Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) trên môi trường nuôi cấy lỏng.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH ------ NGUYỄN THỊ THU HIỀN Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng Dendrobium draconis Rchb.f trên môi trường nuôi cấy lỏ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH

- -

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) trên

môi trường nuôi cấy lỏng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AIA : axit indol axetic

BA : 6 – benzyl adenine BAP : 6 – benzyl aminopurine

2,4 – D : diclorophenoxyacetic acide ĐHQG – HCM : Đại học Quốc gia – Hồ Chí Minh

GA : gibberellic acid IAA : indole 3 – acetic acide IBA : indol 3 – butyric acide

DANH MỤC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân nhanh

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân

3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh protocorm

3.4 So sánh khả năng nhân nhanh protocorm lan nhất điểm hồng

3.5 Ảnh hưởng của KIN, BAP, IBA đến khả năng nhân chồi in

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa vào đến khả năng nhân

3.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân

3.4 So sánh khả năng nhân nhanh protocorm lan nhất điểm hồng

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2.1 Lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) 16

3.1 Protocorm phát sinh sau 15 ngày nuôi cấy với lượng mẫu nuôi

3.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân nhanh protocorm

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy 25 3.4 Protocorm lan nhất điểm hồng sau 15 ngày nuôi cấy 27 3.2 Nhân chồi in vitro lan nhất điểm hồng sau 60 ngày nuôi cấy 28

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, hoa lan đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên Thế giới Đặc biệt là các nước thuộc châu Á nhiệt đới như Thái Lan, Singapore, Philippin, Indonesia…Thái Lan là một nước điển hình về nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan [6] Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm Các loài lan rừng Việt Nam là những thành phần quan trọng trong cấu thành các hệ sinh thái của rừng Việt Nam tạo nên cho Việt Nam thành một trong những vùng phân bố các loài lan quý của Thế giới [6] Tuy nhiên thời gian gần đây hệ sinh thái rừng Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng dẫn đến việc thu hẹp nơi sinh sống của các loài lan rừng cũng như việc khai thác quá mức làm cho nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng cục bộ

Bằng các kĩ thuật nuôi cấy như phương pháp nuôi cấy ngập chìm trong điều

kiện vô trùng các bộ phận của cơ thể thực vật, phương pháp nuôi cấy in vitro ngập

chìm cho ra số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền một cách nhanh chóng, đồng thời còn bảo tồn và phục hồi được các loài cây quý hiếm có hiệu quả Ứng dụng kĩ thuật này vào sản xuất không những sẽ giải quyết được vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học mà còn mở ra một hướng mới cho sản xuất và kinh doanh cây trồng nhất là các loài cây dược liệu, hoa kiểng,…

Trong số những giống lan ở nước ta như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… thì Dendrobium là một chi lớn và có giá trị kinh tế cao Nhất điểm hồng (Dendrobium draconis Rchb.f) là loài lan thuộc chi Dendrobium Đây là một loài lan đẹp, nằm trong sách đỏ Việt Nam và có giá trị

kinh tế cao

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis

Rchb.f) trên môi trường nuôi cấy lỏng”

2 Mục đích của đề tài

Xây dựng quy trình nhân nhanh lan nhất điểm hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy

in vitro trên môi trường lỏng

3 Nội dung đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện và môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân protocorm của lan nhất điểm hồng: lượng mẫu (protocorm) nuôi cấy ban đầu, tốc độ lắc, hàm lượng đường sucrose

- So sánh khả năng nhân nhanh protocorm trên môi trường lỏng và môi trường đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất KTST (BAP, KIN, IBA) lên khả năng nhân chồi từ protocorm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về lan Dendrobium

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Giống lan này được đặt tên vào năm 1799 Chữ Dendrobium có nguồn gốc của chữ Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sống, vì tất cả các loài của Dendrobium đều là phụ sinh bám trên cây gỗ Dendrobium rất phong phú về

chủng loại, loài này lớn thứ hai trong họ lan với khoảng 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc nhiệt đới châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Úc châu

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng có nhiều loài chỉ mọc

và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian và cũng có loài thích nghi với bất kì điều kiện khí hậu nào [4]

1.1.3 Đặc điểm về hình thái

Dendrobium là loại đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang

một thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có nhiều mắt ngủ Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hoa hay từng hoa đơn độc Hoa có màu trắng, vàng đến tím [4]

Dendrobium được chia làm hai nhóm chính theo dạng thân của chúng: dạng thòng hay Nobile là dạng thân mềm thường ở vùng hơi lạnh như Đà Lạt; dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có khí hậu nóng hơn [4]

Hình dạng Dendrobium cũng rất biến thiên: nhóm có giả hành rất dài và

mang lá dọc theo chiều dài của giả hành ấy, thường rụng hết lá khi ra hoa như Long

Tu (Dendrobium primulinum), Ý Thảo (Dendrobium grastio sisimum)…; nhóm giả

hành to, ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá dài, bền, không rụng Hoa tập trung ở phần

này tạo thành chùm đứng hay thòng như Thủy Tiên trắng (Dendrobium farmeri), Thủy Tiên vàng (Dendrobium thyrisflorum)… Nhóm giả hành rất mảnh mai, dài

hay ngắn, có lá mọc theo chiều dài của chúng, dai, bền, không rụng Hoa thường cô

độc ở nách như Hương Duyên (Dendrobium revolutum)…

1.2 Vài nét về lan nhất điểm hồng

1.2.1 Nơi phân bố

Nhất điểm hồng Dendrobium draconis do mục sư C.P.S Parish tìm ra ở Miến

Điện vào năm 1862 Cây lan này mọc khắp Đông Nam Á Tại Việt Nam lan mọc ở

Đà Nẵng, Nha Trang, Langbian, Đà Lạt, Sông Bé, Lộc Ninh Theo sách của Phạm Hoàng Hộ và Trần Hợp đều gọi là nhất điểm hồng [1]

1.2.2 Đặc điểm thực vật học

Đây là một giống phong lan cao chừng 40 cm có 7-9 đốt với vỏ bọc đầy lông đen Hoa nở vào mùa Xuân, màu trắng, trong họng có màu đỏ hay đỏ cam, ngang to 6-7 phân, thơm như mùi cam, quýt, lâu tàn mọc từ các đốt gần ngọn của thân cây năm trước [5] Cây mọc ở trên núi, thích hợp với thời tiết mát mẻ, có thể sống ở chậu hoặc trên các giá thể

1.2.3 Hiện trạng và những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng

1.2.3.1 Hiện trạng

Thuộc loài lan quý hiếm nằm trong sách đỏ Việt Nam

1.2.3.2 Những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng

Rangsayatorn và cs nghiên cứu việc bảo tồn giống Dendrobium draconis từ

hạt sau đó tạo protocorm rồi chuyển thành chồi Kết quả cho thấy ở môi trường Vacin và Went bổ sung 200 ml/l nước dừa là phát triển tốt nhất, số lượng chồi phát triển là tốt nhất [21]

Rangsayatorn nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi lan nhất điểm hồng trên chồi với môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 1mg/l NAA [20]

Phan Hùng Vĩnh và cs nghiên cứu nhân giống in vitro lan nhất điểm hồng (Dendrobium draconis) một loài lan rừng quý hiếm [18]

Lê Thị Nhung nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi in vitro lan Nhất Diểm Hồng (Dendrobium dranconis Rchb.f) trên môi trường lỏng [6]

Nhìn chung những nghiên cứu về lan nhất điểm hồng trên Thế giới chưa nhiều và chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam Những nghiên cứu này chỉ là những nghiên

cứu bước đầu ở một số tổ hợp môi trường và chưa nghiên cứu toàn diện để tìm ra môi trường tối ưu cho việc nhân giống loài lan này bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3 Tình hình nuôi trồng, sản xuất hoa lan trên Thế giới và Việt Nam

1.3.1 Tình hình nuôi trồng và sản xuất hoa lan trên Thế giới

Ở châu Á, hoa lan được biết đến và đưa vào nuôi trồng từ rất sớm Đến thế kỉ

20, người Anh đến Singapore mở đầu cho một giai đoạn mới là lập trại nuôi trồng hoa lan và kỹ thuật nuôi trồng lan Các giống lan được nuôi trồng ở đây là: Arachnis, Vanda, Oncidium…đồng thời lai tạo các loài mới

Đầu thế kỷ 20, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ bằng nhiều nấm cộng sinh có từ cây lan mẹ bắt đầu mở ra một giai đoạn mới Với những kĩ thuật nhân giống bằng hạt đã mở ra khả năng phát triển về ngành lan ở Châu Âu cũng như Thế giới

Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy mô ngày càng lớn phục vụ cho việc xuất khẩu Các loài lan rừng, lan lai, lan cắt cành của Thái Lan được xuất khẩu qua nhiều nước trên Thế giới Có thể nói Thái Lan là một nước điển hình cho ngành nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan ở các nước Châu Á Công nghiệp sản xuất, xuất khẩu hoa lan ở Thái Lan được bắt đầu từ Thong Lor Rakhpa Busobat ở Bangkok Sau những thành công của Thong Lor thì việc sản xuất

và kinh doanh hoa lan rộng sang Ấn Độ, Sri Lanka, Philippin đã lần lượt đến Thái Lan học hỏi kinh nghiệm sản xuất và kinh doanh hoa lan

Mọi kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng hoa lan đã trở thành một bộ phận chủ yếu nhất của ngành trồng hoa cảnh xuất khẩu của nhiều nước Việc nuôi trồng để xuất khẩu hoa lan hiện nay ở nhiều nước đã đạt đến số lượng hàng trăm ngàn giò lan và cành lan mỗi năm Nhu cầu trồng hoa lan trên quy mô công nghiệp ngày càng phát triển Ở nhiều nước các nhà nuôi trồng hoa lan nghiệp dư và chuyên nghiệp đã lập ra các hội hoa lan ngày càng nhiều Đã có hơn 400 hội hoa lan trên Thế giới có nhiều chuyên sang về hoa lan đã được xuất bản Nhiều cuộc hội thảo về hoa lan quốc tế được tổ chức [4]

Trung Quốc là nước có tốc độ phát triển về lan khá nhanh Đầu thập kỷ 80, Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan hồ điệp Năm 2002 sản lượng lan hồ điệp của Trung Quốc là ba triệu cây, chủ yếu ở Quảng Đông, Phúc Kiến, Bắc Kinh, Vân Nam, Sơn Đông,… bao gồm 50 – 60 xí nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng Đông có hơn 10 công ty sản xuất khoảng 1,2 triệu cây (chiếm 40% sản lượng lan hồ điệp của Trung Quốc) Cùng với mức sống ngày càng cao của người dân thì nhu cầu

về hoa cũng ngày càng tăng, diện tích trồng hoa ngày một tăng và nghề trồng lan hồ điệp đã trở thành con đường làm giàu chắc chắn cho nhiều công ty và doanh nghiệp

ở Trung Quốc [4]

Thị trường xuất khẩu hoa lan trên Thế giới ngày càng mở rộng Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành trên Thế giới năm 2000 đạt 150 triệu USD trong đó Nhật Bản là một trong những nước nhập khẩu hoa lan cắt cành số một Thế giới, thứ hai là Ý, tiếp đến là Pháp, Đức đứng thứ 4 và thứ 5 là Mỹ, ở các nước đứng thứ 6 đến 17 lần lượt là: Anh, Hà Lan, Áo, Bỉ, Hy Lạp, Ba Lan, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Canada, Phần Lan, Đan Mạch, Thụy Sĩ…

Thị trường xuất khẩu hoa lan hiện nay rất lớn và đầy triển vọng Ngày nay người tiêu dùng có xu hướng mua hoa lan có giá thành hạ mà không cần biết xuất

xứ vì vậy thị trường hoa lan Thế giới luôn có chỗ cho những quốc gia miễn là hạ giá, hoa bền lâu, màu sắc đúng thị hiếu của đa số người tiêu dùng [4]

1.3.2 Tình hình nuôi trồng và sản xuất hoa lan ờ Việt Nam

Riêng về hoa lan, các loại hoa lan rừng đẹp đến mức độ lộng lẫy đã đến với người dân Việt Nam từ xa xưa Hoa lan đến với người Việt Nam từ những bông hoa đẹp, những vị thuốc chữa bệnh được lưu truyền trong dân gian từ đời này qua đời khác cho đến ngày nay Hoa lan là một loại hoa quý, đối với người Việt Nam, hoa lan tượng trưng cho sự trong sạch, thanh cao Sự hiểu biết về hoa lan còn ít và những người chơi lan trước đây chủ yếu là những người giàu có, những nho sĩ, những cụ già nhàn rỗi [4]

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm phù hợp với sinh thái của các loài hoa lan, nhưng bối cảnh lịch sử của nền kinh tế còn chưa phát triển nên hầu như các cây lan

ở Việt Nam chỉ dừng lại ở dạng trồng để thưởng thức Việc nuôi trồng, kinh doanh

hoa lan như các nước Châu Âu và Châu Á phát triển chưa được quan tâm đúng mức

Vấn đề kinh doanh xuất khẩu hoa lan đối với Việt Nam cho đến ngày nay vẫn đang ở giai đoạn đầu Việt Nam có hai miền Nam, Bắc có khí hậu khác nhau rõ rệt Miền Bắc có mùa đông lạnh và có bão, miền Nam khí hậu ôn hòa, ấm áp Vì thế

để sản xuất lan kinh doanh ở miền Bắc chỉ thích hợp với việc trồng các loại lan chủ yếu khai thác từ các loại lan rừng và nuôi trồng với số lượng ít để trưng bày thưởng thức, còn vấn đề nuôi trồng trên quy mô công nghiệp không thích hợp, do có bão dấn đến giá thành cao, hiệu quả kinh tế kém

Hiện nay, hàng năm vào dịp Tết Nguyên Đán, Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đều mở hội hoa xuân trong đó có trưng bày nhiều loại hoa lan Việc tổ chức chấm thi hoa lan, trao giải, trao huy chương cho các nghệ nhân nuôi trồng hoa lan

có hoa lan đẹp diễn ra thường kì, có tác dụng kích thích người trồng hoa lan, phong trào nuôi trồng hoa lan ngày càng phát triển và nuôi trồng hoa dần dần bước sang giai đoạn kinh doanh, xuất khẩu Các công ty như công ty rau quả xuất khẩu Trung nông – Vegetexco và công ty thủ công mỹ nghệ tổng hợp xuất khẩu thành phố Hồ Chí Minh (Atex – Saigon) là những công ty tham gia xuất khẩu lần đầu tiên ở Việt Nam

Tại thành phố Hồ Chí Minh từ năm 1983 – 1984 bắt đầu có hàng loạt các cơ quan đóng tại thành phố tổ chức thử nghiệm nuôi trồng trên quy mô lớn để xuất khẩu Các vườn lan đáng kể là vườn lan T78, vườn lan của Cục Quản lý giáo dục

Bộ tham mưu, vườn lan cửa hàng dân dụng

Về lan giống từ năm 1976, Trung tâm Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức phòng nuôi cấy phong lan và tạo ra hàng loạt cây con phong lan bằng phương pháp cấy mô

Năm 1987, Ủy ban khoa học thành phố Hồ Chí Minh tổ chức nghiên cứu đề tài và kinh tế kỹ thuật khoa học lan xuất khẩu Và cũng năm 1987, thành phố quyết định thành lập công ty phong lan xuất khẩu trực thuộc sở Lâm nghiệp Sau đó Hội hoa lan, cây cảnh thành phố ra đời, thường xuyên mở những hội thảo về lan, về cây cảnh [4]

Việc xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam chính thức được thực hiện vào năm 1980

do công ty Vegetexco sản xuất lan cắt cành Đà Lạt (Cymbidium) và các loại hoa khác như hoa lay ơn (Gladiolus communis L.), hoa ly Các công ty ở Việt Nam lần

đầu tiên cử đại diện đi dự hội nghị hoa quốc tế tổ chức tại Bratistava (Tiệp Khắc) và bắt đầu quan hệ với các công ty hoa Unicoop (Tiệp Khắc), Inovator (Hunggari) về hoa lan cảnh [4]

Tại Đà Lạt có khoảng 500 gia đình nuôi trồng hoa lan, trong đó có hơn 150 gia đình tham gia vào Hội hoa lan của thành phố Đà Lạt Ủy ban Khoa học Kỹ thuật của Đà Lạt, phòng Sinh học của Viện hạt nhân Đà Lạt cũng tham gia tích cực vào việc lập các cơ sở cấy mô phong lan và sưu tầm các loại lan Hiện nay Đà Lạt đã thu thập được 200 loài có khả năng nuôi trồng xuất khẩu

Đà Lạt hiện nay đang trở thành điểm thu hút các nhà đầu tư kinh doanh hoa

do sự thành công của các công ty nước ngoài đầu tư vào cách đây hơn 10 năm như Dalat Hasfarm chuyên trồng hoa ôn đới, công ty Lâm Thăng – Đài Loan chuyên về

Phalaenopsis (lan hồ điệp)

Vùng Sa Pa, Tam Đảo rất thích hợp cho việc trồng hoa ôn đới như hồng, lyly, lay ơn… Riêng hoa lan nhiệt đới, qua các năm 2003 – 2005 đã tăng từ từ 20 ha đến 50 ha (tăng 150%) Xu hướng tiêu dùng hoa lan đã tăng lên đáng kể và dự đoán

sẽ tăng mạnh trong những năm tới do Việt Nam đã trở thành thành viên của Tổ chức Thương mại Quốc tế WTO sẽ là yếu tố tăng mạnh đầu tư nước ngoài làm tăng các dịch vụ du lịch, tổ chức hội nghị quốc tế [4]

1.4 Sơ lược về nhân giống in vitro

1.4.2 Vai trò và ý nghĩa của nhân giống in vitro

Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật có vai trò và ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản cũng như đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

Về mặt lý luận, nuôi cấy mô đã mở ra khả năng lớn cho việc tìm hiểu kĩ lưỡng về bản chất của sự sống, mối tương tác giữa các bộ phận trong cây, tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển, từ đó tìm ra các biện pháp thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn Phương pháp nuôi cấy mô còn giúp chúng ta giải quyết nhiều vấn đề về bệnh

lý, giúp cho việc phòng bệnh thực vật tốt hơn [8]

Về mặt thực tiễn sản xuất, phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng, nhân nhanh các giống cây trồng và để chọn giống cây trồng Nuôi cấy mô còn

có triển vọng sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học, bằng phương pháp này chỉ sau một thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được một sinh khối lớn vẫn giữ nguyên thuộc tính của chúng, tức vẫn có khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp

Qua đó, chúng ta thấy ngoài ý nghĩa về mặt lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn và có vai trò hết sức quan trọng đối với thực tiễn sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Việc ứng dụng phương pháp này thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt [3]

1.4.3 Các điều kiện và môi trường ảnh hưởng đến hiệu quả nhân giống in vitro

1.4.3.1 Nguồn gốc của mẫu vật

Theo Nguyễn Hoàng Lộc quy trình nhân giống in vitro có 3 giai đoạn: cấy

gây, nhân nhanh, chuẩn bị ra đất và kết quả của việc cấy gây phụ thuộc vào nguồn gốc của mẫu vật Đỉnh sinh trưởng, chồi nách là nguồn mẫu vật quan trọng nhất, sau

đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá [10] Điều này được khẳng định trong nghiên cứu của Styer và Chin (1983), khi hai tác giả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu cây sạch bệnh Tuy nhiên kết quả cho thấy tỷ lệ thành công phụ thuộc vào đỉnh sinh trưởng của chồi ngọn hay chồi bên của cây

1.4.3.2 Độ lớn của mẫu vật

Trong việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì độ lớn của chồi có ý nghĩa rất lớn

Độ lớn của chồi có liên quan đến tỷ lệ sống và ổn định về mặt di truyền Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống, tính ổn định tăng và ngược lại [9]

1.4.3.3 Phương pháp khử trùng mẫu

Hầu hết các mô, cơ quan thực vật đều được nuôi cấy nhưng mức độ thành công phụ thuộc vào môi trường sử dụng, loài thực vật được nuôi và phương pháp khử trùng mẫu Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho lượng mẫu cấy vô trùng vẫn còn khả năng sinh trưởng

Hiện nay có rất nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng như: dung dịch thuốc diệt nấm, cồn 70%, hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, dung dịch brom, chlorur thủy ngân, thuốc kháng sinh,… Tùy vào đối tượng mà ta lựa chọn loại tác nhân vô trùng và thời gian khử trùng thích hợp [9]

1.4.3.4 Sự hóa nâu trong nuôi cấy

Một số loài thực vật, mẫu cấy có thể bị hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy (Basu và Chand, 1998; Mathur và Ahuja, 1991;…) Khi mẫu vật bị hóa nâu thì sự sinh trưởng của mẫu bị ức chế, nếu để lâu ngày mẫu sẽ chết

Sự hóa nâu của mẫu là kết quả của sự oxy hóa hợp chất polyphenol từ mẫu cấy Đây

là hợp chất tự nhiên được biết đến như một tác nhân ức chế sinh trưởng Có nhiều cách để ngăn cản hiện tượng này trong nuôi cấy in vitro và một trong những cách đó

là cấy chuyển mẫu sang môi trường mới hai tuần một lần (Mathur và cs, 1988; Rout

và cs, 1999), làm như vậy thì lượng lớn phenol không được tích tụ [8]

1.4.3.5 Ánh sáng, nhiệt độ

Ánh sáng là yếu tố cần thiết cho quá trình phát sinh chồi, rễ và phát sinh phôi

vô tính Cả chất lượng và cường độ ánh sáng đều rất quan trọng, liên quan đến sự thành công của nuôi cấy Ánh sáng đèn huỳnh quang thường được sử dụng: ánh sáng xanh đẩy mạnh phát sinh chồi; ánh sáng đỏ gây ra rễ của nhiều loài (Murashige, 1977) Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kì chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng) Thời gian

chiếu sáng thường 12 – 16h/ngày, cường độ 8 -12 Wm-2 Nhiệt độ nuôi cấy thường

250C, đối với cây nhiệt đới thì nền nhiệt cao hơn 27 – 300C (Tisserart, 1981)

1.4.3.6 Môi trường nuôi cấy cơ bản

Có hàng trăm loại môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau nhưng có thể phân làm ba loại gồm môi trường White, Knop; B5; MS Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng sẽ giúp mẫu nuôi cấy có khả năng tái sinh và hiệu quả nuôi cấy cao Hiện nay môi trường MS được sử dụng rộng rãi nhất [17]

1.4.3.7 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính:

Nhóm auxin: môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân

tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin – oxydase) không có tác dụng Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng [7]

Nhóm cytokinin: liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ

mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [7] Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào , sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy

mô như Zeatin và 2 – iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng Tỷ lệ

auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và

rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách [18]

1.4.3.8 Hàm lượng đường sucrose

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy việc đưa vào mt nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào)

và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước)

Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa và môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiêu quả kém hơn Sucrose trong khi khử trùng mt, bị biến đổi thành glucose và fructose Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau

đó là fructose Các carbonhydrate khác như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt

1.4.3.9 Tốc độ lắc trong nuôi cấy lỏng

Nuôi cấy lỏng lắc giúp tăng tối đa việc phát triển của mô qua việc loại trừ hiện tượng phân cực của nó; ngăn chặn các ức chế do mô tiết ra bằng cách hòa tan các chất này; giúp môi trường thoáng khí, qua đó sẽ hô hấp, tổng hợp protein hấp thụ muối khoáng của tế bào; môi trường lỏng sẽ gia tăng bề mặt tiếp xúc của mô đối với các chất dinh dưỡng Tốc độ lắc trong nuôi cấy lỏng liên quan nhiều đến khả năng tăng sinh tế bào Đó là bởi tốc độ lắc ảnh hưởng đến sự lưu thông trong bình nuôi cấy và nồng độ oxy hoà tan (DO) trong bình

1.4.3.10 Độ pH môi trường nuôi cấy ban đầu

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH: 5,0 – 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu

Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất sinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu Nuôi cấy callus của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 – 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 – 6,5 Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 – 6,5 Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc

1.5 Ứng dụng của nuôi cấy lỏng trong nhân giống in vitro và bảo tồn các loài

lan

1.5.1 Thế giới

Nghiên cứu của Guek Eng Sim và cs tại trường Đại học School of Chemical

and Life Sciences, Singapore Polytechnic về sự cảm ứng tạo hoa in vitro ở Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae) từ cây con Trong nghiên cứu này,

Guek Eng Sim phân tích mức độ và loại cytokinin nội sinh hiện diện trong mô của

D Madame Thong-In nuôi cấy dưới cả trạng thái sinh dưỡng và ra hoa Phương pháp thí nghiệm để cảm ứng tạo hoa ở D Madame Thong-In gồm có 3 bước chủ yếu Bước 1, bao gồm từ lúc hạt nảy mầm trong môi trường cơ bản đến lúc phát triển thành protocorm Bước 2, cây con cao từ 2-3 mm có một vài lá nhỏ được chuyển qua môi trường lỏng chứa BA (4,4 mg/l) và trong môi trường này cây con

đã chuyển sang giai đoạn sinh sản, một vài cây đã có thể sinh sản chồi hoa Bước 3,