Nghiên cứu phản ứng oxi hóa glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4NP–SiO2–Glucose oxidase

Gần đây, việc nghiên cứu ứng dụng nano từ Magnetic nano particles – MNPs đã thu hút nhiều sự chú ý của các nhà khoa học nhờ vào tính năng nổi bậc như độ tương thích sinh học, tính siêu t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀ NẴNG

HOÀNG NGỌC ÁNH NHÂN

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG OXI HOÁ GLUCOSE BẰNG HỆ XÚC TÁC

Fe3O4NP-SiO2-GLUCOSE OXIDASE

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÓA HỌC

Đà Nẵng, Năm 2017

Công trình được hoàn thành tại

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN MẠNH LỤC

Phản biện 1: PGS.TS Lê Thị Liên Thanh Phản biện 2: GS.TS Đào Hùng Cường

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng

vào ngày 9 tháng 9 năm 2017

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng

 Thư viện trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vật liệu nano đang đi sâu vào đời sống hiện đại và dần thể hiện các vai trò quan trọng với đời sống Gần đây, việc nghiên cứu ứng dụng nano từ (Magnetic nano particles – MNPs) đã thu hút nhiều

sự chú ý của các nhà khoa học nhờ vào tính năng nổi bậc như độ tương thích sinh học, tính siêu thuận từ, diện tích bề mặt riêng lớn Cho đến nay, nano oxit sắt từ (Fe3O4NP) được các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung khai thác, đặc biệt là ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, phân tách các phân tử sinh học, cảm biến và xúc tác sinh học, do vật liệu này thể hiện tính chất từ đặc trưng mà các vật liệu nano khác không có

Trong số các chất mang vô cơ và hữu cơ hiện đang được sử dụng rộng rãi để cố định enzyme, vật liệu nano từ tính trên cơ sở

Fe3O4NP biến tính thể hiện những ưu điểm nổi bật hơn cả, đáp ứng các yêu cầu khắt khe của xúc tác sinh học như: độ tương thích sinh học cao nên hạn chế tối đa việc giảm hoặc mất hoạt tính của các enzyme sau khi cố định; diện tích bề mặt riêng lớn nên tăng cường khả năng chất chứa enzyme và cải thiện khả năng tương tác giữa enzyme và cơ chất; độ bền cao của các hạt nano từ được duy trì khi

có phương pháp biến tính phù hợp; tính chất siêu từ cho phép tách loại hoàn toàn enzyme ra khỏi sản phẩm phản ứng và tái sử dụng chúng Chính vì những ưu điểm nổi bật này mà trong thời gian gần đây, hướng nghiên cứu sử dụng Fe3O4NP làm chất mang enzyme thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề có liên quan với mục tiêu là duy trì tối đa hoạt tính enzyme sau cố định trên nano từ tính để có thể tái sử dụng nhiều lần

Trong công trình này, chúng tôi nghiên cứu phản ứng oxi hoá glucose xúc tác bởi enzyme nano từ tính Fe3O4NP – SiO2 – Glucose oxidase (Fe3O4NP – SiO2 – GOD), trên cơ sở đó đề xuất phương pháp cố định enzyme hiệu quả để làm xúc tác sinh học ứng dụng trong chuyển hoá các hợp chất hữu cơ nói chung và y sinh nói riêng

Với những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu

phản ứng oxi hóa glucose bằng hệ xúc tác Fe3O4NP – SiO2 – Glucose oxidase”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính của hệ xúc tác Fe3O4NP – SiO2 – GOD trong phản ứng chuyển hoá glucose, từ đó đề xuất phương pháp cố định enzyme lên vật liệu từ tính Fe3O4NP

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Phản ứng chuyển hoá glucose oxidase bằng hệ xúc tác

4 Phương pháp nghiên cứu

+ Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu có liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu của đề tài: tổng hợp hạt Fe3O4NP; tính chất từ tính của vật liệu Fe3O4NP; biến tính bề mặt Fe3O4NP bằng oxit kim loại SiO2; các kĩ thuật cố định enzyme lên chất mang

+ Phương pháp hoá học

Phương pháp đồng kết tủa để điều chế Fe3O4NP từ hỗn hợp muối Fe2+ và Fe3+

+ Phương pháp phân tích vật lý

Phân tích các đặc trưng của vật liệu Fe3O4NP, Fe3O4 – SiO2 –

NH2, Fe3O4 – SiO2 – GOD: Chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua – quét (TEM – SEM); Nhiễu xạ tia X (XRD); Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX); Đo đường cong từ trễ; Phân tích nhiệt DTA/TG; Phổ hồng ngoại IR

5 Bố cục luận văn

Ngoài phần mở đầu (03 trang), kết luận và kiến nghị (01 trang), và 50 tài liệu tham khảo (trang 71 75), luận văn gồm có 3 phần:

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ NANO OXIT SẮT TỪ (Fe 3 O 4 NP)

1.1.1 Giới thiệu về vật liệu từ tính

1.1.2 Đặc tính đặc biệt của các hat nano từ tính

1.1.3 Các phương pháp tổng hợp các hạt nano oxit sắt từ 1.1.4 Vật liệu nano từ tính ứng dụng làm chất mang xúc tác

1.1.5 Ứng dụng sinh học của vật liệu nano từ tính

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME GLUCOSE OXIDASE

1.2.1 Giới thiệu về enzyme glucose oxidase

1.2.2 Ứng dụng của enzyme glucose oxidase

1.3 CỐ ĐỊNH ENZYME LÊN CÁC HẠT NANO OXIT SẮT TỪ

1.3.1 Định nghĩa enzyme cố định

1.3.2 Ưu nhược điểm của enzyme cố định

1.3.3 Tính chất của chế phẩm enzyme cố định

1.3.4 Phương pháp cố định enzyme

1.3.5 Cố định enzyme trên vật liệu nano

1.3.6 Cố định enzyme lên các hạt nano oxit sắt từ

1.3.7 Tình hình nghiên cứu việc cố định enzyme trên

Fe 3 O 4 NP

1.4 CÔNG NGHỆ SINH HỌC NANO

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

Hình 2.2 Sơ đồ điều chế Fe 3 O 4 – SiO 2

2.3.3 Chức năng hóa bề mặt Fe 3 O 4 – SiO 2 bằng APTES

Hình 2.3 Sơ đồ điều chế Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2

2.3.4 Cố định enzyme glucose oxidase lên Fe 3 O 4 – SiO 2 –

NH 2

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp Fe 3 O 4 – SiO 2 – GOD

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VẬT LIỆU

2.4.1 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)

2.4.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại (FT-IR) 2.4.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét – truyền qua

2.4.4 Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX) 2.4.5 Phương pháp từ kế mẫu rung (VSM)

2.4.6 Phương pháp phân tích nhiệt (DTA/TG)

2.5 NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG OXY HÓA GLUCOSE BẰNG

3.1.1 Tổng hợp nano oxit sắt từ (Fe 3 O 4 NP)

Hòa tan 5,56 g FeSO4.7H2O và 8 g Fe2(SO4)3 trong 100 ml nước cất bằng khuấy cơ trong 30 phút trong môi trường Ar Thêm 50

ml dung dịch NH3 (25-28%) vào hỗn hợp dung dịch trên đến khi pH=9 Sau khi khuấy trong 60 phút, tăng nhiệt độ phản ứng lên 800C

và khuấy thêm 2 giờ trong môi trường Ar Sau đó, để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm và rửa nhiều lần bằng nước cất và ethanol đến khi đạt môi trường pH=7 Mẫu được sấy ở 600C trong 3 giờ thu được các hạt

nano oxit sắt từ

3.1.2 Tổng hợp các hạt nanoshell Fe 3 O 4 – SiO 2

Cho 300 mg Fe3O4 vào 80 ml ethanol và 20 ml nước cất, hỗn hợp được rung siêu âm trong 30 phút để các hạt phân tán đều Thêm từng giọt 3 ml NH4OH tiếp đến là 0,8 ml TEOs vào hỗn hợp trên và khuấy cơ trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng trong môi trường Ar Hỗn hợp sau phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa được tách bằng nam châm sau đó rửa nhiều lần với nước cất và ethanol đến khi đạt môi trường pH=7

3.1.3 Tổng hợp Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2

Phân tán 300 mg Fe3O4 – SiO2 trong 40 ml ethanol bằng rung siêu âm trong 30 phút Thêm nhanh 1 ml (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) vào hỗn hợp trên và khuấy cơ trong 6 giờ ở nhiệt độ 400C trong môi trường khí Ar Sau đó, hỗn hợp dung dịch được làm nguội đến nhiệt độ phòng Các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2

được tách bằng nam châm và rửa 5 lần bằng ethanol

3.1.4 Cố định enzyme glucose oxidase lên Fe 3 O 4 – SiO 2 –

NH 2

Phân tán 30 mg Fe3O4 – SiO2 – NH2 trong 6 ml dung dịch đệm phosphate (0,01M; pH=7,4) bằng cách rung siêu âm trong 10 phút; thêm 0,3 ml dung dịch glutaraldehyde (GA) 25% vào hỗn hợp

và khuấy trong 6 giờ, các hạt nano được tách bằng nam châm và rửa với dung dịch đệm sau đó là nhiều lần với nước cất thu được các hạt

Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA

Lấy 7 ml enzyme glucose oxidase (0,5 mg/ml đệm phosphate pH=7,4) cho vào mẫu Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GA đã chuẩn bị ở trên Hỗn hợp các hạt nano-GOD được ủ ở nhiệt độ phòng 5 giờ thỉnh thoảng rung nhẹ Dùng nam châm để tách các hạt nano gắn kết GOD (nano/GOD) ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng Các hạt nano Fe3O4 –

SiO2 – GOD được rửa 3 lần với nước cất sau đó bảo quản ở 40C để làm các phân tích tiếp theo

Dung dịch GOD sau khi gắn kết với các hạt nano được dùng

để định lượng GOD còn thừa

3.1.5 Kết quả định lượng hàm lượng enzyme glucose oxidase không gắn kết bằng phương pháp Bradford

Bằng phương pháp Bradford có thể xác định được nồng độ dung dịch GOD sau gắn kết Từ các mẫu chuẩn suy được phương trình:

y = 0,0053x – 0,0033; R2 = 0,9959 (1)

Dựa vào phương trình (1) và giá trị đo mật độ quang của mẫu dung dịch GOD sau gắn kết là 0,2458 thay vào (1) tính được nồng độ enzyme không gắn kết là 0,047 mg/ml Vậy hiệu suất gắn kết enzyme

là 90,6% và lượng enzyme đã được cố định là 3,171 mg

3.2 ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA VẬT LIỆU

Fe3O4 – SiO2 – NH2 (b), Fe3O4NP – SiO2 – GOD (c) xuất hiện lần lượt tại các góc 2 = 30,20; 35,50; 43,20; 57,10 và 62,70 ứng với các đỉnh nhiễu xạ (220), (311), (400), (511) và (440) Các đỉnh nhiễu xạ cực đại của các mẫu vật liệu ứng với các đỉnh chuẩn cấu trúc của nano oxit sắt từ trong phổ chuẩn Điều này chứng tỏ Fe3O4 có cấu trúc tinh thể lập phương spinel Sau khi biến tính bề mặt hạt nano oxit sắt từ cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng tại các góc 2 nhưng cường độ phản xạ bề mặt bị giảm ở các peak đặc trưng điều này chứng tỏ rằng quá trình biến tính bề mặt hạt nano oxit sắt từ không làm thay đổi pha của hạt Fe3O4 nhưng làm thay đổi bề mặt tinh thể của hạt Fe3O4 Như vậy từ kết quả phổ XRD có thể kết luận được

phần nào sự gắn kết của các chất lên bề mặt Fe3O4

Ảnh TEM cho thấy các hạt nano có hình dạng gần như cầu hoặc elip Kích thước của Fe3O4NP khoảng từ 11 20 nm Kết quả của quá trình biến tính bề mặt các hạt nano oxit sắt từ cho thấy không

có sự thay đổi hình dạng nào đáng kể và Fe3O4 – SiO2 – NH2 là cấu trúc lõi võ có kích thước trung bình khoảng 15 22 nm.Các hạt

Fe3O4 – SiO2 – GOD có dạng hình cầu và kích thước trung bình khoảng từ 17 24 nm Kết quả đo kích thước TEM của Fe3O4,

Fe3O4NP – SiO2 – NH2, Fe3O4 – SiO2 – GOD phù hợp với kích thước

đo được bằng nhiễu xạ tia X

hạt nano Fe3O4, hình thái của vật liệu hầu như không thay đổi so với

chất mang ban đầu

Hình 3.14(A) là phổ của các hạt nano Fe3O4 Đỉnh 590 cm-1,

3485 cm-1, 1629 cm-1 lần lượt là dao động kéo căng Fe – O, dao động kéo căng của O – H và dao động bị biến dạng O – H Sự xuất hiện đỉnh 3485 và 1629 cm-1 là do các hạt nano Fe3O4 được tổng hợp trong môi trường nước nên được phủ một số nhóm -OH

Quang phổ của Fe3O4 – SiO2 – NH2 (hình 3.11(B)) cho thấy đỉnh mạnh tại 1097 cm-1 và 800 cm-1, tương ứng với peak của sự dao động hoá trị bất đối xứng và đối xứng của liên kết Si – O – Si Những dao động biến dạng hấp thụ đỉnh của Si – 0 – Si và Si – OH được quan sát tại peak 468 cm-1 và 947 cm-1 Hai dải sóng ở 3413 cm-1 và

1630 cm-1 có thể là dao động hoá trị của liên kết N – H và dao động biến dạng của liên kết N – H của nhóm -NH2.

Hình 3.14(C) là phổ của Fe3O4 – SiO2 – GOD Đỉnh tại 1654

cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng của liên kết N – H của amin bậc 1 và 1394 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết C – N của amin bậc 2 Vùng phổ xuất hiện trong khoảng 2901 – 2988 cm-1 là do dao động đối xứng và bất đối xứng của các nhóm CH2 và CH3 được tìm thấy trong protein và lipid Tại đỉnh 3421 cm-1 là do dao động kéo căng của O – H và N – H có trong nước và protein

Từ những kết quả này chỉ ra APTES đã phủ được trên bề mặt hạt nano thông qua phản ứng silanization và enzyme GOD đã được gắn kết trên bề mặt các hạt Fe3O4 – SiO2 – NH2

3.2.5 Phổ phân tích thành phần nguyên tố (EDX)

Phổ EDX được ghi trên máy Emax – Horiba tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương Kết quả được trình bày ở hình 3.16, 3.17, 3.18

Hình 3.16 Phổ EDX của hạt nano Fe 3 O 4

Phổ EDX của Fe3O4 (hình 3.16) cho thấy các đỉnh peak ở các khu vực 0,75 keV; 6,5 keV tương ứng với năng lượng liên kết của Fe Đỉnh peak có giá trị 0,5 keV ứng với nguyên tố oxy

Hình 3.17 Phổ EDX của Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2

Khi phủ một lớp silica lên bề mặt các hạt nano oxit sắt từ sau

đó hoạt hoá chức năng bằng APTES, kết quả đo phổ của Fe3O4 – SiO2 – NH2 (hình 3.17) cho thấy cấu trúc của Fe3O4 không bị thay đổi khi bị biến tính bề mặt (vẫn xuất hiện các peak ở 0,5 keV; 0,75 keV; 6,5 keV) Mặt khác trong phổ EDX của Fe3O4 – SiO2 – NH2 có các đỉnh xuất hiện ở vùng 0,25 keV; 0,35 keV và 2,75 keV có là năng lượng liên kết của C, N và Si Điều này chứng tỏ, quá trình bảo phủ

và biến tính bề mặt bằng TEOs và APTES đã được thực hiện

Hình 3.18 Phổ EDX của Fe 3 O 4 – SiO 2 – GOD

Thực hiện cố định enzyme trên chất mang, phổ EDX của

Fe3O4 – SiO2 – GOD (hình 3.18) có các đỉnh peak vẫn xuất hiện ở các khu vực như phổ của Fe3O4 – SiO2 – NH2, nhưng cường độ của đỉnh ở vùng 0,25 keV; 0,35 keV; 0,5 keV ứng với năng lượng liên kết của C, N, O có sự tăng cường độ của peak chứng tỏ rằng các enzyme (thành phần có C, N, O) đã được gắn kết thành công lên

Fe3O4 – SiO2 – NH2

Từ kết quả phân tích thành phần hoá học của các nguyên tố

có trong các mẫu vật liệu có thể phần nào khẳng định rằng đã điều chế được các hạt Fe3O4, Fe3O4 – SiO2 – NH2, Fe3O4 – SiO2 – GOD

3.2.6 Phổ phân tích nhiệt (DTA/TG)

Điều kiện đo DTA/TG: trong dòng khí trơ N2 từ nhiệt độ phòng đến 8000C với tốc độ gia nhiệt 100C/phút

(A)

Hình 3.19 Phổ TGA/TG của Fe 3 O 4 (A), Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2 (B),

Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2 – GOD (C)

Hình 3.19 cho thấy sự mất khối lượng của các hạt nano trong khoảng nhiệt độ từ 60 – 1800 C chủ yếu do mất lượng nước hấp thụ trên vật liệu Sự mất khối lượng do nước của các hạt Fe3O4 khoảng 0,488%, Fe3O4 – SiO2 – NH2 là 3,692% và Fe3O4 – SiO2 – GOD là 5,574%

Sự phân rã của APTES xảy ra trong khoảng nhiệt độ 250 –

5000C, của protein bắt đầu tại nhiệt độ 220 – 5000C mà chủ yếu tại

(B)

(C)

2800C Do vậy, trong khoảng nhiệt độ 250 – 6000C khối lượng của các hạt nano phủ APTES giảm khoảng 4,466% chủ yếu là do lớp phủ APTES Cũng khoảng nhiệt độ này sự mất khối lượng của các hạt nano gắn kết GOD là do mất khối lượng của lớp phủ APTES và GOD khoảng 7,113%

3.2.7 Đường cong từ hóa (VSM)

Để nghiên cứu tính chất từ của các mẫu nano Fe3O4, Fe3O4 – SiO2 – NH2, Fe3O4 – SiO2 – GOD ở nhiệt độ phòng tiến hành đo đường cong từ hóa sử dụng thiết bị từ kế mẫu rung Kết quả đo được thể hiện ở hình 3.20

Hình 3.20 Đường cong từ hóa của Fe 3 O 4 (A), Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2 (B), Fe 3 O 4 – SiO 2 – NH 2 – GOD (C), so sánh 3 mẫu (D)

Kết quả cho thấy ở cả 3 mẫu nano Fe3O4, Fe3O4 – SiO2 –

NH2, Fe3O4 – SiO2 – NH2 – GOD lực kháng từ gần bằng 0, như vậy 3 mẫu đều có tính chất siêu thuận từ Đường cong là một đường đối xứng, từ độ bão hòa (emu/g) tương đối cao, cụ thể từ đồ thị, từ độ bão hòa của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4 – SiO2 – NH2, Fe3O4 – SiO2 –

NH2 – GOD lần lượt là 75,18 emu/g; 55,03 emu/g và 34,24 emu/g

Từ kết quả đo đường cong từ hoá có thể kết luận rằng vật liệu Fe3O4 – SiO2 – GOD tạo thành có độ từ bão hoà nhỏ hơn so với vật liệu Fe3O4NP ban đầu, nhưng vẫn đủ lớn để có thể tách ra khỏi môi trường phân tán nhờ tác dụng của từ trường ngoài Vì vậy, có thể

sử dụng vật liệu enzyme cố định trên MNPs đã tổng hợp cho mục tiêu sử dụng vật liệu từ tính làm chất mang trong các ứng dụng có liên quan đến phân tách các phân tử sinh học, xúc tác sinh học,

3.3 NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG OXY HOÁ DUNG DỊCH GLUCOSE BẰNG HỆ XÚC TÁC Fe 3 O 4 – SiO 2 – GOD

3.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển hoá glucose xúc tác bởi hệ Fe 3 O 4 – SiO 2 – GOD

a Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose đến phản ứng xúc tác

Điều kiện tiến hành: Fe3O4 – SiO2 – GOD: 0,5 g; 20 ml dung dịch glucose có nồng độ thay đổi là: 1%; 2%; 3%; 4%; 5%; 6%; 7%; 8%; thời gian phản ứng: 80 phút; nhiệt độ: nhiệt độ phòng (300C); pH=7,4

Sau phản ứng, tách Fe3O4 – SiO2 – GOD bằng từ trường ngoài, tiến hành chuẩn độ bằng iod để xác định hàm lượng glucose còn thừa Kết quả được biểu diễn trên hình 3.22