Nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn Streptomyces chống nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn Streptomyces chống nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt Capsicum frutescens L

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thu

Hà đã tận tình hướng dẫn và ủng hộ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy Cô giáo, các anh chị cán bộ khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo chủ nhiệm, bạn

bè, gia đình và người thân đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này!

Đà Nẵng, ngày 21 tháng 05 năm 2012

30

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự

phát triển của nấm Colletotrichum và Fusarium 31

3.4 Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm Colletotrichum

lên quả ớt (Capsicum frutescens L.) 34

3.5 Kết quả lây nhiễm nấm Fusarium gây bệnh héo

vàng lên cây ớt (Capsicum frutescens L.) 35

3.6

Hoạt tính kháng sinh của 9 chủng xạ khuẩn trên

MT Gause II VSVKĐ: Colletotrichum; Fusarium

VSVKĐ: NB1: Colletotrichum; NB6: Fusarium

40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số

hiệu

3.1 Tỷ lệ % nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt

(Capsicum frutescens L.) qua các giai đoạn

sinh trưởng, phát triển

26

3.2 Tỷ lệ % nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt

(Capsicum frutescens L.) qua các giai đoạn

sinh trưởng, phát triển

26

3.3 Hình ảnh triệu chứng bệnh thán thư ở cây ớt 30

ngày tuổi và trên quả ớt (Capsicum frutescens L.) tại Lộc Mỹ, Hòa Bắc, Hòa Vang, Đà Nẵng

28

3.4 Hình ảnh triệu chứng bệnh héo vàng cây ớt

(Capsicum frutescens L.) giai đoạn cây 90

ngày tuổi tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng

XK3 và XK14 đối với nấm Colletotrichum

trên MT PDA

3.11 Hình ảnh vòng vô khuẩn của chủng xạ khuẩn

XK3 và XK14 đối với nấm Fusarium trên

MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hằng năm, các bệnh cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp Trong đó bệnh do nấm là một trong những dịch hại ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, tính riêng bệnh hại do nấm gây ra chiếm đến 80% thành phần bệnh, theo ước tính có tới hơn 13.000 loài

và hơn 75.000 loại cây trồng bị ảnh hưởng Do đó việc sử dụng hóa chất trong bảo

vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam Tuy nhiên sự phát triển phức tạp và khả năng kháng thuốc của nấm bệnh đã hạn chế tác dụng của thuốc hóa học, cùng với

đó là quá trình tồn dư trong đất, nước và nông sản gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, làm ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái

Chính vì vậy phương pháp đấu tranh sinh học đang là hướng mở tích cực để bảo

vệ cây trồng, nâng cao năng suất và phòng chống ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng và khai thác các tác nhân sinh học (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) để hạn chế sự phát triển và gây hại của các quần thể vi sinh vật gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng, xạ khuẩn

Streptomyces là nhóm có tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh chất kháng

sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh chống nấm mạnh

Cây ớt (Capsicum frutescens L.) là cây trồng quan trọng, có giá trị kinh tế cao

Ớt không chỉ được dùng làm gia vị trong chế biến thực phẩm mà còn là nguồn dược liệu quý Trong quả ớt có chứa nhiều loại vitamin như C, B1, B2, acid citric, acid malic, beta caroten Đặc biệt, quả ớt có chứa hoạt chất capsicain, kích thích não bộ sản xuất ra chất endorphin có đặc tính như thuốc giảm đau, có ích đối với những bệnh nhân bị viêm khớp mãn tính, ung thư Chính nhờ những giá trị trên mà diện tích trồng ớt không ngừng được mở rộng ở nhiều nơi

Đà Nẵng có khí hậu nóng, mưa nhiều là điều kiện thích hợp cho việc trồng ớt Những năm gần đây diện tích trồng ớt ở Đà Nẵng ngày càng được mở rộng và đem lại hiệu quả kinh tế cho người nông dân Tuy nhiên, sự phát triển mạnh của nấm gây bệnh đã làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả ớt, nhiều khi không cho thu hoạch Do đó để khắc phục tình trạng trên, cần có những cuộc điều tra, nghiên

cứu xác định tình hình bệnh hại cây trồng, mức độ phổ biến, tác hại cũng như nghiên cứu những biện pháp phòng trừ bệnh để kiểm soát sự gây hại của chúng

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn

các chủng xạ khuẩn Streptomyces chống nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)”

1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng

chống nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm vi sinh phục vụ thực tiễn sản xuất

2 NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

- Phân lập và nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, hình thái các chủng nấm mốc gây

bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) tại thôn Lộc Mỹ- xã

Hòa Bắc- huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng

- Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có hoạt tính

kháng sinh mạnh chống nấm gây bệnh trên cây ớt

- Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, hình thái và một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng dịch kháng sinh thô của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn chống nấm gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về xạ khuẩn

1.1.1 Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (XK) thuộc lớp Actinobacteria, dưới lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó có 478

loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào

nhóm xạ khuẩn hiếm [35]

XK phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể tìm thấy chúng ở trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Nhiều vùng trên thế giới, số lượng xạ khuẩn trong đất chiếm 20- 40% tổng số các vi sinh vật (VSV) đất Theo Waksman, trong đất xạ khuẩn chiếm 9- 45% tổng số VSV, trong 1 gam đất có khoảng 29.000- 24.000.000 mầm xạ khuẩn [64] Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật

XK là những VSV hiếu khí, phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, XK có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu khoảng 6,8 – 7,5, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [34]

Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60– 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Đặc biệt là các

xạ khuẩn hiếm cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi

Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nước, dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, xenluloza … một số axit amin và axit hữu cơ Một số loại xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người và động vật [8]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

* Khuẩn lạc

Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào tử), có đường kính thay đổi trong khoảng 0,2- 3µm, chiều dài có thể đạt tới vài cm [10] Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định, phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Các loài XK khác nhau

đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoặc rất ít phân nhánh, có loài có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng hoặc xoắn

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường xù xì, chắc, có dạng da, vôi, nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng nâu, xám, trắng tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh và loài Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt

độ, độ ẩm…Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có các sợi khuẩn ty bện chặt, lớp

trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

* Khuẩn ty

Trên môi trường (MT) đặc, hệ sợi của XK có 2 loại: loại cắm sâu vào MT gọi là

hệ sợi cơ chất (HSCC), với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại khác phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (HSKS) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại XK chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng

Độ dài của khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm/ giờ [64] và chất nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi Một số XK có sinh ra

nang bào tử bên trong có chứa các bào tử nang [8]

1.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh, gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [5] Bào tử XK được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300- 400A0 chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…

1.1.4 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt

tên năm 1943 [64] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1- 5mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Cuống sinh bào tử có

những dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, có vòng…Bào tử

xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loại xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram

dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu là 25- 30OC, pH tối ưu 6,5- 8,0 Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật Hiện nay có rất

nhiều cách để phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

1.2 Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn

1.2.1 Định nghĩa chất kháng sinh

Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về chất kháng sinh, theo định nghĩa của Viện sĩ Outchinikov (1987), CKS là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng ức chế tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở nồng độ thấp (10-3- 10-2 g/ml) [44]

1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Có nhiều quan điểm khác nhau về sự hình thành chất kháng sinh (CKS) Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên Số khác lại cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là do

sự cạnh tranh trong MT dinh dưỡng Thường thì CKS không có chức năng rõ rệt đối với tế bào sinh sản ra chúng Mất khả năng hình thành CKS không làm mất khả năng sinh trưởng Lại có quan điểm chất kháng sinh là sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào Theo quan điểm này CKS là sản phẩm trao đổi thứ

cấp, chúng chỉ được tổng hợp sau khi sinh trưởng của VSV đạt đến trạng thái cân bằng sau pha logarit và vật liệu tổng hợp nên chúng là các chất trao đổi sơ cấp [5] Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau

- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác Nhiều chủng xạ khuẩn

có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển

đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách

nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor

1.2.3 Các cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật

Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện chúng Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu Tính đặc hiệu đó gắn liền với cơ chế tác động, vì vậy không thể có cơ chế tác động chung của CKS đối với VSV Cơ chế tác động của CKS có thể chia thành các nhóm cơ bản sau:

- Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của VSV

- Ức chế chức năng của màng tế bào VSV

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp axit nucleic

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của

xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28– 30oC, nhưng nhiệt độ tối

ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18– 280C [22]

* pH môi trường

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [39],[65]

* Thời gian

Việc tổng hợp CKS cũng phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất cao nhất thường là

24 giờ tuổi Lượng giống cấy truyền vào khoảng từ 2 đến 10 % [13]

1.2.4.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N, các chất khoáng [5], [47]

* Nguồn cacbon

Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột [60] Ngoài

ra các chủng XK còn có thể sử dụng các loại đường là khác nhau như glucoza, mannoza, fructoza acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong quá trình lên men sinh CKS

* Nguồn nitơ

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và

vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô [43] Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon

* Nguồn photphat vô cơ

Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml

* Các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Việc bổ sung các nguyên tố vi lượng vào môi trường lên men làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của một số chủng XK

1.2.5 Xạ khuẩn sinh kháng sinh trong bảo vệ thực vật

CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học

Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [6]

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới

Các nhà Liên Xô (cũ) đã nghiên cứu sản xuất và áp dụng các chất kháng sinh phòng chống bệnh thực vật, trong đó có chất kháng sinh levorin và triclotexin cho hiệu quả cao, chất kháng sinh polyen cũng có khả năng làm giảm 70 - 80% bệnh

héo xanh do nấm Verticillium alboatrum [36]

Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal

HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312 [46]

Nhóm hóa sinh phòng nghiên cứu khu vực vùng Jorhat ở Ấn Độ năm 2002 đã

phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.201 có khả năng sinh CKS mới là 2- methylheptyl isonicotinate kháng các nấm gây bệnh thực vật như Fusrium

oxysporum, F solani, F semitectum, F moniliforme [36] Cũng trong năm này, từ

các mẫu đất chọn lọc vùng Taejeon của Hàn Quốc đã phân lập được chuẩn xạ khuẩn

Streptomyces sp thuộc nhóm xám theo phân loại của Bergey [35] Chủng này có

khả năng sản sinh ra hai loại kháng sinh polyen mới là 16 methyloxazolomyxin kháng khuẩn và Tetrin C kháng nấm [34]

Tháng 1 năm 2003, khoa Bệnh học thực vật, trường Đại học Quốc gia Chung

Hsing ở Taichung Đài Loan đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces

padanus PSM-702 có khả năng sinh kháng sinh Fulgichromin CKS này có khả

năng kháng khuẩn mạnh tiêu diệt được Rhizotoniasolani AG-4 Nồng độ tối thiểu

để kiềm chế là 72mg/ml, kiềm chế hơn 90% [41]

Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces sp TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans

Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [12]

Ở Việt Nam, việc phân lập các chủng VSV có khả năng sinh kháng sinh ngày càng có nhiều nghiên cứu sản xuất và ứng dụng Việc nhập các giống VSV từ nước ngoài có nguồn gốc kháng sinh không thích hợp với điều kiện nước ta, khi đưa vào

sử dụng dễ mất hoạt tính Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một

số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và

Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [3]

Nhiều năm qua cũng đã có rất nhiều nghiên cứu ở các trường Đại học tổng hợp

Hà Nội, Đại học dược khoa, Viện công nghệ sinh học,…cho thấy tỉ lệ xạ khuẩn sinh CKS ở Việt Nam khá cao Đây là nguồn tài nguyên quý giá cần được nhiều quan tâm [8], [17]

Hiện nay ở nước ta vẫn giữ phương pháp hóa học trong bảo vệ cây trồng là phổ biến Do đó cần có sự phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trừ sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người [13]

1.3 Tổng quan về cây ớt và tình hình sản xuất ớt trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tổng quan về cây ớt

Cây ớt có tên khoa học là Capsicum sp thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) Có hai nhóm ớt phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L) Ớt là cây gia vị, thân thảo, thân dưới hóa gỗ, có thể

sống vài năm, có nhiều cành, nhẵn; lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, phiến lá dài 2 - 4cm, rộng từ 1,5 -2 cm; hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá Đa số quả ớt mọc hướng xuống đất, chỉ riêng ở cây ớt Chỉ thiên thì quả lại quay lên trời Các bộ phận của cây ớt như quả, rễ và lá được dùng làm thuốc chữa nhiều bệnh

Quả ớt có nhiều tác dụng trong việc nấu nướng, trong quả ớt chứa nhiều chất như chất dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoit, carotenoit, vitamin, protein, chất sợi

và các nguyên tố khoáng chất [42] Nhiều thành phần trong quả ớt có giá trị dinh dưỡng quan trọng, làm gia vị, có mùi thơm và nhiều màu sắc Quả ớt có tác dụng làm giảm nhiễm sạ và cholesterol, ớt giàu vitamin A và C, nhiều khoáng kali, axit folic và vitamin E Vitamin C trong quả ớt giúp cho những người có hệ miễn dịch yếu, thiếu vitamin C Một số các hợp chất tự nhiên khác giúp cho người dùng có giấc ngủ ngon và sâu hơn Hai nhóm chất hoá học quan trọng trong ớt là capsaicinoit và carotenoit Capsaicinoit là alkaloit tạo ra vị cay cho quả ớt Một số lượng lớn carotenoit cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho quả ớt [7], [62]

Cây ớt phát triển tốt ở đất thịt nhẹ, đất pha cát dễ thoát nước Hạt ớt nảy mầm ở 25-30oC, dưới 10oC hạt không mọc Thời kỳ ra hoa cần nhiệt độ 15- 20oC, cần nhiều ánh sáng Cây ớt có khả năng chịu hạn cao, lúc ra hoa chỉ cần độ ẩm trên 70% [7], [28]

1.3.2 Tình hình sản xuất ớt trên thế giới

Ở khu vực châu Á cây ớt đã được trồng nhiều nơi ở Trung Quốc và sau đó lan rộng qua Nhật Bản, bán đảo Triều Tiên từ những năm cuối thế kỷ 14 đến đầu thế kỷ

15 Các giống ớt trồng ở vùng này thuộc nhóm ớt cay hay hơi cay Ở khu vực Đông Nam Á như Inđonêsia, cây ớt được trồng sớm hơn Châu Âu và hiện nay khu vực này chủ yếu trồng dạng ớt cay [60]

Ở châu Âu đến tận thế kỷ 16 cây ớt mới được biết đến nhờ Columbus Từ Tây Ban Nha, ớt được phát tán rộng ra đến vùng Địa Trung Hải và nước Anh, tiếp tục vào các trung tâm Châu Âu trong những năm cuối thế kỷ 16 Trước năm 1885, cây

ớt được người Bồ Đào Nha mang từ Barazil đến Ấn Độ Theo Tong và Bosland

[62], chi Capsicum bao gồm khoảng 20 - 27 loài, một số chủng được thuần hoá là

Capsicum annuum, C baccatum, C chinense, C frutescens, và C pubescens, và đã

được trồng ở nhiều nơi trên thế giới Cây ớt được phân bố rộng rãi khắp châu Mỹ kể

cả dạng hoang dại và dạng trồng

Ngày nay ớt được trồng rộng rãi trên toàn thế giới từ 55 độ vĩ độ Bắc đến 55

độ vĩ độ Nam, đặc biệt ở các nước châu Mỹ và một số nước châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia [42] Diện tích trồng ớt ngày càng được mở rộng và quy mô hơn phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Các nước nhập khẩu và xuất khẩu ớt quan trọng nhất bao gồm: Trung Quốc,

Ấn Độ, Mêxicô, Pakistan, Thái Lan và Thổ Nhĩ Kỳ

1.3.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ớt ở Việt Nam

Việt Nam nằm ở vị trí trải dài theo khu vực 8- 23 độ vĩ độ Bắc, chịu ảnh hưởng của điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, là điều kiện thích hợp cho cây ớt phát triển quanh năm Để bảo đảm có năng suất cao, tăng hệ số sử dụng đất và phù hợp với điều kiện khí hậu, cây ớt thường được gieo trồng vào 2 vụ chính là: Vụ đông xuân, gieo hạt từ tháng 10 đến tháng 2, trồng tháng 1 - 2 và thu hoạch vào tháng 4 - 5, hay tháng 6 - 7 Vụ hè thu: Gieo hạt tháng 6 - 7, trồng tháng 8 - 9, thu tháng 1 - 2 Ngoài

ra có thể trồng ớt trong vụ xuân hè gieo hạt tháng 2 - 3, trồng tháng 3 - 4, thu tháng

7 - 8 [1], [26]

Mặc dù cây ớt ở nước ta đã được trồng trọt từ lâu đời nhưng chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Trung, vùng ven đô, khu vực đông dân cư (Hà Nội, Thái Bình, Hải Hưng, Vĩnh Phúc…) Vùng chuyên canh ớt đã được hình thành ở Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng ớt đã mở rộng ra ở các vùng đồng bằng Bắc Bộ, đồng bằng sông Cửu Long và miền Tây Nam Bộ [7] Hiện nay diện tích trồng ớt ở nước ta tuy khá rộng như còn manh mún chưa được quy hoạch Với những tiềm năng mà cây ớt mang lại cho con người, cây ớt phục vụ cho chế biến và xuất khẩu, vì vậy đây là loại cây trồng được chú ý phát triển trong giai đoạn tới

1.4 Tình hình nghiên cứu thành phần nấm gây bệnh trên cây ớt

1.4.1 Tình hình nghiên cứu thành phần nấm bệnh trên cây ớt

Hằng năm bệnh cây đã gây ra những thiệt hại đáng kể cho hoạt động sản xuất nông nghiệp Vi sinh vật gây bệnh không chỉ làm giảm năng suất mà chúng còn gây ảnh hưởng đến chất lượng nông phẩm, chất lượng đất canh tác Trong quá trình

sống và phát triển trong cây, chúng đã sản xuất ra các độc tố gây hại đến cây trồng

(độc tố Lycomarasmin do nấm Fusarium heterosporum tiết ra gây chết cây) Sự gây

hại và phát tán nhanh chóng của VSV là nguyên nhân chủ yếu làm suy giảm một lượng lớn nông sản Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO), bệnh cây đã làm thiệt hại đến 11,6% sản xuất nông nghiệp, trong đó bệnh do nấm chiếm 83% [42]

Vụ hè năm 2003, bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorium) đã làm giảm 5%

năng suất ớt ở Western NY trong điều kiện gieo trồng ẩm ướt và mát Đây là bệnh gây hại nhiều loại cây trồng và rau màu mẫn cảm với bệnh như cây ớt, cà chua, cải bắp, rau diếp, cà rốt, cần tây và nhiều cây trồng thuộc họ bầu bí Bệnh phấn trắng

(do nấm Leveillula taurica) gây hại trên ớt xuất hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm

1971, năm 1992 bệnh xuất hiện ở ở Puerto Rico, trong nhà lưới ở Idaho năm 1998, trung tâm phía Bắc Mexico năm 1998, vào năm 1999 bệnh gây hại trong nhà lưới ở

cả Canada và Oklahoma Bệnh gây hại trên cả ớt cay, ớt ngọt và ớt chuông ở tất cả các tỉnh ở California từ những năm 1990 [42]

Theo Thomas A Zitter (1989) [62] bệnh do nấm và lớp phụ nấm gây nên trên cây ớt gồm nhiều bệnh khác nhau như bệnh thán thư, bệnh đốm lá, bệnh đen rễ,

bệnh héo Fusarium, bệnh đốm xám lá, bệnh mốc xám, bệnh mốc trắng, bệnh sương

mai, bệnh phấn trắng

Bệnh sương mai xuất hiện rải rác ở New York hơn 40 năm nay và gây thiệt hại

nghiêm trọng ở New Jersey, California, New Mixico và Floria Bệnh héo Fusarium

là một bệnh nấm gây hại trên cà chua, khoai tây, cây họ cà và cây ớt, bệnh được tìm

thấy ở khắp nơi của nước Mỹ Nấm bệnh (Fusarium oxysporum) xâm nhiễm qua rễ

vào cây và phát triển trong cây cản trở sự vận chuyển nước trong cây làm lá bị héo vàng Sau đó sự lây nhiễm sang các lá non và cuối cùng là cây bị chết

Theo nghiên cứu của Ken Pernezny và Tim Momol (2006) [51] thì bệnh nấm

gây hại trên cây ớt gồm có: Bệnh chết rạp cây con (do nấm Pythium spp và

Rhizoctoni asolani) gây vết chết hoại ở trụ lá mầm, cổ rễ và làm cho cây đổ gập

xuống và chết Bệnh đốm trắng lá (Cercospora capsici) có vết đốm trên lá có hình

tròn thô giáp, ở giữa vết bệnh có màu nâu vàng nhạt tới trắng và có viền màu nâu đen Bệnh đốm trắng lá gây hại là nguyên nhân gây rụng lá và làm giảm năng suất

ruộng ớt Bệnh đốm xám lá (Stemphylium solani) với vết đốm trên lá có dạng gần

giống hình tròn, các vết đốm ban đầu có màu nâu sau chuyển sang màu nâu sáng tới sáng trắng với thương tổn bị lõm ở giữa vết bệnh và viền vết bệnh có màu nâu tới

đỏ Bệnh sương mai do nấm Phytophthora capsici là một bệnh phổ biến và hại

nghiêm trọng ở Floria Bệnh làm chết cây con cũng như thối rễ, thối thân, héo lá và thối quả ớt Cây trồng bị nhiễm bệnh héo và chết ngay sau đó Giai đoạn cây ớt ra hoa bị nhiễm nấm, toàn bộ các cành có thể bị nhiễm bệnh Bệnh héo rũ gốc mốc

trắng (Sclerotium rolfsii) gây hại trong điều kiện thời tiết ấm và ẩm ướt Cây trồng

bị nhiễm bệnh thường bị héo do rễ và thân bị chết [51] Bệnh thối hạch do nấm

Sclerotinias clerotiorium gây hại nặng trên cây ớt khi điều kiện thời tiết mát mẻ,

mùa đông ẩm ướt và đặc biệt khi cây ớt được trồng xen canh với các cây trồng mẫn cảm với bệnh Nấm thường xâm nhiễm lên thân, cuống lá và đôi khi cả trên quả làm cây héo và chết [50]

Bệnh chết rũ và thối gốc cây ớt gây hại phổ biến ở các tỉnh miền Trung Việt Nam, tỷ lệ bệnh biến động từ 5,3 đến 57,3% Bệnh gây hại hầu hết các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây ớt, tuy nhiên thường gây hại nặng ở giai đoạn ra hoa - đậu quả

1.4.2 Tình hình nghiên cứu nấm Fusarium gây bệnh héo vàng trên cây ớt

Bệnh héo vàng do nấm Fusarium là một trong những bệnh phổ biến và nguy

hiểm gây thiệt hại lớn trên thế giới kể cả Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ và Châu Đại

Dương Các loài nấm Fusarium đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX Nấm Fusarium thuộc lớp Hyphomycetes, nhóm nấm bất toàn Fungi imperfecti,

đây là loại nấm có thành phần phong phú, đa dạng, sự biến động số lượng loài phụ thuộc cơ bản vào điều kiện khí hậu các vùng khác nhau trên thế giới Loài nấm này gây hại trên nhiều cây trồng, ở tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là các bộ phận

gốc, rễ Nấm bệnh (Fusarium oxysporum) xâm nhiễm qua rễ vào cây và phát triển

trong cây cản trở sự vận chuyển nước trong cây làm lá bị héo vàng sau đó làm cho cây chết

Theo nghiên cứu của Burgess và Summerell [38] thì tại vùng Queensland

Astralia xác định có 3 loài nấm Fusarium moniliforme, Fusarium serif và Fusarium

semitectum trên mẫu bệnh ớt, đặc biệt loài nấm Fusarium oxysporum Chu kỳ sinh

trưởng của nấm bao gồm nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, trong quá trình phát

tán bào tử nấm có mặt trong thời gian và không qua các vụ mùa khác nhau

Fusarium gây bệnh ở hầu hết các cây trồng, làm ảnh hưởng đến khả năng sinh

trưởng, phát triển của cây, làm giảm năng xuất, ngoài ra nó còn gây nguy hiểm cho

con người và động vật Các độc tố Fusarium gây hại cây trồng, độc tố này cũng là

nguyên nhân gây ung thư ở người và vật nuôi, đặc biệt các độc tố từ nấm mốc này gây hại liên tục cho nhiều loại cây trồng khác nhau, chúng tiềm tàng trong đất và gây hại liên tiếp ở nhiều vụ mùa [33] Trong quá trình phát triển nấm có thể sản xuất một loạt các hợp chất độc hại với đa dạng về cấu trúc và khả năng tác động Vào năm 1990, theo báo cáo của Hashami, từ các mẫu ớt thu thập được ở Ấn

Độ đã xác định được nhiều loài nấm như Alternaria, Collectotrichum,

Fusarium,…gây bệnh trên cây, ảnh hưởng lớn đến năng suất, trong đó một số các

loài nấm thuộc chi Fusarium như F moniliforme, F oxysporum, F pallidoresium

và F solani phân lập từ cây ớt Capsicum annuum L sản sinh ra một số các độc tố

anhydrofusarubin, bostricoidin, fusarubin… [45]

Fusarium gây hại phổ biến trên cây ớt, mỗi loài nấm gây ra những triệu

chứng khác nhau trên cây Fusarium oxysporum gây hiện tượng héo cây trồng, cây

mất khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh và dẫn đến chết cây Còn nấm

Fusarium solani gây thối gốc và rễ cây ớt Nấm Fusarium trên cây ớt gây thối gốc

và quả [48] nhưng theo nghiên cứu năm 1999 thì bệnh héo vàng gây hại trên toàn

cây mà không gây hại trên quả [40] Khi cây bị bệnh héo vàng do nấm Fusarium thì

năng suất thu hoạch giảm sút, khoảng 25% các cây cho năng suất thu hoạch thấp khi được trồng trong điều kiện nhà kính Bệnh héo vàng này gây ảnh hưởng nhiều mức

độ khác nhau trên các loại cây ớt [40]

Ở Thái Lan từ năm 2008, bệnh nấm gây hại rất phổ biến Các bệnh trên cây do

nấm Fusarium gây hại ra thiệt hại lớn, đặc biệt nấm Fusarium oxysporum gây

bệnh mà chưa tìm ra biện pháp kiểm soát, mặc dù những cây trồng bị bệnh đã được loại bỏ khỏi đồng ruộng, vệ sinh sạch ruộng và thực hiên các biện pháp canh tác, tuy nhiên do chúng vẫn tồn tại trong đất nên vẫn có khả năng lây nhiễm sang các cây trồng ở các vụ tiếp theo [56]

Tại nhiều nơi trên thế giới, bệnh héo vàng do nấm Fusarium gây ra đã được

quan tâm nghiên cứu Theo A Jamiolkowska từ năm 2004 đến năm 2006 nghiên

cứu về tình hình gây hại của Fusarium gây bệnh trên cây ớt tại Ba Lan thì bệnh diễn biến rất phổ biến, liên tục và ảnh hưởng khá lớn đến năng suất cây trồng Fusarium

oxysporum gây hại làm cây héo và chết, đặc biệt vào năm 2006 nấm bệnh này đã

gây hại nghiêm trọng làm cây ớt chết rất nhiều, thậm chí ớt Orkem bị ảnh hưởng

đến 23,1% Tuy nhiên loài F.solani chỉ gây hại cây ớt Rokita vào năm 2004 [32].

Ở Việt Nam Fusarium là nguyên nhân gây bệnh héo vàng trên cây cà chua,

khoai tây, ớt [20] Theo nghiên cứu của Phạm Đình Quân thì thành phần bệnh nấm hại ớt tại Hải Dương vụ hè thu và vụ đông xuân gồm có 5 loại bệnh, vụ xuân hè

gồm 4 bệnh, trong đó Fusarium gây bệnh héo ớt trên cả 3 vụ và gây hại trên toàn

cây ớt Bệnh nấm đã gây ảnh hưởng khá nghiêm trọng tại vùng sản xuất [25]

Ở nước ta kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái, khả năng gây hại

các loài nấm gây bệnh cây còn hạn chế, đặc biệt là nấm Fusarium gây héo vàng trên

cây ớt

1.4.3 Tình hình nghiên cứu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra là một trong số những bệnh có ý

nghĩa kinh tế quan trọng nhất làm giảm năng suất từ 10 đến 80% ở một số quốc gia đang phát triển, đặc biệt là Thái Lan

Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do các loài nấm Colletotrichum gây

ra bao gồm nấm Colletotrichum acutatum (Simmonds), Colletotrichum capsici (Syd.) Butler và Bisby, Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz., và C

coccodes [49]

Năm 1989 tại Đài Loan, Suryaningsih xác định các loài nấm Colletotrichum

capsici, Colletotrichum gloeosporioides, Glomerella cingulata gây hại trên quả ớt

chín, trong đó 2 loài Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides là

quan trọng hơn cả

Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Kasetsart Kamphaeng Saen Campus,

Nakhom Pathom, Thái Lan (2007) [57] đã xác định 5 loài trong chi Colletotrichum gây bệnh loét trên ớt là: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum coccodes,

Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum capsici, Colletotrichum graminicola

Tác giả Pring et al (1995) [58] nhận định nấm Colletotrichum có thể qua đông

trên các cây ký chủ khác như các cây họ cà hoặc các cây họ đậu, tàn dư thực vật và

các quả bị bỏ lại trên đồng ruộng Các loài Colletotrichum sản sinh ra các hạch nấm

nhỏ để tồn tại ở trạng thái ngủ trong đất giữa mùa đông hay khi gặp điều kiện stress

và những hạch nhỏ này có thể sống sót qua nhiều năm

Sự xâm nhiễm ban đầu của các loài nấm Colletotrichum có liên quan đến nhiều

quy trình bao gồm sự tiếp xúc bào tử trên mặt cây trồng, sự nảy mầm của bào tử, sự hình thành giác bám, sự xâm nhập vào biểu bì của cây, sự phát triển và định vị vào

mô cây và sự sản sinh ra đĩa cành và bào tử phân sinh [49]

Triệu chứng của bệnh do các loài nấm Colettotrichum gây ra thể hiện rất khác

nhau, thường là vết bệnh điển hình nhỏ hoặc to được hình thành trên lá và quả, đôi khi cả ở trên thân Nhưng trong một số trường hợp khác bệnh có thể phát triển như một đốm màu hơi đỏ tía hoặc nâu mà không có sự hình thành vết bệnh rõ ràng Thân và cuống lá có thể bị tróc vỏ, cụm hoa bị tàn lụi và chết đen khi bệnh phát triển mạnh ở giai đoạn này [58]

Đặc điểm hình thái, bệnh lý và sự biến đổi cấu trúc phân tử của loài

Colletotrichum capsici gây thối quả ớt tại vùng cận nhiệt đới phía Tây Bắc Ấn Độ,

đã được P P Than và nhóm nghiên cứu [57] Tác giả cho rằng bệnh thối quả ớt do

nấm Colletotrichum capsici gây ra trong điều kiện nhiệt đới, bệnh đã làm giảm năng

suất và chất lượng một cách đáng kể

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Ngô Bích Hảo (1991) thì nguyên nhân gây

bệnh thối quả ớt là do 2 loài nấm Colletotrichumnigrum và Colletotrichum capsici

Bệnh thường xuất hiện và gây hại nặng vào giai đoạn đang thu hoạch quả, nhiệt độ trung bình là 28- 30oC, độ ẩm 85- 90%, mưa nhiều Ở vùng trồng ớt Huế và Hà Nội,

loài Colletotrichum nigrum là phổ biến, ngược lại ở Hải Dương, Hưng Yên, Hà Bắc thì loài Colletotrichum capsici gây hại phổ biến hơn [15]

Theo Phạm Thị Miên (2008) [21] cho rằng trong vụ xuân hè năm 2008, tại vùng

Hà Nội và phụ cận đã xác định có hai loài gây bệnh thán thư trên ớt đó là loài

Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides Đặc điểm triệu chứng, hình

dáng đĩa cành, bào tử và giác bám của 2 loài là khác nhau Trên đồng ruộng loài nấm

Colletotrichum gloeosporioides gây hại phổ biến hơn nấm Colletotrichum capsici

Theo Vũ Triệu Mân và cộng sự [19] bệnh thán thư do hai loài nấm

Colletotrichum nigrum Ell et Hals và Colletotrichum capsici (Syd.) Butler và Bisby

gây ra Đây là hai loài nấm thường song song phá hại làm quả ớt bị thối nhanh chóng Bệnh phát triển mạnh ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao Ở nước ta, bệnh gây hại mạnh vào tháng 5- 7 khi cây ớt ở thời kỳ thu hoạch quả Bệnh còn gây hại vào giai đoạn sau thu hoạch trong quá trình vận chuyển và bảo quản Nấm tồn tại trên hạt giống dưới dạng sợi nấm, bào tử phân sinh và tàn dư cây bệnh Bào tử phân

sinh có sức sống cao, có khả năng nảy mầm vào vụ sau trong điều kiện khô [19]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG

- Các chủng xạ khuẩn chi Streptomyces phân lập từ đất trồng ớt tại thôn Lộc

Mỹ–xã Hòa Bắc- huyện Hòa Vang- TP Đà Nẵng có hoạt tính kháng sinh chống

nấm Colletotrichum và Fusarium gây bệnh trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)

2.2 Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Mẫu bệnh cây và mẫu đất thu thập tại vùng trồng ớt (Capsicum frutescens L.)

tại thôn Lộc Mỹ – xã Hòa Bắc- huyện Hòa Vang- TP Đà Nẵng

- Phân lập, nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Sinh lý- Hóa sinh, Khoa Sinh- Môi trường, Trường Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm trường Cao Đẳng Lương Thực Thực Phẩm Đà Nẵng

- Phòng Hóa Vi sinh- Trung tâm kỹ thuật đo lường chất lượng 2- TP Đà Nẵng

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu:

Nghiên cứu các chủng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) tại thôn

Lộc Mỹ- xã Hòa Bắc- huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm và nhà lưới

2.2.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2011 đến tháng 05/2012

2.3 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, MnCl2, Na2CO3, ZnCl2, ZnSO4

- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone

- Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)

- Các dung môi: etanol, iso-propanol, metanol, aceton…

- Box cấy vô trùng

- Máy đo pH 151 Martin

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu thập và phân lập mẫu bệnh

2.3.1.1.Thu mẫu bệnh cây

Thu mẫu theo đúng tiêu chuẩn thu mẫu bảo vệ thực vật Việt Nam [2]

Thu mẫu cây bệnh với những triệu chứng từ những vết bệnh ban đầu đến những vết bệnh đã thuần thục trên cây ớt Thu mẫu cả cây do nguồn nấm bệnh gây hại ở rễ, thân, lá và quả Ghi phiếu điều tra mẫu (sử dụng bút chì viết trên giấy bóng mờ) sau

đó bọc trong giấy báo đem về phòng thí nghiệm [4]

Mẫu được lấy theo từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây Mẫu bệnh cây đem về phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở 2- 50C, thời gian bảo quản tối đa là 48 giờ [4]

2.4.1.2 Phương pháp phân lập mẫu bệnh cây

* Phân lập từ lá, thân và quả:

Rửa mẫu lá, thân và quả trong nước cất để loại bỏ đất bụi và tạp chất khác Khử trùng bề mặt mô lá, thân hoặc quả bằng cách dùng giấy mềm đã nhúng cồn 70% lau mặt lá hoặc bằng cách nhúng nhanh lá dày bằng cồn 70% trong 5 giây, rửa lại trong nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng Sau đó dùng dụng cụ vô trùng cắt thành từng đoạn nhỏ 2x2 mm từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh rồi cấy trên môi trường WA (môi trường nghèo dinh dưỡng) Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu bệnh này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28- 30OC trong khoảng 2 - 3 ngày để cho sợi

nấm phát triển mọc trên môi trường Khi nấm đã mọc ra ngoài môi trường WA, ta tiến hành cấy truyền sang môi trường PDA, CLA [4]

* Phân lập từ rễ

Nấm gây bệnh từ rễ phải được phân lập từ rễ chính Cắt bỏ rễ phụ, rửa rễ trong nước cất với một ít nước tẩy rửa để loại bỏ đất và các tạp chất Gọt bỏ lớp vỏ ngoài của rễ vì phần này thường chứa vi sinh vật hoại sinh Mô cấy lấy từ phần ranh giới

mô khỏe và mô bệnh Phun xịt mẫu bằng cồn 70% và rửa lại bằng nước cất vô trùng Cắt những miếng mô mỏng và cấy lên môi trường WA, khi nấm mọc tiến hành cấy truyền sang môi trường PDA, CLA [4]

2.4.2 Sơ bộ phân loại chủng nấm Colletotrichum và Fusarium gây bệnh trên ớt

- Sử dụng khóa phân loại của Brian C Sutton (1998) [37], Keith Seifert (1996) [52] và S B Marthu Olga Kongsdal (2000) [59]

- Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch

+ Kích thước (đường kính, chiều dày)

+ Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…)

+ Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới

+ Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

+ Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)

+ Mùi khuẩn lạc (có, không mùi)

+ Sắc tố hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có

- Quan sát các đặc điểm vi học: hình dạng, vách ngăn của bào tử lớn, nhỏ… 2.4.3 Lây bệnh nhân tạo xác định chủng nấm gây bệnh

Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo là phương pháp kiểm tra và khẳng định được loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên thân, cành, quả có chính xác hay không

* Đối với bệnh héo vàng tiến hành lây nhiễm nấm bệnh trên cây ớt: Chọn những cây ớt khoẻ không bị bệnh được trồng cách ly Hoà dịch bào tử nấm bằng cách đổ nước vào đĩa môi trường nuôi nấm rồi tưới hoặc phun trực tiếp lên cây định lây bệnh

Để cây vào lồng cách ly và theo dõi triệu chứng Phủ nilon lên trên để cách ly, giữ ẩm Thí nghiệm lặp lại 3 lần Sau đó theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trên cây hàng ngày

* Đối với bệnh thán thư tiến hành lây nhiễm trên quả ớt: Chọn những quả ớt khoẻ không bị bệnh thán thư Quả ớt được khử trùng bằng cồn, rửa lại bằng nước cất vô trùng một vài lần và thấm khô bằng khăn giấy vô trùng Lấy 5 quả ớt khoẻ ở

5 cây khác nhau về đặt lên khay có lót khăn giấy, phun ẩm, dùng bông thấm dịch bào tử cho lên quả (không gây và gây vết thương nhẹ trên quả chỗ lây nhiễm) Phủ nilon lên trên để cách ly, giữ ẩm Thí nghiệm lặp lại 3 lần Sau đó theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trên lá và trên quả hàng ngày [4]

Chỉ tiêu theo dõi: Đặc điểm triệu chứng, tỷ lệ bệnh

2.4.4 Phương pháp phân lập mẫu đất

2.4.4.1 Lấy mẫu đất

Mẫu đất được lấy ở lớp bề mặt từ 5- 20cm ở các vị trí khác nhau (4- 5 vị trí)

trong 1 vùng 50 m2 Sau đó các mẫu đem trộn đều đựng trong túi nilông đã khử trùng Ghi ngày lấy mẫu, địa điểm, loại đất, độ sâu…Đất đem về phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC không quá 24 giờ

2.4.4.2 Phân lập mẫu đất

Sử dụng phương pháp phân lập của Egorov [11]

- Cân 1g mẫu, đem nghiền nhỏ, cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất

- Lắc trên máy với tốc độ 220 vòng/phút trong 10 phút, ta thu được dịch mẫu với độ pha loãng 10-2 Dùng pipep vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc đều, ta thu được dịch mẫu có độ pha loãng là 10-3 Tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6

- Lấy 0,1 ml dịch mẫu cho vào các hộp lồng có chứa môi trường phân lập vô trùng Sau đó dùng que trang dàn đều giọt dịch trên mặt thạch

- Đặt các đĩa petri trên ở nhiệt độ phòng, sau 3 - 5 ngày nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ

- Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ đặc trưng của xạ khuẩn Streptomyces cấy truyền

sang ống giống đến khi thuần chủng

2.4.5 Phương pháp giữ giống

Để bảo quản giống cho những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi thực hiện theo phương pháp của Egorov [11] Ống giống được giữ ở nhiệt độ 4 - 60C, 1 tháng cấy chuyền một lần

2.4.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn

lạc (mm) [8], [11]

2.4.6.2 Phương pháp đục lỗ

Phương pháp này được dùng để thử hoạt tính kháng sinh trong dịch thể

Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường đậu tương lỏng, Gause I, Gause II, Czapek nhiệt độ 28- 30oC, sau 5 - 7 ngày để tạo dung dịch cần thử kháng sinh Dùng khoan nút chai, khoan các lỗ trên bề mặt môi trường đã cấy nấm bệnh kiểm định Nhỏ vào các lỗ khoan 1ml dung dịch kháng sinh cần thử Các bước tiếp theo tiến hành giống phương pháp khối thạch [9], [11]

2.4.7 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, hình thái xạ khuẩn

* Đặc điểm nuôi cấy và hình thái

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên 3 MT: MT Gause I, MT Gause II, MT Czapek nguyên gốc ở nhiệt độ 28- 30oC Sau 7, 14, 21 ngày quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc khuẩn lạc, màu sắc HCKS, màu sắc HSCC, sắc tố tan tiết ra môi trường theo phương pháp của Gause và cộng sự (1983) [43], Sherling và Gottieb (1969) [60]

* Sự hình thành sắc tố melanin

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP- 6 ở nhiệt độ phòng Bắt đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen [55]

2.4.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

2.4.8.1 Ảnh hưởng của môi trường

Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được lên men trên các môi trường sau: MT Gause I, MT Gause II, MT Czapek nguyên gốc, MT đậu tương lỏng Nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28- 30oC sau 2 ,3 ,4,5 ,6 ,7 ngày, xác định hoạt tính kháng sinh nhằm chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [9]

2.4.8.2 Ảnh hưởng của thời gian

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause II dịch thể, nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28- 30oC Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7, tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ dịch thể

2.4.9 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng diệt nấm gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt bằng dịch kháng sinh thô của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Chuẩn bị cây ớt có thời gian sinh trưởng như nhau, khỏe mạnh, thân, lá có kích thước tương đương nhau được trồng vào các thùng xốp có đục lỗ Chọn đất trồng cây ở các ruộng không có dịch bệnh ở vụ trước, không trồng các cây cà chua, đậu…Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có mật độ 105 tế bào /ml và dịch bào tử của nấm bệnh có mật độ 106 tế bào/ml

Thí nghiệm được tiến hành theo công thức sau:

+ Công thức 1: Cây đối chứng + dịch nuôi cấy không có các chủng xạ khuẩn

+ Công thức 2: Cây nhiễm dịch bào tử nấm gây bệnh thán thư + dịch nuôi

cấy không có các chủng xạ khuẩn

+ Công thức 3: Cây nhiễm dịch bào tử nấm gây bệnh thán thư + dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn tuyển chọn

+ Công thức 4: Cây nhiễm dịch bào tử nấm gây bệnh héo vàng + dịch nuôi

cấy không có các chủng xạ khuẩn

+ Công thức 5: Cây nhiễm dịch bào tử nấm gây bệnh héo vàng + dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Mỗi thùng xốp thí nghiệm được tưới 20 ml các dịch nuôi cấy Mỗi công thức 30 cây, với 3 lần lặp lại Đánh giá tỷ lệ cây bị bệnh và chiều cao cây sau 7 ngày

2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phân lập các chủng vi nấm gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt

(Capsicum frutescens L.)

Từ 60 mẫu bệnh thán thư và héo vàng thu thập ở các giai đoạn phát triển khác

nhau trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) tại thôn Lộc Mỹ, xã Hòa Bắc, huyện Hòa

Vang, TP Đà Nẵng được phân lập trên môi trường chọn lọc Dựa vào cẩm nang chẩn đoán bệnh cây Việt Nam [4], Vũ Triệu Mân [19], khóa phân loại của Brian C Sutton (1998) [37], Keith Seifert (1996) [52], và S B Marthu Olga Kongsdal (2000) [59] đã phân lập được 9 chủng nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt

Trên môi trường chọn lọc, các chủng nấm mốc gây bệnh có đặc điểm chung như sau:

Có hệ sợi khí sinh màu trắng, phát triển mạnh mẽ, các sợi nấm có cấu tạo dạng sợi giống sợi chỉ, phân nhánh, phát triển xuyên qua bề mặt ký chủ, có khả năng sinh bào tử…

Tạm ký hiệu 9 chủng nấm mốc gây bệnh là NB1 đến NB9 Trong đó các chủng nấm ký hiệu NB1 đến NB4 được phân lập từ các mẫu ớt bị bệnh thán thư, chủng nấm NB5 đến NB9 được phân lập từ các mẫu ớt bị bệnh héo vàng

Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Tỷ lệ mẫu có nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trong tổng số mẫu phân lập ở các giai đoạn sinh trưởng, phát triển trên cây ớt (Capsicum

frutescens L.)

Bệnh

Ký hiệu chủng

nấm bệnh

Mẫu có nấm bệnh/ Tổng số mẫu phân lập ở các giai đoạn

sinh trưởng, phát triển của cây ớt

Giai đoạn cây con Giai đoạn ra hoa Giai đoạn tạo quả

Số lượng (mẫu bệnh)

TLB (%)

Số lượng (mẫu bệnh)

TLB (%)

Số lượng (mẫu bệnh)

TLB (%)

Hình 3.1 Tỷ lệ % nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.)

qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển

Hình 3.2 Tỷ lệ % nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens

L.) qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển

Qua kết quả bảng 3.1, hình 3.1, hình 3.2 và quá trình điều tra ngoài đồng ruộng cho thấy đối với một triệu chứng bệnh trên cây ớt là do nhiều tác nhân nấm bệnh gây ra, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Burgess và cộng sự [4], Vũ

Triệu Mân [19], Burgess và Summerll [38] về thành phấn nấm gây bệnh trên cây trồng Ở các giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau của cây ớt thì nấm bệnh gây hại ở các mức độ khác nhau như sau:

+ Đối với bệnh thán thư trên cây ớt các nấm gây hại chủ yếu ở giai đoạn tạo quả chiếm 65%, còn ở giai đoạn cây con mức độ gây hại chỉ chiếm 25% và giai đoạn ra hoa là 30% Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu (Vũ Triệu Mân (2007) [19], Trần Thị Miên (2008) [21], J Zhejiang (2008) [50], P P Than và cộng sự (2007) [57]) về mức độ gây hại của các loại nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt Theo các nghiên cứu thì nấm gây bệnh thán thư đã làm ảnh hưởng đáng kể đến năng suất và phẩm chất ớt, đặc biệt chúng gây hại nghiêm trọng ở giai đoạn cây tạo quả, kể cả ở giai đoạn sau khi thu hoạch

+ Đối với bệnh héo vàng trên cây ớt thì tỷ lệ bị bệnh cao hơn ở giai đoạn cây ra hoa (44%), tỷ lệ bệnh thấp hơn ở giai đoạn cây con (20%) và tạo quả (32%) Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu về nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Hashira

và cộng sự (1990) [43], Javis và cộng sự (1994) [48], Paranya Chayyawat và cộng

sự (2008) [56]) Tuy nhiên theo nghiên cứu của Elizabeth M Lamb và cộng sự năm

1999 thì nấm gây bệnh héo vàng chỉ gây hại ở giai đoạn cây con và ra hoa, không gây hại ở giai đoạn tạo quả [40], còn theo nghiên cứu của Phạm Đình Quân (2009) tại Hải Dương [25] thì bệnh héo vàng chỉ gây hại ở giai đoạn ra hoa và tạo quả, ở giai đoạn cây con không bị ảnh hưởng

+ Tần suất xuất hiện của các chủng nấm NB1 gây bệnh thán thư và NB6 gây bệnh héo vàng cao hơn các chủng nấm bệnh còn lại, vì vậy chúng tôi chọn 2 chủng nấm này cho các nghiên cứu tiếp theo

Kết quả điều tra và phân lập các chủng nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt cho thấy các triệu chứng bệnh như sau:

 Triệu chứng bệnh thán thư cây ớt

Triệu chứng bệnh thường là vết loét điển hình nhỏ hoặc to được hình thành trên

lá và quả, đôi khi ở trên thân Một số trường hợp bệnh phát triển như một đốm màu hơi đỏ tía hoặc nâu mà không có sự hình thành vết bệnh rõ ràng Thân và cuống lá

có thể bị tróc vỏ, cụm hoa bị tàn lụi và chết đen khi bệnh phát triển mạnh Khi bệnh lây nhiễm lên cây con có thể gây hiện tượng chết rạp cây con Vết bệnh thường có