Nghiên cứu thuỷ phân chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân vào bảo quản sữa tươi nguyên liệu

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CHITIN, CHITOSAN BẰNG ENZYME HEMICELLULASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN VÀO BẢO QUẢN SỮA TƯƠI NGUYÊN LIỆU Luận văn thạc sĩ: Ngành Công nghệ sau thu hoạch Mã số:

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CHITIN, CHITOSAN BẰNG ENZYME HEMICELLULASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN VÀO BẢO

QUẢN SỮA TƯƠI NGUYÊN LIỆU

Luận văn thạc sĩ: Ngành Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 60.54.10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thị Luyến

Nha trang, 2007

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

Lê Thị Tưởng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

1 Cô giáo hướng dẫn: PGS - TS Trần Thị Luyến đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn khoa học để tôi hoàn thành tốt nghiệp này

2 Quý thầy cô đã dày công dạy dỗ chúng tôi trong suốt thời gian học Cao học

3 Quý thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đề cương thạc sĩ

4 Quý thầy cô trong Khoa Chế biến – Trường Đại học Nha trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

5 Trung tâm công nghệ sinh học và môi trường, phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm, phòng thí nghiệm công nghệ chế biến, phòng thí nghiệm vi sinh -

bộ môn công nghệ sinh học, phòng phân tích kiểm nghiệm và phòng đánh giá cảm quan - bộ môn QLCL  ATTP

MỤC LỤC

Bảng các chữ viết tắt trong luận văn

Danh mục các biểu bảng

Danh mục các sơ đồ - hình – đồ thị

MỞ ĐẦU -

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN -

1.1 Tổng quan về chitin -

1.2 Tổng quan về chitosan -

1.3 Tổng quan về COS -

1.4 Ứng dụng của chitin-chitosan-COS -

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin-chitosan-COS -

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước -

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước -

1.6 Tổng quan về enzyme -

1.6.1 Giới thiệu chung về enzyme -

1.6.2 Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme hemicellulase -

1.6.2.1 Một số nghiên cứu về enzyme hemicellulase -

1.6.2.2 Ứng dụng của enzyme hemicellulase -

1.7 Tổng quan về sữa bò -

1.8 TỔNG QUAN VỀ OXY HÓA CHẤT BÉO CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -

2.1 Vật liệu nghiên cứu -

2.2 Phương pháp nghiên cứu -

2.2.1 Phương pháp phân tích -

2.2.2 Bố trí thí nghiệm -

2.2.2.1 Quy trình dự kiến thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme -

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định các thống số của quy trình -

2.2.2.3 Quy trình dự kiến cho quá trình bảo quản sữa bò -

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu -

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu -

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ THỦY PHÂN CHI TIN,

Trang

1

2

4

6

8

8

11

13

15

18

18

23

27

27

29

29

30

31

33

36

36

38

38

39

40

41

45

46

46

47

3.1.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

3.1.2 Xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân

3.1.3 Xác định ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

3.1.4 Xác định ảnh hưởng thời gian quá trình thủy phân

3.2 QUY TRÌNH HOÀN THIỆN CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN, CHITOSAN BẰNG ENZYME HEMICELLULASE

3.2.1 Sơ đồ quy trình

3.2.2.Giải thích quy trình:

3.3 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ COS THÍCH HỢP BẢO QUẢN SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU

3.3.1 Chất lượng cảm quan của sữa bò tươi nguyên liệu

3.3.2 Chọn nồng độ COS thích hợp bảo quản sữa bò tươi nguyên liệu

3.3.2.1 Xác định lượng vi sinh vật ban đầu và lượng vi sinh vật sau 24giờ, 48giờ bảo quản ở nhiệt độ 6-80C

3.3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ COS đến sự biến đổi TPC trong bảo quản sữa

bò ở nhiệt độ 6- 80C

3.3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ COS đến sự biến đổi Coliforms trong bảo

quản sữa bò ở nhiệt độ 6-80C

3.3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ COS đến sự biến đổi S.aureus trong bảo quản

sữa bò tươi nguyên liệu ở nhiệt độ 6-80C

3.3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ COS đến ĐCQ-chung của sữa bò

3.3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ COS đến chỉ số peroxyt của váng sữa

3.4 TÍNH TOÁN SƠ BỘ GIÁ THÀNH SẢN PHẨM

3.4.1 Tính toán sơ bộ chi phí sản xuất chiti-COS bằng enzyme hemicellulase

3.4.2 Tính toán sơ bộ chi phí sản xuất chito-COS bằng enzyme hemicellulase

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

TPC Tổng số vi sinh vật hiếu khí (Total Plate Count)

E.coli Escherichia coli

S.aureus Staphylococus aureus

cfu Colony forming unit (Đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

NA Nutrient Agar

VRB Crystal Violet Neutral red Bile

MPN Most Possible Number

COS Olygosaccharide thu nhận từ chitin và olygosaccharide thu nhận

từ chitosan

Chiti - COS Olygosaccharide thu nhận từ chitin

Chito - COS Olygosaccharide thu nhận từ chitosan

ĐCQ-chung Điểm cảm quan chung

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

PL Phụ lục

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Thành phần hoá học trung bình của 1 lít sữa bò 32

2 Bảng 1.2 Các acid béo chủ yếu trong sữa bò nguyên liệu 33

3 Bảng 3.1: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thu COS 1-PL

4 Bảng 3.2: ĐCQ - chung của COS theo nhiệt độ 1-PL

5 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thu COS 1-PL

6 Bảng 3.4: ĐCQ - chung của COS theo nồng độ enzyme 2-PL

7 Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thu COS 2-PL

8 Bảng 3.6: ĐCQ - chung của COS theo pH 2-PL

9 Bảng 3.7.Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thu COS 3-PL

10 Bảng 3.8 ĐCQ - chung của COS theo thời gian 3-PL

11 Bảng 3.9: Mô tả chất lượng cảm quan của sữa bò tươi nguyên liệu 3-PL

12 Bảng 3.10: Một số chỉ tiêu lý – hóa của sữa bò tươi nguyên liệu 4-PL

13 Bảng 3.11: Một số vi sinh vật trong sữa bò tươi nguyên liệu 4-PL

14 Bảng3.12: Sự biến đổi vi sinh vật trong sữa bò tươi nguyên liệu

theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 6-80C

4-PL

15 Bảng 3.13: Ảnh hưởng nồng độ chito-COS đến TPC theo thời

gian bảo quản ở nhiệt độ 6÷ 80C

5-PL

16 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ chiti-COS đến TPC theo 5-PL

thời gian bảo quản ở nhiệt độ 6 ÷ 80C

17 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nồng độ chito-COS đến sự biến đổi

25 Bảng 3.23: Tính toán sơ bộ chi phí sản xuất chiti-COS 9-PL

26 Bảng 3.24: Tính toán sơ bộ chi phí sản xuất chito-COS 9-PL

4 Hình 2.3 Enzyme hemicellulase có nguồn từ Aspergillus niger 37

5 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình dự kiến cho quá trình thủy phân

chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase

40

6 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến

quá trình thủy phân

41

7 Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ enzyme

đến quá trình thủy phân

42

8 Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng pH đến quá

trình thủy phân

43

9 Hình 2.8: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian đến

quá trình thủy phân

44

10 Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm xác định nồng độ COS trong bảo

quản sữa bò tươi nguyên liệu

45

11 Hình 3.1: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thu COS 47

12 Hình 3.2: ĐCQ-chung của COS theo nhiệt độ 48

13 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thu COS 49

14 Hình 3.4: ĐCQ-chung của COS theo nồng độ enzyme 50

15 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất COS 51

16 Hình 3.6: ĐCQ-chung của COS theo pH 51

17 Hình 3.7:Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thu COS 52

18 Hình 3.8: ĐCQ-chung của COS theo thời gian 53

19 Hình 3.9: Quy trình hoàn thiện quá trình thủy phân chitin,

chitosan bằng enzyme hemicellulase

54

22 Hình 3.12: Sự biến đổi vi sinh vật trong sữa bò tươi nguyên liệu

theo thời gian bảo quản

59

23 Hình 3.13: Ảnh hưởng nồng độ chito-COS đến TPC theo thời

gian bảo quản

60

24 Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ chiti-COS đến TPC theo thời

gian bảo quản

60

25 Hình 3.15:Ảnh hưởng nồng độ chito-COS đến Coliforms 63

26 Hình 3.16: Ảnh hưởng nồng độ chiti-COS đến Coliforms 64

27 Hình 3.17: Ảnh hưởng nồng độ chito-COS đến S.aureus 66

28 Hình 3.18: Ảnh hưởng nồng độ chiti-COS đến S.aureus 67

29 Hình 3.19 : ĐCQ-chung của sữa bò tươi nguyên liệu khi bổ sung

MỞ ĐẦU

Chitin (poly-N-acetylglucosamin) là một polymer sinh học có nhiều trong cấu trúc khớp, sụn của các động vật bậc thấp, trong thành phần tế bào một số vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, và trong lớp vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, ốc, hến, Quá trình thu nhận, tách chiết chitin, chitosan (poly-glucosamin), COS và glucosamin được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y – dược và bảo vệ môi trường như các chất đông tụ, điều chỉnh và kiểm soát pH, chất làm dai giấy viết, thuốc chữa xương khớp, da nhân tạo, [9, 13] Ở Việt Nam, chitin và chitosan đã được nghiên cứu và sản xuất quy

mô pilot từ phế liệu của ngành chế biến thủy sản và được ứng dụng làm chất kháng khuẩn trong nông nghiệp, làm thuốc chữa bỏng và chất làm dai trong sản xuất giò chả thay thế hàn the độc hại [50]

Chitin không có khả năng hoà tan trong nước vì vậy việc sử dụng chúng rất hạn chế Chitin phần lớn dùng làm nguyên liệu để sản xuất chitosan Chitosan là sản phẩm được deacetyl từ chitin Mặc dù chitosan có tính hoạt động sinh học mạnh nhưng cơ thể hấp thụ kém và không có khả năng hòa tan trong nước vì khối lượng phân tử lớn nên hạn chế sử dụng trong một số ứng dụng lớn Một hướng nghiên cứu mới hiện nay trong lĩnh vực chitin, chitosan là sản xuất COS hòa tan từ chitin, chitosan được chiết suất từ vỏ tôm, cua, ghẹ trong ngành thủy sản nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng của COS và góp phần hạn chế hiện trạng ô nhiễm môi trường trong ngành thủy sản nước ta hiện nay

Từ tính cấp thiết trên tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thuỷ phân chitin 

chitosan bằng enzyme hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân vào bảo quản sữa tươi nguyên liệu”

Nội dung của đề tài:

- Nghiên cứu các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân chitin chitosan bằng enzyme hemicellulase

- Nghiên cứu nồng độ COS thích hợp dùng bảo quản sữa tươi nguyên liệu

Tính khoa học của đề tài:

Luận văn đã đưa ra được các thông số thích hợp thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase và sản phẩm thu được là COS Đây là một chất có hoạt tính sinh học, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Luận văn cũng đưa ra được nồng độ COS thích hợp dùng bảo quản sữa tươi nguyên liệu

Tính thực tiễn của đề tài

Kết quả của luận văn góp phần giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường hiện nay trong ngành chế biến thủy sản Việt Nam Mở ra một hướng mới trong công nghệ sản xuất COS từ enzyme và trong công nghệ bảo quản sữa tươi nguyên liệu Ngoài ra các số liệu của luận văn còn cung cấp thêm các thông số khoa học để bổ sung vào các tài liệu phục vụ giảng dạy và là cơ sở cho các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng COS tiếp theo

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN

Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất Trong

tự nhiên chitin tồn tại cả ở động vật, thực vật

Đối với cơ thể động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong thế giới thực vật chitin có ở thành tế bào của một số nấm và tảo như:

nấm Zygemycether, một số tảo Chlorophiceae, nấm bất toàn(Fugiimperfecti), tảo khuẩn (Phycomycetes),

Trong động vật thủy sản đặc biệt trong vỏ tôm, cua, ghẹ và xương mực hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ cao, từ 14 – 35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ, xương mực là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng

Chitin là polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ [11]

Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N – acetyl – β – D

Glucosamin nối với nhau nhờ cầu nối β – 1,4 Glucozit Có công thức phân tử là

[C8H13O5 ]n, trong đó n thay đổi phụ thuộc vào nguyên liệu

D - Glucosamin và 22.5% acid acetic [11]

Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như: thuốc tím (KMnO4), oxy già

H2O2), nước Javen (NaClO) hay Clorua vôi Ca(ClO)2… từ đó lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hoá để khử màucho chitin

Khi đun nóng chitin trong dung dịch kiềm đặc, chitin bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan [2] Dựa vào đặc tính này người ta đã sản xuất chitosan từ chitin.[11]

Chitin là một vật liệu chứa cả 2 nhóm chức –OH và –NH2 cho liên kết với enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể Chitin là một polymer kỵ nước,

độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học Dựa vào đặc tính này, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hóa trị qua cầu nối glutaraldehyt[5] Tuy nhiên, do tính chất kỵ nước nên bề mặt tiếp xúc của chitin nhỏ, khả năng tiếp xúc của enzyme cố định và cơ chất rất hạn chế Vì vậy hoạt tính của enzyme cố định trên chitin thường rất thấp [5]

Chitin đã được ứng dụng làm vật liệu cố định enzyme, hấp phụ kim loại trong xử lý nước thải, chất kích thích sinh trưởng và kháng bệnh cho thực vật, ứng dụng trong y dược làm chất chống đông máu, tăng cường hệ miễn dịch, làm mỹ phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy, công nghiệp dệt, [5]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN

Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β – D Glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 Glucozit Có công thức phân tử

là [C6H11O4N]n với phân tử lượng : Mchitosan = (161.07)n

Chitosan là dẫn xuất của chitin, được sản xuất từ chitin sau khi xử lý chitin trong môi trường kiềm đặc nóng Chitosan có những tính chất đặc biệt hơn chitin:

có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng tan trong môi trường acid acetic loãng tạo thành dung dịch dạng keo, nhớt và trong suốt, chitosan

có thể kết hợp với aldehyde để tạo gel, Vì vậy, khả năng ứng dụng của chitosan rất

rộng rãi [11]

Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp, hình thành gel, đây

là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng màu tím, phản ứng này có thể dùng để phân tích định tính chitosan [11]

Keo chitosan là một keo dương nên có tính kháng khuẩn, kháng nấm Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic

có khả năng bám dính vào bề mặt các điện tích âm Chính vì vậy mà chitosan có thể

tương tác với các polymer có điện tích âm như alginic và tạo lưới gel dẻo bền nhờ lực liên kết tĩnh điện.[1]

Gel Alginic - chitosan

khả năng hấp thụ canxi thúc đẩy quá trình bài tiết acid Uric chống ung thư bướu tham gia hình thành xương sụn trị được các bệnh: viêm loét dạ dày bệnh tiêu chảy bệnh táo bón chuột rút đặc biệt có khả năng kết hợp với mangan tham gia vào quá trình hình thành xương sụn rất tốt [48]

Khi thủy phân chitin, chitosan bằng acid hoặc enzyme sẽ cắt đứt các liên kết glucosit giải phóng các COS

Cơ chế sản xuất chiti-COS từ chitin:

Cơ chế sản xuất chito-COS từ chitosan.[38],[39]

n = 2 ÷ 10

1.4 ỨNG DỤNG CỦA CHITIN, CHITOSAN VÀ COS

Trường Đại học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật từ chitin nhờ phát hiện một số dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ thường mà không làm phá hủy cấu trúc polymer

Chitosan được sử dụng làm chất tạo màng, tạo keo dính để tạo viên bao bọc thuốc hoặc làm tá dược hay các chất mang sinh học dẫn thuốc

Chitin, chitosan và các oligomer của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh, chiti-COS được sử dụng làm thuốc giảm cholesterol trong máu [11]

Khoa Dược - Trường Đại Học Dược TP Hồ Chí Minh bước đầu đã nghiên cứu thành công thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng từ chitosan

Trường Đại học Pukyong National Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công ứng dụng của COS trong việc tăng sức đề kháng điều hòa lượng cholesterol cải thiện thiếu máu và bệnh gan điều hòa áp suất trong máu làm tăng khả năng hấp thụ canxi thúc đẩy quá trình bài tiết acid Uric chống ung thư bướu tham gia hình thành xương sụn trị được các bệnh: viêm loét dạ dày bệnh tiêu chảy bệnh táo bón chuột rút đặc biệt có khả năng kết hợp với mangan tham gia vào quá trình hình thành xương sụn [48]

Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa

sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời có tác dụng phân bón, thuốc trừ sâu, tăng

cường khả năng nảy mầm của hạt

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một

số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của mạ ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ tổng số, đồng thời hàm lượng các enzyme như amylase, catalase hay peroxidase cũng tăng lên Ngoài ra trong nông nghiệp còn sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm, trái cây, do dịch keo chitosan có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm men, vi sinh vật gram âm lên các loại hoa quả

Ngày nay chitosan cũng được sử dụng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm cá, cua để kích thích sinh trưởng

COS tạo nên một lớp phủ ngoài bảo quản hạt, điều hoà đất, làm tăng trưởng

lá, cành, tiêu diệt mầm bệnh, chống lại vi sinh vật,…

COS ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của rau cải, đậu cove và một số rau khác, có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, góp phần bảo vệ môi trường và thực hiện chương trình rau sạch, rau an toàn [11]

Nhờ khả năng đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein, và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg do đó chitosan được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy thực phẩm

Chitosan được sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm đông thực phẩm

Chitosan được sử dụng như một polymercation trong sản xuất agarose chất lượng cao từ agar có chất lượng kém

Chitosan có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các thành phần khác, nên

nó được ứng dụng vào việc khử màu cho đồ uống trái cây

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm, mốc, chống mất nước

Trong ngành công nghiệp dệt có thể thay đổi hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình trên vải rõ nét, chịu được acid, kiềm nhẹ Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải, vải chitosan được nghiên cứu bởi các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang

Trong công nghiệp sản xuất, do cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt, hay tăng độ nét khi in

Trong công nghiệp mỹ phẩm, chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm cho da, do tính chất của chitosan có thể dễ dàng cố định trên lớp biểu bì của da nhờ các nhóm – NH4+, các nhóm này liên kết với tế bào của da Nhờ vậy các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng bằng cách ngăn các chất lọc tia cực tím với nhóm - NH4

+

[11]

Bên cạnh đó, chitosan được sử dụng là thành phần của keo xịt tóc, do chitosan là polymer dương có thể kết hợp với protein của tóc và nhờ độ keo của nó khi khô sẽ làm cho tóc cứng giữ được nếp của tóc

Chế phẩm olygosaccharide ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của Ngô Với nồng độ phun thích hợp là 40 ppm, số lần phun là 3 lần/vụ, liều lượng

là 300l/ha, năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng ( theo nghiên cứu của Đại học Nông nghiệp I Hà Nội [11],[48]

COS có tính hoà tan cao, dễ dàng phát triển - chế biến thực phẩm có lợi cho sức khoẻ, đặc biệt thực phẩm dinh dưỡng và những loại đồ uống chức năng khác nhau

COS có tính kháng khuẩn cao nên được sử dụng làm tăng thời hạn bảo quản sản phẩm [2],[48]

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN – CHITOSAN – COS

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan, COS và ứng dụng của chúng đã được biết đến khá phổ biến Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất COS còn khá mới mẻ Ở nước ta, Trường Đại học Nha Trang bắt đầu nghiên cứu chiết tách được chitin, chitosan từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh ngày càng trở nên cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin, chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Hiện nay có một số cơ sở đang nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan trong đó Trung tâm Chế biến Trường Đại học Nha trang là nơi sản xuất chitosan có chất lượng cao

Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp

Ở miền Nam, Trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thuỷ sản phối hợp với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược TP.HCM, Phân viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin, chitosan trong các lĩnh vực nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

Năm 1998 – 2000 Trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất chitosan từ vỏ tôm Sú, vỏ tôm Mũ Ni, vỏ tôm Hùm, vỏ ghẹ Một dự án sản xuất thử nghiệm chitin, chitosan đã hoàn thành năm 2003 Trường Đại học Nha trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin, chitosan cho một số

cơ sở sản xuất Hiện nay sản phẩm chitin, chitosan của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Tường Đại học Nha Trang đang có uy tín cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số cơ sở sản xuất và nghiên cứu ở nước ta và đang chào hàng đi Thái Lan Sản phẩm chitosan của Trường Đại học Nha Trang đã góp phần giảm nhập khẩu chế phẩm chitosan nước ta hiện nay Trung tâm chế biến của trường Đại học Nha Trang hiện đang mở rộng sản xuất mặt hàng này với các quy trình: Quy trình công nghệ sản xuất chitosan từ vỏ ghẹ của Trần Thị Luyến Quy trình công nghệ sản xuất chitosan từ vỏ tôm Mũ ni của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Quy trình sử dụng papain sản xuất chitosan của Trần Thị Luyến

Năm 2005 Trần Thị Luyến nghiên cứu sản xuất COS từ chitin - chitosan bằng phương pháp hóa học Hiện nay công nghệ đã được hoàn thiện, sản phẩm đang tiếp tục được sản xuất nhưng năng suất còn nhỏ

Năm 2006 Trần Thị Luyến triển khai sản xuất COS bằng enzyme Đây là một hướng nghiên cứu mới ở trong nước, cần tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tượng enzyme khác nhau.[21]

Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan và COS ở trong nước

 Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng - Đại học Nha Trang

Nguyên liệu là vỏ tôm khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v = 1/ 2.5, ở nhiệt độ phòng, sau 48h vớt ra và rửa trung tính, tiếp theo ngâm trong NaOH 8%, nhiệt độ t0 = 1000C trong thời gian τ = 2h với tỷ lệ 1/ 2.5 để khử protein, sau đó vớt ra và rửa trung tính Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% trong 60 phút sau đó đem rửa sạch và tiếp tục tẩy màu bằng

Na2SO3 1.5 % trong thời gian τ = 15phút rồi vớt ra rửa sạch ta thu được chitin

Deacetyl bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v = 1/1 ở nhiệt độ t0 = 800C, sau thời gian 24h rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng tốt, chitin có màu trắng

Nhược điểm: Thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó dễ ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm[11]

 Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội:

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong dung dịch HCl 4% trong thời gian τ = 24h ở nhiệt độ phòng với

tỷ lệ w/v = ½ Sau đó vớt rửa trung tính và dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với

tỷ lệ w/v = 1/2.8, ở nhiệt độ t0 = 90÷ 950C trong thời gian τ = 3h Sau đó rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng bằng HCl 4% với tỷ lệ w/v = 1/2, ở nhiệt dộ phòng trong thời gian τ = 24h và đem rửa trung tính Để tách protein lần 2 ta ngâm trong NaOH 2% với tỷ lệ w/v = 1/2.8 ở nhiệt độ t0 = 90 ÷ 950C sau 3h vớt ra và rửa trung tính rồi tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống hai lần trên Sản phẩm đem sấy khô

ta thu được chitin

Ưu điểm: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu

Nhược điểm: Thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm[11]

 Quy trình sản xuất chitosan của Trung tâm cao phân tử thuộc viện khoa học Việt Nam

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4%

ở nhiệt độ phòng, sau thời gian τ = 24h vớt ra và đem rửa trung tính để làm giảm

lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu chitin trong NaOH 3% ở nhiệt độ t0 = 90 ÷ 950C trong thời gian τ = 3h tiếp tục rửa trung tính và khử khoáng lần hai bằng HCl ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 24h sau đó tiếp tục rửa trung tính và nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ t0 =

90 ÷ 950C sau thời gian τ = 3h, sau đó lại tiếp tục rửa trung tính và đem nấu trong NaOH 40% ta thu được chitosan

Ưu điểm: Sản phẩm chitosan có màu sắc đẹp bằng sản phẩm chitosan theo quy trình của Đỗ Minh Phụng

Nhược điểm: Thời gian thực hiện dài, nhiều công đoạn[11]

 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm của Trần Thị Luyến trường Đại học Nha Trang

Vỏ tôm khô ngâm trong dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 5h, nguyên liệu là vỏ tôm tươi thì ngâm trong HCl với các thông số như trên nhưng tỷ lệ là w/v = 1/5 Sau đó đem rửa sạch và tiến hành xử lý trong kiềm đặc dung dịch NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10 trong thời gian τ = 5h, ở nhiệt độ t0 = 80 ± 20C để khử protein, lipid và deacetyl, sau đó rửa sạch phơi khô thu được chitosan[12,14]

 Quy trình sử dụng enzyme papain sản xuất chitosan của Trần Thị Luyến trường Đại học Nha Trang

Vỏ tôm khô được xử lý trong điều kiện: dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 5h Nguyên liệu vỏ tôm tươi được xử lý tương tự nhưng với tỷ lệ w/v = 1/5 Sau đó tiến hành rửa sạch và khử protein bằng enzyme papain theo phương pháp bổ xung dung dịch 13% papain vào khối vỏ tôm đạt tỷ lệ w/v = 1/5, dùng acid HCl điều chỉnh pH về 5 ÷ 5.5 và nâng nhiệt độ lên 70

÷ 800C trong thời gian τ = 4h.[19]

Sau đó rửa sạch, làm khô ta thu được sản phẩm chitin, tiếp tục tiến hành deacetyl ở nhiệt độ t0 = 80 ± 20C trong thời gian τ = 6h Rửa sạch và phơi khô ta thu được chitosan

Ưu điểm: Hiệu suất thu chitosan cao

 Quy trình công nghệ sản xuất chitosan từ vỏ ghẹ của Trần Thị Luyến trường Đại học Nha Trang

Mai ghẹ được rửa sạch, làm nhỏ với kích thước khoảng 3x3cm sau đó đem khử khoáng bằng HCl 10% với tỷ lệ w/v = 1/4.6 ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 11h rồi vớt ra tiến hành rửa trung tính (lưu ý trong quá trình khử khoáng này phải thường xuyên khuấy đảo) Sau đó đem phơi khô hoặc sấy ở nhiệt

độ t0 = 40 ÷ 500C ta thu được sản phẩm chitosan[14],[18]

 Quy trình sản xuất chito -COS từ bằng phương pháp hóa học của Trần Thị Luyến trường Đại học Nha Trang

Chitosan được xay nhỏ, tiến hành thủy phân bằng HCl 10M, tỷ lệ chitosan/acid là ¼, khuấy 10 phút/300C Sau đó khuấy và ủ 110 phút/400C, nâng nhiệt độ lên 850C/2phút Sau đó mẫu được làm nguội và đem đi trung hòa bằng NaOH nồng độ 50%, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/2.2, nhiệt độ < 450C Tiến hành xử

lý màu bằng methanol (w/v:1/4; =10h) và ethanol (w/v:1/7; =15h) Ly tâm mẫu để loại bỏ nước và muối Sau đó, mẫu được sấy lạnh và đem đi nghiền nhỏ ta được bột COS[20]

 Quy trình sản xuất chito -COS từ bằng enzyme của Trần Thị Luyến trường Đại học Nha Trang

- Papain thương mại thủy phân chitosan ở điều kiện pH=5.5; nhiệt độ =

700C, thời gian 6 ngày cho hiệu suất thu chito-COS là 97%

- Papain từ đu đủ xanh thủy phân chitosan ở điều kiện pH=5.5; nhiệt độ =

750C, thời gian 6 ngày cho hiệu suất thu chito-COS là 95%

- Chitinase chiết từ lá khoai lang thủy phân chitin trong điều kiện pH = 6, nhiệt độ = 250C, tỷ lệ enzyme/cơ chất:20ml/0,1g Tuy nhiên, hiệu suất thu chiti-COS không cao, cần nghiên cứu tiếp tục các điều kiện thủy phân chitin để chọn thông số thủy phân thích hợp

- Cellulase thủy phân chitin – chitosan ở điều kiện pH = 5.2 và nhiệt độ =

550C [21]

1.5.2.Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Nghiên cứu sự tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hoá và công nghệ tách chiết chitin đã có từ những năm 30 của thế kỷ này Theo Hiranol công nghệ sản xuất chitosan lần đầu tiên trên thế giới bởi Kyowa Yushi.Inc (1988), từ đó một vài công

ty Nhật tham gia sản xuất chitin, chitosan thương mại Công nghệ chitin, chitosan cũng được sản xuất với quy mô vừa và nhỏ ở Mỹ và một số quốc gia khác.[42]

Mãi đến năm 1975 những ứng dụng của chitin, chitosan mới phát hiện Kể từ

đó, chúng được đưa vào ứng dụng có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó, Nhật và Mỹ là hai nước sử dụng chitin, chitosan đứng hàng đầu thế giới với sản lượng 400- 600 tấn/năm, kế tiếp là Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp[42]

Trong năm 1990, tổng sản lượng chitin, chitosan thế giới sử dụng là

12000 tấn

Theo đánh giá của FAO, nhu cầu chitin, chitosan trên thế giới có thể tăng đến 36700 tấn/năm trong thế kỷ tới

Do những hạn chế về khả năng hòa tan của chitin, chitosan nên người ta tiến hành nghiên cứu các chế phẩm từ chitin, chitosan

Năm 1859 nhờ vào phát minh đầu tiên của Rouget khi đun sôi chitin trong dung dịch HCl đậm đặc Và về sau đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitin, chitosan và các sản phẩm thủy phân chitin, chitosan[38]

Năm 1994 Shigermase và các cộng sự cho rằng Lysozyme có khả năng thủy phân chitin và chitosan rất tốt trong điều kiện t = 37 0 C, pH = 5,4 với phương pháp:

Phương pháp A (sử dụng một lượng nhỏ enzyme lysozyme): Sự thuỷ phân chất keo chitin bởi lysozyme Cho một ít chất keo chitin ( 0.5% W/V, 10ml) trong 0,2 M dung dịch đệm acetate (pH = 5.4) với 0,05% NaN3, được ủ với lysozyme (2mg/ml, 1ml), tại 370C trong 3 ngày và sau đó cho thêm dung dịch enzyme lysozyme vào (1ml) Sau 3 ngày, lấy đi ly tâm và những sản phẩm trên bề mặt dung dịch mang đi phân tích bởi HPLC

Phương pháp B (sử dụng một lượng lớn enzyme lysozyme): Chitosan đã được deacetyl 30-72% Enzyme lysozyme (20mg) cho thêm vào, tạo nên một hỗn hợp, đem đi ủ ở 370C Trong thời gian ủ, tách ra 0,5ml đưa ra ngoài, acetylated và phân tích bằng HPLC[38]

Năm 1997 Muzzarelli cũng cho rằng hemicellulase, papain và lipase thủy phân chitosan, sản lượng (Chito-COS)n, n = 6 thu được 18% Muzzarelli (1997)

cũng cho rằng Strepmyces griseus HUT 6037 tiết ra enzyme ngoại bào chitinase và

chitosanase ứng dụng thủy phân chitin và chitosan của loài giáp xác[41]

Một nghiên cứu khác của Zhu và các cộng sự vào năm 2001 cho rằng dùng hemicellulase thủy phân chitosan, sản lượng hexaose thu được 18% và dùng cellulase thủy phân chitosan cho sản lượng Chito-COS là 37%[41]

Năm 1992 Murakami và các cộng sự cho rằng enzyme thủy phân chitosan ở những mức độ deacetyl khác nhau cho hiệu suất thu chito-COS khác nhau [11, 53]

Quy trình sản xuất chitosan của Yamasaki và Nacamichi ( Nhật Bản)

Nguyên liệu là vỏ tôm khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2M trong thời gian τ = 1h Sau đó đem rửa sạch rồi làm khô, tiến hành hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15M ở nhiệt độ t0 = 1500C trong thời gian τ = 1h Kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70% Sau thời gian 1h đem rửa sạch và làm khô ta thu được chitosan thành phẩm

Ưu điểm: Quy trình đơn giản, thời gian sản xuất ngắn so với các quy trình khác, hóa chất sử dụng ít, chitosan thu được có độ tinh khiết cao.[11]

Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackm

Vỏ tôm Hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ t0 = 1000C, được khử khoáng bằng cách ngâm trong HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 5h Sau đó đem rửa trung tính rồi sấy khô ở 1000C, và nghiền thành bột mịn rồi tiếp tục ngâm trong HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/2.5 cũng ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian τ = 48h Sau đó đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v = 1/2.5 ở nhiệt độ

t0 = 1000C trong gian τ = 42h rồi đem li tâm thu phần bã và tiến hành rửa trung tính Sau đó lại tiếp tục ngâm trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ như trên, trong thời gian τ = 12h rồi đem ly tâm thu phần bã Tiếp theo rửa trung tính và làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, ethanol, ether Và làm khô ta thu được sản phẩm chitosan dạng bột kem[11]

Năm 1996,1997 Aiba và Muraki cho rằng (Chito-COS)n, n = 1-7 có thể sản xuất được bằng cách dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitosan ở nhiệt độ

370C, pH = 4,5.[53]

 Quy trình xử lý và phân cắt chitosan của Aiba và Muraki (1996)

Chitosan(DA = 22%, hemicellulase

Thuỷ phân Đun sôi trong 3 phút

- Methanol 15ml + acetic anhydride 1ml trong 2h

- Methanol 10ml

Cô đặc đến 9ml

Phần kết tủa

Rửa với 0.1M NaOH – methanol(1:4) 5ml

Rửa với nước – methanol (1:4) 5ml

 Quy trình sản xuất chitosan của Pháp

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, sau đó xay nhỏ Tiến hành khử protein bằng dung dịch NaOH 3.5% với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ t0

= 650C trong thời gian τ = 2h rồi vớt ra rửa trung tính, sau đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 2h rồi vớt ra và tiến hành tẩy màu bằng acetone với tỷ lệ w/v = 1/5, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, vớt

ra và rửa sạch sau đó tẩy màu lại bằng NaOCl 0.135% với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 6 phút rồi vớt ra rửa trung tính ta th u được Chitin Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% tỷ lệ w/v = 1/4 ở nhiệt độ t0 = 850C trong thời

gian τ = 4h rồi đem rửa trung tính thu được chitosan

Ưu điểm: Thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố

Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polymer, do đó độ nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản xuất, công nghệ khó áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay[11]

1.6 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

1.6.1 Giới thiệu chung về enzyme

Hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong tế bào sống đều do enzyme xúc tác Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học Chúng không những có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học Mặt khác, enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm hàng nghìn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường [4],[5],[10]

Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân sacaroza nếu dùng sacaraza làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2.1012 lần so với khi dùng axit làm chất xúc tác

Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi không phân cực Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân

tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat Lượng nước hydrat này khá lớn và

có vai trò quan trọng là làm môi trường cho các phản ứng sinh hoá.[3]

Enzyme cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein Các tác nhân vật lý và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme vì vậy enzyme cũng bị mất hoạt tính khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung Phương trình phản ứng enzyme như sau:

Trong đó:

E: Enzyme; S: cơ chất; ES: Phức hợp enzyme – cơ chất; P: Sản phẩm

Enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp

Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá, đây là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn III: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu[3]

ES + S ES P + E

Enzyme có trong mọi tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật Do vậy người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn này để sử dụng trong công nghiệp Một số nguyên liệu dùng để tách chiết enzyme là [3],[4]

Từ thực vật: nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và quả dứa tách bromelain ,…

Từ động vật: Từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận nhiều enzyme khác nhau như từ dạ dày có thể thu được pepsin, từ tụy tạng thu được trypsin,…

Từ vi sinh vật: Vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm

nhiều loại: Aspergillus, Baccillus, Pencillium, Clostridium, Streptomyces và các loại

nấm men Vi sinh vật là đối tượng thích hợp nhất để sản xuất enzyme[5, 10] Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyne có những ưu điểm sau:

1.6.2 Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme hemicellulase

1.6.2.1 Một số nghiên cứu của enzyme hemicellulase

Hemicellulase là một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm: Xylan endo -1,3--xylosidase, EC 3.2.1.32; xylan 1,4--xylosidase, EC 3.2.1.37; và -L- arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55; Hemicellulase hoạt động tốt ở pH = 4,5÷5,5 và nhiệt độ dưới 500C [59],[60]

Hemicellulase là một enzyme thủy phân hemicellulose Hemicellulose là một

dạng của polysaccharides, hemicellulose có mặt ở thành tế bào, kém bền, có thể bị

thủy phân bởi dung dịch acid yếu và kiềm

Hemicellulase là một hỗn hợp enzyme có thể thủy phân những thành phần

khó tiêu hóa của mô thực vật Nó sẽ tấn công vào hemicellulose và giải phóng ra

những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn[60]

1.6.2.2 Một số ứng dụng của enzyme hemicellulase

Hemicellulase có khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl trên 22%,

trong điều kiện pH = 4,5, nhiệt độ 370C và sản phẩm thu được là (C6H11O4N).n, với

n = 1,2,3,4,5,6,7 Sản phẩm có khả năng hòa tan tốt trong nước Sản phẩm được ứng

dụng nhiều trong các ngành công nghệ thực phẩm, trong y học và trong nông nghiệp [53]

Ngoài ra, hemicellulase được ứng dụng nhiều trong xử lý phế liệu rau quả

(núm quả, lõi quả, rau, ) Vì hemicellulose trong rau quả chủ yếu là pentose,

hemicellulase sẽ thủy phân pentose tạo thành những phân tử đường có khối lượng

thấp hơn, giúp cơ thể sinh vật hấp thụ tốt hơn [32]

Hiện nay, hemicellulase còn được ứng dụng trong sản xuất dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH = 7, nhiệt độ = 500C, thời gian 6ngày với cơ chất là cơm dừa và phôi dừa[26]

Trong công nghệ sản xuất bia, nếu dùng nguồn nguyên liệu tinh bột khác thay thế malt với tỷ lệ cao sẽ bổ sung thêm enzyme hemicellulase nhằm đường hoá các tinh bột

Hemicellulase được ứng dụng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp tạo thành các hợp chất đơn giản dễ tiêu hoá[32]

1.7 TỔNG QUAN VỀ SỮA BÒ TƯƠI

Sữa là một trong những sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao nhất Trong sữa có đầy đủ tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết và dễ được cơ thể hấp thụ Ngoài các thành phần chính là protein, lactoza, lipit, muối khoáng còn có tất cả các loại vitamin chủ yếu, các enzym, các nguyên tố vi lượng không thể thay thế

Protein của sữa rất đặc biệt, có chứa nhiều và hài hòa các axitamin cần thiết Hàng ngày mỗi người chỉ cần dùng 100g protein sữa đã có thể thỏa mãn hoàn toàn nhu cầu về axit amin Cơ thể người sử dụng protein sữa để tạo thành hemoglobin dễ dàng hơn bất cứ protein của thực phẩm nào khác Độ tiêu hóa của protein sữa

96 – 98%

Lipit của sữa giữ vai trò quan trọng trong dinh dưỡng Khác với các loại mỡ động vật và thực vật khác, mỡ sữa chứa nhiều nhóm axit béo khác nhau, chứa nhiều vitamin và có độ tiêu hóa cao do có nhiệt độ nóng chảy thấp và chất béo ở dưới dạng các cầu mỡ có kích thước nhỏ

Giá trị dinh dưỡng của đường sữa không thua kém sacaroza

Hàm lượng muối canxi và phospho trong sữa cao, giúp cho quá trình tạo thành xương, các hoạt động của não Hai nguyên tố này ở dạng dễ hấp thụ, đồng thời lại ở tỷ lệ rất hài hoà Cơ thể có thể hấp thụ được hoàn toàn Đối với trẻ em, canxi của sữa là nguồn canxi không thể thay thế

Sữa là nguồn cung cấp tất cả các vitamin

Sữa không những bổ mà còn có tác dụng chữa bệnh, giải độc

Trong số các thức ăn tự nhiên của con người không có sản phẩm nào mà hỗn

hợp các chất cần thiết lại được phối hợp một cách có hiệu quả như sữa[34]

Chất béo sữa được coi là thành phần quan trọng Về mặt dinh dưỡng, chất

béo có độ sinh năng lượng cao, có chứa các vitamin hòa tan trong chất béo (A,D,E)

Đối với các sản phẩm sữa lên men, chất béo ảnh hưởng tới mùi vị, trạng thái của

sản phẩm Có tới 98 - 99% chất béo của sữa là các triglyxerit, 1-2% còn lại là

phospholipit, cholesterol, caroten, vitamin A, D, E và K

Trong sữa có 18 axit béo Mỗi glyxerit có thể kết hợp với ba phân tử axit béo

mà ba axit béo này có thể cùng loại hoặc khác loại Vì vậy số glyxerit khác nhau là

vô cùng lớn

Chất béo của sữa bao gồm các triglyxerit, diglyxerit, axit béo, sterol,

carotenoit, vitamin A, D, E, K, và một số chất khác

Khi để yên sữa, một lớp váng sữa sẽ được tạo thành trên bề mặt Dưới kính

hiển vi người ta nhận thấy trong váng sữa có rất nhiều thể hình cầu với kích thước

khác nhau, nổi tự do trong sữa Mỗi thể cầu mỡ được bao bọc bằng một màng mỏng[29, 30]

Bảng 1.1:Thành phần hóa học trung bình của 1 lít sữa bò

I Thành phần tạo hình hoặc cung cấp năng lượng

II Các chất xúc tác sinh học (không định lượng được hoặc ở dạng vết

Các sắc tố - enzyme – vitamin

III Các loại khí hòa tan: Khí cacbonic, oxy, nitơ (4-5% thể tích của sữa

ra khỏi vú)

Từ bảng 1.1 cho thấy, chất béo trong sữa bò có hàm lượng khá cao, gần 50%

so với tổng hàm lượng chất khô Đây là nguồn chất béo cung cấp năng lượng cao, các vitamin cần thiết cho cơ thể và một số các acid béo không no có hoạt tính sinh học nếu chất béo được bảo quản tốt Ngược lại, chất béo sẽ xảy ra các biến đổi do quá trình oxy hóa tạo nên các hợp chất gây màu, mùi làm hư hỏng sản phẩm và những hợp chất đó có thể gây ngộ độc đối với cơ thể con người

Bảng 1.2: Các axit béo chủ yếu trong sữa[23]

Các axit béo Số nguyên tử cacbon Điểm nhiệt độ nóng chảy Các axit béo no

16

31 Lauric

+14 -11 -5 Các axit béo chiếm 98-99% tổng chất béo của sữa Chất béo của sữa khác với mỡ của các động vật khác là chứa nhiều axit béo no, có khối lượng phân tử thấp

1.8 TỔNG QUAN VỀ OXY HÓA CHẤT BÉO

Chất béo được cấu tạo từ các acid béo chưa no dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của oxy không khí, nhiệt độ, ánh sáng, chất xúc tác kim loại như Cu, Fe, Zn, làm cho chất béo biến đổi nhiều Mức độ biến đổi chất béo phụ thuộc nhiều yếu tố

như O2, nhiệt độ, ánh sáng và hàm lượng kim loại nặng, enzyme lipoxidaza , nhưng quan trọng hơn cả là số lượng acid béo chưa no có trong chất béo

Khi chất béo bị oxy hóa, đầu tiên sẽ tạo ra các hợp chất peroxit, hydroperoxit Các hợp chất này không bền và có tính hoạt động mạnh nên nhanh phân hủy tạo thành aldehyd, keton, ketoacid làm cho sản phẩm có mùi ôi khét và bị biến màu, giảm giá trị cảm quan cũng như giá trị dinh dưỡng[24]

Hình 1.1 Sự biến đổi về giá trị cảm quan của chất béo

Ở nhiệt độ phòng, oxy không khí tác dụng chủ yếu vào các acid béo nhiều nối đôi Nhưng khi nhiệt độ trên 500C thì không chỉ các acid béo nhiều nối đôi bị oxy hóa, mà ngay cả acid béo một nối đôi cũng bị oxy hóa mạnh Đây là cơ sở để tác giả luận văn chọn khảo sát sự biến đổi của peroxit trong sữa bò trong điều kiện nhiệt độ phòng[31]

Giảm giá trị

dinh dưỡng

Hư hỏng về mùi, vị, màu sắc và giá trị dinh

dưỡng hoặc gây độc hại

Chất béo

Oxy hoá

Mất màu Aldehyd, alcol axit, xeton Gốc tự do

Peroxyt

Chỉ số peroxit là số gam iôt được giải phóng ra bởi peroxit có trong 100g

mẫu Trong không khí, các axit béo có trong chất béo, đặc biệt là các axit béo không

no dễ dàng bị oxi hóa một phần và tạo thành peroxit, gây nên hiện tượng mỡ bị ôi

Việc xác định chỉ số peroxit dựa vào phản ứng sau:

R1 – CH = CH – R2 + KI + 2CH3COOH R1 – CH – CH – R2

+ 2CH3COOK + H2O + I2Lượng iôt giải phóng ra được chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3

2 Na2S2O3 + I2 2 NaI + Na2S4O6

Chỉ số peroxyt biểu thị mức độ oxy hóa của chất béo Chỉ số peroxyt càng

cao chất béo càng kém chất lượng và chỉ số peroxyt tăng theo thời gian bảo quản[25]

O O