NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT MURRAYAFOLINE A TỪ LOÀI GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) CỦA VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Trần Quốc Toàn NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Trần Quốc Toàn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT

MURRAYAFOLINE A TỪ LOÀI GLYCOSMIS STENOCARPA

(DRAKE) CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Trần Quốc Toàn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT

MURRAYAFOLINE A TỪ LOÀI GLYCOSMIS STENOCARPA

(DRAKE) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và các cộng sự Các số liệu và kết quả đƣợc nêu trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, năm 2017 Tác giả luận án

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC SƠ ĐỒ b DANH MỤC HÌNH d DANH MỤC BẢNG BIỂU g DANH MỤC PHỤ LỤC h

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU MURRAYAFOLINE A 3

1.1 Giới thiệu về cây cơm rượu trái hẹp……… ……… 3

1.2 Nguồn gốc thiên nhiên và hoạt tính sinh học của murrayafoline A……5

1.3 Các dẫn xuất tổng hợp của murrayafoline A 10

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CARBAZOLE HIỆN ĐẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG TỔNG HỢP MURRAYAFOLINE A 13

2.1 Giới thiệu carbazole 13

2.2 Các phương pháp tổng hợp carbazole hiện đại 14

2.2.1 Phương pháp sử dụng phức sắt 14

2.2.2 Phương pháp sử dụng xúc tác palladium 17

2.2.2.1 Phương pháp Oxy hóa đóng vòng từ các amin Buchwald-Hartwig 17

2.2.2.2 Phương pháp đóng vòng N-bisaryl sử dụng xúc tác đồng (Cu[II]/Pd[II] 20

2.2.2.3 Phương pháp sử dụng phản ứng Suzuki-Miyaura Coupling 20

2.2.2.4 Phương pháp sử dụng phản ứng Heck-Coupling 24

2.2.2.5 Phương pháp oxy hóa đóng vòng sản phẩm thủy phân benzoxazol-2-ones 27

2.2.2.6 Phương pháp kết nối kiểu Stille – Coupling 28

2.2.3 Một số phương pháp tổng hợp murrayafoline A khác 29

2.2.3.1 Phương pháp Martin 29

2.2.3.2 Phương pháp của Mal 29

2.2.3.3 Phương pháp của Kikugawa 30

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 32

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 Phương pháp thu thập, giám định tên và xử lý mẫu thực vật 32

3.2 Phương pháp phân lập hoạt chất 32

3.3 Phương pháp tổng hợp hữu cơ 33

3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 33

3.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học in vitro 34

3.5.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư 34

3.5.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm trên tế bào tủy xương hình sao kích thích bằng LPS 35

3.5.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm ức chế yếu tố NF-κB 36

3.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư trên động vật thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC 37

3.6.1 Phương pháp thử độc tính cấp 37

3.6.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế khối u của hoạt chất Mu-A trên chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC 37

3.6.3 Phương pháp đánh giá tính độc của hoạt chất Mu-A thông qua kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa máu 38

3.6.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất Mu-A đối với các biến đổi giải phẫu bệnh lí ở gan, thận, lách, phổi chuột gây u thực nghiệm 39

3.6.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng kích hoạt enzyme caspase3/7 của hoạt chất Mu-A bằng bộ kit của Promega 39

3.6.6 Phương pháp xử lí số liệu 39

CHƯƠNG 4: THỰC NGHIỆM 40

4.1 Phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp 40

4.1.1 Nguyên liệu 40

4.1.2 Chiết tách thô 40

4.1.3 Phân lập theo phương pháp sắc ký 40

4.1.4 Phân lập theo phương pháp cất cuốn hơi nước 40

4.1.5 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng murrayafoline A 41

4.2 Tổng hợp toàn phần murrayafoline A 42

4.2.1 Tổng hợp 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen 42

4.2.2 Tổng hợp 2-metoxy-4-metylanilin 42

4.2.3 Tổng hợp murrayafoline A 43

4.3 Tổng hợp các dạng phức hợp của murrayafoline A 44

4.3.1 Tổng hợp liposome 44

4.3.2 Tổng hợp mixen 44

4.4 Tổng hợp các dẫn xuất của murrayafoline A 45

4.4.1 Tổng hợp methoxy-3-methyl-9-(3-bromo)-propyl-9H-carbazole) và 1-methoxy-3-methyl-9-(propen-2-yl)-9H-carbazole 45

4.4.2 Tổng hợp 1-methoxy-3-methyl-9-(3-azido)-propyl-9H-carbazole (105) 46 4.4.3 Bảo vệ nhóm chức amin amine 46

4.4.4 Bảo vệ nhóm chức alcohol 46

4.4.5 Tổng hợp dẫn xuất 1,2,3-triazole của murrayafoline A 47

4.4.6 Tổng hợp 3-(1-methoxy-3-methyl-9H-carbazol-9-yl)propane-1,2-diol (107) 50

4.4.7 Tổng hợp 1-methoxy-3-formylcarbazole (2) 51

4.4.8 Tổng hợp các chalcon của murrayafoline A 51

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

CHƯƠNG 5 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU MURRAYAFOLINE A 54

5.1 Nghiên cứu phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp 54

5.1.1 Định hướng xây dựng phương pháp phân lập 54

5.1.2 Xây dựng phương pháp định lượng murrayafoline A bằng HPLC 55

5.1.2.1 Xác định bước sóng phát hiện 55

5.1.2.2 Xây dựng đường chuẩn cho murrayafoline A 55

5.1.2.3 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp 56

5.1.2.4 Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp 57

5.1.2.5 Kết quả phân tích mẫu thực 57

5.1.3 Xây dựng quy trình phân lập murrayafoline A 58

5.1.3.1 Phương pháp sắc ký 58

5.1.3.2 Phương pháp kết hợp sử dụng cất lôi cuốn hơi nước 59

5.1.3.3 Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất murrayafoline A phân lập được từ rễ cây cơm rượu trái hẹp 61

5.2 Nghiên cứu tổng hợp murrayafoline A ……….63

5.2.1 Tổng hợp 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen 64

5.2.2 Tổng hợp 2-metoxy-4-metylanilin 67

5.2.3 Tổng hợp 2-methoxy-4-metyl-N-phenylanilin 68

5.2.4 Tổng hợp murrayafoline A 69

CHƯƠNG 6: XÂY DỰNG DẠNG PHỨC HỢP CỦA MURRAYAFOLINE A 72

6.1 Mixen 72

6.1.1 Giới thiệu mixen 72

6.1.2 Kết quả điều chế mixen – murrayafoline A 73

6.2 Liposome 75

6.2.1 Giới thiệu về liposome 75

6.2.1 Điều chế tiểu phân liposome chứa murrayafoline A 76

`CHƯƠNG 7: CHUYỂN HÓA TẠO DẪN XUẤT MURRAYAFOLINE A 79 7.1 Chuyển hóa tạo dẫn xuất chứa nhóm triazole 79

7.1.1 Phản ứng của murrayafoline A với 1,3 – dibrompropan 82

7.1.2 Phản ứng azide hóa 86

7.1.3 Phản ứng “Click” đóng vòng 1,2,3 – triazole 89

7.1.4 Phản ứng dihidroxyl hóa nối đôi 103

7.2 Chuyển hóa tạo dẫn xuất chalcon 105

7.2.1 Phản ứng oxi hóa tạo nhóm chức andehit 107

7.2.2 Phản ứng Claisen-Schmidt tạo xeton α,β-không no 109

CHƯƠNG 8: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

MURRAYAFOLINE A VÀ CÁC DẪN XUẤT 117

8.1 Hoạt tính sinh học in vitro của murrayafoline A 117

8.1.1 Hoạt tính gây độc tế bào 117

8.1.2 Hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trên thạch mềm 3D 118

8.1.3 Hoạt tính tim mạch 119

8.2 Hoạt tính sinh học in vivo của murrayafoline A 120

8.2.1 Kết quả xác định khả năng gây độc cấp tính của Mu-A 121

8.2.2 Kết quả xác định khả năng ức chế khối u của Mu-A trên chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC 122

8.2.2.1 Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ cho động vật nghiên cứu của Mu-A 122

8.2.2.2 Khả năng ức chế khối u phát triển 124

8.2.2.3 Khả năng kháng khối u di căn 125

8.2.2.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Mu-A đến các chỉ tiêu huyết học và chức năng gan, thận chuột bị gây u thông qua một số chỉ tiêu sinh hoá máu 126

8.2.2.5 Khả năng kích hoạt hệ enzyme caspase 3/7 của Mu-A 129

8.2.3 Kết luận về các kết quả thử nghiệm khả năng kháng u ung thư in vivo 131

8.3 Hoạt tính sinh học các dạng bào chế của murrayafoline A 132

8.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của mixen-murrayafoline A 132

8.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học của murrayafoline A dạng liposome 132

8.3.2.1 Hoạt tính in vitro 132

8.3.2.2 Hoạt tính in vivo 133

8.4 Hoạt tính sinh học các hợp chất dãy chuyển hóa tạo dẫn xuất triazole của murrayafoline A 135

8.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào 135

8.4.2 Hoạt tính kháng viêm 137

8.5 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất dãy chuyển hóa chalcon của murrayafoline A 139

KẾT LUẬN 141

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 143

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 144

Tài liệu tham khảo 145

DMSO-d 6 Dimethyl sulfoxid đƣợc deuteri hóa

TBDPS tert -butyldiphenylsilyl clorua

(Boc)2O Di-tert-butyl dicacbonat

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ lai hóa murrayafoline A tạo dẫn xuất với 5-fluorouracil, acridone,

murrayafoline A, ciprofloxacin, piperazine 11

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ lai hóa Mu-A tạo dẫn xuất với một số dị vòng chứa nitơ 12

Sơ đồ 1.3: Sơ đồ lai hóa murrayafoline A với zerumbone & artemisinin 12

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp carbazole theo phương pháp sử dụng phức của sắt 14

Sơ đồ 2.2: Ba hướng phản ứng đóng vòng phức trung gian sắt để tổng hợp carbazole 15

Sơ đồ 2.3: Tổng hợp Mu-A theo phương pháp sử dụng phức sắt cacbonyl 16

Sơ đồ 2.4: Tổng hợp carbazole theo phương pháp oxy hóa đóng vòng

amin Buchwald-Hartwig 17

Sơ đồ 2.5: Cơ chế Oxy hóa đóng vòng carbazole từ các amin Buchwald-Hartwig sử dụng xúc tác paladi kết hợp với đồng 18

Sơ đồ 2.6: Tổng hợp một số carbazole bằng xúc tác Pd 19

Sơ đồ 2.7: Tổng hợp murrayfoline A theo phương pháp oxi hóa amin Buchwald-Hartwig với xúc tác paladi 19

Sơ đồ 2.8: Tổng hợp murrayafoline A và carbazole khác bằng xúc tác Cu/Pd kết hợp vi sóng 20

Sơ đồ 2.9: Tổng hợp carbazole bằng phản ứng kết nối Suzuki-Miyaura 21

Sơ đồ 2.10: Tổng hợp mukonidine and glycosinine phản ứng kết nối Suzuki-Miyaura 22

Sơ đồ 2.11: Tổng hợp carbazole bằng amin Buchwald- Hartwing 22

Sơ đồ 2.12: Tổng hợp ( ) murrayazoline 23

Sơ đồ 2.13: Tổng hợp carbazole bằng phản ứng ghép nối Suzuki-Miyaura thế nucleophin 23

Sơ đồ 2.14: Tổng hợp carbazole bằng phản ứng thế nucleophin và đóng vòng bằng phản ứng Heck 24

Sơ đồ 2.15: Tổng hợp mukonine bằng phương pháp thế nucleophin và đóng vòng bằng phản ứng Heck 24

Sơ đồ 2.16: Các bước tổng hợp carbazole qua hai giai đoạn bằng amin Buchwald-Hartwig sử dụng phản ứng Heck-coupling 25

Sơ đồ 2.17: Tổng hợp mukonine sử dụng amin Buchwald-Hartwig 25

Sơ đồ 2.18: Tổng hợp murrayafoline A không qua bước bisaryl trung gian 26

Sơ đồ 2.19: Tổng hợp 1-methoxycarbazoles bằng cách thủy phân

benzoxazol-2-ones và đóng vòng kiểu ghép nối Heck từ diarylamine 26

Sơ đồ 2.20 Tổng hợp 1-methoxycarbazole theo phương pháp thủy phân benzoxazol-2-ones và sử dụng xúc tác Pd(II) để oxi hóa tạo vòng carbazole 27

Sơ đồ 2.21: Tổng hợp 6- methoxylmurrayanime 27

Sơ đồ 2.22: Tổng hợp murrayafoline A theo phương pháp của Tamariz 28

Sơ đồ 2.23: Tổng hợp carbazole theo phương pháp ghép nối Still 29

Sơ đồ 2.24: Quy trình tổng hợp murrayafoline A theo phương pháp Martin 29

Sơ đồ 2.25: Quy trình tổng hợp murrayafoline A theo phương pháp của Mal 30

Sơ đồ 2.26: Quy trình tổng hợp murrayafoline A theo Kikugawa 31

Sơ đồ 5.1: Quy trình phân lập murrayafoline A theo phương pháp sắc ký 58

Sơ đồ 5.2: Quy trình phân lập murrayafoline A sử dụng cất cuốn hơi nước 60

Sơ đồ 5.3: Tổng hợp toàn phần murrayafoline A 63

Sơ đồ 5.4: Tổng hợp 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen 64

Sơ đồ 5.5: Tổng hợp 2-metoxy-4-metylanilin 67

Sơ đồ 5.6: Tổng hợp 2-methoxy-4-N-phenylanilin 68

Sơ đồ 5.7: Tổng hợp murrayafoline A theo phương pháp Fagnou 69

Sơ đồ 5.8: Phản ứng tổng hợp murrayafoline A theo phương pháp Ackermann 69

Sơ đồ 7.1: Quy trình chung tổng hợp 1,2,3 - triazole 79

Sơ đồ 7.2: Cơ chế tạo 1,2,3 – triazole với xúc tác Cu(I) 80

Sơ đồ 7.3: Các bước tạo dãy chuyển hóa chứa nhóm 1,2,3-triazole của murrayafoline A 81

Sơ đồ 7.4: Phản ứng N-ankyl hóa murrayafoline A 82

Sơ đồ 7.5: Phản ứng azide hóa hợp chất 7 86

Sơ đồ 7.6: Phản ứng “Click” đóng vòng 1,2,3 - triazole 89

Sơ đồ 7.7: Phản ứng tổng hợp (1-(3-(1-methoxy-3-methyl-9H-carbazol-9-yl)propyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanamine 90

Sơ đồ 7.8: phản ứng tổng hợp (1-(3-(1-methoxy-3-methyl-9H-carbazol-9-yl)propyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methanol 91

Sơ đồ 7.9: Phản ứng dihidroxi hóa nối đôi 103

Sơ đồ 7.10: Tổng hợp chalcon từ murrayafoline A 107

Sơ đồ 7.11: Tổng hợp 1-methoxy-3-forrmylcarbazole 107

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa 3

Hình 1.2: Các chất đã được phân lập từ cây cơm rượu trái hẹp 4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo murrayafoline A 5

Hình 1.4: Murrayafoline A thể hiện hoạt tính hướng cơ dương tính 7

Hình 1.5 : Mu-A làm tăng chuyển tiếp Ca2+ trên tế bào cơ tim tâm thu của chuột 8

Hình 1.6 : Murrayafoline A làm tăng tần số đỉnh Ca2+ 8

Hình 1.7: Murrayafoline A làm tăng nhẹ lượng Ca2+ lưới cơ tương trong tế bào tâm thất chuột 9

Hình 1.8: Murrayafoline A làm tăng huyết áp động mạch và áp suất tâm thất trên chuột bị gây suy tim thực nghiệm 9

Hình 2.1: Khung cơ sở và cách đánh số thứ tự carbazole 13

Hình 5.1: Sự giải tỏa điện tích trên phân tử Murrayafoline A 54

Hình 5.2: Phổ UV của murrayafoline A 55

Hình 5.3: Đồ thị phương trình đường chuẩn 56

Hình 5.4: Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch chiết cao tổng rễ cây cơm rượu 57

Hình 5.5: Murrayafoline A tinh thể 61

Hình 5.6: Đánh số thứ tự murrayafoline A 61

Hình 5.7: Các mối liên hệ chính trong phổ HMBC của murrayafolin A 62

Hình 5.8: Phổ 1H NMR của 2-nitro-4-metylphenol 65

Hình 5.9: Phổ 1H NMR của 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen 65

Hình 5.10: Phổ 13C NMR của 2-nitro-4-metylphenol 66

Hình 5.11: Phổ 13C NMR của 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen 66

Hình 5.12: Phổ 1H NMR của 2-methoxy-4-metylanilin 67

Hình 5.13: Phổ 1H NMR của 2-methoxy-4-methyl-N-phenylaniline 68

Hình 5.14: Phổ 1H NMR của murrayafoline A tổng hợp 70

Hình 6.1: Minh họa cấu trúc mixen 72

Hình 6.2 : Sản phẩm và mô phỏng cấu trúc mixen – murrayafoline A 73

Hình 6.3: Ảnh FE-SEM của hệ chứa Murrayafoline A 74

Hình 6.4 : Ảnh phân bố kích thước (a) và thế zeta (b) của mixen mang murrayfoline A phân tán trong nước 74

Hình 6.5: Liposome được tạo thành từ các photpholipid trong dung dịch nước 75

Hình 6.6: Cơ chế hình thành liposome bởi quá trình hydrat hóa màng film 76

Hình 6.7: Mô phỏng cấu trúc liposome – murrayafoline a 77

Hình 6.8: Thế Zeta của liposome 77

Hình 6.9: Sự phân bố kích thước các hạt liposome 78

Hình 6.10: Ảnh chụp SEM hạt liposome chứa Mu-A 78

Hình 7.1 : Phổ HRMS của hợp chất 7 82

Hình 7.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 7 83

Hình 7.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất 7 84

Hình 7.4: Phổ HRMS của hợp chất 104 84

Hình 7.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất hợp chất 104 85

Hình 7.6 : Phổ 13C-NMR của hợp chất 104 86

Hình 7.7: phổ HRMS của hợp chất 105 87

Hình 7.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 105 88

Hình 7.9 : Phổ 13C NMR của hợp chất 1-methoxy-3-methyl-9-(3-azido)-propyl-9H-carbazole 88

Hình 7.10: Phổ HRMS của hợp chất (106a) 92

Hình 7.11: Liên kết hidro nội phân tử ở hợp chất 106a 92

Hình 7.12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 106a 93

Hình 7.13: Phổ 13C-NMR của hợp chất 106a 93

Hình 7.14 : Phổ HRMS của hợp chất 106b 94

Hình 7.15: Phổ 1H-NMR của hợp chất 106b 95

Hình 7.16: Phổ 13C-NMR của hợp chất (106b) 95

Hình 7.17: Phổ HRMS của hợp chất 106c 96

Hình 7.18: Phổ 13C-NMR của hợp chất 106c 97

Hình 7.19: Phổ HRMS của hợp chất 106e 98

Hình 7.20: Phổ HRMS của hợp chất 106f 99

Hình 7.21: Phổ 1H-NMR của hợp chất 106f 100

Hình 7.22: phổ 13C-NMR của hợp chất 106f 100

Hình 7.23 : Phổ HRMS hợp chất (106g) 101

Hình 7.24: Phổ HRMS của hợp chất (106h) 102

Hình 7.25: phổ HRMS của hợp chất 107 103

1

Hình 7.27: Phổ 13C-NMR của hợp chất 107 104

Hình 7.28: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hợp chất 2 108

Hình 7.29: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của hợp chất 2 108

Hình 7.30: Các dẫn xuất chalcon của murrayafoline A 110

Hình 7.31: Phổ 1H-NMR của hợp chất 108a 110

Hình 7.32: Phổ 13C-NMR của hợp chất 108a 111

Hình 7.33: Phổ 1H-NMR của hợp chất 108b 112

Hình 7.34: Phổ 1H-NMR của hợp chất 108c 113

Hình 7.35: Phổ 1H-NMR của 108d 114

Hình 7.36: Phổ 13C-NMR của 108d 115

Hình 7.37: Phổ 1H-NMR của hợp chất 108e 116

Hình 8.1:Biểu đồ so sánh hoạt tính gây độc tế bào của murrayafoline A và elipticine qua giá trị IC50 117

Hình 8.2 : Hình ảnh thử nghiệm khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Hep-G2 trên thạch mềm 3D sau 10 ngày nuôi cấy 118

Hình 8.3: Vai trò trung gian của murrayafoline A đối với sự hoạt động và tốc độ co của tế bào cơ tim khi có mặt chất ức chế 119

Hình 8.4: Ảnh tiêu bản tế bào mô thận 126

Hình 8.5: Hoạt tính của enzym caspase 3/7 của hoạt chất Mu-A 130

Hình 8.6: Đồ thị biểu thị sự ức chế tăng trưởng tế bào của Mu-A liposome và Mu-A tự do ở 20 mM 133

Hình 8.7 Ảnh hưởng đến trọng lượng chuột khi sử dụng Mu-A liposome và Mu-A tự do 134

Hình 8.8: Sự tăng trưởng khối u sau khi điều trị với Mu-A tự do và Mu-A liposome 134

Hình 8.9: Đồ thị tương quan giá trị IC50 đối với dòng tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất 7, 105, 106a, 106b, 106e và elipticine 136

Hình 8.10: Cytokine IL-12p40 trong tế bào tua gây viêm bằng LPS bị ức chế mạnh nhất bởi các chất 7, 106c, và 105e tại nồng độ 25 μM trong DMSO (dấu *) 137

Hình 8.11 : Hoạt tính của các hợp chất 7, 106c, và 105e với các interleukin IL-12 P40 (a), IL-6 (b), và TNF-a (c) kích hoạt bằng LPS trên tế bào tua - tủy xương BMDCs 138

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 5.1: Kết quả đo HPLC của mẫu chuẩn ở nồng độ khác nhau 55

Bảng 5.2: Kết quả cho độ lặp lại của phương pháp 56

Bảng 5.3: Kết quả cho độ chính xác của phương pháp 57

Bảng 7.1: Hiệu suất tạo sản phẩm 1,2,3-triazole của murrayafoline A 89

Bảng 8.1: Giá trị IC50 của murrayafoline A trên các dòng tế bào KB, LU-1, LNCaP, HL-60 và Hep-G2 117

Bảng 8.2: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Hep-G2 trên thạch mềm 3D 118

Bảng 8.3: Độc tính cấp của Mu-A trên chuột thí nghiệm 121

Bảng 8.4: Kết quả thống kê về thể tích khối u cũng như trọng lượng chuột ở các lô nghiên cứu sau 45 ngày thí nghiệm 122

Bảng 8.5: Ảnh hưởng của Mu-A trên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm 126

Bảng 8.6: Ảnh hưởng của Mu-A đối với các chỉ tiêu huyết học và enzyme chức năng gan, thận trên chuột thí nghiệm 127

Bảng 8.7: Khả năng kích hoạt hệ enzyme caspase 3/7 của Mu-A 129

Bảng 8.8: Giá trị IC50 của Mu-A tự do và mixen với dòng tế bào Hep-G2 132

Bảng 8.9: IC50 của Mu-A dạng liposome và dạng tự do đối với các dòng tế bào SK-MEL-2 và SK-LU-1 133

Bảng 8.10: Giá trị tỉ lệ phần trăm ức chế dòng tế bào LU-1 ở nồng độ 100µg/ml của các chất dãy chuyển hóa tạo dẫn xuất triazole 135

Bảng 8.11: Giá trị IC50 đối với dòng tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất 7, 105, 106a, 106b và 106e 136

Bảng 8.12: Giá trị %CS đối với các dòng tế bào Hep-G2 và LU-1 139

MỞ ĐẦU

Ngay từ buổi bình minh của loài người, hợp chất thiên nhiên đã đóng vai trò tối quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Ngày nay những hợp chất được phân lập từ động thực vật đã được ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống xã hội, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, Mặc dù công nghệ tổng hợp hóa dược hiện nay đã phát triển hết sức mạnh mẽ, tạo ra được nhiều biệt dược khác nhau sử dụng trong công việc phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong đi rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược không vì thế mà mất đi giá trị của chúng trong phòng và điều trị bệnh Chúng vẫn được sử dụng là nguồn nguyên liệu trực tiếp hoặc gián tiếp cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y

Vì vậy, nguồn dược liệu thiên nhiên vẫn là kho tàng quí giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh thông thường và các bệnh nan y của thời đại như tiểu đường, ung thư, HIV-AIDS, cúm gia cầm H5N1, H1N1 Có thể nêu ra một vài ví dụ như vinblastin, vincristin là các

hoạt chất phân lập từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus họ Apocynaceae) chữa

bệnh ung thư máu, Taxoter-thuốc chữa ung thư vú, ung thư phổi là sản phẩm

chuyển hóa của một số ditecpenoit chiết xuất từ một số loài Taxus họ Thông

(Pinaceae) Gần đây là Tamiflu, một loại thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 và cúm H1N1, có thành phần chính là Oseltamivir photphat Chất này được bán tổng hợp từ axit shikimic, một hợp chất phân lập từ hoa Hồi

Murrayafoline A, là một dẫn xuất carbazole phân lập từ một số loài thuộc họ Rutaceae, đây một hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý báu đặc biệt là các hoạt tính kháng ung thư Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nhóm nghiên cứu sâu hơn về hợp chất này Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Mạnh Cường

đã phát hiện sự có mặt của hợp chất này ở loài cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa thuộc họ Rutaceae) và đã phát hiện hợp chất này có hoạt tính kháng ung

thư và kích thích tim mạch rất tốt

Chính vì vậy, trong luận án này chúng tôi tập trung nghiên cứu thực hiện đề

của hợp chất murrayafoline A từ loài Glycosmis stenocarpa (Drake) của Việt

Nam”

Mục tiêu luận án:

Nghiên cứu phân lập từ rễ cây cơm rượu trái hẹp và tổng hợp hợp chất murrayafoline A, tiến hành bào chế và chuyển hóa tạo dẫn xuất, từ đó xác định các

hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của murrayafoline A và các dẫn xuất

Để đạt được mục tiêu của luận án, luận án đã thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:

• Nghiên cứu quy trình phân lập Murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp

• Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất murrayafoline A

• Nghiên cứu chuyển hóa murrayafoline A thành các dạng nano mixen và nano lyposome

• Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất triazole và chalcon của hợp chất murrayafoline A

• Nghiên cứu các hoạt tính in vitro: gây độc tế bào, kháng viêm, tim mạch

của murrayafoline A và dẫn xuất tổng hợp được

• Nghiên cứu hoạt tính in vivo:

- Xác định độ độc cấp của hoạt chất murrayafoline A thông qua liều gây chết 50% động vật thí nghiệm LD50 (Lethal Dose)

- Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển khối u ung thư thực nghiệm của murrayafoline A

- Nghiên cứu ảnh hưởng của murrayafoline A đối với chỉ tiêu huyết học và một số chỉ tiêu sinh hoá để đánh giá chức năng gan, thận của chuột đã gây u khi cho uống trường diễn

- Nghiên cứu khả năng kháng khối u ung thư di căn của hoạt chất murrayafoline A bằng trực quan và mô bệnh học của chuột gây u thực nghiệm

PHẦN 1: TỔNG QUAN CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU MURRAYAFOLINE A 1.1 Giới thiệu về cây cơm rượu trái hẹp

Cây cơm rượu trái hẹp là một trong 66 loài thuộc chi Glycosmis thuộc họ Rutaceae có tên khoa học là Glycosmis stenocarpa (Drake) Tan Ngoài ra cây này còn có tên là Atalantia stenocarpa Drake, hoặc Murraya stenocarpa (Drake) Guill

[8] Đây là loài có thân gỗ nhỏ, cao 1m, có mùi thơm gắt, không có gai, không lông;

lá thon, to (5 – 11 x 2 – 4 cm), bìa lá có răng cưa mịn, cuống lá dài 1 – 2,3 cm; lá mỏng, mặt trên màu nâu, láng; gân lá có 12 – 24 cặp; hoa phát ở nách lá, cánh hoa dài 4 mm, tiểu nhuỵ có chỉ rời nhau, đĩa mật, noãn sào không có lông; trái mập, màu đỏ nhạt, xoan tròn, to khoảng 13 – 15 mm; hột dài 11 – 12 mm, rộng 4 mm [8]

Hình 1.1: Cây cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa

Năm 2005, nhóm tác giả N.M Cuong, T.Q Hung, T.V Sung và Walter C Taylor đã thông báo tách được 3 carbazole, trong đó có một dime carbazole mới là

bisisomahanin, từ phần dịch chiết n-hexan và cloroform từ rễ của loài G stenocarpa

[26] Năm 2010, các tác giả N.M.Cuong, T.Q.Toan thông báo tách thêm 3 hợp chất

mới gồm 1 cacbohydrat là đường sucrose, hai hợp chất có chứa nito là

N-metylpyrolidine-2-cacboxamit và (±)-p-synephrine Các hợp chất đều được đem thử nghiệm hoạt tính sinh học và cho thấy chúng có các hoạt tính sinh học phong phú [3]

(1) Murrayafolin A

(2) Murrayanin

H N

N H O

(4) N-metylpyrolidine-2-cacboxamit

(5) (±)-p-synephrine

(6) Sucrose

Hình 1.2: Các chất đã được phân lập từ cây cơm rượu trái hẹp

Các thành phần của cây cơm rượu trái hẹp đều có hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật, gây độc tế bào [3]

1.2 Nguồn gốc thiên nhiên và hoạt tính sinh học của murrayafoline A

NH

CH3

O

CH3

(1)

Hình 1.3: Công thức cấu tạo murrayafoline A

Murrayafoline A được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1985 bởi Furukawa và các cộng sự khi nhóm nghiên cứu phân lập các thành phần hóa học từ

cao chiết ethanol của vỏ rễ cây Murraya euchrestifolia thu hái ở Đài Loan [127]

[37] Tới năm 2000, Itoigawa và các cộng sự thông báo rằng họ đã phân lập thành

công murayafoline A từ vỏ rễ cây Murraya euchrestifolia Hàm lượng

murrayafoline A thu được lên tới khoảng 1,2 % khối lượng mẫu khô [41] Nhóm nghiên cứu A.B Abdul và cộng sự đã phân lập được murrayafoline A từ rễ cây

Murraya koenigii (Rutaceae) thu hái tại Malaysia, hàm lượng murrayafoline A

chiếm 0,03% khối lượng mẫu khô [97] Năm 2005, nhóm nghiên cứu của N.M Cường và cộng sự (Viện Hàn Lâm KHCNVN) cũng đã phân lập thành công được

Murrayafoline A từ rễ của cây Glycosmis stenocarpa (Rutaceae) được thu hái tại

miền Bắc Việt Nam [26]

Song song với việc nghiên cứu phân lập từ thiên nhiên, việc xác định hoạt tính sinh học cũng được các nhà khoa học nghiên cứu, kết quả cho thấy murrayafoline A đều thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với các giá trị

MIC (µg/ml): Escherichia coli (6,25); Pseudomonas aeruginosa (50); Bacillus subtillis (6,25); Staphylococcus aureus (6,25); Fusarium oxysporum (25); Candida albicans (12,5); Saccharomyces cerevisae (6,25) [7]

Hoạt tính gây độc tế bào

Năm 2000, Itoigawa và các cộng sự công bố trên tạp chí Journal of Natural

euchrestifolia được biết đến như một hợp chất gây độc tế bào [41] Mu-A bộc lộ

khả năng gây độc tế bào không đáng kể hoặc rất yếu đối với các dòng tế bào khối u SK-MEL-5, Colo-205, HCT-8, KB và A-549, với giá trị ED50 trong phạm vi từ 5,31 đến 7,52 µg/ml Mu-A cũng được chỉ ra có hiệu lực gây độc tế bào chọn lọc đối với dòng tế bào MOLT-4, với giá trị logIG50 là -8,6 Mu-A với một nhóm methyl ở C-3, được chứng minh có ý nghĩa quan trọng và chọn lọc gây độc tế bào đối với dòng tế bào MOLT-4 (bệnh bạch cầu) và HOP-18 (tế bào ung thư phổi kích thước lớn và trung bình), với các giá trị logIG50 tương ứng lần lượt là <-8,60 và -6,54 Khả năng gây độc tế bào với các dòng tế bào khác là yếu hoặc không đáng kể (giá trị logIG50nằm trong khoảng từ -5,22 đến -4,60) Những kết quả này đã chứng minh nhóm methyl ở vị trí C-3 là rất quan trọng để tăng hoạt tính chống ung thư của các carbazole kiểu này [5] Trong một nghiên cứu của Oshi và các cộng sự của ông về các chất ức chế KSP (Kinesin Spindle Protein) có cấu trúc khung 2,3-Fused Indole thì các nhà khoa học này đã công bố rằng Mu-A đã gián tiếp để “bắt giữ” chu trình

tế bào trong pha G2/M (Mu-A was reported to arrest the cell cycle in the phase), không ức chế sự hoạt động của KSP [103] Trong nghiên cứu của Ahmad và đồng nghiệp mình gần đây (2014), các tác giả đã công bố rằng Mu-A có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào CEM-SS với giá trị IC50 3µg/ml [12] Một nghiên cứu được công bố vào năm 2010 của Kim, N.M Cuong và các cộng sự, mở ra triển vọng phát triển một loại thuốc chống ung thư ruột kết từ Mu-A Theo nghiên cứu này, Mu-A kìm hãm sự xuất hiện của cyclin D1 và c-myc, được biết đến là β-catenin/T cell factor- độc lập với gene và do đó ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư ruột kết [29]

G2/M-Như vậy, qua các công trình đã công bố cho thấy Murayafoline A là hoạt chất có tiềm năng rất lớn trong điều trị một số bệnh ung thư

Hoạt tính tim mạch

Trong khoảng vài năm trở lại đây, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc nghiên cứu sâu hơn cơ chế tác dụng của murrayafoline A qua việc nghiên cứu ảnh hưởng tới sự tăng co bóp tâm thất thông qua tín hiệu của kênh Ca2+ [47], [116] Nghiên cứu lâm sàng cho biết sự co bóp bất thường của cơ tâm thất gây ra đột quỵ tim mạch Sự co bóp của cơ tim được điều kiển bởi một loạt các tín hiệu của kệnh

Ca2+ Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất murrayafoline A trên cơ tâm thất của chuột cho thấy:

Murrayafoline A làm tăng co bóp cơ tim tăng chức năng màng cơ tim tâm thu và tâm trương trên chuột Murrayafoline-A đã làm thay đổi sự co thắt tâm thất chuột trên tế bào tâm thất phân lập và cả trên chuột Murrayafoline-A gây ra hoạt tính hướng cơ dương tính trên tế bào tâm thất bằng cách làm tăng sự giải phóng

Ca2+ lưới cơ tương nhờ làm tăng dòng Ca2+ trên kênh ion Ca2+ Murrayafoline-A ở nồng độ 10μM làm tăng đáng kể sự co tế bào (Hình 1.4) Cường độ hiệu ứng hướng cơ dương tính lớn nhất gây ra bởi murrayafoline-Alà khoảng 72%, ở nồng

độ 100 µM, xảy ra ở khoảng thời gian 120 s kể từ khi bắt đầu thí nghiệm Giá trị

EC50 thu được là 23  3.9μM Hiệu ứng hướng cơ dương tính này là thuận nghịch Murrayafoline-A không làm thay đổi động học của quá trình co và giãn tế bào tâm thất cô lập

Hình 1.4: Murrayafoline A thể hiện hoạt tính hướng cơ dương tính

- Murrayafoline A ảnh hưởng lên quá trình chuyển tiếp Ca2+ trên tế bào cơ tim tâm thu của chuột và không làm thay đổi động lực học của sự co và duỗi cơ tim

- Murrayafoline A làm tăng tần số đỉnh Ca2+

(Ca2+ spark), giải phóng ra bởi các đơn vị giải phóng Ca (Ca release unit –CRU), liên quan đến các thụ thể

- Murrayafoline A ở nồng độ 25µM, làm tăng nhẹ lượng Ca2+ lưới cơ tương so với caffein ở nồng độ 10µM

Hình 1.5 : Mu-A làm tăng chuyển tiếp Ca 2+ trên tế bào cơ tim tâm thu của chuột

Hình 1.6 : Murrayafoline A làm tăng tần số đỉnh Ca 2+

Hình 1.7: Murrayafoline A làm tăng nhẹ lượng Ca 2+ lưới cơ tương trong tế bào

tâm thất chuột

- In vivo, Murrayafoline A làm tăng huyết áp động mạch và áp suất tâm thất

trên chuột bị gây suy tim thực nghiệm

Hình 1.8: Murrayafoline A làm tăng huyết áp động mạch và áp suất tâm thất

trên chuột bị gây suy tim thực nghiệm

 Như vậy: qua các nghiên cứu, nhóm tác giả cho rằng hợp chất murrayafoline

A có tác dụng tăng cường sức khỏe tim mạch, tăng khả năng co bóp cơ tim, phòng ngừa thiếu máu cơ tim, giúp giảm thiểu các nguy cơ đột quỵ Chúng tôi dự kiến trong khuôn khổ luận án này tiếp tục nghiên cứu sâu hơn tác dụng của murrayafoline A trên protein đích để hiểu rõ hơn tác dụng tim mạch của murrayafoline A

1.3 Các dẫn xuất tổng hợp của murrayafoline A

Murrayafoline A là một alkanoids carbazole có các nhóm thế methoxy ở vị trí C-1 và metyl ở vị trí C-3 Chính vì vậy, các phản ứng tổng hợp dẫn xuất murrayafoline A có thể thực hiện vào 4 vị trí:

- Thực hiện phản ứng đối với nguyên tử nitơ

- Thực hiện phản ứng trên nhóm methoxy

- Thực hiện phản ứng trên nhóm metyl

- Thực hiện phản ứng đối với vòng benzen

Tuy nhiên, hiện nay các nhóm nghiên cứu mới chỉ bước đầu nghiên cứu vào việc chuyển hóa murrayafoline A theo hướng thực hiện các chuyển hóa ở nhóm OCH3 và gắn các nhóm thế vào vị trí nguyên tử nitơ

Những chuyển hóa đầu tiên được nhóm nghiên cứu của N.M Cường thực hiện trên nhóm thế OCH3 [25] Các tác giả đã thực hiện thủy phân nhóm OCH3, thay thế nhóm CH3 bằng các nhóm 3-methylbut-2-enyloxy và 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-alpha-D-O-glucopyranosyl) Dẫn xuất tạo thành có khả năng kháng nấm

Cladosporium cucumerinum tốt

Trong những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của L.V.Chính và các cộng sự

đã tiến hành chuyển hóa Mu-A theo hướng lai hóa với các chất có hoạt tính sinh học như: 5-fluorouracil, acridone, murrayafoline A, ciprofloxacin,zerumbone & artemisinin … để thu được các hợp chất mới [92]

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ lai hóa murrayafoline A tạo dẫn xuất với 5-fluorouracil,

acridone, murrayafoline A, ciprofloxacin, piperazine

Các hợp chất này đều đƣợc đánh giá hoạt tính sinh học trên các đối tƣợng vi sinh vật kiểm định với các kết quả rất khả quan Hợp chất với 2 hợp phần

murayafoline A gắn với các vị trí N-1 và N-3 của 5-fluorouracil có khả năng kháng

2 vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn gram (-) E Coli và nấm sợi A Niger với MIC

lần lƣợt là 50 và 100 μg/ml Hợp chất có sự xuất hiện của thuốc kháng sinh ciprofloxacin trong phân tử có khả năng kháng 3 vi sinh vật kiểm định gồm vi

khuẩn gram (-) E Coli, vi khuẩn gram (+) S Aereus và nấm sợi A Niger với MIC

lần lƣợt là 100, 25 và 100 μg/ml [92]

Năm 2015, trong một công trình công bố khác, nhóm này tiếp tục chuyển hóa Mu-A với các dẫn xuất theo kiểu lai hóa với các chất mang hoạt tính sinh học cao [2]

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ lai hóa Mu-A tạo dẫn xuất với một số dị vòng chứa nitơ

Các chất tổng hợp được đều được chứng minh cấu trúc bằng các dữ kiện phổ cộng hưởng từ và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào với các dòng G2, LU, RD &

Fl Kết quả cho thấy các dẫn xuất đều có những hoạt tính rất tốt với IC50 trong khoảng 1,39 đến 9,97µg/ml

Trong một nghiên cứu khác, khi nhóm tác giả tiến hành lai hóa murrayafoline A với hai hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt là zerumbone & artemisinin [91] Tuy nhiên, các hợp chất tạo thành lại không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với các dòng HepG2, RD, LU-1 & FL

Sơ đồ 1.3: Sơ đồ lai hóa murrayafoline A với zerumbone & artemisinin

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CARBAZOLE HIỆN ĐẠI

VÀ ỨNG DỤNG TRONG TỔNG HỢP MURRAYAFOLINE A

2.1 Giới thiệu carbazole

Hợp chất carbazole đầu tiên được tìm thấy lần đầu tiên trong nhựa than đá vào năm 1872 bởi Graebe và Glazer, nhưng mãi đến tận năm 1965 hoạt tính sinh học của chúng mới được nghiên cứu rộng rãi mà khởi đầu là nhóm của Chakraborty [80] Từ đó các nhà hóa học và sinh vật học đã liên tục công bố các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của rất nhiều dẫn xuất carbazolee

Hầu hết các carbazole trong thiên nhiên đã biết hiện nay hầu hết được phân

lập từ thực vật bậc cao thuộc chi Murraya, Clausena, Glycosmis thuộc họ Cam Quýt (Rutaceae) Trong đó, Murraya được coi là chi chứa nhiều carbazole nhất

Cấu trúc của carbazole gồm ba vòng dính kết, được ký hiệu bởi chữ cái A, B,

C và được đánh số bắt đầu từ vòng A Dựa vào các nhóm thế trên vòng A người ta

đã phân loại lớp chất này

Hình 2.1: Khung cơ sở và cách đánh số thứ tự carbazole

Đây là một nhóm chất vô cùng đa dạng và phong phú về hoạt tính sinh học như: kháng ký sinh trùng, kháng khuẩn,kháng nấm, kháng virus, diệt công trùng, gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của các khối u, chống oxi hóa, chống kết tụ tiểu

2.2 Các phương pháp tổng hợp carbazole hiện đại

2.2.1 Phương pháp sử dụng phức sắt

Năm 1989, I.Bauer & H.J.Knolker đã đưa ra một phương pháp tổng hợp khung carbazole dựa trên phản ứng sử dụng phức của sắt trong giai đoạn trung gian [50], [124] Phương pháp tổng hợp này được áp dụng lần đầu tiên cho việc tổng hợp carbomycin A, một carbazole được tìm thấy trong tự nhiên [50] Phản ứng này bao gồm hai bước quan trọng, đó là việc hình thành liên kết C – C và oxy hóa (hình thành liên kết C – N) giữa một tác nhân là phức của muối sắt tricarbonyl electrophin

và một aryl amine Sau đó oxy hóa và loại bỏ ion kim loại để tạo ra carbazole

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp carbazole theo phương pháp sử dụng phức của sắt

Nguyên liệu đầu dùng cho phương pháp tổng hợp này là tricarbonyl cylohexadienylium) sắt tetrafluoroborate, được điều chế từ cylohexa-1,3-diene và pentacarbonyliron theo hai bước [22], [40] Sử dụng xúc tác của 1-azabuta-1,3-diene, sự tạo phức của pentacarbonyliron sẽ cho tricarbonyl (Z4-cyclohexadiene) sắt với hiệu suất cao (Sơ đồ 2.1) [54], [58], [63] Các phản ứng làm thay đổi hệ thống diene của phức này được sử dụng cho nhiều ứng dụng khác [52], [56], [67], [105], [120]

(Z5-Các muối phức sắt tricarbonyl tiêu biểu cho các tác nhân eletrophiles để phản ứng dễ dàng với nhiều loại tác nhân nucleophins [16] [56], [67] Theo quy trắc Davies – Green – Mingos, việc tấn công của nucleophiles xảy ra tại điểm cuối của

hệ phối hợp tricarbonyliron-cyclohexadienylium Phản ứng electrophin của các arylamine bởi các phức muối sắt ở gốc 5 aryl- bị thay thế phức sắt tricarbonyl (Z4-cyclohexadiene) Oxy hóa đóng vòng của các phức sắt tạo ra hệ vòng carbazole Tùy theo các tác nhân oxy hóa, ba hướng phản ứng oxy hóa tạo vòng khác nhau, dẫn đến việc hình thành liên kết C – N đã được ghi nhận

Sơ đồ 2.2: Ba hướng phản ứng đóng vòng phức trung gian sắt để tổng hợp

carbazole

Các arylamin sắt trung gian tham gia đóng vòng carbazole (nhánh A, sơ đồ 2.2) qua các bước tạo vòng oxi hóa đóng vòng, tạo vòng thơm và đồng thời loại bỏ kim loại Quá trình này có thể đạt được với các tác nhân oxy hóa khác nhau như:

MnO2 [59], [61] Iot trong pyridine [78], [79] và ferrocenium hexafluorophotphat [61] Quy trình này đã được ứng dụng để tổng hợp hyellazole [64]

Ngoài ra, một phương pháp “one-pot” có thể được sử dụng để tổng hợp một cách hiệu quả mà không cần phân lập những hợp phần phức hợp trung gian bằng cách sử dụng không khí như một tác nhân oxi hóa (nhánh B, sơ đồ 2.2) Như vậy, phản ứng theo nhánh B hình thành phức sắt tricacbonyl (Z4-4a, 9a-dihydrocarbazol), tiếp tục loại bỏ kim loại với trimethylamin-N-oxide làm xúc tác cho ta sản phẩm là một carbazole Quy trình này đã được sử dụng để tổng hợp một

số carbazole thiên nhiên như: carbazomycin A và B [71], (R ) – carquinostatin A [27], [36], [65], [68] (R )–lavanduquinocin [66] và (R ) – neocarazostatin B [74]

Cách thứ ba, thông qua việc sử dụng quinone imine – 3 – hydroxyl carbazole (nhánh C, sơ đồ 2.2) [62], [75], [83] Quá trình oxy hóa phức được thực hiện với MnO2 đối với những hợp chất quinone chứa nhóm chức imin Quá trình loại bỏ kim loại được thực hiện với trimethylamine N-oxide, sau đó hình thành hệ thống vòng thơm liên hợp carbazole Phương pháp này được sử dụng để tổng hợp một số carbazole thiên nhiên như: carbomycin C&D, hyellazole [64] và carazostatin [75]

Năm 1993, trên cơ sở phương pháp tổng hợp carbazole sử dụng phức cacbonyl của sắt, Knölker và các cộng sự đã công bố một phương pháp tổng hợp murrayafoline A khá thú vị [84] theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.3: Tổng hợp Mu-A theo phương pháp sử dụng phức sắt cacbonyl

Tuy nhiên, nhìn vào sơ đồ ta có thể thấy phương pháp này đi qua nhiều bước,

sử dụng nhiều loại tác nhân và điều kiện phức tạp Mặt khác hiệu suất tổng của cả

quá trình tạo ra murayafoline A rất thấp (4%) Vì vậy, không thích hợp để nghiên

cứu tổng hợp murrayafoline A

2.2.2 Phương pháp sử dụng xúc tác palladium

Trong tổng hợp hữu cơ, palladium được coi như một kim loại “đa năng”, sử

dụng nhiều nhất để làm xúc tác Nổi bật nhất là những phản ứng kết nối chéo

“cross-coupling” giữa các hợp chất với liên kết C-X lai hóa sp2 hoặc sp3 với các hợp

chất cơ kim Mặt khác, một lượng lớn các phản ứng trung gian sử dụng palladium

để hoạt hóa các liên kết C-H đã được nghiên cứu Trong hầu hết các trường hợp,

Pd(0) thể hiện hoạt tính xúc tác tốt nhất Tuy nhiên, các phản ứng sử dụng xúc tác

Pd(II) cũng được biết tới nhiều (ví dụ như trong quy trình Wacker) Palladium cũng

đóng một vai trò quan trọng trong phương pháp tiếp cận trong việc đa dạng hóa các

phương pháp tổng hợp carbazole Tuy nhiên chỉ một vài phương pháp trong số

chúng được sử dụng rộng rãi để tổng hợp các carbazole thiên nhiên

2.2.2.1 Phương pháp Oxy hóa đóng vòng từ các amin Buchwald-Hartwig

Một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để nâng cao quá trình tổng

hợp carbazole là sử dụng palladium tạo kết nối kiểu “coupling” C-N/C-C để hình

thành nhân pyrrole Nhiều phản ứng tổng hợp toàn phần các alkanoids carbazole

thiên nhiên đi theo con đường này Việc hình thành liên kết C-N được khởi đầu bởi

một amin Buchwald-Hartwing với một halogenua aryl hoặc triflates với arylamin

trên cơ sở sử dụng xúc tác Pd(0) để hình thành một diaryl amin [39], [101] Sau đó

tiến hành oxi hóa tạo vòng carbazole với sự có mặt của hợp chất Pd(II)

Sơ đồ 2.4: Tổng hợp carbazole theo phương pháp oxy hóa đóng vòng

amin Buchwald-Hartwig

Quá trình oxi hóa tạo vòng liên tục được cải tiến trong những năm qua Năm

1975, báo cáo đầu tiên về phương thức tạo vòng sử dụng xúc tác Pd(II) để vòng hóa

cần được sử dụng để tạo liên kết C-C trên cơ sở oxy hóa nguyên tử cacbon (C-H) lai hóa sp2 [13] Năm 1994, I.Bauer & H.J.Knolker đã cải tiến đáng kể để giảm lượng xúc tác Pd sử dụng bằng cách đưa thêm vào hỗn hợp phản ứng một lượng Cu(II) trong môi trường không khí Cơ sở phương pháp này, trong quá trình oxi hóa diarylamin, các electron được chuyển từ diarylamin đến Pd(II) để thu được carbazole và Pd(0) Sau đó hai electron lại được chuyển đến Cu(II) để thu hồi Pd(II)

và Cu(I) Cuối cùng, Cu(I) lại tiếp tục chuyển electron tới oxi, Cu(II) được tái tạo và oxy phân tử được chuyển thành nước (sơ đồ 2.5) Như vậy, Pd(II) và Cu(II) được sử dụng với lượng nhỏ làm xúc tác, hoàn nguyên trong suốt tiến trình phản ứng, chất oxi hóa ở đây chỉ là oxi lấy từ không khí [34], [51], [57] [77] [114]

Sơ đồ 2.5: Cơ chế Oxy hóa đóng vòng carbazole từ các amin

Buchwald-Hartwig sử dụng xúc tác paladi kết hợp với đồng

Sơ đồ 2.6: Tổng hợp một số carbazole bằng xúc tác Pd

Phương pháp oxy hóa tạo vòng carbazole sử dụng xúc tác Pd đã được áp dụng để tổng hợp rất nhiều các alkanoids carbazole tìm thấy trong tự nhiên như: carbazomadurin A&B [76], [86], epocarbazolins A&B [85]

Sơ đồ 2.7: Tổng hợp murrayfoline A theo phương pháp oxi hóa amin

Buchwald-Hartwig với xúc tác paladi

Ứng dụng phương pháp này, năm 2008, Fagnou và các cộng sự của mình đã

đã tiến hành tổng hợp toàn phần Murrayafoline A từ nitrobenzene theo (sơ đồ 2.7)

2-methoxy-4-methyl-1-Phương pháp này cho hiệu suất rất cao trong từng giai đoạn, vì vậy, hiệu suất tổng của cả quá trình là tương đối lớn

2.2.2.2 Phương pháp đóng vòng N-bisaryl sử dụng xúc tác đồng (Cu[II]/Pd[II]

Quá trình tạo vòng carbazole bao gồm phản ứng aryl hóa aryl amin sử dụng Cu(II) làm xúc tác và Pd(II) oxy hóa tạo vòng đã được công bố bởi nhóm của Mene‟ndez và các cộng sự (Sơ đồ 2.8) [117], [118] Các diarylamin thu được bằng quá trình N-aryl hóa sử dụng xúc tác Cu(OAc)2 giữa arylamin với phenylleadtriacetat trong điều kiện tương tự của Barton [15] Quá trình oxy hóa tạo vòng tiếp tục được sử dụng Pd(OAc)2 làm xúc tác trong điều kiện chiếu xạ vi sóng

cho sản phẩm là các carbazole Quy trình này lần đầu tiên được áp dụng để tổng

hợp murrayafoline A [117] Sau đó trong công trình công bố bởi Knolker và các

cộng sự để tổng hợp một số carbazole thiên nhiên khác như methylcarbazole, glycozolidine cũng như một số carbazole phi tự nhiên khác[ 118]

2-methoxy-3-Sơ đồ 2.8: Tổng hợp murrayafoline A và carbazole khác bằng xúc tác Cu/Pd

phát minh bởi Suzuki Đây là một đóng góp hết sức quan trọng đối với tổng hợp hữu cơ, Suzuki đã được vinh danh bằng giải thưởng Nobel hóa học năm 2010 [6] Phản ứng được mô tả tóm tắt như sau:

Trong đó: R1-BY2 là các hợp chất bo hữu cơ với R1 là các gốc ankyl, ankenyl, ankinyl hoặc aryl; BY2 là các gốc của axit boric, este boronat hoặc muối trifloborat …

R2-X là các hợp chất hữu cơ chứa halogen hoặc giả halogen

b Đóng vòng carbazole sử dụng phương pháp oxi hóa

Ngược lại với phương pháp tổng hợp đã được mô tả ở trên (Mục 2.2.2.2), quá trình N-aryl hóa và tạo kết nối C-C cũng có thể đảo ngược Theo phương pháp này, phản ứng kết nối Suzuki-Miyaura của 2-halogenarylamin thế với axit arylboronic sẽ cho 2-aminobisaryls-N (sơ đồ 2.9), sau đó oxy hóa tạo vòng trên cở

sở xúc tác Pd(II) Sự khác biệt so với các phương pháp ở trên chính là liên kết C-N được hình thành trên cơ sở sự kích hoạt các liên kết N-H và C-H, trong khi liên kết C-C được hình thành theo kiểu coupling chéo

Sơ đồ 2.9: Tổng hợp carbazole bằng phản ứng kết nối Suzuki-Miyaura

Phương pháp này đã được sử dụng để tổng hợp một số carbazole như mukonidine, glycosinine Theo đó, 2-phenylacetacetanilides được oxy hóa bởi oxi không khí với sự có mặt của một lượng xúc tác palladium (II) acetate và đồng (II) acetate cho sản phẩm tạo thành là N-acetylcarbazole, thủy phân để loại bỏ nhóm acetyl sẽ cho ta 9H-carbazole tương ứng [125] Carbazole này được xử lý với LiAlH4 sau đó oxy hóa dạng alcol tạo thành bằng MnO2 để tạo thành glycosinine

mukonidine Phương pháp này rất có tiềm năng trong việc tạo thành các carbazole

thế N như N-alkylcarbazole hoặc N-glycosylcarbazole [43]

Sơ đồ 2.10: Tổng hợp mukonidine and glycosinine phản ứng kết nối

Suzuki-Miyaura

c Phương pháp đóng vòng carbazole sử dụng amin Buchwild-Hartwig

Phương pháp này thường dùng để tổng hợp carbazole có nhóm thế ở nguyên

tử nitơ, thường được tạo thành bằng cách amin hóa hai lần amin Hartwing có chứa nguyên tử halogel ở vị trí 2,2‟ hoặc bisaryl bistriflates với sự có mặt của một lượng nhỏ Pd(0) làm xúc tác (sơ đồ 2.11)

Buchwald-Sơ đồ 2.11: Tổng hợp carbazole bằng amin Buchwald- Hartwing

Chida và các cộng sự đã sử dụng phương pháp này để tổng hợp murrastifoline A [48], [49] và murrayazoline [126] Ngoài ra, việc amin hóa hai lần amin Buchwald-Hartwig để tạo ra khung carbazole rồi tiến hành coupling hóa với xúc tác palladium(0) được sử dụng để xây dựng bộ khung 6 vòng của murrayazoline (sơ đồ 2.12)

Các ứng dụng xa hơn nữa của phản ứng sử dụng các cặp đôi N-arylation

được thực hiện để tổng hợp các carbazoles bao gồm các sản phẩm tự nhiên ellipticine [87] và mukonine [90], và nhiều sản phẩm phi tự nhiên như 11-phenylbenzofuro carbazoles [45]

Sơ đồ 2.12: Tổng hợp ( ) murrayazoline

d Phương pháp sử dụng phản ứng thế nucleophin trên vòng thơm

Phương pháp này được phát triển bởi St.Jean và các cộng sự (sơ đồ 2.13) [119] Theo phương pháp này, N-sulfonyl tự bảo vệ 2-aminophenylboronates phản ứng với 1-bromo- 2- fluorobenzen trong điều kiện xúc tác Pd(0) cho sản phẩm là một carbazole-N-sulfonyl Phương pháp này cho hiệu suất cao với các nhóm thế hút electron mạnh (andehit, ester hoặc sulfones …) ở vị trí nguyên tử nitơ của chất đầu và đã được áp dụng để tổng hợp hiệu quả glycosinine (diễn ra qua 4 bước với hiệu suất tổng khoảng 50%)

Sơ đồ 2.13: Tổng hợp carbazole bằng phản ứng ghép nối Suzuki-Miyaura thế