Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hoá học của lá đu đủ đực (carica papaya (l )) bằng phương pháp sắc ký

Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học và ứng dụng của lá Đu đủ đực.. - Tổng hợp tài liệu về phư

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC

Đà Nẵng - 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: BÙI THỊ THÙY DUNG

Lớp : 14CHD

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hoá học của lá Đu đủ

đực(Carica papaya (L.) )”

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị:

- Nguyên liệu: Lá Đu đủ đực

- Dụng cụ, thiết bị: bộ chưng ninh, bình tam giác, cột sắc ký, bản mỏng sắc ký, đèn UV, cân phân tích, bếp cách thủy, tủ sấy, bình lắc, phễu chiết,…

3 Nội dung nghiên cứu:

- Chiết mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng nối tiếp với các dung môi hexane, dichlomethane và ethyl acetate

n Xác định thành phần hóa học trong cao tổng ethanol bằng phương pháp GC –

Chủ nhiệm khoa Giáo viên hướng dẫn

PGS.TS Lê Tự Hải TS Trần Mạnh Lục

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày tháng 04 năm 2018

Kết quả điểm đánh giá:……

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn đến

TS Trần Mạnh Lục đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ trong suốt quá trình thực

hiện đề tài và hoàn thành báo cáo

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn và các thầy cô phụ trách

phòng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã nhiệt tình

giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong thời gian vừa qua

Bước đầu làm quen với việc nghiên cứu nên bài báo cáo này không tránh khỏi

thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp, bổ sung của thầy cô để em

có thể thu nhận thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm cho bản thân sau này

Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong

cuộc sống cũng như sự nghiệp giảng dạy của mình Em xin chân thành cảm ơn

Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Thùy Dung

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 4

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC 4

1.2.1 Tên gọi 4

1.2.2 Mô tả thực vật 4

1.2.3 Phân bố 5

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5

1.5 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ 7

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 9

2.1.1 Thu mẫu và xử lý mẫu nguyên liệu 9

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 9

2.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 11

2.2.1 Phương pháp ngâm dầm 11

2.2.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng 11

2.2.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng 12

2.2.4 Phương pháp sắc ký cột 17

2.2.5 Định tính một số nhóm chất trong dịch chiết cồn 19

2.3 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 22

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 22

2.3.2 Ngâm dầm tạo tổng cao ethanol từ lá đu đủ đực 24

2.3.3 Chiết phân bố lỏng-lỏng bằng cao tổng ethanol 24

2.3.4 Phân lập phân đoạn bằng sắc ký bảng mỏng và sắc ký cột 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 KẾT QUẢ KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM CHIẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG-LỎNG 28

3.1.1 Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phương pháp ngâm chiết 28

3.1.2 Định tính thành phần nhóm chức cao chiết ethanol 29

3.2 KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG – LỎNG 33

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CAO TỔNG ETHANOL 35

3.4 KẾT QUẢ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN TỪ CAO TỔNG ETHANOL 37

3.4.1 Kết quả sắc ký bản mỏng cao ethanol 37

3.4.2 Kết quả chạy sắc ký cột phân lập cao ethanol 38

3.4.3 Kết quả chạy phân đoạn LĐ.EIII 41

3.4.4 Kết quả đo GC-MS của phân đoạn LĐ.EIII.1 46

3.4.5 Kết quả đo GC-MS của phân đoạn LĐ.EIII.3 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GC : Gas Chromatography

MS : Mass Spectrometry STT : Số thứ tự

TCCS : Tiêu chuẩn cơ sở

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

hình

1.2 Thân, lá, hoa và trái của cây Đu đủ đực 5

2.5 Bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy 16

3.3 Dịch chiết thu được với 3 dung môi n – hexane,

diclometan, etyl acetat

34

3.4 Sơ đồ tóm tắt quá trình chiết lỏng-lỏng từ cao ethanol 34

3.6 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với dung môi n-hexan,

chloroform, diclometan và etyl acetat (từ trái sang phải) soi

dưới đèn UV bước sóng 365 nm

37

3.7 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi chloroform

: diclometan theo các tỷ lệ 8:2; 6:4; 4:6; 2:8 (từ trái sang

phải) soi dưới đèn UV bước sóng 365 nm

38

3.8 Cột sắc ký cao ethanol sau khi nhồi cột và nạp mẫu(1), bắt

đầu rửa giải(2), trong quá trình rửa giải(3,4)

38

3.9 Sắc ký bản mỏng các bình số lẻ từ 1 đến 7 39 3.10 Sắc ký bản mỏng các bình số lẻ từ 8 đến 29 39 3.11 Sắc ký bản mỏng các bình số lẻ từ 31 đến 66 40 3.12 Sắc ký bản mỏng các bình số lẻ từ 67 đến 87 40 3.13 Sắc ký bản mỏng các bình số lẻ từ 88 đến 109 40 3.14 Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn LĐ.EI đến

LĐ.EIV (từ trái sang phải) soi dưới đèn UV bước sóng 365

3.23 Sơ đồ phân lập cao tổng ethanol 45 3.24 Sắc ký đồ GC của phân đoạn LĐ.EIII.1 46 3.25 Sắc ký đồ GC của phân đoạn LĐ.EIII.3 49

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các nguyên liệu từ thiên nhiên để làm thuốc chữa bệnh Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật hiện đại, con người có thể tổng hợp được nhiều hoạt chất có cấu trúc và tác dụng tương tự như các thành phần có nguồn gốc thiên nhiên Song, các loài thảo dược hiện nay vẫn chiếm một vị trí quan trọng trong việc điều trị các bệnh thông thường nhiều người mắc phải, cũng như các bệnh nan y mà Tây y chưa chữa được

Ở Việt Nam, sử dụng cây cỏ làm thuốc là một tập quán lâu đời Với điều kiện khí hậu của vùng nhiệt đới gió mùa, cây cỏ nước ta rất phong phú và đa dạng (khoảng

12000 loài), trong đó có nhiều loài cây cỏ được sử dụng làm thuốc chữa bệnh (khoảng

4000 loài) được lưu truyền sâu rộng trong nhân gian

Một trong những dược liệu quý chưa được nghiên cứu nhiều là cây Đu đủ đực

(Carica papaya) Loài Carica papaya ở Việt Nam còn gọi là Đu đủ

Cây Đu đủ có thể sử dụng tất cả các bộ phận để làm thuốc và nhiều giá trị sử dụng khác như: sử dụng quả Đu đủ làm thực phẩm, lá Đu đủ và hoa Đu đủ được sử dụng làm thuốc trong y học, … Người dân Việt Nam đã dùng lá Đu đủ chữa bệnh ung thư Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [3]

Gần đây, người dân địa phương ở Quảng Nam-Đà Nẵng sử dụng hoa cây Đu đủ đực để điều trị các bệnh về đường hô hấp như viêm họng, ho, mất tiếng, khản tiếng,…; các bệnh về hệ bài tiết như đái rắt, đái buốt, đau niệu đạo,…; chữa sỏi thận; tác dụng kích thích tiêu hóa Ngoài ra, hoa Đu đủ đực còn được coi như thần dược để hỗ trợ điều trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, ưng thư vú và ung thư gan,…[4, 10]

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây Đu đủ đực đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện Tuy nhiên, tại Việt Nam các quy trình chiết tách và xác định thành phần hóa học, cấu trúc của các hợp chất chính trong lá Đu đủ đực vẫn còn rất ít

và chưa toàn diện

Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học của lá Đu đủ đực để tìm hiểu hoạt chất có tác dụng chữa bệnh, chứng minh cho hoạt tính của cây là công việc rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Từ những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách và xác

định thành phần hoá học của lá đu đủ đực (Carica papaya (L.)”, với mục tiêu đóng góp

một phần tư liệu vào hệ thống các công trình khoa học về loài cây này

2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá Đu đủ đực mua tại cơ sở bán nguyên liệu nghiên cứu tại Đà Nẵng

2.2 Mục đích nghiên cứu

- Tìm các điều kiện chiết tách thích hợp các chất từ lá Đu đủ đực bằng các dung môi phân cực khác nhau

- Phân lập, xác định thành phần hóa học của cao chiết ethanol từ lá Đu đủ đực

- Đóng góp thêm thông tin, tư liệu khoa học về loài Đu đủ, tạo cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu về sau

3 Phương pháp thực hiện nghiên cứu

3.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học và ứng dụng của lá Đu đủ đực

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách, phân lập và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật

3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Ngâm chiết chưng ninh bằng dung môi ethanol 80

- Chiết lỏng - lỏng bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau

- Phân lập cao ethanol 80 bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng

- Dùng phương pháp khối phổ (GC-MS) để xác định các chất trong cao chiết ethanol và phân đoạn của cao tổng ethanol

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Những kết quả có được trong đề tài nghiên cứu này sẽ là một nguồn tư liệu có ý nghĩa trong việc cung cấp thông tin về thành phần hóa học các cấu tử được chiết tách

từ loài Carica papaya, qua đó nâng cao giá trị ứng dụng của chúng trong ngành dược

liệu

5 Bố cục đề tài

Cấu trúc đề tài như sau:

Mở đầu (3 trang, từ trang 1 đến trang 3)

Chương 1: Tổng quan (5 trang, từ trang 4 đến trang 8)

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang, từ trang 9 đến trang 27) Chương 3: Kết quả và thảo luận (24 trang, từ trang 28 đến trang 51)

Kết luận và kiến nghị (2 trang, từ trang 52 đến trang 53)

Tài liệu tham khảo (2 trang, từ trang 54 đến trang 55)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

Họ Đu đủ (danh pháp khoa học: Caricaceae, đồng nghĩa: Papayaceae) ) trên thế

giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở nước ta

có 1 chi và một loài, đa số là các loài cây bụi hay cây gỗ nhỏ thân xốp và mập, thường xanh, tuổi thọ thấp, cao tới 5–10 m Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu

đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất, [1]

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

1.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Carica papaya

Tên thông thường: Đu đủ đực hay Đu đủ

Theo phân loại thực vật [8]:

- Giới: Plantae (Giới Thực vật)

- Bộ: Brassicales (Bộ Cải hay Mù tạc)

Hình 1.1 Tiêu bản cây Đu đủ

[8]

trứng to dài 20-30 cm, đườngkính 15-20 cm Thịt quả dày, lúc đầu có màu xanh lục, sau ngả màu vàng cam Trong ruột có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp nhầy[3]

Hình 1.2 Hình ảnh thân (a), lá (b), hoa (c) và trái (d) của cây Đu đủ đực

1.2.3 Phân bố

Cây Đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng

nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, Đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi

có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C Sản lượng Đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [5]

Ở Việt Nam, cây Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Tuy nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000-17000 hecta với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [5]

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

 Các enzyme (enzymes): Nhựa chứa khá nhiều enzyme như papain, chymopapain, papaya glutamine cyclotransferase, glutaminyl-peptide-cyclotransferase, chitinase, papaya peptidase A và B, alpha-D_mannosidase và N-acetyl-beta-D-glucosaminidase Quả chứa beta-galactosidase I, II và III, và 1-amino cyclopropane-1-carboxylase (ACC) oxidase, phenol-D-glucosyltransferase

 Carotenoid: Trong đu đủ chín có 19 carotenoid, chủ yếu là cryptoxanthin (48%), beta carotene (30%) và cryptoflavin (13%),violaxanthin và zeaxanthin

 Alkaloid: Lá chứa carpinin carpain; ruột thân có pseudo carpain

 Monoterpenoid: Quả chứa 4-terpineol, linalool và linalool oxid

 Flavonoid: Chồi non chứa quercetin, myricetin và kaempferol

 Các khoáng chất và vitamin: calcium, sắt,magiê, phốt pho, kali, natri, kẽm,đồng, mangan, thiamine (B1), beta caroten (tiền vitamin A), riboflavine(B2), niacin (B3), pantothenic Acid (B5) ascorbic acid (C), vitamin E, riêngchồi còn có alpha tocopherol

 Glucosinolat: Trong hạt có benzyl isothiocyanate

 Dầu béo của hạt chứa 16,97% acid béo bão hòa (gồm 11,38% palmitic,5,25 % stearic, 0,31% arachidic acid) và 78,63% acid béo chưa bão hòa(76,5% oleic và 2,13% linoleic)[3]

1.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÂY ĐU ĐỦ

1.4.1 Trong đời sống

 Dưỡng sinh với Đu đủ

Đu đủ chín có quanh năm và mùa nào dùng cũng tốt cho sức khoẻ Vào mùa hè,

ăn Đu đủ có tác dụng thanh tâm, nhuận phế, giải nhiệt, giải độc Vào thu đông, Đu đủ giúp nhuận táo, ôn bổ tỳ vị, dưỡng can, nhuận phế, chỉ khái, hoá đàm[14]

 Làm đẹp với Đu đủ

Đu đủ rất giàu enzyme tự nhiên, dễ dàng thấm sâu vào làn da giúp đẹp da, mau lành các tổn thương trên da Đu đủ cũng có tác dụng tẩy tế bào da chết, hồi phục sự tươi trẻ cho làn da[14]

 Chữa bệnh với Đu đủ

Trong Đu đủ có chứa rất nhiều loại enzim, ví như enzim papain rất tốt cho tiêu hoá, giúp tiêu hoá các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn Đối với những bệnh nhân mắc bệnh celiac (một loại bệnh mà không thể tiêu hoá protein trong lúa mì, hay gliandin) thì có thể ăn đu đủ xanh để chữa căn bệnh này[14]

1.4.2 Trong Y học

Dưới đây là một số tác dụng chữa bệnh trong Y học của cây Đu đủ

 Lá Đu đủ phòng ngừa ung thư

Trong lá Đu đủ có chứa chất papain, có khả năng thủy phân chất đạm, trung hòa các độc tố, tăng cường hệ miễn dịch đồng thời chống lại sự phát triển của khối u[15]

 Hạt Đu đủ

Hạt Đu đủ rất dồi dào hàm lượng axit oleic và palmitic Các loại axit béo có trong hạt đu đủ cũng được cho là giúp cho cơ thể của chúng ta phòng chống bệnh ung thư, giúp gan, thận khỏe mạnh

Hạt Đu đủ cũng thể hiện ưu điểm vượt trội của mình trong việc loại bỏ các ký sinh trùng đường ruột ra khỏi cơ thể nhờ hàm lượng enzyme cao, một chất phân giải protein giúp phân hủy ký sinh trùng và trứng của chúng, cũng như các protein không tiêu hóa được hết trong các loại thực phẩm mà bạn ăn[15]

1.5 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ

1.5.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đu đủ trong nước

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [6]

Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên khảo sát thành phần hóa học của hoa Đu đủ đực Kết quả cho thấy sự có mặt của alcaloid, este, acid béo, một số sterol trong hoa Đu đủ đực thu hái tại Đà Nẵng [2]

Năm 2017, Lê Thị Thanh Phương đã phân lập được 2 hợp chất Kaempferol và β-sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform trong hoa Đu đủ đực thu hái trên địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng [4]

1.5.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đu đủ ngoài nước

Trên thế giới, năm 1965, Govindachari T.R., Nagarajan K và Viswanathan N

đã xác định được cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alcaloid được phân lập từ

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong

lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất như sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [9]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu mẫu và xử lý mẫu nguyên liệu

Nguyên liệu mua được tại cơ sở bán nguyên liệu nghiên cứu tại Đà Nẵng, tháng 7/2018, xay thành bột mịn

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1 Các hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng

STT Hệ dung môi(tỉ lệ thể tích) Kí hiệu

Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 và 365 nm, sau

đó phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100C, để phát hiện các hợp chất

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 230 - 400 mesh (0,063 – 0,200 mm)

Cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh, phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm khác

Bảng 2.2 Các hóa chất đã sử dụng

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc

5 Dung dịch H2SO4 (98%) Tinh khiết TCCS Trung Quốc

6 Dung dịch HCl đậm đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc

9 Dung dịch NH4OH Tinh khiết TCCS Trung Quốc

12 Dung dịch Formol 36% Tinh khiết TCCS Trung Quốc

b Thiết bị nghiên cứu

- Đèn UV bước sóng 254 và 365 nm

2.2.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng

a Mục đích

Sau khi chưng ninh 2kg nguyên liệu với dung môi ethanol 80 dung dịch thu được đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia dung dịch ethanol ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

b Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Hình 2.4 Phương pháp chiết lỏng lỏng

Nguyên tắc: là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K[7]

K= Ca/ Cb Trong đó:

Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

 Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Có độ tinh khiết cao

- Hòa tan tốt các chất được chiết

- Không hòa tan lẫn với dung môi cũ, nghĩa là có tỉ khối khác nhiều với dung môi

cũ

- Không tương tác với chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:

- Ảnh hưởng của quá trình chiết

- Vai trò của sự tạo phức

- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan

2.2.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Phương pháp này được Izmailop và Schereiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi

a Nguyên tắc

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi

để bán định lượng hoặc định lượng các hoạt chất thuốc Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc

đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả là ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sang lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển

Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf=a/b

Trong đó:

a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu

b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm

Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1

 Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên Nó cũng được các nhà hóa học tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được trong phản ứng

 Nhược điểm của kỹ thuật:

- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển

- Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi

- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn

- Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20ml hoặc các ống mao quản

- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín

c Lựa chọn dung môi giải ly

Chọn dung môi triển khai phụ thuộc vào mẫu cần tách Với mẫu chưa biết thành phần, chưa có tài liệu tham khảo cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến phân cực

 Cách xác định nhanh loại dung môi phù hợp với mẫu:

Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng nhau, đều nhau trên cùng một bản mỏng, các vết chấm cách nhau 1 cm Dùng những vi quản để đưa các dung môi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết mẫu một loại dung môi khác nhau Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo thành vòng tròn Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi Quan sát các vòng tròn đồng tâm: dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực, dung môi nào vẫn nằm tại chỗ là dung môi đó không đủ phân cực

Để dễ quan sát hơn, nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc ký bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân cực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, methanol Chuẩn

bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất như nhau rồi nhúng mỗi tấm vào một bình như đã chuẩn bị Ghi nhận độ di động của các cấu tử trong mẫu:

 Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì dung môi đó chưa đủ phân cực (dung môi không phù hợp)

 Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực (dung môi không phù hợp)

 Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung môi đó phù hợp

 Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống dung môi đơn không có những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi

d Chấm bản

Trước khi chấm mẫu lên bản phải dùng bút chì vót nhọn vạch đường mức xuất phát cách đáy khoảng 1cm và vạch đường kết thúc cách đầu bản 0,5cm Mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp Nếu mẫu là chất rắn, lấy 1 mg mẫu đặt lên mặt kiếng đồng

hồ hoặc đựng trong một ống nghiệm nhỏ, hòa tan mẫu với vài giọt dung môi dễ bay hơi như acetone Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn

sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên trên bản mỏng tại một điểm cách đáy khoảng 1 cm (điểm này phải ở vị trí sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm này vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình) Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏng để không nhìn thấy lỗ bề mặt Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi về mặt thật nhanh để dung dịch thấm mẫu vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh, không lan thành vết chấm to Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần để

có vết đậm, rõ, đường kính không quá 2mm Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm

e Chuẩn bị bình triển khai

Hình 2.5 Bình triển khai dạng hình khối trụ có nắp đậy

Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng một ít Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5-0,7 cm Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình nhờ vào lớp giấy lọc Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào dung môi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận

để hai cạnh bên không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm

Đậy nắp bình, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực mao dẫn Theo dõi khi dung môi lên đến vạch kết thúc đã được vạch sẵn thì lấy bản ra khỏi bình Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát bằng mắt và dùng bút chì khoanh nhẹ các vết thấy được Còn nếu không thấy gì trên bản, có thể nhìn dưới đèn tử ngoại (UV), bằng hơi iod hoặc phun bản với thuốc thử hiện hình thích hợp

f Cách hiện hình các vết sắc ký

Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằng các phương pháp hóa học và vật lý phù hợp

Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử

có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường

Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia

tử ngoại Ngoài ra có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu

tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ

2.2.4 Phương pháp sắc ký cột

a Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn, tiếp theo cho cát phủ lên để có được một mặt bằng phẳng

Chất hấp thu dạng sệt được chuẩn bị như sau: Trong một becher đã có sẵn dung môi, cho chất hấp thu vào becher đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng Lưu ý không được thực hiện ngược lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không được quá loãng

Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa bên dưới cột để dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại trên đầu cột

Tiếp tục rót hỗn hợp chất hấp thu vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng thanh cao su gõ nhẹ vào ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột

Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt lớp chất hấp thu để làm xáo một phần chất hấp thu trên đầu cột, để yên cho chất háp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng

Đối với chất hấp thu có thể trương nở, cần có thời gian để gel trương nở Thường ta thêm đủ lượng dụng môi để làm thành hỗn hợp sệt có thể rót chảy để rót vào cột

b Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất

có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột qua phễu thủy tinh có đuôi dài Cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao 2cm trong cột thì mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại lên đầu cột

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu ở trong cột có dạng đồng nhất

c Nạp mẫu chất ở dạng bột khô

Trong bình cầu để cô quay chân không, mẫu cần sắc ký được hòa tan trong dung môi thích hợp, cho thêm silicagel vào từ từ một lượng vừa đủ và trộn đều Hỗn hợp này được cô quay chân không cho đến khi bột silicagel khô, khi đó mẫu cần sắc ký sẽ được gắn chặt lên bề mặt hạt silicagel

Đặt mẫu bột khô lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột) cho lên đầu cột để thấm ướt phần bột mẫu khô, cho thêm một lớp silicagel sạch lên trên mặt thoáng của mẫu để bảo vệ bề mặt mẫu Cho dung môi giải ly vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly

d Dung môi giải ly

Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỷ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn

Giải ly có nồng độ tăng dần: đôi khi việc sử dụng một dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột Nếu muốn lấy chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có lực

mạnh hơn Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm “gãy’ cột Cột “gãy” sẽ làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được

e Theo dõi quá trình giải ly

Hứng dung dịch giải ly trong các bình nhỏ có đánh số thứ tự Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau, thường là 10ml Dung dịch trong những lọ hứng được sẽ được cho bay hơi bớt dung môi và chấm bản mỏng Những lọ nào có vết sắc ký giống nhau sẽ được gom lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất thấp sẽ thu được cao của phân đoạn đó

f Chọn phân đoạn để tiếp tục khảo sát

Chọn phân đoạn có lượng cao nhiều và có hợp chất cần phân lập để tiếp tục khảo sát Các phân đoạn có lượng cao ít, nhiều tạp chất, bản mỏng có nhiều vết mờ, dính với nhau hoặc kéo đuôi rất khó khảo sát tiếp, vì nếu cô lập được chất tinh khiết sẽ không đủ lượng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Đồng thời, trong điều kiện cho phép, cần so sánh với hợp chất đã công bố trong tài liệu hoặc trong thư viện hợp chất thiên nhiên

* Thuốc thử Wagner

Hòa tan 1,27g I2 và 2g KI trong 20ml nước cất Thêm nước cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid

sẽ xuất hiện tủa màu nâu

b Định tính flavonoid

Để định tính nhóm flavonoid ta có thể sử dụng 2 thuốc thử là H2SO4 đậm đặc và dung dịch 1% NaOH/ethanol

* Tác dụng với H2SO4 đậm đặc

Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến cam và có phát huỳnh quang đặc biệt Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ Flavanon cho màu cam đến đỏ

* Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ethanol

Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid hòa tan trong ethanol sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu đến đỏ tím

c Định tính steroid

Để định tính nhóm steroid ta có thể sử dụng 2 thuốc thử là H2SO4 đậm đặc và vanillin 1% trong etanol

* Thuốc thử H2SO4 đậm đặc: Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, thêm 5ml chloroform, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Thêm 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch đổi sang màu đỏ đậm hoặc xanh tím thì phản ứng dương tính

* Thuốc thử vanillin 1% trong etanol: Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, thêm 5ml chloroform, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Thêm vào 2 giọt dung dịch vanillin 1% trong etanol, 1 giọt HCl đậm đặc Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc tím thì phản ứng dương tính

d Định tính glycoside

Để định tính nhóm glycoside ta có thể sử dụng 2 thuốc thử là Keller–Killiani và phenol– H2SO4

* Thuốc thử Keller–Killiani (Phản ứng đặc trưng của đường 2–deoxy)

Dung dịch thuốc thử: dung dịch 5% sulfat sắt Fe2(SO4)3 (1ml), acid acetic băng (99ml)

Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mới pha, H2SO4 đậm đặc (1–2 giọt) Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu xanh lục sau 1–2 phút

* Thuốc thử phenol– H2SO4 (Phản ứng của đường)

Dung dịch thuốc thử: phenol (5g), ethanol (95ml), H2SO4 đậm đặc (5ml) Chỉ sử dụng thuốc thử mới pha

Trong một ống nghiệm có chứa 0,1mg mẫu thử, 1ml dung dịch thuốc thử mới pha Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện màu nâu

e Định tính lipid (chất béo)

Để định tính nhóm lipid ta có thể thể sử dụng thuốc thử 50% H2SO4/methanol

* Tác dụng với dung dịch 50% H2SO4/methanol

Nhỏ dung dịch 50% H2SO4 vào một dung dịch lipid hòa tan trong methanol sẽ

có màu nâu đen

f Định tính phenol

Để định tính nhóm phenol ta có thể sử dụng 2 thuốc thử là Bortrager và FeCl3

* Thuốc thử Bortrager (với KOH/methanol để phát hiện quinon, coumarin) Nhỏ dung dịch thuốc thử 5% KOH trong methanol vào dung dịch có chứa quinon, coumarin sẽ có màu đỏ, tím hoặc xanh lục

Dung dịch NaCl (5g), gelatin (0,5g) hòa tan trong 100ml nước cất Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa thành màu nâu

2.3 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm được trình bày ở hình 2.4