Ảnh hưởng của acid Salicylic, Aspirin trong tăng trưởng và phát triển cây lan Thạch Hộc thiết bì ( Đernobium officinale Kimura et Migo)

−− ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN THẠCH HỘC THIẾT BÌ Dendrobium officinale Kimura et Migo TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

−−

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN

TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN

THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P

Sinh viên: LÊ NGUYỄN HOÀNG KIM NGÂN

−−

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN

TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN

THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P

Sinh viên: LÊ NGUYỄN

HOÀNG KIM NGÂN

MSSV: 1411100072 Lớp: 14DSH01

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CÁM ƠN iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ vii

DANH SÁCH HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Nội dung thực hiện 3

1.4 Phương pháp nghiên cứu 3

1.5 Yêu cầu của đề tài 3

1.6 Kết cấu của đề tài 4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì 5

2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 13

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 22

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

3.1 Thời gian và địa điểm 30

3.2 Vật liệu và hoá chất 30

3.3 Điều kiện nuôi cấy 31

3.4 Nội dung nghiên cứu 32

3.5 Phương pháp thu chỉ tiêu theo dõi 40

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 42

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 1

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đồ án tốt nghiệp “Ảnh hưởng của Acid Salicylic và Aspirin trong

tăng trưởng và phát triển cây lan thạch hộc thiết bì trong điều kiện in vitro” là chuyên đề

nghiên cứu của em trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy T.S Đỗ Đăng Giáp Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong đồ án tốt nghiệp là khách quan và không sao chép số liệu của bất kì công trình nghiên cứu nào trước đây

Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường và hội đồng về sự cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và ban giám hiệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho sinh viên chúng em được học tập, sinh hoạt và nghiên cứu thêm nhiều điều hay và bổ ích

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, ngành Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức rất quý báu, những kinh nghiệm quý báu về học và làm trong suốt 4 năm học vừa qua

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy T.S Đỗ Đăng Giáp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đồ án tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã đồng hành và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện

Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASA Acetylsalicylic acid (Aspirin)

MS Môi trường Murashige – Skoog

NAA α - Naphthaleneacetic acid

DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Bảng thiết bị

Bảng 4.1 Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc

thiết bì sau 4 tuần quan sát

Bảng 4.2 Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc

thiết bì sau 4 tuần quan sát

Bảng 4.3 Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc

thiết bì sau 4 tuần quan sát

Bảng 4.4 Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc

thiết bì sau 4 tuần quan sát

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch

hộc thiết bì

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên tổng số chồi của cây lan

thạch hộc thiết bì

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều TLT và TLK của

cây lan thạch hộc thiết bì

Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan

thạch hộc thiết bì

Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên tổng hàm lượng

Chlorophyll của cây lan thạch hộc thiết bì

Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan

thạch hộc thiết bì

Biểu đồ 4.7 Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan

thạch hộc thiết bì

DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.2 Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.3 Lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.4 Thân khí sinh của lan thạch hộc

Hình 2.5 Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.6 Hoa của lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.7 a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Salicylic acid

Hình 2.8 Sơ đồ các con đường tổng hợp salicylic acid trong cây

Hình 2.9 Các ảnh hưởng của SA lên thực vật

Hình 2.10 a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin

Hình 2.11 Dẫn xuất Aspirin từ Salicylic acid

Hình 2.12 Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor a: mẫu

cấy ban đầu b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận

Hình 3.1 Mẫu nuôi cấy ban đầu

Hình 3.2 Mẫu lan thạch hộc sử dụng để tiến hành thí nghiệm SA và ASA

Hình 3.3 Lan thạch hộc thiết bì khi sấy khô

Hình 4.1 Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bên cạnh những loài thực vật đa dạng làm nguồn thực phẩm hay làm đồ trang trí thì còn có một số loại thực vật quý được sử dụng với mục đích bồi bổ cơ thể và rất có giá trị dược liệu như sâm ngọc linh, ngải cứu, đông trùng hạ thảo,

Thêm vào đó còn có một số loài thực vật không những được trồng làm cây cảnh

mà còn có thể dùng để trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ mắt, chống lão hoá, rất hiệu quả, đó là lan thạch hộc thiết bì (Nguyễn Thanh Thuận, 2015) Ngoài ra, lan thạch

hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) còn có nhiêu giá trị dược học như

chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp (Kowitdamrong, 2013; Chu, 2014) Do có nhiều lợi ích

và nơi phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là

những vùng núi cao gây nguy hiểm cho người thu hái nên giá cả rất đắt đỏ Hơn nữa, lan thạch hộc thiết bì khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán và cũng hiện là loài đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá

“bị đe doạ” (Bậc T) (Sách đỏ Việt Nam năm 2007 – phần thực vật – trang 448), suy giảm

nghiêm trọng do chặt phá rừng và thu hái về trồng làm cây cảnh (Gu, 2007) Vì thế, cần phải có biện pháp giúp bảo tồn loài dược liệu quý

Nhiều loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên thường được bảo tồn

nhờ phương thức nảy mầm từ hạt (Kauth, 2005) Với công nghệ nhân giống in vitro hiện

nay, hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn đến một triệu cây con (Trần

Văn Minh, 2001) Đã có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan Dendrobium sp

bằng phương pháp gieo hạt lan trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (Luan

và cs, 2006) Nguyễn Văn Song (2011) cũng có nghiên cứu về việc nhân nhanh in vitro

loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường sacarose + 2,0 mg/l BA Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp dụng công nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số loài lan bản địa làm dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo có nguy cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị Sơn và cs, 2012; 2013; Vũ Ngọc Lan và cs, 2013)

Kỹ thuật nuôi cấy mô mở ra hướng mới giúp bảo tồn những loài thực vật có nguy

cơ tuyệt chủng như lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Phương pháp nuôi cấy mô đem lại giá trị kinh tế cao, tiết kiệm được thời gian chăm sóc, tạo ra cây giống đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, năng suất cao, chất lượng đảm bảo không bị phụ thuộc vào điều kiện khí hậu bên ngoài nên nuôi cấy mô ngày càng khẳng định tính ưu việt trong việc nhân nhanh cũng như bảo tồn những loài cây quý

Môi trường nuôi cấy thực vật in vitro chủ yếu bao gồm muối khoáng, vitamin, các

khoáng chất, nguồn carbon và các chất điều hoà sinh trưởng khác (Bektas và cs, 2013)

Và trong các chất điều hoà sinh trưởng thì Salicylic acid và Aspirin có thể giúp tăng nhanh tốc độ sinh trưởng và phát triển của thực vật

Năm 2017, Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của

các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chồi in vitro lan thạch hộc thiết

bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) đã tìm ra nồng độ thích hợp của các chất

điều hòa sinh trưởng thực vật an toàn khi sử dụng để kích thích phát triển chồi và cụm chồi của lan thạch hộc thiết bì Thêm vào đó, từ năm 2015 đến năm 2017, nghiên cứu của Trần Ngọc Ngoạn đã xây dựng và thu được các kết quả khả quan từ mô hình trồng lan thạch hộc thiết bì từ cây nuôi cấy mô tế bào

Với mục đích bảo tồn nguồn dược liệu quý và tăng nhanh tốc độ sinh trưởng của

lan thạch hộc, đề tài: “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong

tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro” nhằm tìm ra nồng độ Salicylic acid và Aspirin thích

hợp và an toàn với sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium

officinale Kimura et Migo)

1.2 Mục đích nghiên cứu

Với mục đích nhân nhanh với năng suất cao loài lan thạch hộc thiết bì

(Dendrobium officinale Kimura et Migo) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm

góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý và tạo ra nguồn sinh khối lan lan thạch hộc thiết

bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) dồi dào cung cấp rộng rãi cho người sử dụng

Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược

1.3 Nội dung thực hiện

− Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì trên hai dãy nồng độ

− Khảo sát ảnh hưởng của aspirin lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì trên hai dãy nồng độ

− Tìm nồng độ thích hợp nhất của salicylic acid và aspirin tạo ra kết quả tối ưu nhất

cho sự tăng trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì in vitro

1.4 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần Các số liệu thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm SAS và sử dụng các hàm trong excel

1.5 Yêu cầu của đề tài

Xác định được công thức tối ưu của môi trường nuôi cấy MS kết hợp salicylic

acid và aspirin thích hợp nhất cho cây lan thạch hộc thiết bì in vitro tăng trưởng tốt

1.6 Kết cấu của đề tài

Chương 1: Mở đầu

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

2.1.1 Mô tả về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Chi Dendrobium, bao gồm 1100 loài hoặc nhiều hơn nữa trên thế giới, là một nhóm lớn nhất trong họ Orchidaceae Có 76 loài thuộc chi Dendrobium ở Trung Quốc, gồm

74 loài và 2 loại, trong đó thân cây được sấy khô của D.officinale được liệt kê trong Dược điển Trung Hoa dưới tên Dendrobii Officinalis Caulis (Tie-pi-shi-hu) như một

khoản mục riêng Theo như thuyết Y khoa Cổ Truyền Trung Hoa, chức năng chính của

D.officinale là dưỡng âm và loại bỏ khí hư, “bảo vệ” dạ dày và điều hoá chất lưu Loài

này được sử dụng với mục đích chính là “bảo vệ” dạ dày, điều hoà sản phẩm chất lưu của cơ thể, và xoa dịu các triệu chứng như là khô họng và khô mắt với thị lực mờ trong phòng khám, và được tìm thấy có thể kích thích miễn dịch (Sydney Tang và cs, 2011)

và tác dụng kháng u bướu (Kowitdamrong và cs, 2013)

Hình 2.1 Lan thạch hộc thiết bì

Hình 2.2 Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì

Cây lan Thạch hộc thiết bì thuộc:

Giới: Plantae (giới Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (ngành Ngọc Lan)

Lớp: Magnoliopsida (lớp Ngọc Lan)

Bộ: Asparagales (bộ Măng Tây)

Họ: Orchidaceae (họ Lan)

Chi: Dedrobium (chi Lan hoàng thảo)

Loài: Dendrobium officinale Kimura et Migo

Hình 2.3 Lan thạch hộc thiết bì

2.1.3.1 Đặc điểm của cây trưởng thành

Thạch hộc thiết bì hay thạch hộc tía là cây thảo phụ sinh lâu năm, thân mọng nước, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát Với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía và có giá trị độc đáo về dược phẩm (Chu Chu và cs, 2014)

2.1.3.2 Đặc điểm của thân rễ

Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Thân rễ thường có màu xanh và không phủ lông Số lóng trên thân thay đổi tùy từng cây và dao động trong khoảng từ 3 – 7 lóng (Chu Chu và cs, 2014)

2.1.3.3 Đặc điểm thân khí sinh

Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân từ 3,5 – 8 cm, bán kính thân 0,2 – 0,4 cm Bề mặt vỏ ngoài vàng – xanh hoặc vàng – vàng (Chu Chu và cs, 2014)

Hình 2.4 Thân khí sinh của lan Thạch hộc

2.1.3.4 Đặc điểm của rễ

Rễ mọc ra từ các mấu trên thân Đôi khi rễ cũng được hình thành từ rễ khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất, thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, thỉnh thoảng có nhiều hơn Số lượng và khích thước rễ khác nhau cho từng cá thể Số lượng rễ trong khoảng từ

2 – 9 (Chu Chu và cs, 2014)

2.1.3.5 Lá cây

Hình 2.5 Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì

Lá hình thuôn dài, mọc so le đều hai bên thân, phía cuống tù, gần như không cuốn,

ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12 cm, rộng 2 – 3 cm trên có 5 gân dọc (Nguyễn Thanh Thuận, 2015)

2.1.3.6 Đặc điểm hoa, quả

Cụm hoa mọc thành chùm 2 – 4 hoa ở sát nách lá, hoa nở khoảng tháng 3 – 4, và kết quả vào khoảng tháng 5 – 6 (Nguyễn Ngọc Thuận, 2015)

Hình 2.6 Hoa của lan thạch hộc thiết bì

2.1.4 Giá trị dược liệu của lan thạch hộc thiết bì

Theo Dược điển Trung Quốc thì trong D.officinale Kimura et Migo có dendrobium

polysaccharides (23%), alkaloids (0,02 – 0,04%), amino – acids (135 mg/g cây khô), nhiều kim loại như Sắt (292 mcg/g), Kẽm (12 mcg/g), Mangan (52 mcg/g), Đồng (3,6 mcg/g) Ngoài ra, thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon Trong thân cây thạch hộc tía

có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6 – hydroxy – dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N – methyl – dendrobium, 8 – epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng Thân cây thạch hộc tía có dầu bay hơi, trong

đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50% Trong cổ thư đông y Trung

Quốc cách đây hơn 1000 năm đã xác định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc, tuyết liên, nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh chi, ngọc trai, đông trùng hạ thảo, trong đó thạch hộc tía xếp đầu bảng

Nghiên cứu của Liu, X F và cs (2011) cho thấy khi cho chuột uống dịch chiết và

các Polysaccharide thô của D.officinale Kimura et Migo giúp cải thiện và tăng cường

đáng kể khả năng miễn dịch tế bào và miễn dịch không đặc hiệu ở chuột, tăng sản sinh IFN – gamma ở lách

Nghiên cứu tác dụng của D.officinale Kimura et Migo trên hệ tiêu hoá cho thấy

một polysaccharide (Dendronan) có tác dụng tốt, giúp điều hoà hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng các acid béo chuỗi ngắn SCFA, giảm pH ruột kết và thời gian hình thành phân (Zhang, G.Y., và cs, 2015)

Ngoài ra, D.officinale Kimura et Migo là một trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo

và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (Yao, C và cs, 2012)

2.1.5 Giá trị thị trường của lan thạch hộc

Trên thị trường, thân cây tươi thạch hộc tía đang có giá bán khoảng 150 USD/kg Giá trị của nó còn được cổ thư xếp trên nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh chi, ngọc trai, đông trùng hạ thảo

2.1.6 Nhân giống lan thạch hộc thiết bì

2.1.6.1 Nhân giống bằng giao hạt

Năm 2014 theo Nguyễn Thị Sơn và cs quả lan sau khi được khử trùng, xẻ lấy hạt cấy vào các môi trường nền: MS (Murashige & Shoog, 1962), VW (Vacin & Went, 1949), Hyponex Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu vàng chanh Sau 8 tuần nuôi cấy thu được kết quả các hạt đã nảy chồi 100% trên nền môi trường MS và VW Hạt gieo

trên nền môi trường VW cho tỷ lệ hạt có màu xanh cao nhất, sau 6 tuần nuôi cấy cho tỷ

lệ mẫu phát sinh chồi cao nhất (100%) Hạt được gieo trên nền môi trường H cho tỷ lệ mẫu có màu xanh thấp nhất sau 8 tuần nuôi cấy Về hình thái, chồi tốt nhất trên môi trường nền VW (đồng đều màu xanh bóng, không bị xốp, không bị mọng nước, chồi phát triển mạnh không bị biến dị), tiếp đến là MS Vì vậy, môi trường VW + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường + 10% ND là môi trường thích hợp nhất

cho sự nảy mầm của hạt lan D officinale Kimura et Migo

2.1.6.2 Nhân nhanh cụm chồi

Theo Nguyễn Thị Sơn và cs, môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường là tối ưu cho nhân nhanh cụm chồi loài lan nghiên cứu Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan và cs., (2013) khi nhân nhanh cụm chồi lan thuốc D.nobile Lindl Kết quả nghiên cứu trên lan hài Hằng (P hangianum Gurss.) khi nhân nhanh chồi cho biết cần bổ sung lượng chuối cao hơn, lên đến 100g chuối/lít môi trường (Hoàng Thị Giang và cs., 2010)

2.1.6.3 Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân in vitro mang mắt ngủ

Cây lan in vitro thân mang 2 mắt ngủ được đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền

MS đều tái sinh chồi và cho sinh trưởng mạnh nhất, thể hiện qua chiều cao chồi, đường kính chồi, số chồi và màu sắc lá xanh tốt hơn hẳn trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA + 6g agar/lít môi trường là thích hợp cho

việc phát sinh chồi giống lan D officinale Kimura et Migo Tương tự với kết quả của Li

(2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống lan này tại Trung Quốc (Nguyễn Thị Sơn và

cs, 2014)

2.1.6.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Theo nghiên cứu Nhân giống in vitro lan thạch hộc thiết bì của Nguyễn Thị Sơn và

cs năm 2014 môi trường RE + 10 g sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 α – NAA/lít

môi trường là tối ưu ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh giống lan D officinale Kimura et

Migo Với tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi; chiều dài rễ trung bình là 3,19 cm sau 30 ngày nuôi cấy

2.1.7 Một số nghiên cứu trên lan thạch hộc thiết bì Dendrobium officinale

Nghiên cứu “Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (thạch

hộc thiết bì)” của Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thuỷ và cs vào năm 2014 đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW + 10 g sucrose + 6 g agar + 100 ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100 ml ND +

20 g sucrose + 6 g agar + 60 g chuối chín/lít môi trường Nhân giống vô tính thông qua

nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi

cấy trên môi trường MS + 20 g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA + 6 g agar/lít môi trường Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 mg/l α – NAA

Nguyễn Thanh Thuận năm 2015 đã nghiên cứu “Giá trị dược liệu của cây lan thạch

hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” đã khẳng định giá trị dược học của

loại thảo dược này về khả năng kháng khuẩn, chống oxy hoá, tăng cường hệ miễn dịch,

ức chế tế bào ung thư, điều hoà đường huyết, cải thiện hoạt động của hệ tiêu hoá, ổn định

hệ vi sinh đường ruột,

Năm 2017, Hanxiao Tang, Tianwen Zhao, Yunjie Sheng, Ting Zheng, Lingzhu Fu

và Yongsheg Zhang đã có nghiên cứu về dược tính của lan Thạch hộc – một loại thảo mộc bổ dưỡng trong dược liệu Trung Quốc Khoảng 190 hợp chất đã được phân lập từ

Dendrobium officinale Kimura et Migo trong những thập kỷ qua Tác dụng dược lý của Dendrobium officinale Kimura et Migo có tác dụng chống ung thư, hạ đường huyết,

chống lão hóa, bảo vệ dạ dày loét Tuy nhiên, còn có các thành phần phân tử nhỏ khác cần nghiên cứu thêm

2.1.8 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc thiết bì Dendrobium officinale

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của lan Thạch hộc

mà không thể bỏ qua đó chính là ánh sáng Ánh sáng cần phải được đảm bảo để có thể quang hợp và sinh trưởng được Lan Thạch hộc thuộc giống lan ưa nắng nên không cần cung cấp quá nhiều ánh sáng, chỉ cần một lượng nhỏ và vừa đủ 70%

2.1.8.3 Độ ẩm không khí

Đa số các loại lan đều có thể sống trong môi trường nhiệt đới với độ ẩm không khí đạt từ 70 – 90%, còn riêng lan Thạch hộc sẽ là 60 – 80% Do đó trong quá trình tiến hành trồng và chăm sóc, cần đảm bảo độ ẩm khoảng 70% để lan có thể sinh trưởng tốt

và thuận lợi nhất

2.1.8.4 Nước

Lan khá dễ ngập úng mặc dù chúng là loài ưa ẩm, chính vì vậy trong những ngày mưa nên hạn chế việc tưới nước, điều tiết lượng nước phù hợp để tránh tình trạng ngập úng, thối rễ Trong giai đoạn mọc rễ, chồi và sinh trưởng, cây lan sẽ cần rất nhiều nước, cần phải đảm bảo đủ nước để cây phát triển khỏe mạnh

2.1.8.5 Sự thông thoáng

Cần đảm bảo thoáng khí, thoáng gió để hạn chế tình trạng bệnh trên cây Nên tránh việc trồng lan ở nơi có nhiều bụi bẩn, khói, không khí ô nhiễm sẽ cản trở quá trình hô hấp của cây

2.2 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

2.2.1 Salicylic acid (SA)

2.2.1.1 Giới thiệu chung

vệ thực vật dưới áp lực sinh học và phi sinh học Các cơ chế bảo vệ này bao gồm việc thành lập hệ thống kháng tập nhiễm (systemic acquired resistance-SAR) (Mecroux và cộng sự, 1990), tạo nên protein gây tính kháng bệnh ở cây chủ (pathogenesis- related proteins-PR) (Malamy và cộng sự, 1990) cũng như là tạo ra tính "siêu mẫn cảm" ở thực vật ("hypersensitive response") (Horváth và cộng sự, 2007) Tác dụng bảo vệ của SA đối với các yếu tố stress phi sinh học như kim loại độc (Strobel và Kuc, 1995), stress nhiệt (Dat và cộng sự, 1998), nhiệt độ thấp (Janda và cộng sự, 1999, Mora- Herrera và cộng

sự, 2005 ), và oxy hoá gây hại (Strobel và Kuc, 1995; Kusumi và cộng sự, 2006) đã được chứng minh Hơn nữa, vai trò của SA trong việc tạo ra khả năng chịu mặn đã được nghiên cứu chi tiết ở nhiều loài thực vật SA đã được báo cáo đã tạo ra khả năng chịu mặn trong

cà chua (Stevens và cộng sự, 2006), ngô (Gunes và cộng sự, 2007), cà rốt (Eraslan và cộng sự, 2007) và lúa mỳ (Arfan và cộng sự, 2007) Nó cũng đã được sử dụng để tăng cường tái tạo in vitro ở một số loài thực vật (Quiroz-Figueroa và cộng sự, 2001, Luo và cộng sự, 2001, Hao và cộng sự, 2006) Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào được thực hiện ở các loài Hibiscus, bao gồm Hibiscus acetosella và Hibiscus moscheutos, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới ở phía tây châu Phi (Menzel và Wilson, 1961) và Bắc Mỹ

Salicylic acid là một acid monohydroxybenzoic béo, một loại acid phenolic và một acid beta hydroxy Acid hữu cơ kết tinh không màu, được sử dụng rộng rãi trong tổng

hợp hữu cơ và có chức năng như một hormone thực vật Nó có nguồn gốc từ sự trao đổi chất của salicin Ngoài việc giữ vai trò là một chất chuyển hóa có hoạt tính quan trọng của aspirin (acid acetylsalicylic), mà hoạt động một phần như là một tiền chất của acid salicylic, có lẽ nó được biết đến nhiều nhất vì nó được sử dụng như là một thành phần quan trọng trong các sản phẩm chống mụn trứng cá (WHO, 2015)

(Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Acid_salicylic) Salicylic acid là một trong những nguyên liệu ban đầu để sản xuất acetylsalicylic acid (aspirin) năm 1897 Salicylic acid là một chất điều chỉnh tăng trưởng nội sinh và có

thể điều chỉnh sự phát triển của thực vật in vitro bằng cách ảnh hưởng đến chức năng

sinh lý và sinh hóa của chúng (Agami và Mohamed, 2013) Vai trò của salicylic acid trong sự tăng trưởng mô, sự phát triển nhiều chồi, rễ và xơ cứng của cây con có nguồn

gốc in vitro đã được quan sát thấy ở Ziziphus spina – Christi (Galal, 2012), Hibiscus

acetosella và Hibiscus moscheutos (Sakhanokho và Kelley, 2009)

2.2.1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp SA của thực vật

Chu trình shikimic acid sinh ra cinnamic acid rồi sau đó biến đổi theo hai cách để tạo thành salicylic acid:

− Thông qua isochorismic acid nhờ isochorismate pyruvate lyase (IPL) xúc tác và từ phenylalanine tạo cinnamic nhờ phenylalanie ammonia lyase (PAL) xúc tác Sau

đó SA tổng hợp từ benzoic acid, một dẫn xuất từ cinnamic acid, nhờ benzoic acid

2 – hydroxylase (BA2H) xúc tác

− SA cũng tổng hợp từ cinnamic acid thông qua o – coumaric acid Enzyme salicylic acid methyl transferase (SAMT) xúc tác tạo methyl salicylate từ salicylic acid, còn enzyme salicylic acid glucosyl transferase (SAGT) xúc tác phản ứng glycosyl – hóa SA tạo dẫn xuất beta – glucoside

Quá trình sinh tổng hợp SA của thực vật được biểu diễn dưới dạng sơ đồ trong hình sau:

Hình 2.8 Sơ đồ các con đường tổng hợp salicylic acid trong cây

2.2.1.2 Ảnh hưởng của SA lên thực vật

2.2.1.2.1 Ảnh hưởng sinh lý

Salicylic acid đã cho thấy có ảnh hưởng trên nhiều quá trình của thực vật Sự trổ hoa, sự phát sinh nhiệt trong những cây sinh nhiệt, và kích thích tính kháng bệnh là những quá trình mà SA có những ảnh hưởng chính Aspirin (Acetylsalicylic acid) hoạt động giống như SA vì nó được chuyển thành salicylic acid trong dung dịch của nước trong thực vật cũng như hệ thống động vật (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.2.1.2.2 Ảnh hưởng lên sự trổ hoa

Salicylic acid có thể kích thích sự trổ hoa Có thông tin cho rằng SA đươc xử lý kết

hợp với kinetin và IAA thúc đẩy sự tạo mầm hoa cây thuốc lá trong nuôi cấy mô Tuy nhiên cũng có những kết quả trái ngược về vấn đề này và cho rằng có nhiều hợp chất ảnh hưởng lên sự tạo mầm hoa này không riêng gì SA (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.2.1.2.3 Mối quan hệ giữa SA và sự phát sinh nhiệt trong cây

Sự phát sinh nhiệt trong cây hoa loa kèn được xác định là do SA tác động SA gây

ra sự phát nhiệt để làm bay hơi những hợp chất amin và indole có mùi để hấp dẫn côn trùng đến giúp cho sự thụ phấn Nhiệt độ xung quanh hoa có thể tăng lên 14oC (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.2.1.2.4 Mối quan hệ giữa Salicylic acid và tính kháng bệnh trong cây

White và cs là những người đầu tiên tiến hành xử lý SA và các dẫn xuất của nó (2,6 dichloroisonicotinic acid (INA), benzothiadiazol S – methyl ester (BTH) để cảm ứng làm tăng tính kháng bệnh virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá Cụ thể là xử lý nói trên thường làm tăng sự biểu hiện của các gen kháng virus, vi khuẩn, oomycete và nấm bệnh

ở cả cây một và hai lá mầm SA thường kích thích tạo chất ức chế quá trình sao chép và khả năng xâm nhập của virus SA kiểm soát phản ứng siêu mẫn cảm HR làm chết tế bào, hàm lượng chất chứa các gốc oxy hoạt động, hoạt hóa phản ứng peroxide hóa lipid tạo các gốc tự do

Một vài loài cây kháng bệnh giới hạn sự phát triển của vết bệnh thành một vùng nhỏ quanh nơi xâm nhiễm của mầm bệnh lúc đầu với một hoại tử xuất hiện Tế bào tự chết để bảo vệ được gọi là phản ứng quá nhạy cảm Hiện tượng này thường đi kèm với

sự sản xuất ra một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ Tính kháng bệnh và sự sản sinh ra protein này có thể được tạo ra do SA hoặc acetylsalicylic acid ngay cả khi không

có mầm bệnh xâm nhiễm Trong quá trình phát triển của những cây siêu nhạy cảm đáp ứng với mầm bệnh, một số lượng lớn SA đã được sinh ra từ cinnamic acid trong vùng phụ cận của vết bệnh hoại tử (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.2.1.3 Một số nghiên cứu sử dụng SA trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nghiên cứu: Cải thiện ảnh hưởng của salicylic acid đến cây Táo gai dại Ziziphus

spina-christi (L.) của Abdelnasser Galal vào năm 2012 đã chứng minh được khi môi

trường nuôi cấy MS đạt được tối ưu khi bổ sung với 0,25 (mg/l) 6 – Benylaminopurine (BAP) và 25 (mg/l) SA Điều kiện nuôi cấy mô sẹo tối ưu thu được trên môi trường MS

bổ sung với 3 (mg/l) 2,4 – Dichlorophenoxyaacetic acid (2,4 – D) và 25 (mg/l) SA, trong khi điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sẹo soma hình thành thu được trên môi trường MS bổ sung với 2,0 (mg/l) 2,4 – Dichlorophenoxyaacetic acid (2,4 – D) và 10 (mg/l) SA Năm 2013, Ana Cláudia Pacheco và cs đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của

SA đến sự tăng trưởng và ra hoa của cây cúc vạn thọ (Calendula officinalis L.) và cũng

làm tăng tổng hàm lượng flavonoid trong cụm hoa của loài cây này trong nghiên cứu: Những thay đổi do salicylic acid tác động đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo flavonoid của cúc vạn thọ

SA là một chất giống như hormone đã được báo cáo để tăng cường tái tạo in vitro

ở một số loài thực vật, bao gồm cà phê arabica (Quiroz-Figueroa và cộng sự, 2001), đậu ván dầu adsurgen (Luo và cộng sự, 2001), và yến mạch nuda (Hao và cộng sự, 2006)

Hiệu quả tích cực của SA đối với sự hình thành và tăng trưởng của rễ là mối quan

tâm đặc biệt, vì một số báo cáo về các nghiên cứu khả năng chịu mặn in vitro cho thấy

rằng sự hình thành và phát triển của rễ không chỉ bị ảnh hưởng đến muối mà còn tương quan với khả năng chịu mặn ở cả cây trồng (Martinez, 1996; Cano và cộng sự, 1998) Hơn nữa, sử dụng SA ngoại sinh tác động qua rễ đã tạo ra khả năng chống chịu đối với

các stress phi sinh học bao gồm khả năng chịu nhôm của cây Muồng ngủ (Cassia tora)

(Yang và cộng sự, 2003), chịu cadmium của lúa (Guo và cộng sự, 2007) và chịu mặn của lúa mì (Arfan và cộng sự, 2007)

Ngoài ra, các đặc tính kháng nấm của salicylic acid, khi hòa tan vào trong nước làm chậm sự tăng trưởng của nấm mốc làm tắc nghẽn các mô mạch của hoa

Hình 2.9 Các ảnh hưởng của SA lên thực vật

2.2.2 Aspirin (ASA)

2.2.2.1 Giới thiệu chung

Công thức hóa học: C9H8O4

Điểm sôi: 140oC

Aspirin, hay acetylsalicylic acid (ASA), là một dẫn xuất của salicylic acid Khi nghe đến Aspirin chúng ta sẽ nghĩ ngay đến thuốc chống viêm, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm Theo như một vài nghiên cứu gần đây chúng ta sẽ bất ngờ khi biết rằng thuốc Aspirin có thể là “thần dược” giúp cho cây cối xanh tốt, aspirin có khả năng chống nấm, chống hạn cho cây và có thể giúp cây tăng trưởng nhanh hơn

Hình c

Hình 2.10 a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin

(Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Aspirin) Mặc dù aspirin là một điều kỳ diệu khá mới của y học, bản thân aspirin được chiết xuất từ cây liễu và đã được sử dụng như một loại thuốc giảm đau trong ít nhất 6000 năm qua Theo như How Stuff Works giải thích, không phải cho đến khi các nhà khoa học làm việc với chiết xuất và thanh lọc các thành phần hoạt chất có trong cây liễu, salicin,

thì aspirin mới bắt đầu trở thành thứ mà chúng ta biết ngày hôm nay Trong đường tiêu hóa của chúng ta, salicin được phân giải thành salicylic acid, một chất giúp giảm đau và viêm nhiễm Các nhà khoa học Đức đã có thể tổng hợp chất này trên quy mô lớn, nhưng đáng tiếc là lại gặp khó khăn trên niêm mạc dạ dày Aspirin được tạo ra như là một phiên bản của salicylic acid tổng hợp với độ acid thấp hơn (Nhật ký Công nghệ sinh học)

Hình 2.11 Dẫn xuất Aspirin từ Salicylic acid

2.2.2.2 Một số nghiên cứu sử dụng Aspirin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tại trường Đại học Rhode Island, những người làm vườn đã thử nghiệm nghiền 4 viên aspirin hòa trong 15 lít nước rồi phun vào một phần của vườn rau 3 tuần/1 lần trong suốt mùa vụ Kết quả thật tuyệt, cuối mùa vụ họ thấy rằng cây trồng tăng trưởng tốt hơn

và cho năng suất cao hơn so với nhóm cây không được phun aspirin (Như Quỳnh, 2017 – vtc.vn)

Các nhà nghiên cứu từ Kings Park, Western Australia đã phát hiện ra rằng thành phần chính của thuốc aspirin là salicylic acid có vai trò quan trọng trong quá trình thoát hơi nước ở thực vật trong điều kiện khô hạn Salicylic acid có khả năng bảo vệ hệ thống quang hợp, cho phép thực vật tăng trưởng, mặc dù có tình trạng thiếu nước Điều này có thể do vai trò của acid salicylic trong việc hỗ trợ quá trình điều chỉnh các lỗ khí khổng ngăn ngừa sự mất nước quá nhiều Thử nghiệm xử lý với aspirin ở thực vật cho thấy với điều kiện tưới một lít nước trong một tháng, 40% số cây sống sót so với 3% ở những cây không được xử lý Kết quả của nghiên cứu này rất quan trọng trong các dự án phục hồi thực vật tại Nature Park Thumama, Riyadh

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu từ thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Ngô Xuân Bình, 2010)

− Thao tác hoàn toàn trong điều kiện vô trùng, cây con sẽ tránh được các tác nhân bất lợi từ môi trường bên ngoài

− Sử dụng vật liệu ban đầu sạch virus có thể tạo ra được rất nhiều cây sạch virus

− Cây nếu như không cần sử dụng ngay có thể bảo quản với số lượng lớn trong một thời gian dài

− Các tế bào thực vật có thể được cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lí Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

− Có thể kiểm soát được chất lượng và hiệu suất của sản phầm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật như là chất lượng nguyên liệu thô và đồng nhất giữa các lô sản xuất

− Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào

có chất lượng cao hơn so với trong cây hoàn chỉnh (trích Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật)

2.3.1.2 Hạn chế

− Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng

có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh

tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

− Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo

Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

− Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình, cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền (trích giáo trình nuôi cấy mô

tế bào thực vật)

2.3.2 Ứng dụng nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô ra đời và có nhiều ứng dụng khác nhau như vi nhân giống, tạo cây đơn bội, chọn dòng tế bào thực vật (chọn dòng chịu bệnh, chọn dòng chịu stress, nuôi cấy protoplast khắc phục hiện tượng lai xa, chuyển gen thực vật,… đặc biệt ứng dụng nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn cũng như chọn dòng có năng suất về hợp chất thứ cấp đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối thực vật (sinh khối là dạng vật liệu sinh học từ sự sống, hay gần đây là sinh vật sống, đa số là các cây trồng hay vật liệu

có nguồn gốc từ thực vật) (https://vi.wikipedia.org) Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế

bào thực vật chỉ sau 1 thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng sinh khối lớn có hoạt chất

cao, thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có thể tạo ra sinh khối có hoạt chất cao, nghĩa là thực

vật nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid,

các steroid dùng trong y học,…)

2.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của thực vật in vitro

2.3.3.1 Nuôi cấy trên môi trường rắn

Độ cứng của môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro Có

một số chất có tác dụng làm đông đặc môi trường như agar, agarose, gellan gum Trong

đó agar được sử dụng khá rộng rãi Agar là một loại polysacharide được thu nhận từ rong

biển và được biết đến như là một chất làm đông đặc môi trường trong nuôi cấy mô in

vitro Agar hòa tan trong nước ở nhiệt độ từ 60 – 100oC và đông đặc ở khoảng nhiệt độ

45oC Agar không phản ứng với các thành phần môi trường cũng như không bị triệt tiêu bởi các hoocmon thực vật và được sử dụng trong khoảng 0,8 – 1% Ưu điểm của agar khi bổ sung vào môi trường là hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể trong quá trình nuôi cấy

Tuy nhiên, môi trường chứa agar cũng có một số mặt bất lợi như môi trường bán rắn sẽ hạn chế sự di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút Ngoài ra, các độc tố do mô thực vật tiết ra (thường gặp là hiện tượng cây tiết ra phenol) sẽ tập trung quanh nó gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chính mẫu cấy Môi trường bán rắn chỉ được sử dụng một lần, vì không thể thay đổi thành phần của môi trường để phù hợp với từng thời kỳ phát triển của thực vật vì vậy phải cấy chuyền liên tục

2.3.3.2 Nuôi cấy lỏng

Hệ thống nuôi cấy lỏng ra đời đã đem lại nhiều triển vọng cho nuôi cấy mô Trong nuôi cấy lỏng có ba loại: hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh, hệ thống nuôi cấy lỏng lắc và hệ thông nuôi cấy bioreactor

Nuôi cấy lỏng tĩnh: các tế bào được ngập chìm và để tĩnh trong môi trường nuôi

cấy, sau thời gian nuôi cấy nhất định thì các tế bào được chuyển qua môi trường khác để

có thể đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Ưu điểm của phương pháp này là việc chuẩn bị và sử dụng môi trường khá dễ dàng (Shakti và cộng sự, 2007) Nuôi cấy trong môi trường lỏng cho phép kiểm soát một cách chủ động các thông số lý hóa,

là tiền đề cho xây dựng hệ thống tự động, triển khai trong quy mô công nghiệp Chi phí sản xuất thấp hơn so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động Do không cần sử dụng chất làm đặc môi trường như agar vì thế sẽ giảm thiểu được nguồn chi phí cũng như nguồn nhân lực trong quá trình sản xuất Do là môi trường lỏng nên các chất dinh dưỡng sẽ phân bố đều môi trường giúp cây tiếp xúc hoàn toàn với nguồn dinh dưỡng vì thế giảm thời gian nuôi cấy đi đáng kể Tuy nhiên, trong môi trường lỏng tĩnh sự trao đổi không khí rất hạn chế, điều này sẽ làm cho mẫu cấy chậm phát triển, đôi khi chết (đối với mẫu mô sẹo, protocorm,…) Mẫu cấy trong môi trường lỏng một thời gian sẽ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể (Shakti và cộng sự, 2007)

Hình 2.12 Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor a: mẫu

cấy ban đầu b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận

Nuôi cấy lỏng lắc: các tế bào được ngập chìm trong môi trường và sự thông khí

nhờ máy lắc với tốc độ 100 – 150 vòng/phút Nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc có những ưu điểm sau:các chất dinh dưỡng được khuếch tán trong môi trường với độ đồng đều cao tạo điều kiện cho mẫu hấp thu triệt để Hơn nữa, toàn bộ bề mặt cây tiếp xúc với môi trường sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng tốt hơn, giảm thời gian nuôi cấy Do trong môi trường được lắc liên tục nên không có sự hạn chế về trao đổi khí nên cây phát triển tốt hơn môi trường lỏng tĩnh.Nuôi cấy lỏng lắc dễ dàng cho nhân giống với số lượng lớn cũng như tạo ra nhiều sinh khối Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn Ngoài ra, nuôi cấy lỏng lắc còn khắc phụ được hiện tượng thủy tinh thể trên môi trường lỏng tĩnh Hạn chế của phương pháp này

là trong quá trình lắc liên tục trong một thời gian có thể tạo ra các bọt khí nhỏ gây giảm nồng độ oxy hòa tan trong môi trường, ngoài ra nuôi cấy lỏng (hoặc lỏng lắc) trong khoảng thời gian sẽ khiến môi trường bay hơi (Shakti và cộng sự, 2007) Vì thế, cần bổ sung hoặc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường khác để đảm bảo sự phát triển của mẫu cấy

2.3.4 Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro

Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của thực vật trong nuôi cấy mô

là không thể phủ nhận Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định đến sự thành công hay thất bại của mẫu cấy, nó quyết định đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau và sự ảnh hưởng đến từng đối tượng ở những giai đoạn khác nhau cũng khác nhau Tuy có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau nhưng thành phần của một môi trường nuôi cấy chủ yếu gồm những nhóm sau: các chất khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra

trong môi trường còn có các chất làm đông đặc môi trường như agar hay các chất bổ sung từ nguồn hữu cơ khác Mỗi nhóm khác nhau thì đóng vai trò khác nhau trong môi trường nuôi cấy:

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô hay tế bào thực vật nuôi cấy cũng

không khác biệt nhiều so với việc trồng trong tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp cho cây trồng in vitro bao gồm nitơ, phospho, kali, canxi, Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy như nitơ tạo các liên kết hữu cơ, sinh tổng hợp các amino acid và protein, và làm chất mang một

số cation như đồng, mangan vận chuyển qua hệ thống màng Phospho là một trong những thành phần quan trọng trong môi trường cấy, phospho tham gia vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucletic, tham gia cấu trúc của màng tế bào

Khoáng vi lượng: trước đây, các nguyên tố vi lượng không được nghiên cứu và

đưa vào môi trường Đến những năm gần đây thì các nguyên tố khoáng vi lượng mới được nghiên cứu và đưa vào môi trường Một số nguyên tố vi lượng như Fe, Cu Bo, Zn,

Mn, Clo,… Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng

để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Các nguyên tố này tuy chứa một lượng nhỏ nhưng không thể phủ nhận vai trò quan trọng của các nguyên tố này đối với các hoạt động với enzyme Sắt tham gia vận chuyển các chất qua màng, ngoài ra sắt đóng vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp chlorophyll,…

Vitamin: thông thường cây có khả năng tự tổng hợp những vitamin cơ bản cho quá

trình phát triển của chúng, tuy nhiên để đảm bảo quá trình phát triển của mẫu cây thì chúng ta cần cung cấp một vài loại vitamin khác (một số loại vitamin thường sử dụng như B1, B2,

B6,…) Vitamin rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa bên trong thực vật Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tùy theo từng giai đoạn nuôi cấy Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những

vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1 – 1 mg/L (Trần Văn Minh, 1994)

Các chất điều hòa sinh trưởng: là nhóm chất được bổ sung vào môi trường nuôi

cấy có tác dụng kích thích sự phát triển của mẫu cấy Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng khác nhau là auxin, cytokinin, gibberellin, abscisis acid và ethylen Mỗi nhóm đều có sự ảnh hưởng riêng đến mẫu cấy.Tùy vào mục đích nghiên cứu mà chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung được bổ sung ở những nồng độ khác nhau

Đường: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp

nen các chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất carbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô Đường là nguồn cung cấp carbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết môi trường trong nuôi cấy mô, kể

cả khi nuôi cấy chồi non hoặc tế bào Khi hấp khử trùng, đường bị phân hủy một phần, thuận lợi cho cây hấp thụ Có nhiều loại đường khác nhau được sử dụng trong nuôi cấy

mô và sự ảnh hưởng của nó cũng khác nhau đến mẫu cấy Tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu có thể lựa chọn loại đường và nồng độ bổ sung vào môi trường nuôi cấy Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)

Nước dừa: Thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, dường, ARN, AND Đặc

biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là: myo

– inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosid của cytokinin Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy Nước dừa thường được sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ 07/05/2018 – 29/07/2018 tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới

3.2 Vật liệu

3.2.1 Nguồn mẫu lan thạch hộc thiết bì

Mẫu nuôi cấy ban đầu sử dụng là cây lan thạch hộc (Dendrobium officinale Kimura

et Migo) in vitro có tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới

Hình 3.1 Mẫu nuôi cấy ban đầu

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Bảng 3.1: Bảng thiết bị

Tủ cấy vô trùng Máy đo hàm lượng chlorophyll