển của khối u ác tính ở người Kháng nguyên CD44 hiện diện ở tế bào lympho T, hạch bạch huyết, hồng cầu, tế bào não và tế bào nội mơ

Trang 22

Sự biểu hiện của CD44 cũng ñược chứng minh xuất hiện ở MSC CD44 liên quan ñến khả năng gắn kết của tế bào bạch huyết trên tế bào nội mô, khả năng tìm về (homing)

cơ quan lympho ngoại vi, các vị trí viêm và tập hợp bạch cầu CD44 còn gây tín hiệu phóng thích cytokine và hoạt hóa tế bào T

- CD90: là là loại immunoglobulin nhỏ nhất, bám dính trên bề mặt tế bào (Clark

và Springer, 1999) Ở người, CD90 biểu hiện ở các dòng SC như MSC, HSC, KSC và những mô không phải lympho như nguyên bào sợi, tế bào thần kinh và tế bào nội mô hoạt hóa CD90 có chức năng tổng hợp và phóng thích các chất kích thích sinh trưởng như cytokine, những thành phần của dịch ngoại bào giúp sửa chữa mô tổn thương (Lynn Kisselbach et al, 2009)

- CD105: hay endoglin, là protein liên quan ñến sự tăng sinh và tình trạng thiếu

oxy cảm ứng (hypoxia-inducible), biểu hiện nhiều ở tế bào nội mô angiogenic (tế bào

có chức năng sửa chữa và bảo vệ mạch máu) Ngoài ra, CD105 còn ñược biết ñến như

là glycoprotein chuyển màng loại 1 và là một phần của thụ thể TGF-β Endoglin biểu hiện mạnh ở tế bào nội mô thành mạch máu, và syncytiotrophoblasts của bánh nhau

Nó cũng ñược tìm thấy trên tế bào mono hoạt hóa, MSC và tế bào leukemic của dòng lymphoid và myeloid Những nghiên cứu gần ñây còn cho thấy CD105 liên quan ñến chức năng bảo vệ tế bào và chống lại sự chết theo chương trình (apoptosis)

Marker âm tính (dưới 2% số tế bào trong tổng số tế bào khảo sát biểu hiện)

- CD34 là glycoprotein bề mặt, biểu hiện ở giai ñoạn sớm của HSC và những tế

bào tạo máu nguyên thủy từ máu cuống rốn hay từ tủy xương cũng như tế bào nội màng Các phân tử này có khả năng ñiều hòa sự bám dính của tế bào tạo máu Mặc dù kháng nguyên này ñược phân vào loại marker cho tế bào tạo máu nhưng cũng có nghiên cứu ñồng thời cho thấy nó chưa biểu hiện ở quần thể SC Dựa vào trạng thái biệt hóa, tế bào âm tính với CD34 có khả năng là tế bào nguyên thủy tạo máu, tuy nhiên chúng cũng ñược xem là chuyên biệt cho tiền trung mô như hủy cốt bào, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào mỡ và một số tế bào khác

Trang 23

- CD45 biểu hiện mạnh ở dòng HSC CD45 ñược biết ñến như là marker cho

bạch cầu CD45 hiện diện ñến 10% vùng bề mặt của tế bào lympho nhưng biểu hiện ít hơn ở các tế bào bạch huyết khác

- HLA-DR: (human leukocyte antigens) là thụ thể bề mặt tế bào, ñặc trưng cho tế

bào lympho T Nó biểu hiện ở tế bào máu cuống rốn và tế bào máu ngoại vi dương tính với CD34, bao gồm ñại thực bào (macrophage), tế bào mono, tế bào lympho Tần số biểu hiện HLA-DR dương tính ở tế bào CD34+CD38+ cao hơn CD34+CD38− Có giả thuyết cho rằng tế bào càng biệt hóa biểu hiện phân tử này biểu hiện càng mạnh

Một phương pháp rất thông dụng ñược dùng trong việc nhận diện các marker bề mặt ñó là phương pháp nhuộm huỳnh quang Bằng phương pháp này, các marker ñược nhận diện và bám bởi các kháng nguyên ñặc hiệu có gắn nhân tố phát huỳnh quang Nhờ các nhân tố huỳnh quang bám dính, các marker mục tiêu sẽ ñược nhận diện thông qua hệ thống máy flow cytometer (FC)

Hình 2.1 (a) Nguyên tắc nhận diện Markers bề mặt tế bào bằng chất nhuộm huỳnh quang; (b)Nguyên tắc hoạt ñộng của máy flow cytometer

2.3.2.3 Khả năng biệt hóa

MSC từ máu cuống rốn cũng có khả năng biệt hóa in vitro và ex vitro thành các dòng tế bào khác nhau (Pittenger et al 1999), bao gồm tế bào xương (Sila-Asnaet et al, 2007; Friedmand et al,2006), tế bào sụn (Bernardoet et al, 2007), tế bào cơ (Toma et

al, 2002), tế bào mỡ và tế bào thần kinh (Sanchez-Ramos et al, 2000)

Trang 24

2.3.3 Ưu thế của việc sử dụng tế bào gốc trung mô máu cuống rốn

Vì MSC có ñặc ñiểm miễn dịch học ñặc biệt ñó là ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho ở ñiều kiện invitro và kéo dài sự sống của mô ghép invivo (Bartholomew et al., 2002) nên MSC tồn tại ñược lâu trong môi trường dị ghép (Liechty et al., 2000) Nguồn MSC từ máu cuống rốn hiện nay ñược sử dụng phổ biến hơn so với các nguồn khác vì việc thu nhận không cần phải có những thao tác phức tạp và không làm tổn thương cơ thể cho như khi thu nhận từ tủy xương hay máu ngoại vi

MSC từ máu cuống rốn có rất nhiều ưu thế so với các dòng tế bào gốc khác:

- Hơn hẳn tế bào gốc tủy xương, MSC từ máu cuống rốn có thể khắc phục ñược

sự thải loại miễn dịch của cơ thể vì các tế bào này chưa phát triển những ñặc ñiểm ñể

hệ miễn dịch nhận diện

biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào xương, sụn, cơ, mỡ, gân, thần kinh, tế bào tiết insulin (GAO Feng et al) Tuy nhiên khả năng biệt hóa có thể giảm

sau nhiều lần cấy chuyền trong nuôi cấy in vitro…

- Máu cuống rốn rất dồi dào, dễ thu nhận và bảo quản Tế bào gốc từ máu cuống rốn ít khi mang mầm bệnh nên an toàn cho cấy ghép

- Ngoài ra, trẻ sau khi sinh sẽ không sử dụng ñến UCB nữa, do ñó, việc sử dụng MSC từ UCB là hoàn toàn hợp ñạo ñức và có thể sử dụng thay thế vai trò chữa bệnh của tế bào gốc phôi vì không vướng phải vấn ñề ñạo ñức sinh học

Đái tháo ñường – hay thường gọi ñơn giản là bệnh tiểu ñường (diabetes) - là một

bệnh lý trong ñó cơ thể không có khả năng ñều hòa lượng ñường trong máu, ñiều này làm cho lượng ñường trong máu của người bệnh thường xuyên cao hơn mức cho phép (trên 4 mmol/L) Bệnh có liên quan trực tiếp ñến việc cơ thể hoặc không sản xuất ñủ insulin, hoặc không phản ứng ñúng cách với insulin ñược sản xuất

Trang 25

2.4.1 Tình hình phát triển bệnh tiểu đường trên thế giới và Việt Nam

Vào khoảng giữa những năm 80 của thế kỷ trước, tổng số người mắc bệnh tiểu

đường trên thế giới vào khoảng 30 triệu Ngày nay con số đĩ đã lên tới 246 triệu và

theo dự đốn tới năm 2025 số người mắc bệnh sẽ lên tới 380 triệu Căn bệnh này làm

ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế thế giới Ước tính, mỗi năm trên thế giới người ta

phải bỏ ra khoảng 215 đến 375 tỷ đơ la để chữa căn bệnh này Thực tế đĩ cho thấy bệnh tiểu đường cĩ xu hướng tăng mạnh theo sự phát triển của xã hội, đặc biệt là tiểu

đường loại 2

Kết quả nghiên cứu của SARAH WILD và cộng sự (2004) cho thấy số người mắc bệnh tiểu dường sẽ tăng gấp đơi vào năm 2030 so với năm 2000 đồng thời số người mắc bệnh tiểu đường ở các nước đang phát triển tăng cao hơn so với các nước phát triển

Theo xu hướng đĩ, Việt Nam cũng khơng nằm ngồi những nước được xem là cĩ nguy cơ cao phát triển bệnh tiểu đường trên thế giới Tính tốn của Hội người giáo dục bệnh đái tháo đường Việt Nam cho thấy: Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường năm

2002 chiếm 2,7%, đến 2008 đã tăng lên 5,7% dân số Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo

đường ở các thành phố lớn chiếm tỷ lệ 7,2% dân số

PGS.TS Tạ Văn Bình (Chủ tịch Hội người giáo dục bệnh đái tháo đường Việt Nam) phát biểu rằng với tỷ lệ tăng từ 8-20% mỗi năm: "Việt Nam khơng phải là quốc gia cĩ tỷ lệ đái tháo đường lớn nhất thế giới, nhưng bệnh đái tháo đường ở Việt Nam phát triển nhanh nhất thế giới" Phĩ giáo sư cũng cho biết thêm “Mỗi phút trên thế giới

cĩ 6 người chết vì bệnh đái tháo đường (3,2 triệu người chết/năm), tương đương với số người chết do HIV/AIDS”

2.4.2 Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường khơng phân loại theo các giai đoạn bệnh khác nhau mà dựa trên khả năng đáp ứng glucose của cơ thể

2.4.2.1 Tiểu đường loại 1 (type 1 diabetes)

Tiểu đường loại 1 là một bệnh tự miễn, xảy ra do sự hủy diệt các tế bào beta của tuyến tụy bởi hệ thống miễn dịch của bệnh nhân Tiểu đường loại 1 chiếm khoảng 5-

Trang 26

10% tổng số ca tiểu ñường (Scott R Votey và Anne L Peters, 2009), có thể xuất hiện ở hầu hết các lứa tuổi và có khả năng di truyền Bệnh tiểu ñường loại 1 sẽ gây tử vong, trừ khi ñược ñiều trị bằng insulin

2.4.2.2 Tiểu ñường loại 2(type 2 diabetes)

Tiểu ñường loại 2 là tình trạng tăng ñường huyết do sự kháng lại insulin của cơ thể Mặc dù tuyến tụy vẫn sản xuất insulin, ñôi khi cao hơn mức bình thường nhưng cơ thể không sử dụng ñược nên insulin trở nên không ñủ ñáp ứng nhu cầu cơ thể

Bệnh tiểu ñường loại 2 hiếm xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, nhưng gần ñây

ñã trở nên phổ biến hơn Theo thống kê chung, có khoảng 15% số người lớn tuổi hơn

70 mắc tiểu ñường loại 2

2.4.2.3 Một số loại tiểu ñường khác

Ngoài 2 loại nên trên, một số bệnh lý liên quan ñến nồng ñộ ñường trong máu và nồng ñộ insulin cũng ñược xem là bệnh tiểu ñường

* Tiểu ñường loại 3(Tiểu ñường liên quan ñến Alzeimer’s)

Trong cơ thể, insulin giúp chuyển ñổi thức ăn thành năng lượng tế bào nhưng não

sử dụng insulin theo một cách khác góp phần tạo ký ức mới Các nhà khoa học cho biết não của bệnh nhân Alzheimer's có mức insulin thấp hơn người bình thường và não

có hiện tượng kháng insulin Tại synapses, tại không gian mà các tế bào não liên lạc, nơi ký ức ñược hình thành, tế bào thần kinh dự trữ các thụ thể ñặc biệt chỉ dành cho insulin Khi hormone này ñược ñưa vào, kết nối ñược thực hiện cho phép những ký ức mới hình thành

Một nhóm các nhà khoa học ở trường ñại học Northwestern lần ñầu tiên chứng tỏ tại sao chức năng nhớ của bộ não bị mất ñi liên quan ñến sự thiếu hụt insulin Nhóm nghiên cứu khám phá ra cơ chế phân tử bên trong sự kháng insulin như sau: amyloid beta- derived diffusible ligands (ADDL) là một loại protein ñộc có khả năng gây ñau trong não của bệnh nhân Alzheimer's Khi ADDL bám vào tế bào thần kinh tại synapse, chúng sẽ tiêu diệt các thụ thể tiếp nhận insulin Một khi tế bào thần kinh mất

ñi các ñiểm này, insulin không thể liên kết vào tế bào não dẫn ñến mất trí (theo

Catherine Guthrie, tạp chí Time, 2007)

Trang 27

Với kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học hy vọng rằng bệnh Alzeimer cĩ thể được điều trị dựa trên vai trị của insulin trong tương lai gần

* Tiền tiểu đường (prediabetes)

Tiền tiểu đường là bệnh lý xảy ra khi nồng độ đường trong máu của bệnh nhân cao hơn một người hơn bình thường nhưng khơng đủ cao cho một chẩn đốn bệnh tiểu

đường loại 2 Nhiều người phải trải qua nhiều năm trong trạng thái tiền tiểu đường rồi

mới phát triển tiểu đường loại 2

* Tiểu đường thai kỳ (Gestational diabetes)

Tiểu đường thai kỳ là tiểu đường xảy ra trên phụ nữ được phát hiện lần đầu tiên khi mang thai Trong 100 phụ nữ mang thai ở Mỹ thì cĩ 3-8 người bị đái tháo đường thai kỳ Khi đường huyết tăng cao sẽ gây nhiều ảnh hưởng xấu, đặc biệt khơng tốt cho thai nhi

2.4.3 Các phương pháp điều trị tiểu đường

Các phương pháp điều trị tiểu đường khác nhau tùy thuộc vào từng loại tiểu

đường Các phương pháp điều trị bao gồm: chế độ dinh dưỡng, rèn luyện thể chất hợp

lý, kiểm tra thường xuyên tình trạng đường huyết, thuốc uống, thuốc tiêm (insulin), cấy ghép cơ quan và cấy ghép SC

2.4.3.1 Chế độ dinh dưỡng, thể thao

Hoạt động thể chất điều độ, ăn uống hợp lý cĩ thể là một liệu pháp hỗ trợ tốt cho

cả việc ngăn ngừa và điều trị tiểu đường Lượng đường trong máu cĩ thể được đảm bảo ở mức cho phép bởi sự điểu tiết khẩu phần ăn như phải biết ăn gì, ăn bao nhiêu, khi nào ăn là hợp lý Bằng cách này ta cĩ thể tự chăm sĩc cơ thể, giảm nguy cơ bệnh tim, đột quỵ, và những vấn đề khác gây ra do bệnh tiểu đường

2.4.3.2 Sử dụng thuốc

Cĩ nhiều loại thuốc được dùng điều trị tiểu đường hiện nay:

- Insulin: bệnh nhân tiểu đường đầu tiên được điều trị bằng insulin vào tháng 1 năm 1922 Insulin được đưa trực tiếp vào cơ thể khi tụy khơng sản xuất đủ hoặc khơng

cĩ khả năng sản xuất insulin đáp ứng nhu cầu cơ thể Insulin được dùng dưới 3 hình

Trang 28

thức: tiêm bằng kim tiêm, phun bằng áp suất cao qua da và dùng máy bơm treo trên cơ thể (loại này có thể dùng ñược trong nhiều ngày)

- Các loại thuốc khác: hiện nay có rất nhiều loại thuốc trên thị trường ñược dùng diều trị bệnh nhân tiểu ñường, mỗi loại có một chức năng riêng và cách sử dụng cũng khác nhau Nhiều trường hợp dùng kết hợp hai hoặc ba loại thuốc, một số loại có chứa nhiều thành phần thuốc khác nhau trong một viên thuốc Một số loại thuốc ñược dùng kết hợp với insulin

Sử dụng thuốc là phương pháp ñơn giản nhất ñể ñiểu khiển mức insulin nhưng phương pháp này không an toàn cho bệnh nhân vì bệnh nhân phải tiêm insulin thường xuyên nhưng vẫn có khả năng bị hạ ñường huyết hay tăng ñường huyết ñột ngột

2.4.3.3 Cấy ghép cơ quan

Cấy ghép tụy: Tụy nằm phía sau phần dưới của dạ dày Nó tiết insulin và các

enzyme giúp cơ thể tiêu hóa và sử dụng thức ăn Các cụm tế bào ñược gọi là các tiểu

ñảo của Langerhans có mặt khắp nơi trong tuyến tụy Các tiểu ñảo này ñược tạo thành

từ một số loại tế bào, bao gồm các tế bào beta tạo insulin

Trong thí nghiệm cấy ghép ñảo tụy, tiểu ñảo ñược lấy từ tuyến tụy của một người hiến tụy vừa mới chết và chuyển vào cơ thể người bệnh Các tiểu ñảo ñược sử dụng là tinh khiết và ñã ñược xử lý Sau khi cấy ghép, các tế bào beta trong các ñảo tụy bắt ñầu thực hiện chức năng và sản xuất insulin Các nhà nghiên cứu hy vọng cấy ghép tụy sẽ giúp những người bị bệnh tiểu ñường loại 1 sống mà không cần tiêm insulin hàng ngày

Trang 29

Hình 2.2 Phương pháp cấy ghép tiểu ñảo

Cấy ghép tế bào tiểu ñảo (Hình 2.2.): Cấy ghép tế bào tiểu ñảo là phương pháp

cấy ghép các tiểu ñảo ñộc lập của tụy cho vào cơ thể người nhận Liệu pháp này ñược

sử dụng chủ yếu trong ñiểu trị tiểu ñường loại 1 Bằng phương pháp này, tế bào tiểu

ñảo sẽ ñược tách chiết và tinh sạch từ tuyến tụy của người cho sau ñó ñưa vào cơ thể

bệnh nhân bằng cách truyền vào gan.Theo những nghiên cứu gần ñây, phương pháp

này có thể giúp bệnh nhân không cần tiêm insulin trong một năm

Cấy ghép cơ quan là một phương pháp ñược ñánh giá có hiệu quả cao trong ñiều trị tiểu ñường, tuy nhiên phương pháp này có một hạn chế rất lớn là thiếu nguồn cho

và phải ức chế miễn dịch cơ thể trước và sau khi cấy ghép ñể tránh hiện tượng thải loại sau cấy ghép Việc ức chế miễn dịch cơ thể trong một thời gian dài sẽ dẫn ñến những

hệ quả nghiêm trọng cho bệnh nhân

2.4.3.4 Liệu pháp tế bào gốc

Liệu pháp tế bào gốc hiện ñược xem là phương pháp hứa hẹn ñem lại kết quả

hữu hiệu nhất trong ñiều trị tiểu ñường Nhờ vào khả năng tăng sinh và biệt hóa của

SC, các tế bào có chức năng cần thiết có thể ñược tạo ra từ tế bào của chính cơ thể

bệnh nhân

* Cấy ghép tế bào gốc:

- Thu nhận SC có khả năng biệt hóa hay chuyển biệt hóa thành tế bào tiết insulin

Cấy ghép trực tiếp những SC chưa biệt hóa này vào cơ thể bệnh nhân, tạo ñiều kiện

thích hợp cho các tế bào này biệt hóa invivo

Trang 30

- Cấy ghép tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell transplantation –HSCT):

Phương pháp sử dụng HSC ñược sử dụng ñể ñiều trị các bệnh tự miễn nói chung, trong

ñó có tiểu ñường loại 1 Mục ñích của việc ñiều trị này là ñể thay thế các tế bào miễn

dịch ñang giết chết dần các tế bào sản xuất insulin bằng các tế bào mới chưa ñược lập trình Bằng phương pháp này hệ máu của bệnh nhân sẽ ñược thay mới, do ñó hệ miễn dịch mới sẽ không tiếp tục phá hủy các tế bào beta tiết insulin ñồng thời tạo ñiều kiện cho các tế bào beta ñược tái tạo từ tụy

* Cấy ghép tế bào chức năng:

- Cấy ghép tế bào tiết insulin: Bước ñầu tiên của phương pháp này là nuôi cấy

tăng sinh và biệt hóa SC thành tế bào tiết insulin (insulin producing cell- IPC) trong môi trường in vitro Các tế bào ñã biệt hóa này sau ñó sẽ ñược chuyển vào cơ thể người bệnh Phương pháp này cần thiết phải có sự kết hợp với cấy ghép HSC nhằm

ngăn chặn sự phá hủy các tế bào tiết insulin mới cấy ghép

- Tạo lớp vỏ bọc cho các tế bào ñược cấy ghép (encapsulation): Một mối quan

tâm trong việc cấy ghép các tế bào mới vào cơ thể người là hệ thống miễn dịch cũng sẽ tấn công những tế bào mới cấy ghép, làm giảm hiệu quả ñiều trị Vì vậy, ngay cả khi

việc biệt hóa invivo ñược thực hiện ở người, các tế bào ñược ñưa vào cơ thể bệnh nhân

không có nghĩa là các tế bào sẽ sống sót ñể thực hiện chức năng Thêm vào ñó, một vấn ñề nan giải của liệu pháp cấy ghép là tế bào hay cơ quan mới có khả năng phát triển ngoài kiểm soát và hình thành các khối u trong cơ thể nhận Vì vậy, một trong những hướng nghiên cứu mới nhất ñưa ra giải pháp cho vấn ñề này là kết hợp cấy ghép SC và tạo lớp vỏ bọc sinh học cho các tế bào cấy ghép Lớp vỏ bọc này cho phép các phân tử nhỏ như glucose, insulin trao ñổi dễ dàng nhưng ngăn chặn ñược sự tương tác của tế bào cấy ghép với hệ miện miễn dịch cơ thể Lớp vỏ bọc này vừa bảo vệ các

tế bào này khỏi sự chống phá của hệ miễn dịch vừa giúp chúng phát triển trong khuôn khổ cho phép, hạn chế sự hình thành khối u

Trang 31

2.4.4 Tế bào tiết insulin

2.4.4.1 Insulin

Hình 2.3 Sự sản xuất insulin trong tuyến tụy

Insulin là một nội tiết tố có tác ñộng mạnh mẽ ñến sự trao ñổi chất Insulin giúp các tế bào (như tế bào trong gan, cơ bắp, và các mô mỡ) hấp thu glucose từ máu, lưu trữ nó dưới dạng glycogen trong gan và cơ

- Tác ñộng của insulin trong chuyển hóa glucose: Khi hàm lượng glocose trong máu tăng các tế bào beta của ñảo tụy sẽ tiết insulin tác ñộng ñến các quá trình dự trữ

và sử dụng glucose ở các loại mô trong cơ thể ñặc biệt là tại gan, cơ và mô mỡ Insulin

sẽ giúp gucose dự trữ trong gan dưới dạng glycogen Khi hàm lượng insulin giảm, tế bào gan sẽ chuyển glycogen trở lại thành glucose và chuyển vào máu

- Tác ñộng của insulin lên chuyển hoá lipid: khi glycogen ñược dự trữ tối ña, lượng glucose vào gan sẽ ñược chuyển hoá thành acid béo nhờ tác ñộng của insulin Insulin tác ñộng lên cả sự tổng hợp và phân giải chất béo Tăng cường dự trữ chất béo triacylglycerol là một trong những hoạt ñộng quan trọng nhất của insulin

- Tác dụng lên chuyển hoá protein: Insulin kích thích sự chuyển acid amin vào trong tế bào, ức chế sự phân giải protein và ñiều khiển quá trình tổng hợp protein (Saltiel and Kahn 2001) Insulin kích thích sự phiên mã có chọn lọc, sự hoạt ñộng của

Tụy người

Tế bào β

Insuli

Glucose Sợi cơ

ĐảoTụy

Mạch máu

Trang 32

ribosome cần cho sinh tổng hợp protein Ở gan insulin ức chế sự tạo thành ñường mới,

các acid amin sẽ ñược chuyển thành protein dự trữ

- Ngoài ra, Insulin cũng thúc ñẩy quá trình phiên mã của nhiều mRNA Nó kích thích tăng trưởng, tổng hợp DNA, và sự nhân lên của tế bào

2.4.4.2 Quá trình hình thành

Insulin là một hormone peptide gồm 51 amino acid và có trọng lượng phân tử

5808 Da Nó ñược sản xuất tại các tế bào beta thuộc ñảo nhỏ của Langerhans ở tuyến tụy Insulin ñược hình thành qua một loạt những biến ñổi từ sản phẩm dịch mã ban ñầu

là preproinsulin thành proinsulin và insulin trưởng thành

Preproinsulin là sản phẩm sơ cấp của quá trình dịch mã gene insulin, là một chuỗi

peptide dài khoảng 110 amino acids Khi ñược tác ñộng bởi protease preproinsulin sẽ hình thành proinsulin bằng cách cắt chuỗi peptide tín hiệu

Preproinsulin gần như không tồn tại trong tế bào, vì loại bỏ peptide tín hiệu không phải là một bước riêng biệt nhưng liên quan chặt chẽ ñến dịch mã ở lưới nội chất (ER)

Proinsulin là tiền thân của insulin ñược tổng hợp ở lưới nội chất, ñược cuộn lại và cầu nối disulfua của nó bị oxi hóa Proinsulin sau ñó ñược vận chuyển ñến hệ Golgi và

ñược ñóng gói vào các túi tiết Tại các túi tiết, một loạt các proteases sẽ tác ñộng lên

protein ñể hình thành insulin trưởng thành Insulin trưởng thành có ít hơn proinsulin

39 amino acid; 4 ñược loại bỏ hoàn toàn, và 35 amino acid còn lại hình thành peptide C-peptide ñược phân tách từ trung tâm của chuỗi proinsulin; hai ñầu (chuỗi B

C-và chuỗi A) vẫn ñược nối với nhau bằng cầu nối disulfua

Trang 33

- Khởi ñầu quá trình, glucose sẽ ñi qua kênh GLUT2 trên màng tế bào beta

- Sự phosphoryl hóa của glucose ñược thực hiện bởi glucokinase, hình thành pyruvate ñi vào ty thể của tế bào

- Quá trình hô hấp tế bào diễn ra ở ty thể, phóng thích ATP

- ATP ñược tổng hợp sẽ ức chế kênh K+ (rất nhạy với ATP) trên màng tế bào

- Khi kênh K+ bị ức chế sẽ làm thay ñổi sự phân cực của màng tế bào beta

- Sự phân cực của màng tế bào sẽ kích thích mở kênh Ca2+

2 Preproinsulin cuộn lại, oxi hóa và cắt peptide tín hiệu, hình thành

proinsulin

3 Proinsulin ñược vận chuyển ra khỏi

hệ Gongi, ñưa vào túi tiết

proinsulin

4 Protease cắt C peptide

5 Carboxypeptidase E sản

xuất insulin trường thành

2 Preproinsulin cuộn lại, oxi hóa

và cắt peptide tín hiệu, hình thành

proinsulin

3 Proinsulin ñược vận chuyển ra

khỏi hệ Gongi, ñưa vào túi tiết

4 Protease cắt C peptide

5 Carboxypeptidase E sản

xuất insulin trường thành

1 Preproinsulin ñược Dịch mã và dịch chuyển ra khỏi lưới nội chất sần

Trang 34

- Ca2+ từ môi trường kết hợp với Ca2+ nội bào sẽ tác ñộng lên các túi tiết chứa phân tử insulin trưởng thành

- Các túi tiết này sẽ hòa vào màng tế bào, giải phóng insulin ra ngoài, vào máu

Hình 2.5 Quá trình glucose kích thích tế bào beta tiết insulin

Ở tế bào thường:

Khi insulin hiện diện trong máu, nó sẽ ñi ñến các tế bào cơ, tế bào mỡ và tế bào gan, giúp các tế bào này hấp thu glucose Insulin kích thích tế bào vận chuyển glucose vào trong bằng việc tăng cường các kênh GLUT 4 trên màng tế bào GLUT 4 là kênh

ñịnh vị trên màng tế bào, có chức năng vận chuyển glucose vào bên trong tế bào

- Bình thường, kênh GLUT 4 hiện diện rất ít trên màng tế bào

- Khi insulin ñược phóng thích vào máu, nó sẽ bám trên thụ thể bề mặt tế bào

- Insulin sẽ gây photphoryl hóa bán ñơn vị beta của thụ thể màng thành một enzyme kinase hoạt hóa

- Enzyme này sẽ họa hóa hàng loạt các enzyme nội bào khác

Trang 35

- Kết quả của sự hoạt hóa này là sự kích thích các túi chứa thụ thể màng GLUT 4 hòa vào màng tế bào

- Việc bổ sung kênh GLUT 4 trên màng sẽ tăng lượng glucose ñi vào tế bào, giảm nồng ñộ ñường trong máu

Hình 2.6 Quá trình insulin kích thích sự hấp thu glucose

bào tiết insulin

Biệt hóa ở tế bào nói chung là quá trình biến ñổi từ tế bào chưa có chức năng thành tế bào có chức năng chuyên biệt Sự biệt hóa xuất hiện rất nhiều lần trong quá trình sống của sinh vật ña bào từ sự chuyển biến hợp từ thành các mô khác nhau trong

cơ thể Trong ñiều kiện in vivo, sự biệt hóa của tế bào có liên quan ñến hoạt ñộng của

hàng hoạt gen, sự ñóng hay mở các gen này sẽ dẫn ñến sự biệt hóa của tế bào ñó Sự biệt hóa SC không chỉ phụ thuộc vào tiềm năng biệt hóa của SC mà còn phụ thuộc vào

tác nhân biệt hóa Trong ñiều kiện in vitro, phương pháp chung nhất ñể biệt hóa là loại

bỏ các tác nhân biệt hóa không ñịnh hướng và cảm ứng tế bào biệt hóa thành dạng tế bào mong muốn bằng các tác nhân biệt hóa thích hợp

Màng plasma Thụ thể insulin

Tăng cường

nguyên phân

Tổng hợp protein

Tổng hợp glycogen

Vận chuyển glucose

Trang 36

Khi MSCs biệt hóa thành tế bào chức năng thuộc cùng một lớp phôi thì ñược gọi

là sự biệt hóa Mặt khác, sự biệt hóa của MSCs thành tế bào chức năng thuộc nội phôi

bì hay ngoại phôi bì thì gọi là sự chuyển biệt hóa Đối với tế bào tiết insulin, quá trình

biệt hóa của MSC thành IPC ñược gọi là sự chuyển biệt hóa vì IPC không có nguồn

gốc trung mô Có nhiều phương pháp biệt hóa SC thành tế bào chức năng như biệt hóa

bằng hóa chất, biệt hóa bằng các gốc tự do và dạng oxy hoạt ñộng, biệt hóa bằng kích

thích vật lý, biệt hóa bằng chất nền ngoại bào, biệt hóa bằng ñồng nuôi cấy với các tế

bào ñã biệt hóa, biệt hóa bằng chuyển gen 2.5.1 Biệt hóa bằng hóa chất

Trong môi trường invitro, ñể biệt hóa SC thành tế bào chức năng thì hóa chất là

lựa chọn ñầu tiên vì có thể sử dụng hóa chất ñể ñiều khiển hướng biệt hóa của tế bào

Một số hormone, cytokine, vitamine, ion Ca2+ tác ñộng lên tế bào có thể dẫn ñến khởi

ñộng các chuỗi tính hiệu giúp tế bào biệt hóa Các phân tử hóa chất tác ñộng lên tế bào

theo kiểu tác ñộng của hormone hay tín hiệu nội bào Sự tác ñộng này sẽ làm tế bào

thay ñổi sự biểu hiện kiểu hình bằng cách ñóng hoặc mở các gene trong bộ gene của tế

bào

Đối với SC biệt hóa thành tế bào beta, có nhiều nghiên cứu cho thấy

Nicotinamide có vai trò quan trọng trong sự biệt hóa thành tế bào tiết insulin từ SC

Nicotinamide là chất ức chế poly (ADP-ribose) synthetase có tác dụng biệt hóa và tăng

sinh khối tế bào trong tế bào tụy thai người ñược nuôi cấy và bảo vệ tế bào khỏi sự mất

nhạy ở ñiều kiện nồng ñộ ñường cao Một báo cáo của Ramiya và cộng sự ñã chứng tỏ

nicotinamide giúp tiểu ñảo xuất phát từ tế bào tiền thân tụy tiết nhiều insulin hơn so

với nuôi cấy chỉ với glucose Điều này cũng chỉ ra rằng nicotinamide ñiều khiển quá

trình chuyển biệt hóa và trưởng thành của SC thành tế bào tiết insulin Trong những

nghiên cứu gần ñây, nicotinamide ñược dùng ñể ñảm bảo sự sống và chức năng của tế

bào tiểu ñảo

β-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol- 2-ME) là chất chống oxi hóa ở tế bào,

ñược sử dụng rất phổ biến với vai trò là một chất kích thích tế bào thần kinh (sự biểu

hiện nestin) Nestin ñược xem là một marker cho tiền thân tế bào tiểu ñảo tuyến tụy

Năm 2004, MSCs ñược kích thích biểu hiện nestin và biệt hóa thành tế bào tiểu ñảo

Trang 37

thông qua giai ñoạn trung gian tế bào thần kinh Nên β-mercaptoethanol ñược sử dụng như chất thúc ñẩy biệt hóa thành ICPs Trong nghiên cứu của Chen LB và cộng sự (2004), β-mercaptoethanol có chức năng tăng cường chức năng biệt hóa của Nicotinamide

Ngoài khả năng cảm ứng biệt hóa, 2-Mercaptoethanol (2-ME) có khả năng bảo vệ

tế bào khỏi bị tổn thương do stress oxi hóa khi tiếp xúc với ñường ở nồng ñộ cao trong một thời gian dài Nicotinamide còn hoạt ñộng như chất chống oxi hóa kết hợp với 2-

ME bảo vệ tế bào khỏi các hiện tượng gây ñộc cho tế bào do nồng ñộ ñường cao gây

ra như stress oxi hóa

Vai trò của glucose trong biệt hóa SC thành tế bào tiết insulin:

- Glucose ñiều hòa phiên mã Insulin

Vùng -340 tới +1 trên promoter của gen Insulin bao gồm các trình tự ñiều hòa

phiên mã quan trọng A3, C1, E1 Khi glucose hiện diện trong tế bào, các trình tự ñiều hòa này gắn kết với nhân tố ñiều hòa tương ứng PDX-1, MafA, Beta-2 và thực hiện chức năng ñiều hòa của mình

- Glucose ñiều hòa dịch mã Insulin

Glucose kích thích sự hình thành phức hợp eIF-4F có chức năng nhận diện mRNA preproinsulin và thu hút ribosome 40S bám vào mRNA eIF2, là một nhân tố quan trọng ñiều hòa quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào, chỉ hoạt ñộng trong trạng thái phức hợp GTP-eIF2 Glucose có khả năng kích thích hoạt ñộng ñiều hòa (up-regulated) của eIF-2B, một nhân tố có chức năng chuyển ñổi GDP-eIF2 thành GTP-eIF2

- Glucose ñiều hòa sự tiết insulin

Các kênh protein GLUT-2 ở chuột và GLUT-1 ở người khi ñược kích thích bởi glucose sẽ trở thành các kênh tín hiệu gây tiết insulin Cơ chế tiết insulin ñược trình bày ở phần lộ trình hoạt ñộng của insulin (2.4.4.3.)

2.5.2 Biệt hóa bằng chuyển gen

Mục ñích của phương pháp này là nhằm bổ sung một số gen hoạt ñộng vào hệ gen của SC, các gen mới ñược thêm vào sẽ có chức năng mã hóa các protein thúc ñẩy quá trình phiên mã của một loại các gen khác dẫn ñến biệt hóa tế bào Nhiều nghiên

Trang 38

cứu cho thấy Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1) là một nhân tố phiên mã quan trọng thiết yếu cho sự phát triển tụy và sự trưởng thành của tế bào beta

Vai trò trong sự phát triển tụy: trong quá trình phát triển phôi, Pdx1 chỉ ñược biểu

hiện ở một quần thể tế bào nhất ñịnh trong vùng nội mô Tế bào nội mô dương tính với

Pdx1 sẽ có khả năng phát sinh chồi tụy và sau ñó là toàn bộ tuyến tụy

Trong sự trưởng thành tế bào beta: khi phát hiện chuột knock out Pdx1 không có

sự phát triển thành tụy, người ta cho rằng gen này có vai trò rất quan trọng trong sự

biệt hóa của tế bào beta Tế bào beta ñang phát triển sẽ ñồng biểu hiện Pdx1, Nkx6-1,

và Insulin quá trình này gây bất hoạt MafB và biểu hiện MafA, một tín hiệu quan trong

trong sự trưởng thành của tế bào beta Pdx1 cũng ñóng một vai trò trong sự hình thành các tế bào nội tiết, mã hóa cho insulin và somatostatin, hai sản phẩm tụy nội tiết, và

biểu hiện ñồng thời glucagon Vì vậy, Pdx1 chỉ biểu hiện mạnh ở tế bào beta (sản xuất

insulin) và tế bào delta (sản xuất somatostatin) mà không biểu hiện ở tế bào alpha (sản xuất glucagon)

Dựa vào vai trò của Pdx1 trong tế bào beta, nhiều nghiên cứu chuyển gen Pdx1

ñể tăng cường sự biểu hiện gen insulin ñã ñược tiến hành và cho kết quả khả quan

(Yanhua li et al, 2007 ; H Kajiyama et al, 2009; Huijuan Yuan et al, 2010)

Trang 39

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1 Vật liệu

- Máu cuống rốn người: ñược thu nhận từ Bệnh viện Hùng Vương- Tp HCM

có sự cho phép của sản phụ, cần ñảm bảo những ñiều kiện như:

• Máu ñược thu nhận ngay sau khi sản phụ sinh

• Cuống rốn phải ñược thu nhận từ trẻ sơ sinh khỏe mạnh, ñủ tháng

• Âm tính với HIV, HBV A, HBV B và các bệnh di truyền khác

• Mẫu máu ñược sử dụng tối ña trong vòng 48 giờ sau khi thu nhận

Primer cho phản ứng khuếch ñại gen Insulin, Pdx1, Ngn3, Glut2, GAPDH (gen

GAPDH ñược dùng như housekeeping gene)

Bảng 3.1 Thông tin primer dùng trong nghiên cứu

tham khảo

Kích thước sản phẩm

2007

139bp

Trang 40

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Bảng 3.2 Danh sách dụng cụ dùng trong nghiên cứu

7 Micropipette 100-1000 µl, 10-100 µl, 5-50 µl Nychiro Nhật

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	8,38 MB