Nghiên cứu sản xuất kháng sinh VANCOMYCIN từ xạ khuẩn STREPTOMYCES ORIENTALIS

Một số ứng dụng khác của Streptomyces 12 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 12 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar

Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm

Khoa Công Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường

BÀI TIỂU LUẬN

NGHIÊN CƯU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TƯ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES

ORIENTALIS

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai

Danh sách thành viên : Nguyễn Tuấn Ngọc 2013100090

2008100132

Huỳnh Ngọc Tuyền 2008100168 Lê Thị Thúy Hằng2008100110

MỤC LỤC

0 Tháng 12 -2011

I ĐẶT VẤN ĐỀ 2

II NỘI DUNG

1 Khái quát về Streptomyces orientalis 3

1.1 Streptomyces 3

1.2 Streptomyces orientalis 3

1.3 Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh 4

2 Khái quát về Vancomycin 4

2.1 Sinh tổng hợp 5

2.2 Dược và hóa học 6

2.3 Cơ chế tác dụng 7

3 Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis

8

3.1 Chủng giống vi sinh vật 7

3.2 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng

S orientalis 4912 8

3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 9

3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến 9

3.5 Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên

4 Một số ứng dụng khác của Streptomyces 12 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 12

4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar13

4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết

ra các protein dị để sản xuất dược sinh học 13 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) 13

I KẾT LUẬN 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, công nghệ sinh học đươc coi là một trong nhưng ngành công nghệ hàng đầu của thế giơi Và trong đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các loại hoạt chất ưng dụng trong y học cũng như nhưng lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống và nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc

Tư nhưng phương pháp sinh tổng hơp và bán tổng hơp thì công nghệ vi sinh tổng hơp kháng sinh tiếp tục khăng định vai trò quan trọng của mình Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh đươc tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn có khoảng 8.000 chất là do kháng sinh vi sinh vật tổng hơp, trong đó xạ khuẩn tổng hơp hơn 60% Các công trình nghiên cưu đã chưng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hơp kháng sinh đa dạng về cấu trúc trúc và đăc điểm kháng khuẩn Đăc biệt trong số đó có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều ưng dụng trong thực tiễn đời sống hiện nay

Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế nhưng nhà khoa học cũng như nhưng y bác sĩ không ngưng học hỏi tìm tòi để có thể tìm được ra những phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TƯ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, đươc nhóm tâm đắc nhất và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp ơ đề tài này

+ Mục tiêu :

Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin tư chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 phù hơp

vơi nguyên liệu và điều kiện môi trường khí hậu Việt Nam.

+ Nội dung nghiên cưu :

- Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống

- Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất

- Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nhỏ

2

- Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin tư dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912

- Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na

II NỘI DUNG

1 Khái quát về Streptomyces orientalis

1.1 Streptomyces

- Streptomyces là lơn nhất chi

của Actinobacteria và chi nhập của gia

đình streptomycetaceae Hơn 500 loài

Streptomyces vi khuẩn đã đươc mô tả Cũng

như vơi các Actinobacteria khác,

Streptomyces là Gram dương, và có bộ gen

vơi cao GC đươc tìm thấy chủ yếu trong đất và

thảm thực vật mục nát, nhất Streptomyces sản

xuất bào tử, và đươc ghi nhận về mùi của họ

mà kết quả tư sản xuất của một biến động chất

chuyển hóa, geosmin Streptomyces đươc

nghiên cứu rộng rãi nhất và đươc biết đến

nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces) Streptomyces thường sống ơ đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

1.2 Streptomyces orientalis

Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là

Streptomyces orientalis , nay đươc gọi là orientalis Amycolatopsis, vi

khuẩn Streptomyces chủ yếu đươc tìm thấy trong đất và thảm thực vật

mục nát Streptomyces orientalis ban đầu đươc tìm thấy trong đất Ấn

Độ và Indonesia Nó đươc phát triển trên môi trường thạch men một chiết xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C

Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, đươc

sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bơi vi khuẩn Gram dương, đăc biệt là khuẩn tụ cầu Nó hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hơp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Trong khi Vancomycin có thể hưu ích để ngăn ngưa viêm nhiễm, nó cũng có thể gây ra vấn đề Nó đã được báo cáo là gây độc cho thận, và trong vài trường hợp gây

Hình 1.1 Streptomyces

độc cho tai, đặc biệt là các dây thần kinh thính giác Do đó, Vancomycin thường đươc sử dụng như một loại thuốc cuối cùng, chỉ đươc sử dụng khi không có gì khác

1.3 Ứng dụng trong sản xuaát kháng sinh

Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp

- Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin

- Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml

- Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta còn có thể

sử dụng một số biện pháp kĩ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp Việc tuyển chọn các dòng cây kháng

bệnh này cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại

2 Khái quát về Vancomycin

Vancomycin là chất kháng sinh thuộc

nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực

trong điều trị bệnh, từng được coi là

phương thuốc cuối cùng vì có khả năng

điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy

4

Hình 1.2 Hình 1.3Hình 2.1

hiểm do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhiễm β-lactam) gây nên Vancomycin đã đươc đưa vào chưa bệnh tư hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn đươc coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chưa bệnh cao khi dùng một mình hoăc phối hơp vơi các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn vơi nhiều loại kháng sinh thông dụng Bơi vậy, việc nghiên cưu sinh tổng hơp vancomycin vẫn đươc quan tâm, phát triển, để tư đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao Hơn nữa nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế đề ra

Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nươc, phối hơp vơi điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xâây dựng một cơ sơ sản xuất kháng sinh này vơi công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

2.1 Sinh tổng hơp

Vancomycin sinh tổng hơp xảy ra thông qua tổng hơp protein khác nhau nonribosomal (NRPSs) Enzyme xác định trình tự axit amin trong quá trình lắp ráp đến 7 mô-đun Trước khi Vancomycin đươc lắp ráp thông qua NRPS, các axit amin đầu tiên đươc sửa đổi L-tyrosine đươc sửa đổi để trơ thành β hydroxychlorotyrosine (β-hTyr) và 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lương Măt khác, acetate đươc sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5-DPG)

Tổng hơp peptide Nonribosomal xảy ra thông qua phân biệt các mô-đun có thể tải và mở rộng các protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide tại địa điểm liên kết của các phạm vi hoạt động Mỗi module thường bao gồm một adenylation (A) tên miền, một chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền và tên miền ngưng tụ (C) hoăc kéo dài Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể đươc kích hoạt bằng cách chuyển đổi thành một phưc tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền vơi một đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine bơi thioesterification phưc tạp sau đó đươc chuyển vào miền PCP vơi việc đẩy AMP Trong sinh tổng hơp các Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có măt, chăng hạn như các epimerization (E) miền, đươc sử dụng isomerizes axit amin tư một lập thể khác, và một tên miền thioesterase (TE) đươc sử dụng như một chất xúc tác cho tạo

Một số loại thuốc kháng sinh

vòng và vận hành của phân tử thông qua một thioesterase phân cắt

Một tập hơp các multienzymes (CEPA enzym tổng hơp peptide, CepB, và CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp các heptapeptide (Hình 2) Các tổ chưc của CEPA, CepB, và CEP C chăt chẽ tương tự như tổng hơp peptide khác như nhưng chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, và SrfA3) và gramicidin (GrsA và GrsB) Mỗi enzym tổng hơp peptide kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt tưng lĩnh vực CEPA mã hóa cho mô-đun 1, 2, và 3 CepB mã hóa cho các mơ-đun 4, 5, và 6 và CepC mã hóa cho mơ-đun 7 Sau khi phân

tử heptapeptide tuyến tính đươc tổng hơp, Vancomycin đã phải trải qua thay đổi hơn nưa, chăng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl hóa Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 đươc sử dụng Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là nhưng enzym P450 Và ORF 9 và 14 đươc xác định là enzym thủy phân giả định Vơi sự gíup đỡ của các enzym này, các nhóm β-hydroxyl đươc giơi thiệu trên tyrosine dư lương 2 và 6, và khơp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2 Ngồi ra, haloperoxidase đươc sử dụng để gắn các nguyên tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một quá trình oxy hóa

6

Hình 2.2

2.2 Dươc và hóa học

Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa đươc sản xuất bơi quá trình lên men của các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước đây là chỉ định Nocardia orientalis )

Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác biệt rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết Các hình thái hiện diện trong thuốc là các măt nhiệt động ổn định hơn conformer và do đó có hoạt động mạnh hơn

2.3 Cơ chế tác dụng

Vancomycin hoạt động bằng cách ưc chế tổng hơp thích hơp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Do cơ chế khác nhau mà theo đó các vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (ngoại trừ một số loài do lậu cầu của Neisseria)

Các phân tử ưa nước lớn có thể hình thành liên kết hydro tương tác với các thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties các NAM / NAG- peptide Trong nhưng trường hơp bình thường, đây là một sự tương tác năm điểm Điều này ràng buộc

của vancomycin D-Ala-D-Ala ngăn chăn tổng hơp thành tế bào trong hai cách:

+ Ngăn chăn sự tổng hơp của polyme dài của N-acetylmuramic acid (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) đã hình thành sơi xương sống của các tế bào vi khuẩn

+ Ngăn cản các polyme xương sống để kìm chế sự hình thành, liên kết với nhau

3 Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis

3.1 Chủng giống vi sinh vật

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2, các hóa chất dung để phân tích, định lương và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912

A Hình dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C bào tử

8

Hình 3.1 Hình 2.5

Cơ chế tác dụng của Vancomycin

3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ơ xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn đươc môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sơ để nghiên cưu ảnh hương của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh

Hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose vơi hàm lương thích hơp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong

số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, vơi hàm lương 0,2% là thích hơp Nghiên cưu ảnh hương của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hơp cho sinh

trương, phát triển và sinh tổng hơp kháng sinh của chủng S orientalis 4912 là 280C và pH tư 6 đến 8 Lương giống đươc cấy vào môi trường lên men thích hơp 6 - 8% so vơi môi trường lên men

Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S orientalis

9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đăc trưng giống như ơ các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác

3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gây chủng đột biến bằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng

S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8-30,3% đối với xử lý bào tử và 66,33% đối với xử lý tế bào trần.

Hình 3.2