Xác định các genalen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa Việt Nam

Kết qu đánh giá kiểu hình các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r các mẫu giống nghiên c u ..... - Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh các Q

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHÙNG THỊ PHƯƠNG NHUNG

XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM

NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019

H C VI ỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

XÁC ĐỊNH CÁC GEN - ALEN ĐẶC THÙ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA

CÁC GIỐNG LÚA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truy ền và Chọn giống cây trồng

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Đỗ Năng Vịnh

GS.TS Pascal Gantet

NHÀ XU T B N H C VI N NỌNG NGHI P - 2019

L I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đơy lƠ công trình nghiên c u c a tôi, các kết qu nghiên

c u đ ợc trình bƠy trong luận án lƠ trung thực, khách quan vƠ ch a từng đ ợc sử

c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp), đƣ t o điều ki n thuận

lợi cho tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy

Tôi xin c m n Ch ng trình h c bổng GRiSP – IRRI, Trung tơm Hợp tác quốc tế nghiên c u vƠ Phát triển nông nghi p bền vững (CIRAD - Pháp),Vi n Nghiên c u vì sự Phát triển (IRD – Pháp), đề tƠi "Nghiên c u ch c năng gen quy

đ nh phát triển bộ r lúa, phục vụ ch n t o giống lúa ch u h n bằng công ngh gen” thuộc "Ch ng trình tr ng điểm phát triển vƠ ng dụng công ngh sinh h c trong lĩnh vực Nông nghi p vƠ PTNT đến năm 2020” - Bộ Nông nghi p vƠ Phát triển nông thôn Vi t Nam, đƣ tƠi trợ kinh phí cho các phần nghiên c u c a tôi

Đặc bi t tôi xin bƠy tỏ lòng biết n sơu sắc tới GS.TS Đỗ Năng V nh, GS.TS Pascal Gantet, TS Brigitte Courtois đƣ trực tiếp h ớng dẫn vƠ giúp đỡ

tận tình trong quá trình h c tập, nghiên c u để tôi hoƠn thƠnh luận án nƠy

Tôi xin chơn thƠnh c m n: Các thầy cô, đồng nghi p đƣ quan tơm, giúp

đỡ, động viên vƠ đóng góp nhiều ý kiến cho vi c hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các

cộng tác viên, kỹ thuật viên, t i Phòng thí nghi m tr ng điểm Công ngh tế bƠo

thực vật, Phòng thí nghi m liên kết Vi t- Pháp, Vi n Di truyền Nông nghi p; Bộ môn Qu n lý Ngơn hƠng gen- Trung tơm TƠi nguyên di truyền thực vật; Phòng Nghiên c u Di truyền – CIRAD – Pháp, đƣ giúp đỡ tôi trong quá trình lƠm thí nghi m vƠ hoƠn thƠnh luận án nƠy; Các thƠnh viên trong gia đình, b n bè đƣ t o điều ki n vƠ động viên tôi trong suốt quá trình thực hi n luận án nƠy

Xin trơn tr ng c m n!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác gi lu n án

Phùng Th Ph ng Nhung

M C L C

L i cam đoan i

L i c m n ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục b ng ix

Danh mục hình x

Trích yếu luận án xii

Thesis abstract xiv

Ph n 1 M đ u 1

1.1 Tính c p thiết c a đề tƠi 1

1.2 Mục tiêu nghiên c u c a đề tƠi 3

1.3 Ph m vi nghiên c u 3

1.4 Những đóng góp mới c a đề tƠi 4

1.5 Ý nghĩa khoa h c vƠ thực ti n c a đề tƠi 5

Ph n 2 T ng quan tƠi li u 6

2.1 Vai trò vƠ đặc điểm bộ r lúa 6

2.1.1 Vai trò c a bộ r cơy lúa 6

2.1.2 Đặc điểm c u trúc c a bộ r lúa 7

2.1.3 Đặc điểm phát triển c a bộ r lúa 10

2.2 QTLs vƠ Gen liên quan đến sự phát triển bộ r lúa 12

2.2.1 Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ r lúa 12

2.2.2 Các gen liên quan đến sự hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa 16

2.3 Nguyên lý vƠ ng dụng c a GBS 24

2.3.1 Ph ng pháp gi i trình tự NGS – nền t ng c a GBS 24

2.3.2 Nguyên lý c a ph ng pháp GBS 28

2.3.3 Các ng dụng c a GBS trong ch n giống cơy trồng 33

2.4 Nguyên lý vƠ ng dụng c a GWAS 35

2.4.1 Nguyên lý 35

2.4.2 GWAS lƠ một công cụ mới hữu hi u 36

2.4.3 Các b ớc xơy dựng một nghiên c u GWAS 38

2.4.4 Ý nghĩa vƠ tiềm năng c a GWAS trong ch n t o giống lúa 42

2.5 Nguồn gen lúa vƠ tình hình nghiên c u r lúa Vi t Nam 44

2.5.1 Nguồn gen lúa Vi t Nam 44

2.5.2 Tình hình nghiên c u đặc điểm bộ r lúa Vi t Nam 45

Ph n 3 V t li u vƠ ph ng pháp nghiên c u 48

3.1 Đ a điểm nghiên c u 48

3.2 Th i gian nghiên c u 48

3.3 Vật li u nghiên c u 49

3.4 Nội dung nghiên c u 49

3.5 Ph ng pháp nghiên c u 51

3.5.1 Chiết tách ADN tổng số 51

3.5.2 Phơn tích đa d ng di truyền bằng ch th DArT 51

3.5.3 Phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) 54

3.5.4 Phơn tích c u trúc di truyền c a tập đoƠn mẫu giống nghiên c u 54

3.5.5 Xác đ nh m c độ phơn rƣ c a LD (Linkage Disequilibrium) 55

3.5.6 Đánh giá đặc điểm nông sinh h c 56

3.5.7 Ph ng pháp đánh giá kiểu hình bộ r 57

3.5.8 Lập b n đồ liên kết (GWAS) 60

3.5.9 Ph ng pháp xác đ nh các gen ng viên 61

Ph n 4 K t qu vƠ th o lu n 62

4.1 Đặc điểm c a bộ s u tập giống lúa 62

4.1.1 Đặc điểm thu đ ợc qua thông tin hồ s mẫu giống 62

4.1.2 Đặc điểm nông sinh h c c b n 63

4.2 Kết qu phơn tích đa d ng di truyền với ch th DArT 68

4.2.1 Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền 68

4.2.2 Xơy dựng cơy phơn lo i cho các giống lúa nghiên c u 69

4.3 Kết qu phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS –Genotyping by sequencing) 72

4.3.1 Kết qu phơn tích đa hình vƠ c u trúc di truyền với SNPs marker 72

4.3.2 Đặc điểm c a các mẫu giống lúa trong các phơn nhóm khác nhau 75

4.3.3 Kết qu phơn tích Linkage Disequilibrium (LD) 82

4.4 Kết qu đánh giá kiểu hình các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r các mẫu giống nghiên c u 86

4.4.1 Kết qu phơn tích ph ng sai vƠ các thống kê c b n 86

4.4.2 Kết qu phơn tích thƠnh phần chính 98

4.5 Kết qu phơn tích liên kết toƠn h Gen (GWAS) 101

4.5.1 Các QTLs liên kết với tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r 101

4.5.2 Các gen ng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ r 114

4.5.3 Điểm đặc bi t c a vùng QTLs liên kết với NCR trên NST số 11 120

Ph n 5 K t lu n vƠ ki n ngh 131

5.1 Kết luận 131

5.2 Kiến ngh 132

Danh sách các công trình liên quan đến luận án 133

TƠi li u tham kh o 134

Phụ lục 158

DANH M C CH VI T T T

Ch vi t t t Ch vi t đ y đ Ti ng Vi t

ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length

Polymorphism

Đa hình độ dƠi các đo n nhơn

b n ch n l c ANOVA Analysis of Variance Phơn tích ph ng sai

bp Base pair 1bp = 1cặp nucleotide

CH Central Highlands Vùng Tơy Nguyên

Chr Chromosome Nhi m sắc thể

cM Centimorgan Xen-ti-mooc-gan

CRL1 Crown Root Less 1 Đột biến gơy m t r b t đ nh

lúa DAPC Discriminant Analysis of Principal

20 cm

Khối l ợng khô c a phần r từ

0 đến 20 cm DW2040 Dry Weight of root part in the 20-

40 cm

Khối l ợng khô c a phần r từ

20 đến 40 cm DW4060 Dry Weight of root part in the 40-

60 cm

Khối l ợng khô c a phần r từ

40 đến 60 cm DWB60 Dry Weight of root part Below 60

cm

Khối l ợng khô c a phần r dƠi

h n 60 cm FYPP Phytochrome associated

serine/threonine proteinphosphates GA20oX Gibberelic acid 20 oxidase

GBS Genotyping By Sequencing Phơn tích kiểu gen thông qua

gi i trình tự GLM General Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính GWAS Genome-wide Association Studies Nghiên c u lập b n đồ liên kết

toƠn h gen IAA Auxin/ indole -3- acetic acid Auxin

IR Irrigated Canh tác ch động t ới tiêu

kb Kilo base pair 1kb =1000 bp

LBD Lateral organ boundary domain

LD Linkage Disequilibrium Sự m t cơn bằng liên kết

LLGTH Longest Leaf Length Chiều dƠi thơn

MAF Minor Allele Frequence Alen có tần số nhỏ h n

Mb Megabase pair 1Mb = 1000 kb

MIF Mini Zinc Finger

MLM Mix Linear Model Mô hình hồi quy tuyến tính hỗn

hợp MRD Mekong River Delta Đồng bằng sông Cửu Long MRH Morphogenesis of Root Hair

MRL Maximum of Root Length Chiều dƠi r tối đa

NCC North Central Coast Duyên h i Bắc Trung Bộ NCR Number of Crown Root Số l ợng r b t đ nh

NE Northeast Vùng Đông Bắc Bộ

NGS Next Generation Sequencing Công ngh gi i trình tự thế h

tiếp theo NILs Near Isogenic Lines Dòng đẳng gen

NR_T Number of crown roor per Tiller Số r b t đ nh trung bình/nhánh

PIN Pin- formed

PIP Plasma membrane Intrinsic Protein

PLAT Polycystin-1, Lipoxygenase,

Alpha-toxin and Triacylglycerol QHB Quiescent Center homobox

QTLs Quantitative Trait Loci Locus tính tr ng số l ợng R_S Root – Shoot ratio Tỷ l khối l ợng khô giữa phần

r vƠ phần thơn cơy RAPD Radnom Amplified Polymophism

RILs Recombinant Inbred Lines Dòng tái tổ hợp

RL Rainfed Lowland Canh tác n ớc tr i vùng th p

RR Response Regulator Yếu tố điểu ch nh ph n ng RRD Red River Delta Đồng bằng chơu thổ sông Hồng SCC South Central Coast Duyên h i Nam Trung Bộ SCR Scarecrow

SDW Shoot Dry Weight Khối l ợng khô phần thơn cơy

SE Southeast Vùng Đông Nam Bộ

TIL Number of Tiller Số nhánh

WOX WUCHEL-related

DANH M C B NG

3.1 Các giống lúa đ ợc dùng để xơy dựng th vi n DArT markers 53 4.1 Phơn nhóm mẫu giống theo th i gian sinh tr ng 64 4.2 Phơn nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hi u 65 4.3 Đặc điểm hình d ng h t c a các mẫu giống lúa Vi t Nam trong bộ s u tập

giống nghiên c u 67 4.4 Ch số FST giữa các nhóm phụ vƠ m c ý nghĩa P-value 75 4.5 Đặc điểm c a các phơn nhóm trong hai nhóm giống thuộc loƠi phụ indica

vƠ japonica 81

4.6 Sự phơn rƣ c a LD trên 12 nhi m sắc thể trong nhóm giống indica vƠ

japonica 83 4.7 Kết qu phơn tích ANOVA vƠ h số di truyền theo nghĩa rộng c a các tính

tr ng nghiên c u 87 4.8 Các giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng liên quan đến đặc điểm phát

triển bộ r các mẫu giống nghiên c u 88 4.9 Giá tr thống kê c b n c a các tính tr ng nghiên c u theo 2 nhóm giống

indica (ind) vƠ japonica (jap) 91

4.10 So sánh giá tr trung bình c a các tính tr ng giữa các phơn nhóm thuộc

nhóm giống indica vƠ japonica 94

4.11 H số t ng quan giữa các tính tr ng theo dõi c tập đoƠn vƠ riêng cho

từng nhóm giống indica vƠ japonica 95

4.12 Danh sách các QTLs đƣ xác đ nh đ ợc với P-value < 1E-04 c tập đoƠn

vƠ hai nhóm giống indica vƠ japonica 103

4.13 Các QTLs liên kết với nhiều h n một tính tr ng nghiên c u c tập đoƠn

vƠ hai nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica 112

4.14 Danh sách các gen ng viên đƣ đ ợc khẳng đ nh về vai trò vƠ ch c năng

đối với sự phát triển bộ r 116 4.15 Các giống lúa có kiểu hình t ng ph n vƠ haplotype khác bi t t i vùng

QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR trên NST số 11 123 4.16 Danh sách các gen nằm trong vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng NCR

trên NST số 11 127

DANH M C HỊNH

2.1 ThƠnh phần r c u trúc nên bộ r lúa 8

2.2 C u trúc xuyên tơm c a r lúa 9

2.3 Tổ ch c mô theo chiều d c vƠ mô hình phơn chia tế bƠo r lúa 10

2.4 Số l ợng QTLs liên kết với đặc điểm bộ r lúa trên các vùng nhi m

sắc thể 14

2.5 Các b ớc gi i trình tự theo ph ng pháp Sanger (a) vƠ NGS (b) 27

2.6 Các b ớc chính trong quá trình thực hi n GBS 29

2.7 So sánh ph ng pháp xác đ nh QTLs truyền thống vƠ GWAS 35

3.1 S đồ tổng quát quá trình thực hi n các nội dung nghiên c u 50

3.2 S đồ các b ớc thực hi n phơn tích đa d ng di truyền với DArT 52

3.3 Các ch tiêu vƠ v trí thu thập số li u các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r c a các giống nghiên c u 59

4.1 Đặc điểm phơn bố c a 214 mẫu giống lúa Vi t Nam sử dụng lƠm vật li u nghiên c u 63

4.2 Biểu đồ tần số phơn bố mẫu giống lúa theo chiều cao cơy 66

4.3 Tỷ l vƠ số l ợng các mẫu giống chia theo tính ch t nội nhũ 67

4.4 ThƠnh phần genome c a các mẫu giống nghiên c u 69

4.5 Cơy phơn lo i di truyền c a 270 mẫu giống với 241 DArT marker 70

4.6 Phơn bố c a GBS marker trên 12 nhi m sắc thể vƠ ch số đa hình (PIC) c a chúng trong ma trận haplotype chuẩn b cho GWAS 73

4.7 Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica 77

4.8 Các phơn nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ japonica 80

4.9 Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST nhóm giống indica 84

4.10 Sự phơn rƣ LD theo kho ng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST nhóm giống japonica 85

4.11 Hình nh biểu di n mối t ng quan giữa thơn vƠ r c a các mẫu giống trong tập đoƠn sử dụng phần mềm RASTA 89 4.12 Tần số phơn bố c a một số tính tr ng nghiên c u trong hai nhóm loƠi phụ

4.13 Vòng tròn t ng quan xơy dựng bằng phơn tích thƠnh phần chính (PCA)

cho các tính tr ng nghiên c u 99 4.14 Phơn bố c a các giống lúa trong tập đoƠn nghiên c u trên mặt phẳng PCA

dựa trên dữ li u kiểu hình c a các tính tr ng nghiên c u 100 4.15 Hình biểu di n QQ-Plot cho c tập đoƠn vƠ hai nhóm giống thuộc loƠi phụ

indica vƠ japonica 102

4.16 Manhattan Plot c a tính tr ng số l ợng r (NCR) c tập đoƠn vƠ hai

nhóm mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica 108

4.17 Manhattan Plot c a tính tr ng độ dƠy r (THK) c tập đoƠn vƠ hai nhóm

mẫu giống thuộc loƠi phụ indica vƠ japonica 109

4.18 Tỷ l các d ng alen các v trí đánh d u xung quanh q45 122

TRệCH Y U LU N ỄN

Tên Tác gi : Phùng Th Ph ng Nhung

Tên Lu n án: “Xác đ nh các gen-alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ r c a các

giống lúa Vi t Nam”

Chuyên ngƠnh: Di truyền vƠ Ch n giống cơy trồng Mƣ s : 9 62 01 11

Tên c s đƠo t o: H c vi n Nông nghi p Vi t Nam

M c đích vƠ đ i t ng nghiên c u c a lu n án

M ục đích nghiên cứu

- Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ li u

kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng về đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống lúa Vi t Nam,

- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) vƠ kiểu hình c a các tính tr ng chính liên quan đến sự phát triển bộ r c a các mẫu giống đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên

c u GWAS

- Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh các QTLs vƠ các gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a một tập đoƠn giống lúa Vi t Nam

Đối t ợng nghiên cứu

Đề tƠi đƣ khai thác sự đa d ng di truyền c a lúa Vi t Nam từ đó xác đ nh các QTLs/ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r bằng ph ng pháp lập b n đồ liên

kết toƠn h gen (GWAS – Genome wide Association Studies)

kiểu hình bộ r sử dụng ph ng pháp ống r c i tiến, cơy lúa 6 tuần tuổi

- Các phần mềm đ ợc sử dụng trong nghiên c u gồm: DArTsoft 7.4, DArWin 5, STRUCTURE; BEAGLE; TASSEL; R; RASTA; vƠ các phần mền hỗ trợ phơn tích

thống kê SAS 9.2; R; XLstat, Excel

K t qu chính vƠ k t lu n

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đề tƠi đƣ khám phá ra các QTLs/ gen ng viên liên kết với các tính tr ng chính đóng vai trò quan tr ng trong sự phát triển bộ r một tập đoƠn nguồn gen lúa Vi t Nam Kết qu nƠy lƠ c s thúc đẩy các nghiên c u tiếp theo nhằm lƠm rõ m ng l ới

các gen liên quan đến quá trình điều khiển sự phát sinh, phát triển bộ r lúa H n nữa,

sự thƠnh công c a nghiên c u nƠy cho th y kh năng kết hợp hi u qu các kỹ thuật phơn tích h gen hi n đ i trong phơn tích h gen cơy trồng, góp phần thúc đẩy sự hiểu biết các

yếu tố di truyền liên quan đến các tính tr ng quan tơm, đặc bi t có ý nghĩa cho c i tiến

giống cơy trồng, nh t lƠ trong bối c nh nh h ng sơu sắc vƠ ph c t p c a BĐKH

- Các kết qu trung gian c a đề tƠi nh : thông tin về đặc điểm nông sinh h c c

b n, đặc điểm đa d ng di truyền vƠ c u trúc quần thể, đặc điểm phát triển bộ r r t đa

d ng c a các mẫu giống nghiên c u, lƠ các c s dữ li u có tính tham kh o cao trong các ch ng trình ch n t o giống lúa Vi t Nam, đặc bi t lƠ các ch ng trình ch n t o

c i tiến bộ r lúa Mặt khác bộ dữ li u đa hình kiểu gen với 25971 SNPs phơn bố trong toƠn h gen đƣ đ ợc công bố có thể đ ợc tiếp tục sử dụng để phát triển các nghiên c u GWAS liên quan đến các tính tr ng nông sinh h c quan tr ng khác

K ết luận

1) Đề tƠi đƣ đánh giá đ ợc sự đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ đặc điểm nông sinh h c c b n c a 270 mẫu giống lúa, trong đó có 214 mẫu giống lúa Vi t Nam Đồng

th i đánh giá đ ợc sự đa d ng di truyền c a các mẫu giống lúa trên thông qua sử dụng

241 ch th DArT Từ kết qu đó xơy dựng đ ợc cơy phơn lo i di truyền có c u trúc

l ỡng cực, phơn các mẫu giống nghiên c u thƠnh các nhóm loƠi phụ khác nhau

2) Kết qu về phơn tích kiểu gen thông qua gi i trình tự (GBS) đƣ xơy dựng đ ợc

bộ dữ li u haplotype với 25971 ch th cho đa hình cao, hƠm l ợng thông tin đa hình (PIC) trung bình đ t 32,0% Sử dụng số l ợng lớn các ch th SNPs trong bộ dữ li u nƠy

để phơn tích c u trúc vƠ đa d ng di truyền c a nhóm giống indica, japonica Vi t Nam

cho th y 114 mẫu giống lúa indica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 6 phơn nhóm từ I1 đến

I6, 62 mẫu giống japonica Vi t Nam đ ợc phơn thƠnh 4 phơn nhóm từ J1 đến J4 với

những đặc điểm đặc tr ng riêng

3) Kết qu đánh giá kiểu hình bộ r đƣ xơy dựng đ ợc bộ dữ li u kiểu hình r gồm

18 tính tr ng c a 194 mẫu giống lúa Các mẫu giống đa d ng về đặc điểm hình thái vƠ

c u trúc bộ r , đặc bi t lƠ các tính tr ng số l ợng r , độ dƠy r , khối l ợng khô c a r các tầng đ t khác nhau, độ dƠi r Đặc bi t đƣ xác đ nh đ ợc một số giống lúa có bộ r dƠi vƠ dƠy thuộc phơn nhóm I3 có ý nghĩa trong ch n giống nh : Blề Blậu Chớ (G205),

Tẻ n ng (G153), Khẩu Năm Rinh (G189), Khẩu Pe L nh (G155)

4) Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, nghiên c u đƣ cung c p một danh sách gồm 88 QTLs liên kết với 18 tính tr ng nghiên c u, trong đó có

28 QTLs đồng th i liên kết với nhiều h n một tính tr ng, 33 QTLs nằm trong vùng trình

tự c a gen ch c năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng số l ợng r (NCR) trên NST số 11, vƠ 1 vùng QTLs liên kết chặt với độ dƠy r (THK) trên NST số 2 Căn c v trí c a QTLs, xác đ nh đ ợc 889 gen ng viên, trong đó có 407 gen đƣ đ ợc xác đ nh vƠ phơn nhóm ch c năng gi đ nh, 24 gen trong số nƠy đƣ có các công bố ch ng minh ch c năng hóa sinh vƠ sinh h c liên quan đến sự phát triển bộ r

THESIS ABSTRACT

PhD Candidate: Phung Thi Phuong Nhung

Thesis title: Identification of new genes and alleles associated with root development in

a core collection of rice varieties in Vietnam

Major: Genetic and Plant breeding Code: 9.62.01.11

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

The development of Genome-wide Association studies (GWAS) in crops has made it possible to mine interesting alleles hidden in gene bank resources However, only a small fraction of the rice genetic diversity of any given country have been exploited in the studies with worldwide sampling conducted to date The thesis had been researched to development of a panel of rice varieties from Vietnam for GWAS purposes to identify some new QTLs and candidate genes associated with root development

Materials and Methods

The panel, initially composed of 270 accessions, was characterized for simple agronomic traits (maturity class, grain shape and endosperm type) commonly used to classify rice varieties We first genotyped the panel using Diversity Array Technology (DArT) markers (6144 clones) We analyzed the panel structure, identified two

subpanels corresponding to the indica and japonica sub-species and selected around 200

non-redundant accessions for Genotyping By Sequencing (GBS) (with 50000 marker)

A matrix adapted for GWAS was built by eliminating the markers with a minor allele frequency below 5% and imputing the missing data The panel of 200 rice varieties was phenotyped under greenhouse conditions for several root traits in an experimental design with 3 replicates The results were submitted to association mapping using a mixed model involving structure and kinship to enable the identification of significant associations The analyses were conducted successively on the whole panel (185

accession) and on its indica (115 accessions) and japonica (64 accessions) subpanel

Main findings and Conclusions

Scientific and practical significance

The publicly available panel constitutes an imprortant resource giving access to original allelic diversity It will be use for GWAS on root, panicle traits, grain and yield traits, or abiotic stress adaption

Some of the major QTLs we detected through this Genome-wide Association Study contain promising candidate genes encoding regulatory elements of known key

regulators of root formation and development

In rice breeding, major QTLs and candidate SNPs, candidate genes associated with such agronomy traits, identified though GWAS in this thesis research (after confirmed by functional studies and validations), have been deployed to enhance adaption and productivity of rice in future

Conclusions

1) The rice varieties studied showed a strong diversity of basic agronomic traits such as tree height, flowering time, branching and effective branching, growth time, grain shape, endosperm characteristics The 270 rice varieties exhibited genetic

diversity with bipolar structure, mainly indica (168 germplasms), and japonica (88 germplasms), the remaining are Aus/Boros and Sadri/Basmati

2) Results of GBS analysis produced a set of genetic data consisting of a polymorphic matrix of 25971 marker species with nearly 200 rice varieties in Vietnam, the PIC of these markers is 32% in average Results of population structure analysis

with SNP marker showed indica group was divided into 6 sub-populations (from I1 to I6) and japonica was divided into 4 sub-populations (from J1 to J4) Each group has its

own unique characteristics of basic agronomic traits, ecological regions and source of collection

3) The phenotypic assessment results provided a set of phenotypic data of 18 traits directly or indirectly related to rice root development in 194 rice varieties The

mean comparisons showed that subpopulations I3 and I6 in the indica subpanel and

subpopulations J1 and J3 in the japonica subpanel had the deepest and thickest roots while subpopulations I1 and I4 as well as J2 and J4 registered the poorest performances

in this respect The indica types from group I3 constitute interesting donors of deep and

thick root that may be used as parents in crosses in root breeding programes, example: Ble Blau Cho (G205), Te Nuong (G153), Khau Nam Rinh (G189), Khau Pe Lanh (G155)

4) Identified 88 QTLs at a high level for 18 traits Identify two strong QTLs related to root numbers (NCR) on chromosome 11 and related to root thickness (THK)

on chromosome 2 Based on the location of QTLs, in LD was calculated, 899 candidate genes were identified in the high confidence region of 88 QTLs, 33 QTLs in genes with predicted functions, 407 genes were identified function in hypothetical, 24 genes were identified whose reported biological function in consistent with the associated

phenotype, the rice gene or its predicted Arabidopsis ortholog

PH N 1 M Đ U

1.1 TệNH C P THI T C A Đ TĨI

Lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy l ng thực chính nuôi sống h n một nửa dơn

số thế giới Tổng di n tích gieo trồng c a lúa trên toƠn thế giới trong 10 năm gần đơy dao động trong kho ng 156 đến 161,7 tri u hecta (STATISTAT, 2018) Cơy lúa đ ợc gieo trồng nhiều quốc gia trên thế giới với nhiều h sinh thái khác nhau (t ới tiêu, n ớc tr i đồng bằng, ngập n ớc, n ng rẫy vùng cao) So với các cơy trồng khác, cơy lúa có nhu cầu n ớc lớn h n Sự thích nghi với các chế

độ th y văn khác nhau tr thƠnh một trong những đặc điểm c a giống tích lũy qua quá trình thuần hóa vƠ ch n l c tự nhiên NgƠy nay, tr ớc những di n biến

ph c t p khó kiểm soát c a Biến đổi khí hậu, các cơy trồng đặc bi t lƠ cơy lúa đang đ ng tr ớc nguy c b tổn h i nghiêm tr ng về năng su t vƠ s n l ợng do

những nh h ng c a h n, mặn, vƠ ngập lụt kéo dƠi Bộ r đóng vai trò quan

tr ng trong đ i sống cơy lúa, giúp cơy bám vƠo đ t, hút n ớc, dinh d ỡng vƠ nhiều ho t động trao đổi ch t khác nh h ng trực tiếp đến kh năng sinh tr ng, phát triển, năng su t, đặc bi t lƠ khi cơy gặp các điều ki n ngo i c nh b t lợi Một

bộ r có kh năng ăn sơu, r dƠy vƠ kh năng phơn nhánh rộng có thể giúp cơy lúa khai thác đ ợc n ớc từ những lớp đ t sơu h n trong điều hi n h n hán (Fukai

and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011) Bộ r ho t động tốt h n trong điều ki n

ngập n ớc sẽ giúp tăng kh năng chống ch u vƠ duy trì năng su t lúa trong điều

ki n ngập lụt (Bailey-Serres and Voesenek, 2010) T o ra những giống lúa có

kiểu hình bộ r phù hợp với mỗi điều ki n gieo trồng lƠ mục tiêu c a các nhƠ

ch n t o giống lúa trong bối c nh di n biến ph c t p c a Biến đổi khí hậu toƠn cầu nh ng r t khó thực hi n vì những h n chế trong quan sát trực tiếp bộ r Hiểu

biết về các yếu tố di truyền có liên quan đến các đặc điểm phát triển vƠ thích nghi

c a bộ r lƠ c s để phát triển vƠ ng dụng ph ng pháp ch n l c phơn tử trong các nghiên c u ch n t o, c i tiến bộ r lúa

Trong những năm gần đơy nghiên c u về r cơy trồng nói chung vƠ lúa nói riêng ngƠy cƠng đ ợc quan tơm Nhiều ph ng pháp khác nhau đƣ đ ợc sử dụng

để khám phá các yếu tố di truyền liên quan đến bộ r lúa, nh ph ng pháp gơy

đột biến (Guiderdoni and Gantet 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013),

ph ng pháp phơn tích s n phẩm phiên mƣ (transcriptomic) (Takehisa et al.,

2012), ph ng pháp xác đ nh QTLs sử dụng các quần thể lập b n đồ (Champoux

et al., 1995; Kamoshita et al., 2008; Khowaja et al., 2009) Nhiều gen liên quan đến đặc điểm hình thái vƠ ch c năng sinh lý c a r đƣ đ ợc xác đ nh, m ra c

hội để c i tiến năng su t lúa (Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013; Mai et al., 2014; Wu and Cheng, 2014) HƠng trăm QTLs liên quan đến các tính

tr ng bộ r lúa đƣ đ ợc công bố trên các quần thể lập b n đồ khác nhau (Courtois

et al., 2009) Tuy nhiên, h n chế c b n c a các QTLs đ ợc thiết lập bằng các

quần thể lập b n đồ lƠ độ dƠi c a đo n NST mang QTLs/gen ng viên có kích

th ớc r t lớn (Courtois et al., 2009) Mặt khác, số l ợng alen đ ợc đánh giá trong

mỗi nghiên c u xác đ nh QTLs sử dụng quần thể lập b n đồ r t h n chế, th i gian nghiên c u kéo dƠi (Buckler and Thornsberry, 2002)

Ph ng pháp GWAS (Genome-wide Association Studies) xu t hi n lần đầu tiên trong một nghiên c u di truyền ng i (Hirschhorn and Daly, 2005) sau sự

ki n gi i trình tự h gen ng i thƠnh công GWAS nhanh chóng đ ợc đ a vƠo

các nghiên c u thực vật, đặc bi t lƠ các cơy mô hình nh Arabidopsis (Atwell

et al., 2010) B n ch t c a GWAS lƠ thiết lập mối quan h thống kê liên kết giữa

sự dao động c a các tính tr ng đ nh l ợng ph c t p với các kiểu gen trong quần

thể (Nordborg and Weigel, 2008) Bằng vi c sử dụng số l ợng ch th lớn, mật độ cao, bao ph toƠn h gen vƠ các quần thể tự nhiên có sự suy gi m liên kết m t cơn bằng một cách nhanh chóng, GWAS đƣ m nh mẽ c i tiến độ phơn gi i t i

mỗi v trí QTLs xuống còn từ 1 đến vƠi chục kilo-base thay vì đ ợc tính bằng mega-base trong các nghiên c u tr ớc đó (Buckler and Thornsberry, 2002; Zhu

et al., 2008) Những QTLs đầu tiên liên quan đến sự phát triển c a bộ r lúa đ ợc xác đ nh bằng ph ng pháp GWAS đƣ đ ợc công bố trên các t p chí uy tín

(Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013), cho th y tiềm năng ng dụng c a

ph ng pháp nƠy trong nghiên c u di truyền các tính tr ng liên quan đến sự phát triển bộ r lúa

Sự tiến bộ vƠ ngƠy cƠng hoƠn thi n c a công ngh phơn tích genome thông

l ợng cao, sự phát triển các h thống ph ng pháp luận vƠ phần mềm phơn tích,

lƠ điều ki n thúc đẩy ngƠy cƠng nhiều các nhƠ khoa h c lựa ch n sử dụng GWAS

trong các nghiên c u c a mình (Zhu et al., 2008) Các bộ dữ li u kiểu gen đ i

di n cho sự đa d ng c a về đ a lý c a Oryza đƣ đ ợc xơy dựng (Tung et al., 2010; Courtois et al., 2013) vƠ đ ợc sử dụng trong GWAS với các tính tr ng r

lúa (Famoso et al., 2011; Courtois et al., 2013) Mặc dù h đƣ sử dụng quần thể

có kích th ớc khá lớn (từ 200 đến 400 mẫu giống), nh ng vẫn ch khai thác đ ợc

một phần nhỏ sự đa d ng c a lúa trên thế giới

Nền văn minh Vi t Nam gắn liền với cơy lúa n ớc Các giống lúa đ a

ph ng Vi t Nam khá đa d ng (ĐoƠn Thanh Quỳnh vƠ cs., 2016) Tuy ch a ph n ánh hết sự đa d ng c a lúa trên thế giới nh ng những nguồn gen đ a ph ng, đáng chú ý lƠ từ những vùng có điều ki n đ a lý, sinh thái khác nhau có thể mang các tính tr ng, các QTLs, các gen có ý nghĩa quyết đ nh trong các tính tr ng nông

h c quan tr ng cần đ ợc khám phá, khai thác (Myint et al., 2012; Radanielina et

al., 2013) Đơy lƠ nguồn tƠi nguyên quý giá để xác đ nh các yếu tố di truyền kiểm soát sự phát triển bộ r vƠ kh năng chống ch u với các stress phi sinh h c cơy lúa Xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển r các giống lúa Vi t Nam sẽ cung c p nền t ng quan tr ng để lƠm sáng tỏ c chế phơn tử về

sự phát triển bộ r vƠ t o điều ki n để c i tiến kh năng chống ch u với các điều

ki n ngo i c nh b t lợi lúa

1.2 M C TIểU NGHIểN C U C A Đ TĨI

- Lựa ch n các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ li u kiểu gen vƠ dữ

li u kiểu hình phục vụ cho các nghiên c u GWAS thông qua hh o sát sự đa d ng

về đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ di truyền c a một tập đoƠn các mẫu giống lúa Vi t Nam

- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu gen (haplotype) c a tập đoƠn mẫu giống đ ợc

ch n, lƠm c s dữ li u để phát triển các nghiên c u GWAS với các tính tr ng quan tơm

- Xơy dựng bộ dữ li u kiểu hình c a một số tính tr ng chính liên quan đến

sự phát triển bộ r c a các mẫu giống lúa đ ợc ch n, lƠm c s cho nghiên c u GWAS để xác đ nh các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a lúa Vi t Nam

- Sử dụng ph ng pháp GWAS để lập b n đồ liên kết toƠn h gen, từ đó xác đ nh các QTLs vƠ gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a các

giống lúa Vi t Nam

1.3 PH M VI NGHIểN C U

- Nghiên c u đ ợc thực hi n trên c s một tập đoƠn gồm 214 mẫu giống lúa đ ợc thu thập từ nhiều vùng c a Vi t Nam, 33 mẫu giống lúa đối ch ng đ i

di n cho đa d ng c a Oryza sativa trên thế giới do CIRAD cung c p vƠ 23 mẫu

giống khác đ ợc cung c p b i Vi n Di truyền Nông nghi p Các mẫu giống đƣ

đ ợc đánh giá về các đặc điểm nông sinh h c c b n vƠ đa d ng di truyền bằng

ch th DArT Kết qu nƠy lƠ c s để lựa ch n các mẫu giống cho thiết lập dữ

li u kiểu gen vƠ kiểu hình để phục vụ phát triển các nghiên c u GWAS

- Một tập đoƠn gồm 200 mẫu giống lúa đ ợc ch n đƣ đ ợc phơn tích kiểu gen bằng 50000 ch th SNPs, sử dụng ph ng pháp phơn tích kiểu gen thông qua

gi i trình tự GBS, vƠ đ ợc đánh giá biểu hi n c a 18 tính tr ng chính liên quan đến sự phát triển bộ r

- Phơn tích GWAS đ ợc tiến hƠnh đồng th i trên 3 ma trận dữ li u cho t t

c tập đoƠn (185 mẫu giống x 21623 marker), nhóm giống indica (115 mẫu giống

x 13842 marker), nhóm giống japonica (64 mẫu giống x 8821 marker)

- Kết qu nghiên c u giới h n m c xác đ nh đ ợc các QTLs/gen ng viên liên quan đến sự phát triển bộ r c a các mẫu giống lúa Vi t Nam trong tập đoƠn nghiên c u

1.4 NH NG ĐịNG GịP M I C A Đ TĨI

- Đƣ kh o sát vƠ đánh giá một cách có h thống các đặc điểm nông sinh h c

c b n c a tập đoƠn 270 giống lúa, trong đó có 214 giống lúa Vi t Nam

- Đƣ xác đ nh đ ợc m c độ đa d ng di truyền vƠ cơy phơn lo i c a một tập

hợp nguồn gen lúa Vi t Nam bằng một l ợng lớn ch th hi n đ i nh DArT vƠ SNPs marker

- Sử dụng ph ng pháp GBS xơy dựng đ ợc bộ dữ li u kiểu gen với 25971 SNPs marker, bao ph toƠn h gen với mật độ cao, lƠ c s để phát triển nghiên

c u GWAS với các mục tiêu khác nhau (năng su t, c u trúc bông, kh năng

chống ch u với sơu b nh vƠ điều ki n b t lợi) trên tập đoƠn lúa nghiên c u

- Luận án đƣ cung c p một bộ dữ li u gồm các thông số, thông tin c a các tính tr ng chính liên quan đến sự phát triển bộ c a h n 190 mẫu giống lúa Vi t Nam

- Kết qu lập b n đồ liên kết toƠn h gen (GWAS) cung c p một danh sách

gồm 88 QTLs liên kết với 18 tính tr ng theo dõi, trong đó có 33 QTLs nằm trong vùng mƣ hóa gen ch c năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng số l ợng r (NCR) NST số 11 vƠ 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính tr ng độ dƠy r (THK) NST số 2 Xác đ nh đ ợc 889 gen ng viên, trong đó có 407 gen đƣ đ ợc xác

đ nh vƠ phơn nhóm ch c năng gi đ nh, 24 gen trong đó đƣ có những công bố

ch ng minh ch c năng hóa sinh vƠ sinh h c liên quan đến sự phát triển bộ r

1.5 ụ NGHƾA KHOA H C VĨ TH C TI N C A Đ TĨI

- Những đóng góp về đặc điểm nông sinh h c c b n, đặc điểm phát triển

bộ r , đa d ng di truyền c a các giống lúa trong luận án sẽ m rộng vƠ nơng cao

những hiểu biết về sự đa d ng c a nguồn gen lúa Vi t Nam cũng nh thế giới LƠ

c s để lựa ch n vật li u cho các ch ng trình ch n t o giống lúa

- Bộ dữ li u kiểu gen gồm h n 25000 SNPs marker đ ợc đăng t i trên trang TropGenDB lƠ nguồn dữ li u m , có thể đ ợc cung c p cho các nhƠ khoa h c khác để tiếp tục phát triển các nghiên c u GWAS trên tập đoƠn nghiên c u với nhiều mục tiêu khác nh : xác đ nh các QTLs liên quan đến kh năng chống ch u, năng su t, ch t l ợng, c u trúc bông,…vv

- Dữ li u thông tin về đặc điểm bộ r có ý nghĩa tham kh o vƠ lƠ c s lựa

ch n vật li u cho các ch ng trình lai t o giống c i tiến tính tr ng bộ r lúa

- Kết qu c a luận án cung c p một danh sách các QTLs/gen ng viên có liên quan đến sự phát triển bộ r các giống lúa Vi t Nam, bổ sung thêm thông tin hữu ích vƠ chi tiết giúp các nhƠ khoa h c quan tơm nghiên c u di truyền bộ r lúa Vi t Nam vƠ trên thế giới có hiểu biết toƠn di n, chính xác vƠ đầy đ h n

về m ng l ới các gen liên quan Đặc bi t, những đặc điểm riêng bi t c a các

giống lúa Vi t Nam có thể mang đến những phát hi n mới, đặc tr ng, mƠ các nghiên c u sử dụng các nguồn vật li u lúa khác trên thế giới không thể tìm th y

- Nhìn chung, luận án cung c p một mô hình áp dụng những công ngh , kỹ thuật hi n đ i trong phơn tích genome để đ a vƠo khai thác đa d ng nguồn gen lúa Vi t Nam, lƠm rõ mối quan h giữa kiểu gen vƠ kiểu hình, nhằm khai thác các gen/alen đặc thù ẩn trong nguồn gen đó Kết qu c a luận án m ra con

đ ng triển v ng trong khai thác genome để ng dụng vƠo các ch ng trình ch n giống phơn tử t o ra các giống lúa có bộ r thích hợp lƠm tăng kh năng thích

ng với các điều ki n ngo i c nh b t lợi

PH N 2 T NG QUAN TĨI LI U

2.1 VAI TRọ VĨ Đ C ĐI M B R LÖA

2.1.1 Vai trò c a b r cơy lúa

Bộ r lƠ c quan đặc bi t quan tr ng với cơy lúa, có ch c năng bám giữ giúp cho cơy đ ng vững vƠ khai thác, vận chuyển n ớc, ch t dinh d ỡng cung

c p cho cơy trong quá trình quang hợp NgoƠi ra, bộ r còn có các ch c năng th

c p khác nh dẫn truyền, tổng hợp các ch t điều hòa sinh tr ng, ch t dự trữ trong cơy Sự tổng hợp các ch t hữu c nƠy r t quan tr ng đối với quá trình sinh

tr ng vƠ phát triển cơy lúa Vi c gi i phóng các ch t hữu c từ r có thể lƠm thay đổi các đặc tính vật lý, hóa h c vƠ sinh hóa c a đ t bên trong vùng r (Wu and Cheng, 2014) Bộ r r t nh y c m, nó c m nhận vƠ ph n ng l i với các stress phi sinh h c vƠ sinh h c, vƠ giao tiếp với các bộ phận trên mặt đ t thông qua các kênh tín hi u b i các hoocmon (Bailey-Serres and Voesenek, 2010;

Parent et al., 2010; Zhao et al., 2012; Hong et al., 2013; Sun et al., 2014) Bộ r còn góp phần điều ch nh độ dẫn khí, đồng th i nh h ng đến t thế c a l ỡi lá

vƠ hi u su t quang hợp d ới sự tác động c a đi n tr đ t, dinh d ỡng, các điều

ki n b t lợi nh h n hoặc mặn (Wu and Cheng, 2014)

Với vai trò khai thác n ớc vƠ các ch t dinh d ỡng cần thiết cho sự sinh

tr ng phát triển c a toƠn bộ cơy, đặc điểm c u trúc vƠ ho t động c a bộ r có tính quyết đ nh đến toƠn bộ quá trình sinh tr ng phát triển vƠ năng su t c a các

giống lúa Bộ r có thể có nhiều c chế khác nhau để tác động vƠo quá trình hình thƠnh, tích lũy vƠ duy trì năng su t cơy lúa, nh t lƠ khi đối mặt với các yếu tố

b t lợi (Yang et al., 2012; Jeong et al., 2013; Ju et al., 2015) Mặt khác, nhiều

nhƠ khoa h c cũng cho rằng cơy lúa có bộ r ăn sơu h n, số l ợng r b t đ nh nhiều h n, đ ng kính r lớn h n, vƠ kh năng phơn nhánh tốt h n có thể có kh năng chống ch u tốt h n với điều ki n h n hán do kh năng khai thác n ớc c a

chúng đ ợc tăng lên (Fukai and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011)

Tầm quan tr ng c a bộ r trong đ i sống cơy lúa đ ợc nhìn nhận toƠn di n trong nhiều nghiên c u, nhiều khía c nh khác nhau Các kết qu đƣ công bố lƠ

c s để khẳng đ nh không thể bỏ qua các tính tr ng liên quan đến bộ r trong các nghiên c u ch n t o giống lúa, đặc bi t lƠ trong các ch ng trình ch n t o

giống lúa chống ch u với các stress sinh h c vƠ phi sinh h c hi n nay

2.1.2 Đ c đi m c u trúc c a b r lúa

Bộ r lúa mang những đặc điểm điển hình c a bộ r chùm các cơy ngũ

cốc một lá mầm (Coudert et al., 2010) Đặc điểm hình thái h c, gi i phẫu h c,

quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa đƣ đ ợc nhiều nhƠ khoa h c nghiên

c u từ nhiều năm nay Theo mô t c a Reboillat et al (2009), bộ r lúa đ ợc

thiết lập ch yếu từ 5 lo i r chính gồm: r mầm (radicle – ra), r b t đ nh m c trong giai đo n n y mầm (embryonic crown root – ecr), r b t đ nh hình thƠnh từ đốt thơn đầu tiên trên mặt đ t c a cơy lúa sau khi quá trình n y mầm kết thúc (crown root – cr), r bên lớn vƠ r bên nhỏ R b t đ nh m c trong giai đo n n y

mầm (ecr) lƠ các r b t đ nh phát sinh trong kho ng th i gian cơy lúa xu t hi n lá thật th nh t vƠ lá thật th 2, t c lƠ sau n y mầm từ 2-3 ngƠy R bên lớn (lager lateral root – llr) đ ợc hình thƠnh từ r chính, có đ ng kính nhỏ h n, nh ng có

c u t o gi i phẫu gần giống r chính R bên nhỏ (small lateral root –slr) có

đ ng kính r t m nh, chiều dƠi ngắn h n Hình 2.1 mô t cụ thể từng lo i r c u trúc nên một bộ r cơy lúa

R b t đ nh phơn hóa thơn từ vòng mô phơn sinh có đặc điểm t ng tự

nh phần trụ bì r lúa (Itoh et al., 2005; Coudert et al., 2013a) Các r bên phơn hóa từ trụ bì r (pericycle) vƠ một phần từ nội bì (Rebouillat et al., 2009; Orman- Ligeza et al., 2013) C u trúc đồng tơm c a r lúa (Hình 2.2) tính từ tơm ra ngoƠi

gồm các lo i mô sau: phần trung trụ gồm xylem, ploem, trụ bì, nội bì (endoderm); lớp vỏ (mesodermis), gồm các tế bƠo mô khí (aerenchyma); lớp

c ng mô (sclerenchyma); ngo i bì; biểu bì (Rebouillat et al., 2009) C u trúc

xuyên tơm nƠy đ m b o r lúa có thể phát triển tốt trong c điều ki n h o khí vƠ

yếm khí Đặc bi t, các mô khí có kh năng trao đổi khí với thơn cơy lúa khi cơy sinh tr ng vƠ phát triển trong điều ki n yếm khí NgoƠi ra, phần đầu c a chóp

r có một vùng nằm trung tơm c a mô phơn sinh r đ ợc g i lƠ QC (Quiescent Center), đơy lƠ một vùng tế bƠo đặc bi t (Hình 2.3), chúng phơn chia r t chậm

hoặc không phơn chia, nh ng sẽ khôi phục tr ng thái ho t động vƠ d ch chuyển theo d ng đ ng kinh tuyến khi các tế bƠo xung quanh chúng b tổn th ng

(Coudert et al., 2010) Đặc điểm, ch c năng vƠ ho t động c a các lo i mô nƠy đƣ

đ ợc mô t vƠ ch ng minh trong nhiều nghiên c u, vƠ đ ợc tổng hợp b i

Chú thích: (a) Hình thái bộ r lúa giai đo n 1 tuần sau n y mầm c a giống lúa Nipponbare (b) Hình thái bộ r lúa 40 ngƠy sau n y mầm (c) Hình nh c a một r b t đ nh cơy lúa 40 ngƠy sau n y

m ầm Các ký hi u: ra – r mầm, ecr – r b t đ nh xu t hi n trong giai đo n n y mầm, cr- r b t đ nh, llr –

r bên lớn, slr – r bên nhỏ Tỷ l kích th ớc: (a) t ng đ ng 1cm, (b) t ng đ ng 5cm, (c) t ng

đ ng 1cm

Hình 2.1 ThƠnh ph n r c u trúc nên b r lúa

Nguồn:Rebouillat et al (2009)

Chú thích: (a) Hình gi i phẫu lát cắt ngang c a một r chính, điểm cắt cách đầu r 2 cm, đ ợc nhuộm b i formandehyde safranin glycerin acetic axit; lignins bắt mƠu đỏ, cellulose bắt mƠu xanh (b) Phóng to phần trung tr ụ (c) Chi tiết c a một phloem (d) S đồ tóm tắt c u trúc xuyên tơm c a r lúa Ký hi u t ng ng: ep, epidermis (biểu bì); ex, exodemis (ngo i bì); sc, sclerenchyma layer (lớp c ng mô); me, mesodermis (l ớp vỏ); ae, aerenchyma (tế bƠo mô khí); en,endodermis (nội bì); pe, pericycle (trụ bì); mx, metaxylem (xylem);cmx, center metaxylem;pp, protoploem; cc, companion cells; mp, metaphloem; pc, endodermis passage cell; px, protoxylem; ph, phloem Kích th ớc chuẩn: (a) 50 µm; (b) 25 µm; (c) 5 µm;

(d) 50 µm

Hình 2.2 C u trúc xuyên tơm c a r lúa

Nguồn:Rebouillat et al (2009)

Chú thích: (a) Hình gi i phẫu phần chóp r theo chiều d c, các phần mô t ng ng với tên đ ợc mƣ hóa theo b ng mƠu t ng ng (b) H ớng phơn hóa tế bƠo từ tế bƠo mô phơn sinh (vùng đ ợc giới h n bằng nét đ t) thƠnh các lo i mô khác nhau Các chữ viết tắt: xyl = xylem, st = Stele tissues (phloem), pe = pericycle (tr ụ bì), en = endodermis (nội bì), co = Cortex (vỏ), scl = Sclerenchyma (lớp c ng mô), ex = Exodermis (lớp vỏ), ep = epidermis (biểu bì), QC = Quiescent Center (trung tơm tĩnh)

Hình 2.3 T ch c mô theo chi u d c vƠ mô hình phơn chia t bƠo r lúa

Nguồn Coudert et al (2010)

Tr i qua quá trình tiến hóa, di thực vƠ ch n l c tự nhiên trong suốt h n

10.000 năm (Sweeney and McCouch, 2007), cơy lúa đƣ có những biến đổi để thích nghi rộng rƣi với nhiều lo i môi tr ng sinh thái vƠ điều ki n gieo trồng khác nhau (canh tác có t ới tiêu, canh tác n ớc tr i trên đ t th p, canh tác n ng

rẫy, canh tác vùng đ t ngập n ớc, vƠ vùng ngập mặn ven biển) cũng nh với các m c đầu t khác nhau c a các hộ nông dơn trong thực tế s n xu t Hi n nay,

đƣ có tới trên 100.000 giống lúa khác nhau đang đ ợc l u giữa trong Ngơn hƠng gen lúa quốc tế t i Vi n nghiên c u lúa g o quốc tế (IRRI) - Philippines Một

phần nhỏ các giống trong ngơn hƠng gen nƠy đƣ đ ợc nghiên c u đánh giá kiểu hình r , kết qu cho th y các kiểu gen nghiên c u có sự biến đổi về kiến trúc bộ

r theo giống vƠ điều ki n khác nhau c a môi tr ng sống (O'Toole and Bland,

1987; Lafitte et al., 2001) Điều nƠy có thể liên quan đến các c chế di truyền khác nhau tác động đến quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r cơy lúa

2.1.3 Đ c đi m phát tri n c a b r lúa

Cơy lúa có bộ r chùm đặc tr ng cho các cơy h Hòa th o Khi h t lúa n y

mầm thì r mầm (radicle) sẽ xu t hi n R mầm không ăn sơu, ch dƠi kho ng

15cm, trên bề mặt r mầm r t ít r bên, nh ng các lông hút r t phát triển R

mầm ch yếu lƠm nhi m vụ hút n ớc cung c p cho phôi phát triển trong quá trình n y mầm c a h t vƠ sẽ chết sau 10-15 ngƠy, lúc cơy m đ ợc 2-4 lá thật (Nguy n Đình Đ , 2009) Sau khi mầm xu t hi n kho ng 2-3 ngƠy, sẽ có kho ng

5 r b t đ nh đơm ra từ đốt lá bao mầm, chính đ ợc g i lƠ “Embryonic Crown Root” - ECR, quá trình nƠy di n ra trong suốt th i gian xu t hi n lá thật th nh t

vƠ th hai (Rebouillat et al., 2009) Các r b t đ nh sau đó m c ra từ đốt thơn

chính hoặc từ các đốt thơn c a các nhánh lúa đ ợc g i lƠ “crown root” – CR Số

l ợng r b t đ nh CR g p nhiều lần r b t đ nh m c giai đo n n y mầm (ECR),

ch u trách nhi m chính trong vi c hoƠn thƠnh ch c năng c a bộ r lúa, do đó sự hình thƠnh vƠ phát triển c a r CR có ý nghĩa đặc bi t quan tr ng trong đ i sống cơy lúa Đơy lƠ lý do khiến các nhƠ khoa h c đặc bi t quan tơm nghiên c u về r

CR (Inukai et al., 2005; Kitomi et al., 2011; Gao et al., 2014)

Sự xu t hi n c a r CR vƠ số l ợng r CR có liên quan trực tiếp đến ho t động đẻ nhánh c a cơy lúa Quy luật phát sinh r vƠ ho t động đẻ nhánh cơy

lúa đƣ đ ợc nghiên c u b i Yoshida et al (1982) Theo đó, khi lá th n xu t

hi n, thì r sẽ bắt đầu đơm ra từ đốt th (n-3) Mỗi đốt th ng có thể phát sinh

5-25 r Có hai vòng r trên một đốt thơn, r phát sinh từ vòng r trên to vƠ khỏe, r phát sinh từ vòng r d ới nhỏ vƠ kém quan tr ng h n (Yoshida and Hasegawa, 1982) Trong quá trình sinh tr ng sinh d ỡng, các đốt thơn nƠy th ng xếp r t xít nhau vƠ nằm d ới mặt đ t, do đó bộ r hình thƠnh d ng chùm

các giai đo n sinh tr ng khác nhau c a cơy lúa, m c độ phát triển c a

bộ r cũng r t khác nhau Bộ r lúa phát triển vƠ đ t kích th ớc tối đa về khối

l ợng cũng nh về biểu hi n hình thái xung quanh giai đo n trỗ, mặc dù sau đó các nhánh, các vùng ho t động mới c a r vẫn tiếp tục đ ợc s n sinh cho đến khi cơy đ ợc thu ho ch Các vùng r mới đ ợc s n sinh nƠy có thể đóng vai trò quan

tr ng trong quá trình vƠo chắc c a h t lúa Điều ki n dinh d ỡng c a môi tr ng

đ t cũng trực tiếp nh h ng đến sự phơn nhánh c a r lúa Môi tr ng đ t có đầy đ ch t dinh d ỡng sẽ h n chế sự phơn nhánh c a r , ng ợc l i, môi tr ng

có sự thiếu hụt về n ớc vƠ dinh d ỡng sẽ kích thích sự phơn nhánh c a r

Đ ng kính c a r gi m dần theo c p phơn nhánh, t c lƠ các c p phơn nhánh cƠng cao thì đ ng kính r cƠng nhỏ Các giống lúa khác nhau có tập tính khác

nhau trong quá trình phát triển bộ r c về chiều ngang vƠ chiều d c do đó đặc

điểm hình thái vƠ gi i phẫu cũng có những điểm khác nhau (Uga et al., 2009)

Bộ r nằm d ới mặt đ t nên r t khó để có thể quan sát hết các đặc điểm c a

nó, vì vậy, sẽ r t hữu ích nếu chúng ta biết mối quan h giữa d ng hình cơy vƠ đặc điểm phát triển c a bộ r Những thông tin nƠy sẽ lƠm cho vi c tìm hiểu biểu

hi n c a năng su t các giống lúa d ới các chế độ n ớc khác nhau đ ợc d dƠng

h n, giúp cho các nhƠ ch n t o giống cơy trồng những thuận lợi b ớc đầu trong

vi c lựa ch n các giống lúa thích hợp với sự thay đổi c a môi tr ng Tuy nhiên cho đến nay, vẫn ch a có căn c thuyết phục để thiết lập các ch dẫn t ng tự

Một cách tiếp cận khác đó lƠ tìm kiếm các ch th phơn tử đặc tr ng cho các biểu

hi n c a tính tr ng bộ r vƠ sử dụng chúng để nhận biết đặc điểm bộ r c a giống nghiên c u Đơy cũng lƠ lý do vì sao hi n nay trong các ch ng trình nghiên c u

c i tiến giống lúa, các nghiên c u về di truyền r lúa đang đ ợc đặc bi t quan tơm Những năm gần đơy nhiều QTLs/gen có liên quan đến sự hình thƠnh, phát triển bộ r lúa đƣ đ ợc công bố

2.2 QTLs VĨ GEN LIểN QUAN Đ N S PHỄT TRI N B R LÖA 2.2.1 Các QTLs liên quan đ n s phát tri n b r lúa

2.2.1.1 Các nghiên cứu xác định QTLs

Ban đầu, để xác đ nh đ ợc các gen điều khiển kiến trúc c a bộ r các nhƠ nghiên c u ch yếu sử dụng ph ng pháp di truyền h c truyền thống với các phép lai vƠ s đồ ph h qua từng thế h Với ph ng pháp nƠy, QTLs đ ợc thiết

lập dựa trên mối t ng quan giữa sự phơn ly giữa kiểu gen vƠ kiểu hình đ ợc t o

ra từ một quần thể lai đ ợc g i lƠ "quần thể lập b n đồ", t o ra bằng ph ng pháp lai thuận ngh ch vƠ lai l i (backcrossing) Nghiên c u đầu tiên về kiến trúc bộ r

lúa đ ợc công bố b i Champoux et al (1995) đƣ m đầu cho hƠng lo t các

công bố khác sau đó Kết qu c a những nghiên c u nƠy đƣ đ ợc tóm tắt b i

Kamoshita et al (2008), cho qu ần thể lập b n đồ CT9993/IR622266 (Kamoshita

et al., 2008); vƠ b i Khowaja et al (2009) cho quần thể lập b n đồ

Bala/Azucena Trong bƠi tổng quan c a mình Courtois et al (2009) đƣ phơn tích

những điều ki n thiết lập c a 675 QTLs trong 24 nghiên c u 12 quần thể lập

b n đồ riêng bi t; những h thống đánh giá kiểu hình r t đ n gi n, thông th ng

lƠ sử dụng h thống th y canh, hoặc h thống thí nghi m chậu v i, ống r với giá

thể ch yếu lƠ đ t, lƠ đặc tr ng cho những nghiên c u trong giai đo n nƠy Phần

lớn các tr ng hợp (368 trong tổng số 675 QTLs) điều ki n đánh giá kiểu hình lƠ

để đánh giá vƠ ớc l ợng kh năng di truyền; ch có r t ít các nghiên c u phơn tích cụ thể các QTLs liên quan đến kh năng c m ng với các điều ki n thiếu hụt

về n ớc hoặc lƠ kh năng đơm sơu c a r (147 vƠ 160 QTLs, t ng ng) Các ch tiêu đ ợc đo đếm th ng lƠ: Chiều dƠi r , độ dƠy c a r , số l ợng r , khối l ợng

r các độ sơu khác nhau, tỷ l giữa phần r vƠ phần thơn c a cơy Quần thể lập

b n đồ th ng đ ợc sử dụng lƠ các dòng thuần tự phối (RILs) hoặc lƠ các dòng

quần thể đ n bội kép (DHLs) b i vì b n ch t tự nhiên ổn đ nh c a các dòng cho phép lặp l i các phép đo Để tối đa hóa sự khác bi t giữa hai bố mẹ vƠ đ n gi n hóa vi c xác đ nh sự đa hình, hầu hết các quần thể (8/12 quần thể, t ng ng với

560 QTLs) đƣ sử dụng đ ợc t o ra từ phép lai giữa một indica vƠ một japonica

Kích th ớc c a các quần thể lập b n đồ nƠy th ng m c nhỏ (kho ng từ 100 đến 150 cá thể), cho phép xác đ nh một vƠi QTLs với hi u ng rộng nh ng có độ

phơn gi i th p (Courtois et al., 2009) Mặc dù sự t ng tác giữa QTLs x Môi

tr ng đƣ đ ợc khẳng đ nh lƠ khá lớn (Kamoshita et al., 2002; MacMillan et al.,

2006) nh ng có một vƠi vùng nhi m sắc thể th ng xuyên xu t hi n các quần

thể vƠ/hoặc các môi tr ng thí nghi m khác nhau, điều nƠy đ ợc rút ra sau khi

tổng hợp vƠ so sánh kết qu QTLs các nghiên c u khác nhau (Courtois et al., 2009; Khowaja et al., 2009) Các tính tr ng có số l ợng QTLs đƣ đ ợc xác đ nh nhiều nh t theo từng cụm QTLs trên các nhi m sắc thể khác nhau (Chr1 (30-40 Mb), Chr2 (25-35 Mb), Chr3 (0-5 Mb), Chr4 (30-35 Mb), Chr9 (15-20 Mb),

đ ợc trình bƠy thông qua đồ th Hình 2.4

Gần đơy, những h thống đánh giá hình thái bộ r thông l ợng cao vƠ công ngh dựng nh 3D đƣ đ ợc sử dụng cho các thí nghi m đánh giá kiểu hình lƠm tăng độ tin cậy vƠ ý nghĩa c a các QTLs xác đ nh đ ợc, m ra một h ớng đi mới đầy triển v ng, tập trung ch yếu các tính tr ng b ớc đầu nh : mật độ r vƠ

m c độ lan sơu, rộng c a r ; thêm vƠo đó lƠ các ch tiêu c b n nh : các đặc

tr ng cho độ dƠi c a r , vƠ các ch tiêu đặc tr ng cho di n tích c a r (Topp et

al., 2013) Nghiên c u nƠy sử dụng quần thể lập b n đồ Bala/Azucena vƠ đƣ xác

đ nh đ ợc một số QTLs có liên quan đến các tính tr ng đ n gi n, vƠ xác đ nh

đ ợc một số QTLs hoƠn toƠn mới

Chú thích: R/S, lƠ tỷ l khối l ợng giữa phần r vƠ phần thơn; RN, lƠ số l ợng r b t đ nh; MRL,

c a nó (Courtois et al., 2009) Ph ng pháp GWAS sử dụng các quần thể tự

nhiên cho th y sự phơn rƣ LD (Linkage Disequilibrium) một cách nhanh chóng

đƣ xu t hi n nh một công cụ m nh mẽ để c i tiến độ phơn gi i t i mỗi v trí QTLs so với ph ng pháp sử dụng quần thể lập b n đồ GWAS đòi hỏi số l ợng marker với mật độ r t lớn trên mỗi nhi m sắc thể, điều nƠy ch có thể thực hi n

đ ợc nh sự phát triển m nh mẽ c a công ngh gi i trình tự hi n đ i ngƠy nay Những kết qu đầu tiên c a ph ng pháp phơn tích GWAS trên các tính tr ng bộ

r lúa vừa đ ợc công bố (Shen et al., 2001; Clark et al., 2013; Courtois et al.,

2013)

2.2.1.2 Các gen đ ợc phân lập từ các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ

ở lúa

Các kết qu lập b n đồ QTLs liên quan đến sự phát triển bộ r lúa đƣ

đ ợc tiếp tục nghiên c u thông qua phát triển các dòng NILs có ch a các QTLs trên các nền di truyền khác nhau, các QTLs liên kết chặt với các v trí cloning

(Shen et al., 2001; Steele et al., 2006; Steele et al., 2013) Hầu hết các QTLs có tác động đến một số tính tr ng kiểu hình quan tr ng đƣ đ ợc công bố v trí chính xác để có thể phơn lập Ví dụ đầu tiên ph i kể đến lƠ gen liên quan đến kh năng

hút photphos c a lúa đ t có hƠm h ợng photphos th p PUP1 (PHOSPHORUS

UPTAKE 1 ), sau đó lƠ gen PSTOL1 (PHOSPHORUS-STARVATION

TOLERANCE 1), đƣ đ ợc clone vƠ đ ợc ch ng minh mƣ hóa một “receptor-like cytoplasmic kinase” (Gamuyao et al., 2012) Gen nƠy không th y biểu hi n

Nipponbare Cơy mang gen siêu biểu hi n c a gen nƠy có hƠm l ợng lơn (P) trong thơn tăng lên đáng kể vƠ năng su t tăng 60% trong điều ki n thiếu lơn (P)

so với cơy đối ch ng Các gen nƠy có tác dụng lƠm tăng sự phát triển giai đo n

sớm c a r , lƠm cho bộ r có kích th ớc lớn h n, chiều dƠi vƠ di n tích bề mặt

c a r tăng, góp phần lƠm tăng kh năng hút lơn (P), vƠ các dinh d ỡng khác nh

đ m (N), kali (K) Gen nƠy biểu hi n vùng phát sinh r b t đ nh (CR) vƠ t i mô phơn sinh c a nó t i vùng gốc thơn V trí biểu hi n c a gen nƠy ch ng tỏ nó liên quan đến sự điều khiển vi c hình thƠnh vƠ vƠ kéo dƠi c a r b t đ nh

Một gen khác đƣ đ ợc clone từ một QTLs liên kết với tính tr ng phát triển

bộ r lƠ gen DRO1 (DEEPER ROOTING 1) (Uga et al., 2013; Uga et al., 2015)

Biểu hi n c a DRO1 đ ợc điều khiển b i auxin thông qua yếu tố phiên mƣ ARF (Auxin Response Factor -ARF transcription factors) DRO1 điểu khiển tính

h ớng đ a c a r , cũng nh thông qua vi c điều khiển sự kéo dƠi c a tế bƠo biểu

bì theo kh năng tăng tr ng c a r đ nh h ớng theo sự lôi kéo c a tr ng lực Sự biểu hi n c a DRO1 trên nền di truyền IR64 lƠm tăng độ m c a góc giữa r vƠ

trục ngang trên mặt đ t, lƠ nguyên nhơn dẫn đến sự ăn sơu h n c a bộ r So với

IR64, các dòng đẳng gen (dòng NILs) mang gen DRO1 có một số hi u ng

không mong muốn nh lá r , th i gian ra hoa chậm h n (kéo dƠi th i gian sinh

tr ng), tuy nhiên, trong điều ki n h n thì có năng su t cao h n, vƠ không suy

gi m năng su t so với cơy đối ch ng điều ki n th ng

Quá trình cloning hai QTLs có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên kiến trúc bộ r nƠy lƠ tiêu biểu cho các khó khăn gặp ph i trong quá trình xác đ nh các QTLs liên quan đến các tính tr ng r lúa Khó khăn th nh t, lƠ khó khăn chung đối với t t c các tính tr ng, đó lƠ sự sai l ch khá lớn giữa v trí marker với v trí gen liên kết với tính tr ng quan tơm Khó khăn th hai, lƠ b i sự khác bi t trong

c u trúc c a các nhóm giống khác nhau (Schatz et al., 2014), vƠ trong một nhóm,

giữa các giống, sự vắng mặt c a gen PSTOL1 trong giống lúa đối ch ng

Nipponbare lƠ một minh h a Một lý do nữa, đó lƠ có r t nhiều gen trong genome

hi n nay ch a đ ợc lƠm rõ ch c năng Ví dụ, s n phẩm c a gen DRO1 lƠ một

protein không có sự t ng đồng về ch c năng với các protein đƣ đ ợc biết đến

(Uga et al., 2013) Mặc dù số l ợng các gen đ ợc clone từ các QTLs còn khá h n chế, nh ng sự xu t hi n c a DRO1 vƠ PSTOL1 với những ch c năng quan tr ng liên quan đến sinh tr ng vƠ phát triển bộ r đƣ ch ng minh hi u qu vƠ ý nghĩa

c a ph ng pháp nƠy Do đó, để khắc phục các nh ợc điểm vƠ nơng cao hi u qu nghiên c u cần lƠm gi m kích th ớc c a kho ng cách từ điểm đánh d u đến các gen quan tơm, sử dụng GWAS lƠ một bi n pháp trong đó; bên c nh đó các nghiên c u di truyền, khai thác sự đa d ng c a lúa cần kết hợp với các ph ng pháp phơn tích ch c năng gen hi n đ i để kiểm tra vƠ ch ng thực ch c năng sinh

h c c a gen nh ph ng pháp lƠm cơm gen hoặc gơy siêu biểu hi n gen trong các điều ki n đặc thù

2.2.2 Các gen liên quan đ n s hình thƠnh vƠ phát tri n b r lúa

Gi i trình tự vƠ gi i mƣ genome lúa (Yu et al., 2002; Itoh et al., 2007), cũng

nh vi c t o ra một bộ s u tập các đột biến (Hirochika et al., 2004; Krishnan et

al., 2009; Guiderdoni and Gantet, 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013) vƠ các nghiên c u sƠng l c sự biến đổi c a kiểu hình r c a các d ng đột biến đó cho phép chúng ta xác đ nh đ ợc các gen chính điều khiển sự hình thƠnh, sự xu t

hi n vƠ sự phát triển c a r lúa (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013) Căn c vƠo ph ng th c tác động vƠ vai trò c a gen

đó trong quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa mƠ có thể phơn thƠnh

những nhóm gen khác nhau

auxin

Các nghiên c u sinh lý, hóa sinh vƠ di truyền thực vật đƣ lần l ợt khẳng

đ nh vai trò c a auxin trong sự hình thƠnh vƠ phát triển bộ r thực vật nói

chung vƠ lúa nói riêng Quá trình sinh tổng hợp vƠ vận chuyển auxin vƠ tín

hi u c a nó đóng vai trò quan tr ng trong vi c kiểm soát sự tăng tr ng vƠ phát triển c a r , có thể nói auxin nh một ch t điều hòa tổng thể trong quá trình nƠy

Những công bố gần đơy đang dần hé lộ c chế tác động c a auxin đến quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r lúa thông qua ho t động c a một m ng l ới gen vƠ các yếu tố phiên mƣ c m ng với auxin đ ợc tìm th y

Đột biến crown root less 4 (crl4) đ ợc biến đổi từ OsGNOM1, gen mƣ hóa

sự vận chuyển guanine-nucleotide qua mƠng cho ARFs (ADP-ribosylation fator),

một thƠnh viên c a gia đình protein G (Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009)

Protein G, hay còn g i lƠ “protein nucleotide-binding guanine”, lƠ một gia đình các protein ho t động nh một thiết b chuyển m ch phơn tử bên trong tế bƠo, có liên quan trong vi c truyền tín hi u từ một lo t các kích thích bên ngoƠi một tế bƠo vƠo bên trong qua mƠng tế bƠo Ho t động c a chúng đ ợc quy đ nh b i các

yếu tố kiểm soát kh năng gắn kết vƠ th y phơn guanosine triphosphate (GTP) thƠnh guanosine diphosphate (GDP) Protein G lƠ một thƠnh viên c a nhóm lớn các enzyme có tên lƠ GTPases Sau yếu tố nƠy lƠ một d ng t ng đồng c a GNOM1, nó điều khiển m ng l ới vận chuyển nội bƠo c a protein vận chuyển

auxin PIN1 (PINFORMED1) trong Arabidopsis Đổi l i, PIN1 lƠ yếu tố cần thiết

để tập trung auxin vƠo các tế bƠo hình thƠnh r bên (Steinmann et al., 1999; Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009) Đột biến crl1 vƠ Osgnom1 đƣ đ ợc đánh

giá dựa trên sự vắng mặt c a các r b t đ nh vƠ sự suy gi m số l ợng các r bên

Trong các đột biến nƠy, sự biểu hi n c a một vƠi gen OsPIN đƣ b thay đổi Trong đột biến crl4, sự vận chuyển auxin b suy yếu đi lƠm cho sự phơn bố auxin trong các tế bƠo gốc r b thay đổi (Kitomi et al., 2008) Kết qu cho th y v trí

vận chuyển auxin có liên quan tới sự hình thƠnh r b t đ nh vƠ r bên lúa OsWOX3A (WUSCHEL-releted homeobox 3A) đ ợc mƣ hóa b i NAL2

(NARROW LEAF2) vƠ NAL3 lƠ một cặp gen lặp Cặp đôi đột biến nal2/nal3 biểu

hi n một kiểu hình ph c t p, lƠm thay đổi sự phát triển c a các bộ phận khác nhau c a cơy, đáng chú ý lƠ nó lƠm gi m m nh mật độ c a các r bên Một hi u

ng đáng chú ý khác c a đột biến nƠy lƠ lƠm tăng số l ợng vƠ chiều dƠi c a các

lông hút (Cho et al., 2013) Trong đột biến nal2/nal3 sự biểu hi n c a các gen

OsPIN khác nhau đƣ đ ợc biến đổi Kết qu c a sự biến đổi nƠy đ ợc gi i thích

bằng gi thuyết cho rằng có sự tăng vận chuyển auxin tới các mô biểu bì, n i phát sinh lông hút, đồng th i lƠm gi m l ợng auxin vận chuyển tới trụ bì

(pericycle) n i các r bên đ ợc phơn hóa (Yoo et al., 2013) OsTIR1 vƠ OsAFB2

lƠ hai gen lúa có cùng nguồn gốc với các c quan c m thụ auxin (receptor) TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1) vƠ AUXIN SIGNALING F-

BOX2 (AFB2) Arabidopsis , đ ợc lƠm b t ho t bằng OsMir393a vƠ OsMir393b (Bian et al., 2012; Xia et al., 2012) Cơy siêu biểu hi n OsMir393 thể hi n kiểu

hình biến đổi do tác động dơy chuyền c a các tín hi u liên quan đến auxin, bao

gồm c sự suy gi m số l ợng r b t đ nh OsMir393a biểu hi n rõ các v trí phát sinh r chính vƠ r bên, điều nƠy ch ra rằng OsMir393a có liên quan đến

vi c điều khiển sự hình thƠnh c a r sau giai đo n r mầm thông qua vi c ph

đ nh sự điều khiển c a các ch t nhận (receptor) auxin lúa Các ch t nhận auxin TIR1 vƠ AFB2 đ ợc đ nh v trong nhơn, n i mƠ chúng có thể t ng tác với OsIAA1 - một protein điều khiển AUXIN/INDOLE ACETIC ACID (AUX/IAA)

(Bian et al., 2012; Xia et al., 2012) Protein AUX/IAA t ng tác vƠ c chế ARF (Auxin Response Factors), có ch c năng nh một yếu tố phiên mƣ

Arabidopsis, khi các ch t nhận nƠy đ ợc t o ph c hợp với auxin, nó có thể t ng tác với các protein AUX/IAA Kết qu c a sự rƠng buộc nƠy lƠ do sự ho t động

c a enzyme gắn ubiquitin (lƠ các protein điều khiển có kích th ớc nhỏ, kho ng 8,5 kDa) SKP1- CULLIN- FBOX (SCF), mƠ các ubiquitin sử dụng lƠ các AUX/IAA, mục tiêu c a nó lƠ lƠm suy gi m hƠm l ợng auxin trong các tế bƠo phát sinh r , từ đó có thể lƠm gi m số l ợng r hình thƠnh Những sự t ng tác nƠy đòi hỏi ph i có một hoặc vƠi protein đi kèm (chaperone hoặc co-chaperone) (Guilfoyle and Hagen, 2007; Mockaitis and Estelle, 2008; Vanneste and Friml,

2009; Lavenus et al., 2013)

lúa, một sƠng l c các đột biến m t kh năng c m ng với auxin để đánh

giá đặc điểm c a c a hai đột biến (Oscyclophilin2 (Oscyp2) vƠ lateral root less2

(lrl2))đƣ đ ợc xác đ nh dựa vƠo sự vắng mặt c a các r bên mƠ nguyên nhơn c a

sự vắng mặt nƠy lƠ do đột biến trên cùng một gen (Kang et al., 2013; Zheng et

al., 2013) NgoƠi ra, Oscyp2 còn thể hi n một lo t các kiểu hình không c m ng

với auxin mƠ t ng quan với sự suy gi m nồng độ c a OsIAA11 để ph n hồi l i

với auxin OsCYP2/LRL2 lƠ một protein đi kèm, nó có thể t ng tác với chaperone OsSGTS (SUPPRESSOR OF G2 ALLELE OF SKP1) Một số gi thiết cho rằng ph c hợp nƠy có liên quan đến sự suy gi m c a OsIAA11 do SCFTIR trong quá trình ph n hồi l i với auxin trong giai đo n sớm c a sự phơn

co-hóa r bên (Kang et al., 2013)

OsIAA11 hoặc OsIAA13 gia tăng ch c năng đột biến, trong đó, các axit amin có liên quan đến sự suy gi m c a các protein c m ng với auxin đƣ đ ợc

biến đổi, mang đến d ng kiểu hình có r t ít r bên (lateral rootless) (Kitomi et al., 2012; Zhu et al., 2012) OsIAA11 vƠ OsIAA13 lƠ cần thiết cho sự hình thƠnh r

bên Hai đột biến crl1(crown root less 1) (Inukai et al., 2005) vƠ

arl1(adventitious less1) (Liu et al., 2005) đều đ ợc biến đổi từ gen OsLBD3-2,

đơy lƠ gen mƣ hóa một yếu tố phiên mƣ LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN transcription factor) phục vụ cho vi c hình thƠnh các c quan bên vùng biên LBD lƠ một nhóm gen đặc thù ch u trách nhi m kiểm soát

sự hình thƠnh r các loƠi khác nhau (Coudert et al., 2013b) Các cơy lúa có

ch a đột biến crl1 vƠ arl1 không có sự hình thƠnh r b t đ nh (để t o thƠnh bộ r chùm), đồng th i số l ợng r bên cũng gi m đi đáng kể Ho t động c a CRL1

c m ng với auxin Sự c m ng nƠy b m t đi trong cơy gơy siêu biểu hi n một

lo i protein đƣ đ ợc biến đổi có tên lƠ OsIAA3, không suy gi m sau khi điều tr

bằng auxin, điều nƠy ch ra rằng sự biểu hi n c m ng c a CRL1 với auxin lƠ

hoƠn toƠn độc lập với sự suy gi m c a protein AUX/IAA NgoƠi ra, promotor

c a CRL1 còn ch a một trình tự c m ng với auxin (ARE), trình tự nƠy có kh

năng t ng tác in vitro với yếu tố phiên mƣ OsARF16 (Inukai et al., 2005)

T t c các dữ li u trên cho th y sự hình thƠnh r b t đ nh vƠ r bên lúa liên quan đến một m ng l ới gen điều khiển b i auxin, nó bao gồm các receptor

thụ c m auxin ARF vƠ LDB M ng l ới gen điều hòa nƠy đ ợc b o tồn r t tốt các loƠi cơy hai lá mầm vƠ một lá mầm khác nhau (Hochholdinger and Tuberosa, 2009; Péret et al., 2009; Lavenus et al., 2013) lúa, một số thƠnh phần trong

m ng l ới điều hòa nƠy tham gia vƠo điều khiển sự hình thƠnh c r b t đ nh vƠ

r bên, tuy nhiên cũng có một số thƠnh phần khác ch đặc hi u cho một lo i r

nh t đ nh Vì những lý do nƠy, cơy lúa tr thƠnh một mô hình đầy h a hẹn để nghiên c u m ng l ới gen tham gia đến quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r

c a cơy xu t phát từ c hai bộ phận thơn vƠ r sau giai đo n r mầm

2.2.2.2 Các gen điều khiển sự hình thành và phát triển bộ rễ cảm ứng với các

Bên c nh auxin, các hoocmon thực vật khác nh cytokinin, ethylen, axit abscisic, gibberellin, axit jasmonic, cũng tham gia điều khiển quá trình hình thƠnh vƠ phát triển bộ r Chúng thông qua sự t ng tác t ng hỗ, hoặc đối

kháng với auxin để tác động đến hình thái vƠ c u trúc bộ r Một số gen đƣ đ ợc công bố ch u sự điều khiển c a các phytohoocmon nƠy nh :

Đột biến crl5 (crown root less 5) biểu hi n một kiểu hình với số l ợng r

chính gi m đáng kể, nguyên nhơn lƠ do có sự suy gi m quá trình phơn hóa r

chính t i gốc r (Kitomi et al., 2011) Gen CRL5 mƣ hóa yếu tố phiên mƣ

AP2/ERF (APETALA/ETHYLENE RESPONSE FARTOR transcription factor),

biểu hi n c a nó c m ng với auxin thông qua yếu tố phiên mƣ AFR Cytokinin

c n tr sự hình thƠnh r b t đ nh vƠ r bên lúa (Rani Debi et al., 2005; Kitomi

et al., 2011), nh ng những cơy có sự xu t hi n c a CRL5 l i có thể hình thƠnh r bên một cách bình th ng Nguyên nhơn lƠ do CRL5 kích ho t biểu hi n c a hai

d ng ARRs (A RESPONSE REGULATOR) - một ch t c chế các tín hi u c a

cytokinin (To et al., 2004)

T ng tự, yếu tố phiên mƣ WOX11 (WUSCHEL-related Homeobox trancription factor) kiểm soát sự biểu hi n c a các ARRs khác nhau vƠ điều khiển

c quá trình hình thƠnh lẫn quá trình phát triển c a r b t đ nh lúa (Zhao et al.,

2009) Biểu hi n c a WOX11 đ ợc gơy ra b i auxin vƠ cytokinin Kết qu nƠy cho th y CRL5 vƠ WOX11 lƠ một sự giao cắt giữa hai đ ng h ớng điều hòa đối

lập c a auxin vƠ cytokinin đối với sự hình thƠnh các r b t đ nh lúa

Gen HOX1 (HEME OXYGENASE 1) điều khiển sự hình thƠnh c a r bên

thông qua quá trình t o khí CO (carbon monoxide) HOX1 đ ợc điều hòa b i auxin vƠ các tín hi u stress, cũng nh axit jasmonic vƠ nitric oxit (Chen et al., 2012; Hsu et al., 2013), đơy lƠ một đ ng h ớng r t đáng quan tơm, chúng ta có

thể ng dụng đ ng h ớng nƠy vƠo để góp phần xơy dựng các mô hình kiến trúc

r ng phó với các điều ki n ngo i c nh b t lợi (stress)

2.2.2.3 Các gen liên quan đến sự hình thành mô phân sinh rễ

Sau b ớc kh i đầu, tế bƠo phơn chia vƠ tr thƠnh một bộ phận có hình d ng

c a một mô phơn sinh r Trong mô phơn sinh r có một trung tơm đ ợc t o thƠnh từ một l ợng nhỏ tế bƠo mô phơn sinh nh ng đang tr ng thái không phơn chia (quiescent center - QC), trung tơm nƠy lƠ cần thiết để duy trì tr ng thái ổn

đ nh c a các tế bƠo r đ ợc t o thƠnh (van den Berg et al., 1997) T i trung tơm

QC c a r lúa, vai trò c a auxin đ ợc thể hi n thông qua sự ho t động c a gen

OsIAA23 (Jun et al., 2011) Gen QHB (QUIESCENT CENTER HOMEOBOX) lƠ

một gen t ng đồng với WUSCHEL-related WOX5, một gen QC đặc tr ng

Arabidopsis, gen đóng góp trong vi c kiểm soát ho t động c a các tế bƠo QC vƠ

mô r (Kamiya et al., 2003a; Breuninger et al., 2008; Ditengou et al., 2008) Gen

QHB đ ợc biểu hi n trong giai đo n sớm c a quá trình phơn hóa r QC, vƠ

những biểu hi n c a nó độc lập với CRL1/ARL1 giai đo n hình thƠnh r b t

đ nh (Kamiya et al., 2003b; Inukai et al., 2005; Liu et al., 2005; Ni et al., 2014)

Mối quan h nƠy cho th y CLAVATA/WOX lƠ một đ n v tín hi u điều hòa ho t động c a mô phơn sinh đ nh r lúa T ng tự nh một đ n v điều hòa ho t

động c a mô phơn sinh đ nh chồi đƣ đ ợc mô t Arabidopsis Trong ph m vi

nƠy, sự vận chuyển tín hi u peptide CLV3 đ ợc đ m b o b i LRR RLK (LEUCINE RICH REPEAT RECEPTOR - LIKE KINASE) CLV1 (Müller et al.,

2006) Trong những dòng lúa siêu biểu hi n OsRPK1, gen mƣ hóa LRR RLK,

m c độ biểu hi n c a các gen OsPIN khác nhau đ ợc điều ch nh gi m xuống, sự

vận chuyển auxin theo cực b hỗn lo n vƠ chiều dƠi c a các r hình thƠnh trong

giai đo n n y mầm, cũng nh số l ợng các r b t đ nh vƠ mật độ c a r bên (Zou

et al., 2014) Tuy nhiên, ng i ta không xác đ nh đ ợc cụ thể gen nƠy có liên quan đến b ớc nƠo trong quá trình phát triển c a bộ r (có thể lƠ giai đo n bắt đầu hình thƠnh r , quá trình duy trì các mô phơn sinh, hay các quá trình khác c a

sự phát triển) Một điều đặc bi t lƠ OsRPK1 đ ợc điều hòa b i auxin, axits abscisic (ABA) vƠ các stress về mặn Vai trò nh h ng c a gen OsRPK1 đến

kh năng thích ng c a hình thái r đối với các điều ki n stress còn cần đ ợc

nghiên c u thêm (Zou et al., 2014)

Arabidopsis, SCARECROW (SCR), một yếu tố phiên mƣ (transcription factor) c a GRAS (GRAS family), cũng đặc tr ng cho vùng QC (Sabatini et al.,

2003) lúa, OsSCR1 đ ợc biểu hi n QC vƠ cũng có thể tham gia vƠo vi c xác

đ nh vùng QC (Ni et al., 2014) Sự biểu hi n c a OsSCR1 b suy gi m vùng mô phơn sinh r t i các đốt thơn gần gốc c a các cơy mang đột biến arl1 (Liu et al.,

2005) Cùng với SHORTROOT (SHR), một yếu tố phiên mƣ GRAS khác, SCARECROW điểu khiển sự phơn chia c a nội bì/ tế bƠo ban đầu c a lớp vỏ vƠ

sự bi t hóa nội bì Arabidopsis (Di Laurenzio et al., 2007; Cui et al., 2007) lúa, c chế nƠy cũng đ ợc b o tồn, OsSCR1 cũng biểu hi n nội bì, tế bƠo ban đầu c a lớp vỏ vƠ giai đo n sớm c a sự bi t hóa c a các tế bƠo nội bì (Ni et al.,

2014) H n nữa, OsSCR1 có thể t ng tác với OsSHR1, điều nƠy đ ợc quan sát

th y t i vùng trung trụ c a r nh ng có thể đơy ch lƠ quá trình d ch chuyển để đi

đến các tế bƠo phơn sinh nội bì (Kamiya et al., 2003a; Cui et al., 2007; Ni et

lúa đ ợc đặc tr ng b i lớp ngo i bì cũng nh lớp tế bƠo c ng mô

nằm ngay bên trong biểu bì (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010) Huang

et al. (2009) đƣ xác đ nh đ ợc một đột biến c m ng với nhôm, ký hi u lƠ c68,

trong đột biến nƠy sự bi t hóa c a biểu bì vƠ ngo i bì b rối lo n, gen t ng ng

với đột biến nƠy lƠ DEFECTIVE IN OUTERCELL LAYER SPECIFICATION 1

(DOCS1) , mƣ hóa một protein LRR RLK (Huang et al., 2012a) Kết qu nƠy ch

ra rằng nghiên c u sơu h n về các gen liên quan đến ho t động c a mô phơn sinh

vƠ các mô r theo c u trúc xuyên tơm có thể sẽ giúp chúng ta xác đ nh đ ợc

những nguồn gen mới cho tính kháng vƠ nơng cao kh năng thích ng c a cơy lúa trong điều ki n đ t đai b nhi m độc

2.2.2.4 Các gen liên quan đến sự xuất hiện của rễ hậu phôi

Các r xu t hi n sau giai đo n n y mầm đ ợc g i lƠ r hậu phôi, đối với cơy lúa, bộ r hình thƠnh sau giai đo n n y mầm ch yếu lƠ r b t đ nh phát sinh từ đốt thơn sát mặt đ t (CR), vƠ các r bên (lateral root - LR) phát sinh từ các r chính (th ng lƠ r b t đ nh - CR) Khi hình thƠnh, các mô phơn sinh r ph i phát triển xuyên qua thơn (đối với r b t đ nh - CR) hoặc các mô r (đối với các r bên -LR) Sự xu t hi n c a r b t đ nh (CR) b kích thích trong môi tr ng ngập

n ớc Sự kích thích nƠy ph i thông qua tác động c a ethylen, liên quan đến biểu

hi n c a các gen điều hòa chu trình tế bƠo c a các mô phơn sinh r b t đ nh (CR)

vƠ thúc đẩy, trong quá trình đồng tổng hợp với axit gibberellic, sự chết c a tế bƠo

biểu bì vùng r xu t hi n (Lorbiecke and Sauter, 1999; Mergemann and Sauter,

2000; Steffens et al., 2006) Nitric oxit (NO) cũng có tác động thúc đẩy sự xu t

hi n c a r b t đ nh (CR), trong khi axit abscisic c chế quá trình nƠy (Steffens et

al., 2006; Xiong et al., 2009) Một ch c năng vận chuyển auxin phơn cực thông qua sự điều hòa c a gen OsPIN1 cũng cần thiết cho sự xu t hi n vƠ phát triển r

b t đ nh (Xu et al., 2005) Trong đột biến Oscand1, mô phơn sinh r b t đ nh b

c chế hoƠn toƠn vƠ chúng hình thƠnh nh ng không hề xu t hi n (Wang et al., 2010) Arabidopsis, OsCAND1 mƣ hóa một protein điều hòa (ubiquitin ligase)

có tên CULLIN- ASSOCIATED AND NEDDYLATION-DISSOCIATIED 1 (CAND1) SCFTIR1 liên quan đến sự suy gi m c a AUX/IAA trong quá trình đáp

ng với auxin (Cheng et al., 2004) Trong đột biến Oscand1, sự phơn bố c a

auxin b thay đổi trong mô phơn sinh r b t đ nh, nh lƠ một biểu hi n c a các gen đều hòa chu trình tế bƠo Trong những cơy đƣ b phá vỡ ho t động c a gen

origin recognition complex subunit3 (orc3), sự xu t hi n c a các r bên đƣ b kìm

hƣm b i sự rối lo n các ho t động trong chu trình tế bƠo trong vi c hình thƠnh

các mô phơn sinh r bên mới (Chen et al., 2013) OsORC3 cũng đ ợc biểu hi n

r mầm vƠ t i mầm r b t đ nh, có vẻ nh nó tham gia vƠo nhiều quá trình khác nhau trong sự phát triển c a bộ r

Sự hình thƠnh vƠ xu t hi n r lƠ những quá trình c b n quyết đ nh số l ợng

vƠ sự phát triển bộ r thực vật Nghiên c u về quá trình nƠy lƠ cần thiết để xác

đ nh các yếu tố di truyền quyết đ nh đến kh năng tăng c ng số l ợng nhánh bên c a bộ r

Các đột biến khác nhau liên quan đến sự phát triển bộ r cho phép xác đ nh

đ ợc các gen liên quan đến các ch c năng sinh h c khác nhau Một số gen nƠy lƠm gi m sự phát triển c a r bằng cách tác động nên quá trình hình thƠnh vách

ngăn tế bƠo r Gen OsDGL1 lƠ gen mƣ hóa tiểu đ n v

DOLICHYLDIPHOSPHO-OLIGO-SACCHARIDE-PROTEIN GLYCOSYLTRANSFERASES 48 kDa, tiền thơn c a c u trúc polisaccharide trong vách ngăn c a tế bƠo r lúa Các cơy ch a gen đột biến Osdgl1 biểu hi n một kiểu hình r ngắn b i vì đƣ có một lỗi x y ra

trong quá trình kéo dƠi vƠ phơn chia c a tế bƠo r (Qin et al., 2013)

Một gen khác tác động nên sự hình thƠnh vách ngăn tế bƠo trong quá trình phơn bƠo c a r lúa đƣ đ ợc phơn lập bằng ph ng pháp sƠng l c các đột biến có

kiểu hình r ngắn đ ợc đặt tên lƠ OsGLU3 Gen nƠy mƣ hóa một protein gi đ nh MEMBRANE-BOUND ENDO 1,4-B-GLUCANASE (Zhang et al., 2012a) Trong đột biến Osglus3, hƠm l ợng tinh thể cellulose b suy gi m trong vách ngăn tế bƠo vƠ quá trình kéo dƠi r b c chế Điều nƠy cho th y rằng OsGLUS3

có thể đóng góp vƠo quá trình điều ch nh sự phát triển c a bộ r trong môi tr ng thiếu hụt photphate (lơn) (Zhang et al., 2012b)

M rộng cũng lƠ một nhơn tố quan tr ng c a quá trình kéo dƠi r lúa, Shin

et al (2005) trong nghiên c u c a mình đƣ xác nhận gen OsEXPANNSIN8

(OsEXPA8) biểu hi n đặc hi u đầu r (Shin et al., 2005) Cơy siêu biểu hi n

gen OsEXPA8 có kh năng tăng tr ng đều theo không gian hình cầu tốt h n cơy đối ch ng, mang l i sự c i tiến đáng chú ý trong h r c a chúng, sự kéo dƠi vƠ

phơn nhánh bộ r đ ợc kích thích m nh mẽ (Ma et al., 2013) Kiểu hình nƠy lƠ

kết qu c a sự tăng kh năng kéo dƠi c a vách tế bƠo

Đột biến Osspr1(Oryza sativa short postembryonic root 1) cũng mang đến