Nghiên cứu thành phần và thử hoạt tính sinh học các hợp chất Cassaine Diterpene Alkaloids từ lá cây Lim xanh Erythrophleum fordii, Việt Nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM DƯƠNG THANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT CASSAINE DITERPENE ALKALOIDS TỪ LÁ CÂY LIM XANH ERYTHROPHLEUM FORDII, VIỆT NAM C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

DƯƠNG THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT CASSAINE DITERPENE ALKALOIDS TỪ LÁ CÂY LIM

XANH ERYTHROPHLEUM FORDII, VIỆT NAM

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2017

Công trình được hoàn thành tại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN MINH HIỀN

Phản biện 1: PGS.TS Trần Thị Xô Phản biện 2: TS Trần Mạnh Lục

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày

09 tháng 09 năm 2017

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng

 Thư viện trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề

Lim xanh có tên khoa học là Erythrophleum fordii, phân bổ

chủ yếu ở Việt Nam, Trung Quốc và Đài Loan Trong các bài thuốc dân gian cổ truyền Trung Quốc, lim xanh được sử dụng như một bài thuốc giúp tăng tuần hoàn máu Lim xanh là cây gỗ lớn, cao 37-45m, đường kính có khi tới 2-2,5m, thường xanh Gốc có bạnh vè, thân tròn, phân cành nhánh lớn, tán lá hình ô, dày, rộng Vỏ màu nâu, bong vảy lớn, khi non có nhiều bì khổng Lá kép lông chim 2 lần với 3-5 đôi cuống thứ cấp và mỗi cuống mang 9-15 lá chét hình trái xoan, đầu nhọn, gốc tròn

Là cây đặc hữu của Việt Nam, phân bố ở đai thấp vùng có lượng mưa 1500-3000 mm/năm, từ Quảng Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hoà Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Bình, Huế, Quảng Nam tới Bình Thuận Là cây ưa sáng, lúc non chịu bóng, lớn lên tính ưa sáng càng rõ và thường chiếm tầng trên của rừng Lim xanh ưa đất feralit đỏ vàng, tốt, tầng dày, ẩm mát, còn tính chất đất rừng, tái sinh dưới các dạng rừng có độ tàn che 0,3-0,7, tái sinh chồi mạnh hơn hạt Sống hỗn giao với Sồi, Giẻ, Trám trắng, au sau, ăng lẻ, Gội, Trâm,…

Lim xanh được coi là một cây giàu tannin, vỏ cây chứa khoảng 15,21% tannin Gỗ lim có dác lõi phân biệt, dác màu xám nhạt hay vàng nâu; lõi khi mới chặt màu xanh vàng sau chuyển màu nâu sẫm, rất cứng, thuộc loại tứ thiết; một trong những loại gỗ tốt nhất của Việt Nam

Rễ cây có nốt sần cố định đạm làm tăng độ phì của đất Khi cây bị chết, rễ mục là giá thể tốt nhất cho loài nấm, một loài nấm làm thuốc bổ rất quí phát triển Nấm Lim xanh thường dùng để trị: ung

thư gan, xơ gan, viêm gan B, viêm gan C, ung thư đại tràng, đau dạ dày, thấp khớp, nóng gan,mụn, suy nhược thần kinh….Ngoài ra nấm lim xanh còn làm tăng sự miễn dịch của cơ thể, làm mạnh gan, cô lập

và diệt các tế bào ung thư

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu các hoạt chất có hoạt tinh sinh học trong cây lim xanh thu hút sự quan tâm của nhiều

nhà khoa học trên thế giới Trong lim xanh Erythrophleum fordii có

nhiều cassaine diterpenoid amine, amide và triterpene Đặc biệt, các cassaine alkaloid trong cây lim xanh cho thấy hoạt tính tương tự như cây mao địa hoàng (dùng làm thuốc chữa suy tim) Ngoài ra, còn cho thấy khả năng gây độc tế bào với một số dòng ung thư

Vì vậy việc nghiên cứu, phân lập các hoạt chất cassaine alkaloid từ

Erythrophleum fordii, là điều cấp thiết, từ đó có thể thực hiện các tính toán in-silico, chuyển hoá các nhóm chức để tăng hoạt tính của

các cassaine alkaloid Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên chúng tôi

quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần và thử hoạt tính sinh học các hợp chất Cassaine Diterpene Alkaloids từ lá cây lim xanh Erythrophleum fordii, Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng quy trình chiết tách các hợp chất hóa học trong lá cây lim xanh

- Phân tích định tính và định lượng các hợp chất cassaine

diterpene alkaloid có trong lá cây lim xanh Erythrophleum fordii

- Phân lập các hợp chất hóa học, xác định thành phần hóa học, cấu trúc của một số hợp chất hóa học có trong lá cây lim xanh

- Bước đầu khảo sát hoạt tính sinh học các phân đoạn chiết, các cassaine alkaloid phân lập được

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng

Cây lim xanh tại tỉnh Quảng Nam

3.2 Nguyên liệu

Cây lim xanh tại Quảng Nam

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

- Nghiên cứu về cây lim xanh : đặc điểm, phân bố, công dụng

- Nghiên cứu về diterpene alkaloid

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ cây lim xanh

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất Cassaine diterpene alkaloid

4.1 Nghiên cứu thực nghiệm

- Khảo sát chiết lá của cây lim xanh

- Phân tích định tính các cassaine diterpene alkaloid có trong dịch chiết

- Phân tích định lượng các cassaine diterpene alkaloid bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (LC- MS), (LC,MS/MS)

- Phân lập một số cấu tử, xác định cấu trúc Thử hoạt tính sinh học

4.Dự kiến tiến độ nghiên cứu

Tháng 12/2016: Xây dựng đề cương nghiên cứu;

- Tháng 01/2017:

+ Chuẩn bị phần tổng quan tài liệu nghiên cứu;

+ Chuẩn bị phòng thí nghiệm, dụng cụ, hóa chất, nguyên liêu và các trang thiết bị cần thiết để thực hiện thí nghiệm;

+ Xây dựng mô hình thí nghiệm;

-Tháng 02– 06/2017: Tiến hành thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu đã xây dựng; thảo luận, xin ý kiến chỉ đạo của giáo viên hướng dẫn;

- Tháng 07/2017: Xử lý số liệu và hoàn chỉnh luận

văn;

- Tháng 08/2017 : bảo vệ luận văn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LIM XANH

1.1.1 Đặc điểm sinh thái

1.1.2 Đặc điểm phân bố

1.1.3 Công dụng của Lim xanh

1.2 LỚP CHẤT DITERPENE

1.2.1 Giới thiệu chung

1.2.2 Phân loại diterpene và công dụng của một số diterpene điển hình

1.3 CASSAINE DITERPENE ALKALOIDS

1.3.1 Cassaine

1.3.2 Cassaine diterpene alkaloids

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.4.1 Phương pháp chiết

1.4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký cột

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ MS)

(LC-CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.3 LỰA CHỌN PHÂN ĐOẠN CHIẾT TỐI ƯU

2.3.1 Phương pháp chiết

2.3.2 Khảo sát dung môi chiết với dung môi Methanol 2.3.3 Khảo sát dung môi chiết với dung môi Ethanol/nước 2.4 ĐỊNH TÍNH BẰNG CÁC THUỐC THỬ MÀU TƯƠNG ỨNG

2.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC BƯỚC ĐẦU TRONG CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT TƯƠNG ỨNG

2.7.1 Phương pháp ESI-MS và phương pháp LC-MS 2.7.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng

2.7.3 Phương pháp tách và tinh chế chất

2.7.4 Chạy cột sắc ký phân đoạn F1

2.7.4 Chạy cột sắc ký phân đoạn F11

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐỊNH TÍNH BẰNG THUỐC THỬ MÀU

Bột lá Lim xanh sau khi được chiết qua các dung môi Bột lá Lim xanh sau khi được chiết qua các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate thử qua các loại thuốc thử : Mayer, Wanger, Dragendroff

Qua ba thuốc thử dùng để định tính alkaloids, các kết quả

được tổng hợp trong bảng 3.1 dưới đây

Nhận xét : Dựa vào bảng 3.1, cả bốn dịch chiết với bốn dung môi

khác nhau về độ phân cực trong đó butanol là dạng dung môi protic polar (có khả năng hòa tan các anion thông qua các liên kết Hydro nhờ vào việc sở hữu Hydro linh động) đều cho thầy sự xuất hiện của Alkaloid Tuy nhiên dựa vào độ lập lại, cường độ và lượng kết tủa thu được, bước đầu có thể kết luận, chiết với chloroform cho lượng alkaloid nhiều nhất

3.2 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT

3.2.1 Ảnh hưởng của dịch chiết đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn kiểm định

Bảng 3.2 Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến sự sinh trưởng

của các chủng vi khuẩn kiểm định

Dung môi

Các chủng vi khuẩn E.coli B.cereus

hexane 0,5 ±0,5mm 3±0,5mm

Chloroform 1 ± 0,5 mm 2 ± 0,5 mm

Ethyl acetate 6 ± 0,5 mm 5 ± 0,5 mm

Nhận xét : Qua kết quả, có thể nhận thấy các mẫu dịch chiết

đã thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật từ thấp đến cao Sự khác biệt

về hoạt tính sinh học ức chế đối với các loài vi sinh vật của dịch chiết có thể do ảnh hưởng nhiều yếu tố

Từ kết quả trên, mẫu dịch chiết cho hoạt tính kháng sinh cao nhất là dịch chiết butanol

3.2.2 Thử hoạt tính kháng sinh của dịch chiết trên các chủng vi khuẩn kiểm định

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của dịch chiết trên

các chủng vi khuẩn kiểm định

Vi sinh vật thử hoạt tính E.Coli Pseudomoas Klebsilla

hexane 1± 0,5 mm 2 ± 0,5 mm 5 ± 0,5 mm chloroform 2± 0,5 mm 3 ± 0,5 mm 2 ± 0,5 mm

butanol 19 ± 0,5

ethyl acetate 15 ± 0,5

mm 20 ± 0,5 mm 19± 0,5 mm

Nhận xét: Qua kết quả trên, có thể nhận thấy cả bốn dịch chiết

đều gây ức chế đối với các vi khuẩn kiểm định với độ lập lại tương đương các thí nghiệm mục 3.2.1 Ngoài ra, các dung môi không cho thầy sự ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khảo sát, ngoại trừ dung môi butanol Thử hoạt tính sinh học với vi khuẩn Pseudomonas thì dịch chiết với dung môi ethyl acetate cho thấy hoạt tính gây ức chế đối với sự sinh trưởng Pseudomonas là mạnh nhất

3.3 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG DỊCH CHIẾT

Bảng 3.4 Khối lượng cao sau khi chiết từng phân đoạn với các dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate

Dung môi chiết

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.4, mô tả khối lượng cao chiết với từng

dung môi : hexane, chloroform, butanol, ethyl acetate Qua bảng 3.4, khối lượng cao thu được nhiều nhất sau khi chiết ứng với dung môi chlororform, cũng như không có chênh lệch đáng kể khi dung môi chiết ban đầu là methnol hay hỗn hợp ethanol/nước (95:5,v/v) Điều này cho thấy có thể tùy theo mục đích nghiên cứu và ứng dụng về sau mà chọn methanol hoặc hỗn hợp ethanol/nước (95:5,v/v) sao cho phù hợp

a) Các hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong dịch

chiết với Methanol

Bảng 3.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết hexane STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

1 357 Prolithospermic acid

C18H13O8

Từ bảng 3.5, hợp chất được định danh là Prolithospermic acid,

là một dihydroxybenzoic acid, một loại phenolic acid

Bảng 3.6 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với chloroform STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

Từ bảng 3.6, hợp chất được định danh là Rosmarinic acid, Ethyl lithospermate, Dimethyl lithospermate, Rosmarinic acid là một hợp chất hóa học được tìm thấy trong nhiều loại thực vật, có tính oxy hóa mạnh

Bảng 3.7 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với butanol

STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

1 153 Protocatechuic acid

[C7H5O4]

Từ bảng 3.7, hợp chất được định danh là Protocatechuic acid, Protocatechuic acid là một axit dihydroxybenoic, một loại axit phenolic Nó là một chất chuyển hóa chính của các polyphenol chống oxy hóa có trong trà xanh Nó có ảnh hưởng hỗn hợp lên tế bào bình thường và ung thư trong các nghiên cứu in vitro và in vivo

Bảng 3.8 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với ethyl acetate STT m/z Tên cấu tử

CTPT

Công thức cấu tạo

1 717 Salvianolic

acid B [C36H29O16]

2 717 Salvianolic

acid E [C36H29O16]

Từ bảng 3.8, hợp chất được định danh là Salvianolic acid B và Salvianolic E Hai hợp chất này là các chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào và chất thải gốc tự do đang điều tra cho một loạt các điều kiện từ rối loạn nhịp tim thiếu máu đến bệnh Alzheimer

b) Một số hợp chất trong dịch chiết với ethanol/nước

Bảng 3.9 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết hexane STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

1 153 Protocatechuic

acid [C7H5O4]

2 551 Monomethyl

lithospermate [C28H23O12]

Từ bảng 3.9, hợp chất được định danh là Protocatechuic và Monomethylllithospermate Protocachuic acid là một axit dihydroxybenzoic, một loại axit phenolic Nó là một chất chuyển hóa chính của các polyphenol chống oxy hóa có trong trà xanh Nó có ảnh hưởng hỗn hợp lên tế bào bình thường và ung thư trong nghiên cứu in vitro và in vivo

Bảng 3.10 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với chloroform STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

1 313 Salvianolic acid F

[C17H13O6]

Từ bảng 3.10, hợp chất được định danh là Salvianolic acid F Hợp chất Salvianolic acid F có hoạt tính chống oxy hóa

Bảng 3.11 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với butanol STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

1 313 Salvianolic acid F

[C17H13O6]

2 551 Monomethyl lithospermate

[C28H23O12]

Bảng 3.12 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý trong

dịch chiết với ethyl acetate STT m/z Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo

Từ bảng 3.12, một số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú

ý được định danh là Tanshinone, Salvianolic acid F, Protocatechic acid, Lithospermic acid

Nhận xét : Các kết quả ESI-MS cho thấy, so với các dịch chiết trong

dung môi hexane và chloroform, các dịch chiết trong dung môi butanol và ethyl acetate cho thấy thành phần chứa nhiều các hợp chất phenolic Mặc dù các mẫu chiết đều cho thấy các peak m/z ứng với khối lượng phân tử của các cassaie diterpene alkaloid, tuy nhiên đều lẫn tạp chất rất nhiều Vì vậy, việc phân lập bằng các phương pháp sắc kí khác sau khi được các phân đoạn chiết để định danh cụ thể các cassaine diterpene alkaloid có trong lá của cây Lim xanh là cần thiết

3.4.THỬ SẮC KÍ BẢN MỎNG KẾT HỢP LC-MS

Hình 2.17 Sắc kí bản mỏng với hệ dung môi methanol : chloroform :

acid acetic (10:70:0,095)

2 g cao chiết chloroform được tách bằng cột silicagel, rửa giải

hệ dung môi M/Cl/AA với tỷ lệ độ phân cực tăng dần từ 10:70:0,095 đến hệ M/Cl với tỷ lệ 10:60; 10:50; 10:40; 10:30; 10:20; 10:10 thu được 12 phân đoạn (từ F1-F12) Hứng các phân đoạn vào các lọ penicillin sạch và khô Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng với chất hiện màu là vanillin trong acid sulfuric Trong đó, một số phân đoạn có vệt tròn rõ, đồng thời cho các phản ứng màu ứng với sự xuất hiện của alkaloid, đó là phân đoạn F1, F11

3.4.1 Kết quả phân lập các hợp chất từ dịch chiết bằng GC-MS

Hình 3.19 Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F1

Hình 3.20 Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F11

Hình 3.21 Phổ GC-MS của các hợp chất phân đoạn F12

Nhận xét: Dựa vào phổ GC-MS, cho thấy các peak khối lượng MS

đều nhỏ hơn 200, không cho thấy các peak tương ứng với m/z của cassaine diterpene alkaloid (Mr > 400) Vì vậy, các mẫu được gửi đo

LC-MS Phòng thí nghiệm Sinh hoá hữu cơ (Prof Kajihara’s Laboratory), Khoa Hoá, Đại học Osaka, Osaka, Nhật Bản và kết quả

đo LC-MS được biện luận cụ thể trong phần tiếp theo

3.4.2 Kết quả phân lập các hợp chất từ dịch chiết bằng GC-MS

Hình 3.22 Phổ LC-MS các hợp chất có trong phân đoạn F1

Dựa vào phổ LC-MS, cho thầy có 05 đỉnh phân tử ở m/z 422.2 [M+H]+; 452.2[M+H]+;480.1[M+H]+;494.2[M+H]+ và 534.2[M+H]+ Dựa vào kết quả phổ LC-MS và so sánh các hợp chất đã được công

bố [13] từ cây Lim xanh, một số hợp chất cassaine diterpene alkaloid

có mặt trong phân đoạn F1 bao gồm :

m/z 422.2 [M+H]+ là 6a-Hydroxydinorcassamide (B), ứng với công

thức phân tử là C23H35NO6

(B)

m/z 452.2 [M+H]+là 3b-Hydroxynorerythrosuamide (A), ứng với

công thức phân tử là C24H37NO7