Khảo sát chọn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNTHỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---LÂM MAI TÙNG KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ H

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-LÂM MAI TÙNG

KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH

SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-LÂM MAI TÙNG

KHẢO SÁT CHỌN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH

SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN ĐỨC BÁCH

HÀ NỘI, NĂM 2015

Trang 3

Page ii

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trungthực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 15 tháng 7 năm 2015

Tác giả luận văn

Lâm Mai Tùng

Trang 4

đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.

Tôi xin được cám ơn chân thành PGS.TS Phan Hữu Tôn, ThS Tống Văn Hải,

Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinhhọc đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện luận văn tại Bộ môn

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong KhoaCông nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếpgiảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời gian tôi học tập

và nghiên cứu

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm

ơn tới gia đình và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trongquá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 15 tháng 7 năm 2015

Học viên

Lâm Mai Tùng

Trang 5

Page 4

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu 2

2.2 Yêu cầu 2

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây

5 1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây

7 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 8

1.3 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt nam 10

1.4 Bệnh mốc sương trên cây khoai tây 11

1.4.1 Lịch sử phát hiện 11

1.4.2 Phạm vi phân bố 12

1.4.3 Triệu chứng 12

1.4.4 Nguyên nhân gây bệnh

13 1.4.5 Điều kiện phát sinh phát triển 15

1.5 Chỉ thị phân tử và những ứng dụng 16

Trang 6

Page 5

1.5.1 Khái niệm về chỉ thị phân tử 161.5.2 Chỉ thị phân tử và chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai 21

Trang 7

Page 5

Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu nghiên cứu 30

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.3 Nội dung nghiên cứu 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Ngoài đồng ruộng 31

2.4.2 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu nông sinh học 32

2.4.3 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng sương mai R1 và R3a 34

2.4.4 Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây Phytophthora infestans 36

2.4.5 Đánh giá bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo 37

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Đặc điểm nông sinh học một số mẫu giống khoai tây vụ đông xuân 38

3.1.1 Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn 38

3.1.2 Đặc điểm thân 44

3.1.3 Đặc điểm lá 48

3.1.4 Đặc điểm hoa, quả của các mẫu giống khoai tây 52

3.1.5 Đặc điểm củ khoai tây 56

3.1.6 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 60

3.2 Đánh giá mức độ nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng 63

3.2.1 Bệnh sương mai hay mốc sương 66

3.2.2 Bệnh đốm lá 67

3.2.3 Bệnh héo xanh 67

3.2.4 Bệnh héo vàng 67

3.2.5 Bệnh hại do virut gây ra 68

3.2.6 Sâu xám 68

3.3 Kết quả PCR phát hiện gen kháng sương mai R1 và R3a 68

3.4 Phân lập nấm bệnh sương mai và lây nhiễm đánh giá khả năng nhiễm 72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

1 Kết luận 74

2 Đề nghị 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

Trang 8

Page 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Năng suất protein và năng lượng của một số cây lương thực 7

Bảng 1.2 Năng suất khoai tây của 5 nước đứng đầu thế giới trong 2 năm 2012- 2013 10

Bảng 2.1 Bảng các mẫu giống nghiên cứu 30

Bảng 2.2 Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng để phát hiện gen R1, R3a kháng sương mai 36

Bảng 3.1 Thời gian sinh trưởng 41

Bảng 3.2 Đặc điểm thân của các mẫu giống 46

Bảng 3.3 Đặc điểm lá của các mẫu giống 49

Bảng 3.4 Đặc điểm hoa, quả của các mẫu giống khoai tây 54

Bảng 3.5 Đặc điểm củ khoai tây 56

Bảng 3.6 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 60

Bảng 3.7 Mức độ nhiễm một số bệnh ngoài đồng ruộng 64

Bảng 3.8 Mức độ nhiễm một số bệnh ngoài đồng ruộng 70

Trang 9

Page vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây khoai tây 5

Hình 1.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ khoai tây sau khi luộc và nướng 8 Hình 1.3 Bản đồ các gen kháng đặc hiệu chủng bệnh mốc sương ở khoai tây 22

Hình 1.5 Bản đồ gen RB/Rpi-blb1 23

Hình 1.6 Bản đồ gen Rpi-blb2 25

Hình 3.1 Các dạng lá khoai tây 52

Hình 3.2 Các dạng thân lá khoai tây 52

Hình 3.3 Hoa và quả khoai tây 55

Hình 3.4 Một số hình ảnh về màu vỏ củ 59

Hinh 3.5 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng R1 69

Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng R3a 69

Hình 3.7 Lây nhiễm đánh giá nhân tạo 73

Trang 10

Ethylendiamin Tetraacetic Acid Amplicon length polymorphismAmplified fragment lenght polymorphismRandom amplified polymorphic DNA Resistance Gene Analog

Single sequence repeat, microsetelliteSingle nucleotide polymorphismSingle strand confortmation polimophismSequence Tagged site

Moderately repeat, dispersed and highlyvariable DNA, minisatelite

Trang 11

Page 1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ Solanaceae,

có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru, là cây trồng ngắn ngày, chiếmmột vị trí quan trọng trong các cây lương thực, thực phẩm phục vụ cho con người.Hiện nay, khoai tây là loài cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới, được trồng phổbiến thứ tư về mặt sản lượng lương thực sau lúa, lúa mì và ngô Chúng có đặc điểmrất dễ trồng, cho thu hoạch nhanh và thích ứng với các điều kiện môi trường khácnhau (International Year of the Potato 2008; Jeff Chapman và cs 2011) Tuy nhiên,khoai tây thường hay nhiễm một số bệnh hại làm ảnh hưởng không nhỏ đến năngsuất và chất lượng củ Bệnh hại trên khoai tây rất đa dạng, phong phú về thành phần

và nguyên nhân gây bệnh như: bệnh sương mai, bệnh héo vàng, bệnh đốm lá, bệnhhéo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus….Trong đó bệnh sương mai do nấm

Phytophthora infestans gây ra bệnh hại nghiêm trọng bậc nhất, gây thiệt hại 16%

năng suất trên toàn thế giới (Haverkort A và cs 2009) Bệnh có thể lây nhiễm toàn

bộ cây, bao gồm thân lá và củ (Fry W 2008)

Để đối phó với dịch bệnh, tạo sự phát triển bền vững và giảm lượng thuốcbảo vệ thực vật tạo ra sản phẩm sạch thì việc tạo ra giống khoai tây mới với khả

năng kháng cao với Phytophthora infestans được coi là chiến lược bền vững cho

việc trồng khoai tây trong tương lai

Nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, công nghệ chọn tạo giốngnhờ chỉ thị phân tử ra đời đã rút ngắn thời gian chọn tạo giống, đảm bảo độ chínhxác và quy tụ được nhiều gen mục tiêu vào một giống mà phương pháp chọn giốngtruyền thống rất khó hoặc không thể thực hiện được Để tạo được giống khoai tâymới thì việc đầu tiên là phải có nguồn gen kháng và chỉ thị phân tử liên kết với cácgen kháng đó, sau đó đánh giá và xác định khả năng kháng bệnh sương mai của cácgiống để sử dụng trong công tác lai tạo giống sau này

Gen kháng bệnh sương mai đã được lai tạo từ các loài dại S demissum, S.

stoloniferum và S tuberosum subsp andigena, S phureja là các loài khoai tây trồng

Trang 12

Page 2

phổ biến ở khắp nơi trên thế giới (Bradshaw và cs 2006) Loài S demissum của Mexico mang gen kháng bệnh sương mai là nguồn cung cấp 11 gen trội R (R1-R11)

đã được lai với S tuberosum trong những năm 1950 và 1960 để tạo giống kháng (Bradshaw và Ramsay, 2005) Gen R1, R3a là gen kháng chủng đặc hiệu với

Phytophthora infestans đã được lai tạo vào giống khoai tây truyền thống (Umaerus

và Umaerous, 1994)

Bên cạnh đó, người ta đã xác định được một hệ thống các marker phân tửDNA liên kết với các gen kháng đã được phát triển và hỗ trợ đắc lực cho chươngtrình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai Các chỉ thị phân tử DNA dựa

trên PCR cho gen R1 là R1F/R(76-2sf2/76-2SR)), gen R3a là R3-1380 đã được

nhiều nhà chọn giống trên thế giới sử dụng để phát hiện và chọn lọc giống khoai tâykháng bệnh sương mai

Trong những năm gần đây, Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Câytrồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã thu thập và lưu trữ được tập đoàn cácmẫu giống khoai tây rất đa dạng và phong phú Để khai thác được nguồn gen nàyphục vụ công tác lai tạo giống kháng bệnh sương mai chúng tôi đã tiến hành thực

hiện đề tài: “Khảo sát chọn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị

Đánh giá được đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng sâu bệnh

Phân lập các mẫu nấm sương mai (Phytophthora infestans) trên khoai tây.

Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu giống trên đồng ruộng

Dùng chỉ thị phân tử DNA phát hiện được các gen kháng R1, R3a trong

các mẫu giống khoai tây

Trang 13

Page 3

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây ( Solanumtuberosum L.) có nguồn gốc ở vùng cao nguyên

thuộc dãy núi Andes (Nam-châuMỹ) ở độ cao 2000 - 5000 mét Người Tây BanNha lần đầu tiên phát hiện ra cây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũngMagdalenna (Nam Mỹ) của người bản xứ chạy trốn, họ đã tìm thấy cây đậu, ngô vàkhoai tây Lúc đó người ta gọi khoai tây là Truffles vì hoa có màu sặc sỡ(Salaman,1949)

Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoaitây có từ khoảng 500 năm trước công nguyên Thời kỳ người Tây Ban Nha chinhphục châu Mỹ thế kỷ 16, nông dân đã trồng hàng trăm giống khoai tây dọc miềnnúi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia, Ecuador và Peru (Horton,1987) Ngày nayngười da đỏ ở vùng Titicaca vẫn còn trồng những giống khoai tây khởi thủy(Ducreux, 1989)

Khoai tây được du nhập vào nước ta là do một người Pháp là giám đốc vườnbách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, và nó nhanh chóng được trồng ở nhiều địaphương Do người Pháp là người đem cây về nước ta và phổ biến cách trồng nênnhân dân ta gọi cây này là "khoai tây" (Vũ Hướng Văn, 2007) Hiện nay, khoai tâyđược trồng tập trung chủ yếu ở đồng bằng sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng cókhí hậu mát mẻ, ôn hòa… (Đỗ Kim Chung, 2003)

1.1.2 Phân loại

Theo Hawkerkks (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó có 68loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượngNST (Tạ Thu Cúc, 2007)

Nhóm 1: Diploids : 2n = 2x = 24.

S.x arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum Juz.et Buk

Trang 14

Page 4

S phueja Juz.et Buk.

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt.

Nhóm 2 : Triploids : 2n = 3x = 36.

S.x chaucha Juz Et Buk là dạng lai tự nhiên giữa S tuberosum subp.Andigena và

S stenotomum.

S.xjuzepczukii Buk Là dạng lai tự nhiên giữa S acuale và S snenotomum,

phân bố ở trung Peru đến Nam Bolivia, có khả năng kháng bệnh sương mai

Nhóm 3: Tetraploids: 2n = 4x = 48.

Có 1 loài là : S tuberosum L và 2 loài phụ là :

Phân loài tuberosum

Phân loài Andigena (juz Et Buk) Hawkes

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh, cao trungbình từ 40-70cm đến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm sóc mà chiều caocây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt hay đậm, đôi khi

có màu phớt hồng hoặc tím tùy thuộc vào giống

Lá hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lá kép xẻlông chim, có 3 – 7 đôi mọc đối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùng thường lớnhơn gọi là lá chét đỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc

mà có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt, …

Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên một chùm hoa Nó thuộc loại hoalưỡng tính và có cấu tạo 5 : 5 : 5, cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng, cũng cóthể là phớt hồng, tím, hồng, vàng hoặc đỏ v.v phụ thuộc vào từng loại và giống

Trang 15

Page 5

Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, quả có dạng hình cầu, hình trứng hoặchình nón Vỏ quả có màu xanh đôi khi có xọc vằn hoặc đốm, trong quả có hai ngănchứa hạt và thịt quả, (Tạ Thu Cúc ,2007)

Hạt khoai tây thuộc loại rất nhỏ, trọng lượng 1000 hạt chỉ đạt khoảng 0,7gđến 1g Hạt có dạng ovan dẹt, bên ngoài là vỏ, bên trong có nội nhũ và phôi Phôikhoai tây có hình chữ U, bên trong chứa hai lá mầm phôi và rễ mầm

Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành là

do thân phát triển dưới đất, trong điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây có thể làtròn, elíp, tròn dài, đôi khi hình vuông Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể

là màu trắng, trắng nhạt, vàng, hay vàng nhạt v.v

Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng của mắt củ, là cơ quan sinh sản

vô tính của khoai tây Màu sắc của mầm khác nhau phụ thuộc vào từng giống có thểmàu trắng hoặc màu tím, khi gặp ánh sáng mầm có màu xanh

Hình 1.1 Cây khoai tây

1 Củ khoai tây 3 Hoa khoai tây

2 Lá khoai tây 4 Rễ khoai tây

5 Thân khoai tây

1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây

• Nhiệt độ

Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khảnăng phân bố, thời vụ gieo trồng, quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất của

Trang 16

Page 6

cây Tổng nhu cầu nhiệt cho cây khoai tây sinh trưởng và phát triển dao động từ

160C đến 180C Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân dao động từ 16oC – 18oC là thíchhợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển khác nhau sẽyêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau

+ Hạt nảy mầm ở nhiệt độ tối thiểu 12oC –15oC và nhiệt độ thích hợp nhất là

18oC – 22oC Nhiệt độ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ

thối

+thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt độ thích hợp là 200C- 220C

+ Thời kỳ phát triển tia củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn để thúc đẩyhình thành thân và củ (Mai Thạch Hoành, 2003)

• Ánh sáng

Khoai tây là cây ưa sáng, cường độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinhtrưởng và cho năng suất cao là từ 40.000 - 60.000 lux Thời kì từ cây non đến giaiđoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài (trên 14 h ánh sáng/ngàyđêm) để quang hợp và tích luỹ chất dinh dưỡng, đồng thời ra hoa, đậu quả Thời kìsinh trưởng sinh thực và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoai tây cần có thời gianchiếu sáng ngắn

• Độ ẩm

Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, chính vì vậy trong thâm canh để năng suấtcao cần phải cung cấp nước thường xuyên cho cây để cây sinh trưởng và phát triểntốt Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác nhau

+ Thời kỳ trồng đến xuất hiện tia củ cần đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80 %.+ Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ độ ẩm đất là 80 %

Thiếu nước hoặc thừa nước đều ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triểncủa cây (Mai Thạch Hoành, 2003)

Trang 17

Page 7

Đất có hàm lượng Chloride cao sẽ làm giảm hàm lượng chất khô của củ (TrươngVăn Hộ, 1990)

1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây

Khoai tây vừa là cây lương thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡngcao, hàm lượng dinh dưỡng của khoai tây chỉ kém trứng (Leviel,1986) Sử dụng100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng lượng, 10% sắt,10% vitaminB1 và 20 - 50% nhu cầu vitamin C cho một người trong một ngày đêm

(Beukemaetal., 1990; Horton, 1987) Khi xem xét các cây trồng nhiệt đới và cận

nhiệt đới (từ 30o vĩ Bắc đến 30o vĩ Nam) VanderZaag (1976) cho rằng, cây khoaitây sinh lợi hơn bất cứ cây trồng nào khác vì đem lại năng suất năng lượng và năngsuất protein cao nhất

Bảng 1.1 Năng suất protein và năng lượng của một số cây lương thực

Đã phát hiện ra rằng tác dụng giảm ung thư tuyến tiền liệt khi hấp thụ khoai tâythường xuyên

Trang 18

Page 8

Nước ép củ khoai tây tươi có tác dụng trung hòa độ axít cao trong dạ dày, kíchthích tiêu hóa và chữa viêm tuyến dịch vị Do vậy nhân dân Nga từ xưa đã có kinhnghiệm dùng nước ép khoai tây để uống chữa đau dạ dày

Hình 1.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ khoai tây sau khi luộc

và nướng 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Sản xuất khoai tây trên thế giới đã trải qua những thay đổi lớn Tính đếnđầu những năm 1990, hầu hết khoai tây đã được trồng và tiêu thụ ở châu Âu, Bắc

Mỹ và các nước thuộc Liên Xô cũ Kể từ đó, đã có một sự gia tăng đáng kể trong sảnxuất và nhu cầu ở châu Á, châu Phi và Mỹ Latinh, sản lượng khoai tây tăng từ dưới

30 triệu tấn vào đầu năm 1960 với hơn 165 triệu tấn trong năm 2007

Trang 19

Page 9

Hình 1.3 Bản đồ phân bố địa lý của trồng khoai tây trên toàn thế giới

(Nguồn: RTB Maps)

Châu Á và Châu Âu là khu vực sản xuất khoai tây lớn, chiếm hơn 80% sảnlượng thế giới trong năm 2007 Trong khi ở châu Phi và châu Mỹ Latinh diện tíchtrồng chiếm khoảng hơn 20% của toàn thế giới Bắc Mỹ là nơi sản xuất khoai tâyđứng đầu thế giới, khoảng hơn 40 tấn/ha Châu Á chiếm gần một nửa nguồn tiêu thụkhoai tây của thế giới, nhưng dân số lớn nên sức tiêu thụ bình quân trên đầu người ởmức khiêm tốn 24 kg vào năm 2005, nơi tiêu thụ khoai tây nhiều là châu Âu Ởchâu Phi và châu Mỹ Latinh, tiêu thụ bình quân đầu người thấp nhất, nhưng có dấuhiệu ngày càng tăng Trung Quốc hiện là nước sản xuất khoai tây lớn nhất, và gầnmột phần ba tất cả khoai tây được thu hoạch ở Trung Quốc và Ấn Độ

Trang 20

Page 10

Bảng 1.2 Năng suất khoai tây của 5 nước đứng đầu thế giới trong 2 năm 2012- 2013

Sản xuất khoai tây tại Việt Nam đã đạt đỉnh điểm vào những năm 1979 và

1980 sau đó giảm dần Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suấtthấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt (tỷ lệ nhiễm bệnhvirus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp)

Biểu đồ 1.1 Diễn biến diện tích, sản lượng khoai tây Việt Nam

(giai đoạn 2009 – 2013)

(Nguồn: FAOSTAT 2014)

Trang 21

Diện tích trồng và sản lượng khoai tây tăng dần qua các năm từ năm 2009 tớinăm 2012 nhưng không đáng kể tới năm 2013 diên tích trồng khoai tây giảm tới42%, nhưng năng suất lại tăng gần 20% so với năm 2012 Diện tích trồng giảmnhưng năng suất không vì thế mà giảm theo đây là một tín hiệu đáng mừng chongành sản xuất khoai tây ở nước ta.

Tuy nhiên, sản xuất khoai tây cũng còn gặp nhiều khó khăn trong quá trìnhtrồng cũng như chọn tạo giống Giống khoai tây thường bị thoái hóa do điều kiệnngoại cảnh và đặc biệt là hiện tượng thoái hóa do virus Chính điều đó đã thúc đẩycác nhà khoa học tìm ra các giải pháp ngăn chặn hiện tượng này Nguyễn QuangThạch, Hoàng Minh Tấn và cs (1993); Nguyễn Thị Kim Thanh năm (1998) đã cóhàng loạt những công bố kết quả nghiên cứu nhằm hoàn chỉnh quy trình sản xuấtkhoai tây giống có kích thước nhỏ sạch bệnh, tiến tới hoàn chỉnh hệ thống sản xuấtgiống khoai tây sạch bệnh có chất lượng cao ở Việt Nam

Năm 2004, Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp I đãkết hợp với Bộ môn Sinh lý thực vật – Trường Đại học Nông nghiệp I tiến hành xâydựng và đưa ra một hệ thống sản xuất giống khoai tây hoàn toàn sạch bệnh

Để chủ động khắc phục tình trạng nhiễm virus trên khoai tây năm 2010 Việnsinh học nông nghiệp đã tạo ra dòng khoai tây mới bằng phương pháp protoplast,dòng mới đã được trồng thử nghiệm và cho kết quả rất tốt

1.4 Bệnh mốc sương trên cây khoai tây

1.4.1 Lịch sử phát hiện

Bệnh mốc sương khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mêxicô đây cũng đượccoi là trung tâm đa dạng sinh học của nấm mốc sương Triệu chứng bệnh được mô

tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây Bệnh được xác định nguyên nhân là do

nấm Ban đầu Montagne đặt tên nấm là Botrytis infestans (1845), tới năm 1854 nấm được đổi tên thành Peronospora infestans, cho đến năm 1876 nấm được Montagne

và Anton de Bary đặt lại là Phytophthora infestans và tên gọi này được tiếp tục gọi

tới ngày nay Sự phát tán của nấm ra thế giới được chia làm hai giai đoạn giai đoạngiữa thế kỉ 19 và giai đoạn thế kỉ 20 cho đến nay Giai đoạn giữa thế kỉ 19 lúc nàykhoai tây bắt đầu xuất hiện và được phổ biến rộng rãi trên các nước bắc Mỹ và châu

Trang 22

Âu Cùng với sự phổ biến của khoai tây nấm mốc sương cũng phát tán ra các vùngtrồng đầu tiên là Mỹ theo nguồn bệnh trên khoai tây dại sau đó từ Mỹ lan sang châu

Âu theo đường củ giống Giai đoạn thứ 2 vào thế kỉ 20 lúc này do toàn cầu hoá vềthương mại cũng như vận chuyển hàng hoá bệnh mốc sương theo củ khoai tây pháttán ra hầu như tất cả các vùng có xuất hiện cây khoai tây Bệnh hại nặng có thể mấtmùa và dẫn tới nạn đói như ở Ireland năm 1845-1846 và ở Đức năm 1919 Bệnhmốc sương có thể coi là một trong những bệnh hại có sức tàn phá lớn nhất trong lịch

sử con người

1.4.2 Phạm vi phân bố

Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trên thế giới nơi có điều kiện lạnh đủ để

trồng khoai tây Theo thống kê của CABI 1982 nấm P infestans đã xuất hiện trên

hầu hết các châu lục Tại châu Á bệnh xuất hiện tại 26 nước trong đó có nhữngnước lân cận và láng giềng nước ta như Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Phillipin, HànQuốc, Nhật, Ấn Độ và bao gồm cả Việt Nam Do tính chất phức tạp của giai đoạn

phát tán thứ 2 của nấm P infestans không chỉ chủng cũ mang chủng nấm A1 phát

tán mà cả chủng mới A2 cũng phát tán đi toàn thế giới CABI năm 1996 cũng đưa

ra thống kê các nước đã xuất hiện chủng mới này Theo kết quả trên chủng nấm A2

đã xuất hiện ở 26 nước và vùng lãnh thổ trong đó châu Á có 5 nước là Ấn Độ,Indonesia, Hàn Quốc, Nhật, Israel Quần thể ở Hàn Quốc, Nhật, Ấn Độ đã xuất hiện

cả hai loại chủng nấm Theo những công bố mới đây có thể chủng nấm A2 đã xuấthiện ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc giáp với biên giới nước ta

Ở nước ta bệnh phân bố trên hầu hết các vùng trồng khoai tây và cà chua.Bệnh gây hại mạnh và quanh năm ở các vùng có khí hậu mát mẻ như Lâm Đồng,Lào Cai; gây hại vào vụ đông và đông xuân ở các tỉnh đồng bằng bắc bộ và bắctrung bộ nơi có 1 mùa đông lạnh

1.4.3 Triệu chứng

Bệnh gây hại toàn cây, bệnh hại trên thân, lá, củ (Kết quả điều tra bệnh hại1967-1968, Viện Bảo vệ Thực vật) Triệu chứng của bệnh rất đa dạng tuỳ thuộc vàođiều kiện thời tiết

Trang 23

Triệu chứng bệnh trên lá: Vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ màu xanhthẩm sau đó lan rộng ra có màu nâu thẫm, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻkhông rõ ràng Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá sau đó lan rộng vàophiến lá (Stevenson, 1993) Phần giữa vết bệnh hoá nâu đen do các đám mô bị chếthoá nâu, xung quanh vết bệnh thường có đám cành bào tử và bào tử phân sinh màutrắng Khi thời tiết ẩm ướt hoặc buổi sáng sớm có sương các đám bào tử phân sinhnày dày và xốp tạo ra một lớp trắng như sương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth etall, 1996).

Triệu chứng trên cuống lá, cành và thân cây Các vết bệnh lúc đầu nâu hoặcthâm đen sau đó lan rộng ra xung quanh kết hợp với nhau tạo thành đoạn dài Trênthân vết bệnh kéo dài thành từng đoạn vỏ và thân cây thâm đen thối ướt Khi điềukiện ẩm độ xuống thấp vết bệnh chết tóp lại, khi độ ẩm cao trên vết bệnh có lớpcành bào tử và bào tử phân sinh trắng như sương muối bao phủ Bệnh làm cho thâncành bị thối, mềm có mùi mốc

Triệu chứng trên củ khoai tây: Triệu chứng bệnh mốc sương có thể nhầm lẫnvới một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các đặc điểm như có vết màu nâulõm xuống Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có màu nâu xám lan rộngvào phía trong đôi khi còn ăn sâu vào trong lõi củ Các củ bị bệnh hoặc các lát củnày khi đặt ở nhiệt độ <200C và ẩm độ bão hoà có thể quan sát thấy một lớp nấmtrắng và cành bào tử phân sinh cũng như bào tử phân sinh trên bề mặt của củ (VũTriệu Mân, Lê Lương Tề, 2001)

Bệnh lan truyền trong cây có thể từ lá tới thân rồi quả,củ Nhưng cũng có thểlan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên hệ thân lá Khi bệnh xuất hiện nếu gặp điềukiện thời tiết phù hợp như nhiệt độ <200C, ẩm độ cao >80% cây sẽ nhanh chóng tànlụi có thể gây thành dịch làm giảm năng suất nghiêm trọng

1.4.4 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh mốc sương cà chua khoai tây được Anton de Bary cà Montagne xác

định là do nấm Phytophthora infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm

sương mai (Peronosporales)

Trang 24

Nấm có cấu tạo dạng sợi đơn bào, sinh sản theo hai phương thức vô tính vàhữu tính.

Phương thức sinh sản vô tính là phương thức sinh sản quan trọng nhất trongviệc phát tán tạo thành dịch bệnh trên đồng ruộng Nấm sinh sản vô tính bằng bào

tử phân sinh tạo ra bởi các cành bào tử phân sinh nằm lộ trên bề mặt vết bệnh đặcbiệt là dưới vết bệnh Cành bào tử phân sinh không màu phân nhiều nhánh cấp 1 so

le với nhau, trên mỗi đỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi lõm, đây chính là đặc điểm

riêng biệt của cành bào tử nấm P infestans so với các loài Phytophthora khác Bào

tử phân sinh hình quả chanh yên, kích thước trung bình là 22-23x16-2µ m Bào tử

có 2 kiểu nảy mầm trực tiếp và gián tiếp Nếu nhiệt độ môi trường trong khoảng

20-240C bào tử phân sinh sẽ trực tiếp hình thành ống mầm sau đó tạo thành sợi nấmxâm nhập vào tế bào mô cây kí chủ Nếu nhiệt độ môi trường từ 12-180C trong điềukiện ẩm cao hoặc có giọt nước bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du động bào tử(zoospore) có 2 roi Các du động bào tử này có khả năng chuyển động nhờ có giọtnước sẽ tìm tới các lỗ khí khổng nảy mầm tạo ra các sợi nấm và xâm nhập vào cây

kí chủ Dù là phương thức nảy mầm trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi khi xâm nhậpsợi nấm đều dùng phương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặc hìnhcầu để xâm nhập vào mô lá

Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió lan truyền bào tử phân sinh,

có thể do nước rửa trôi bào tử Bào tử vô tính có khả năng tồn tại trong đất ẩm từvài ngày tới vài tuần tuy vậy trong đất khô khả năng này khá hạn chế Trong điềukiện tồn tại trên bề mặt nước có đất bào tử cũng có thể tồn tại tới vài tuần nhưngtrong điều kiện không có đất bào tử chỉ tồn tại được vài ngày Khả năng qua đôngcủa bào tử trong đất là hạn chế nhất là các tầng đất có phủ băng giá Khả năng chịulạnh của bào tử vô tính khá tốt khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo bào tử nấm

có thể chịu được nhiệt độ tới -50C trong vòng 1 ngày Nếu bào tử nấm có khả năngnảy mầm và xâm nhập vào củ khoai tây thì khả năng qua đông của nấm lại rất cao,bào tử cũng có thể sống sót qua đông nếu nằm trên đất bám vào bề mặt củ trong quátrình bảo quản qua đông và là mầm bệnh cho vụ sau

Trang 25

Phương thức sinh sản hữu tính có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sự tồn dưcủa bệnh Bào tử trứng hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơquan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium) Saukhi phối giao nhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứnglưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31x50 µm (Erwin và Ribeiro, 1996) Bào

tử trứng có khả năng tồn tại lâu trong đất mà không mất đi khả năng nảy mầm và độctính Đặc biệt oospore có khả năng tồn tại trong hạt cà chua là nguồn bệnh đặc biệtnguy hiểm cho vụ sau Tuy vậy chỉ khi đủ cả 2 chủng nấm cùng với điều kiện lạnh

ẩm mới sảy ra hiện tượng sinh sản hữu tính Hiện tượng này chưa tìm thấy sảy ra ởnước ta

P infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau tuỳ thuộc vào

vùng sinh thái cũng như chế độ phòng trừ của từng vùng Mỗi chủng khác nhau cóđộc tính khác nhau và khả năng xâm nhiễm trên mỗi giống cà chua, khoai tây làkhác nhau chính vì vậy việc xác định chủng nấm tại các vùng sinh thái sẽ đưa ra cơcấu giống cây trồng thích hợp để giảm tối đa tác hại của bệnh

Bệnh mốc sương khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nơi đây cũng chính lànguồn gốc ra đời của cây khoai tây Sau đó bệnh đã lan ra các nước châu Âu, châuÁ cùng với việc di thực của cây này Bệnh được chính thức xác định đầu tiên năm

1930 ở Đức, 15 năm sau (1845-1848) bệnh trở thành dịch nguy hiểm ở Bắc Âu, đặcbiệt ở Ai-rơ-len Hiện nay bệnh phổ biến và gây hại rất lớn ở các vùng trồng khoaitây trên thế giới và ở nước ta

1.4.5 Điều kiện phát sinh phát triển

Bệnh gây bệnh nhờ những bào tử, chúng có thể phát tán nhờ gió chuyển từnơi này sang nơi khác, cây này sang cây khác Bào tử theo mưa, nước tưới xuốngđất, xâm nhập vào củ, phát sinh chủ yếu khi củ bắt đầu hình thành gây hại trực tiếpđến năng suất

Bệnh có quan hệ chặt chẽ với thời tiết như lượng mưa, ẩm độ, nhiệt độ Nếunhiệt độ thấp hơn 20oC + mưa (hoặc sương) bệnh phát triển liên tục Nếu vườnkhoai tây được bón đạm nhiều, mất cân đối hoặc trồng quá dày, tiêu thoát nước

Trang 26

kém, việc trồng khoai tây liên tục không có thời vụ rõ ràng, xen kẽ, không phân khuvực là những điều kiện thuận lợi để bệnh phát sinh và phát triển.

Ở nước ta bệnh phá hại nặng trong những năm thời tiết ẩm ướt, rét và mưakéo dài, trời có nhiều sương mù, nhiệt độ dưới 20oC Ở miền Bắc bệnh phá mạnh từtháng 12 đến tháng 2

Đà Lạt là vùng cao nguyên có khí hậu ôn hòa, hội tụ đủ những điều kiệnthuận lợi cho bệnh tồn tại và phát triển quanh năm Hầu hết những giống khoai tâyhiện có trong sản xuất tại Đà Lạt đều bị nhiễm bệnh, ở mức độ nặng nhẹ khác nhau.Mức độ bệnh còn phụ thuộc vào mùa vụ Mùa mưa (từ tháng 4-5 đến tháng 9-10)bệnh gây hại nặng và ảnh hưởng lớn đến năng suất, vào mùa khô mức độ bệnh giảm

* ALP (Amplicon length polymorphism) Sự đa hình về chiều dài những đoạn DNA

được nhân lên trên cơ sở nhân gen PCR Sự đa hình đựơc phát hiện ngay bằng cáchđiện di sản phẩm PCR nhân gen trên gel, thường là agarose hoặc acrylamide

* AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism) Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên

tắc sử dụng enzym giới hạn cắt AND hệ gen và nhân bội các đoạn ADN chọn lọcbằng kỹ thuật PCR, được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995 Để thiết kế đượccác mồi đặc trưng, trước hết ta cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn Khi

xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau.Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt Dựa vàotrình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor) Sau đó dùng enzym ligase đểnối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt Dựa vào trình tự adaptor tathiết kế mồi PCR Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với

Trang 27

adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1-3nucleotide Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở haiđầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản Chỉ thị AFLP rất chính xác, có thể

sử dụng cho tất cả các thực vật, động vật Loại chỉ thị này vô cùng hữu hiệu trongviệc lấy vân tay AND của bất kỳ cá thể sinh vật nào

* RAPD (Random amplified polymorphic DNA) Chỉ thị RAPD được hình thành

dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR được William và cộng sự phát triển vào năm

1990 Phương pháp RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADNnhất định mà dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫunhiên Mồi ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6-12 nucleotit, nhiệt

độ kết cặp thấp Ưu điểm của loại chỉ thị này là không cần phải biết trình tự cácnucleotide trên đoạn ADN cần nhân, tiêu tốn ít ADN mẫu Bên cạnh đó chỉ cần một

bộ mồi ta có thể sử dụng được với các loài khác nhau Quy trình thực hiện nhanh,

dễ dàng Bên cạnh đó cũng còn một số hạn chế như: chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi

sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trưng nên không phân biệt được thể

dị hợp tử RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích, điện di để tìmliên kết gen thường không đồng nhất Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là sựnhân bội của nhiều locus, độ nhạy của RAPD phụ thuộc vào điều kiện của phảnứng, đặc biệt là ở những cơ thể có hệ gen lớn như lúa mì (Devos và Gale, 1992)*DAF (DNA amplification fingerprinting) Phương pháp nhân DNA in vân tay dùngrất nhiều đoạn mồi đơn ngắn

* Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương tự gen kháng) Khi so sánh

trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau,các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, nhưvùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit(Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein kinaza (PK) (Grant và ctv., 1995) Những vùng này đã được sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa trên PCR,

đó là kỹ thuật RGA Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xâydựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng Bởi vậy, sản phẩm “nhậndạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng Kỹ thuật RGA đã được

Trang 28

dùng để tách, lập bản đồ gen kháng đạo ôn Pi-44(t) (Chen và ctv., 1999), cũng như

một số gen khác

* SSR (Single sequence repeat, microsetellite) Chỉ thị SSR (Simple Sequence

Repeats) còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) được phát triển bởi Litt và Luty năm

1989 Vi vệ tinh là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần Ví dụ:

NNNNNNN(GA)20-40NNNNNNNNN NNNNNNN(CAT)16-26NNNNNNNNN NNNNNNN(TTGG)12-18NNNNNNNNN

Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người, sau đó đựơc dùng trongnghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và Sebatian, 1998) Bộ gen Eukaryote có nhiềuđoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từngloài Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến,tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ mộtđến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngànlần hoặc nhiều hơn Các ‘vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinhvật Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ởcác cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau

Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùngkhác Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn Đây là loạichỉ thị đang được sử dụng nhiều trong lập bản đồ gen, trong nghiên cứu đa dạng ditruyền và chọn giống MAS Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thựchiện, không tốn kém SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao,nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho mộtloài Tuy nhiên, SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đadạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng mộtloài động vật hay thực vật Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen trongchọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiêncứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng

Trang 29

trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khảnăng cho phép đánh giá mức độ alen thuộc một locut.

* Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhấttrong hệ gen Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong hệgen, ADN từ hai các thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khácbiệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp Một cặp base ở một vị trí nào

đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp base khác làbiến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏhơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một SNP Hiện nay, người ta

đã công bố 3 triệu SNP trong hệ gen người, nhiều hơn bất cứ chỉ thị phân tử nào đãđược công bố trước đó Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ hệ

gen người cho đến hệ gen các sinh vật khác như cây Arabidopsis, cây lúa SNP có

những ưu điểm nổi bật sau:

- SNP có tính chất “diallelic” trong quần thể và tần suất alen của nó có thể đượcước

đoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loại xét nghiệm kỹ

thuật

- SNP là những chỉ thị phân tử có tính ổn định rất cao về mặt di truyền Loại chỉ thịnày dựa trên so sánh trình tự của từng gốc nucleotide một, vì thế rất chính xác, sốlượng đa hình cực kỳ nhiều Nhược điểm chính: phải sử dụng kỹ thuật xác địnhtrình tự ADN nên chỉ thực hiện được ở các phòng thí nghiệm có đủ trang thiết bị

Người ta cũng có thể phát hiện chỉ thị này bằng cách sử dụng enzyme CelI cắt sản

phẩm PCR tại vùng có SNP của cây nghiên cứu Phương pháp này mang lại hiệuquả cao và đã từng được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

* SSCP (Single strand confortmation polimophism) Sự đa hình về cấu trúc sợi

đơn DNA, trong gennom có một số nơi DNA tại đó mở xoắn tạo thành hai sợi đơn.Những nơi mở xoắn được được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng của genom sinhvật

Trang 30

* MRDHV (Moderately repeat, dispersed and highly variable DNA, minisatelite).

Phương pháp dùng kĩ nghệ DNA để nghiên cứu sự đa dạng của những đoạn DNA,mẩu vệ tinh nhỏ dễ biến động phân tán và lặp đi lặp lại trong bộ genome của sinh vật

Trang 31

Page 20

* STS (Sequence Tagged site) Chỉ thị STS do M Olson và cộng sự đề xuất năm

1989 STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiệnbằng kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sửdụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome STS là chỉ thịnhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết

kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này Các đoạnmồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Phươngpháp này dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém, hơn nữa lại sửdụng mồi đặc hiệu nên kết quả ổn định Nhược điểm của chỉ thị này là cần biết trình

tự hai đầu của các đoạn mẫu dò mới có thể tiến hành được nghiên cứu, không cótính chất đa hình như các chỉ thị phân tử khác, tần suất đa hình thấp, thay đổi ở mỗilocus và ở mỗi cặp lai cụ thể

Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến làloại chỉ thị mới - chỉ thị phân tử ADN thế hệ đầu tiên, với những ưu điểm vượt trội

so với những chỉ thị hình thái hay chỉ thị hóa sinh đang được sử dụng trong nhữngnghiên cứu đương thời Tiếp theo, mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉthị phân tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh phản ứngchuỗi trùng hợp - PCR Với khả năng tạo ra cấp số nhân bản sao chỉ từ một vài phân

tử ADN ban đầu, kỹ thuật PCR được coi là phát minh mang tính bước ngoặt, làmthay đổi hoàn thành cách thức tiếp cận - nghiên cứu sinh học phân tử, và là cơ sởnền tảng ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo Sau này, nhiều chỉ thị phân tửADN đã được phát triển và ứng dụng trong nghiên cứu nói chung như RAPD, SSR,AFLP như đã nêu ở trên

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chỉ thị tử để phát hiện gen khángbệnh sương mai, đó là chỉ thị SSR Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần cónhững yêu cầu như: bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội (cho phép phânbiệt cá thể đồng hợp tử - dị hợp tử), phân biệt rõ ràng giữa các alen, xuất hiện nhiềutrong genôm (tần suất xuất hiện trong hệ genôm cao), phân bố đều trên hệ genôm,

dễ dàng tiếp cận đánh giá, trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen), phântích nhanh và dễ dàng, khả năng tái lập cao, kết quả trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở

Trang 32

Page 21

nghiên cứu, chi phí thấp Trong thực tế, không có một chỉ thị phân tử ADN nào lýtưởng, đạt được đầy đủ những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người

ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phân tử ADN thỏa mãn một số điều kiện chính

1.5.2 Chỉ thị phân tử và chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương

mai

Trong số các biện pháp phòng trừ tác hại ảnh hưởng của bệnh sương mai thìviệc sử dụng các giống kháng ngày càng được quan tâm nhiều hơn Việc lựa chọngen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức độ đadạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh và tính độc của quần thể tácnhân gây bệnh, đặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế Với sự phát triển mạnh

mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề

“chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ranguồn gen kháng sương mai Các nhà khoa học đã tìm được vị trí các gen được định

vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen

đó, tạo ra các bản đồ di truyền liên kết gen Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thểphát hiện được sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thịliên kết chặt với gen đó

Có ít nhất 11 gen kháng bệnh mốc sương thuộc loại gen kháng đặc hiệu

chủng đã được xác định trong loài khoai tây dại S demissum (ký hiệu R1 đến R11).

Một số gen kháng trong số này đã được lập bản đồ (Hình 2.4) hoặc đã được nhândòng (Bradshaw và cs, 2006) và đưa vào các giống khoai tây khác nhau (Umaerus

và cs, 1994) Hiện nay, hầu hết các giống khoai tây trồng trọt mới chọn tạo mangmột hoặc nhiều gen kháng bệnh mốc sương và biểu hiện một mức độ kháng tốt trênđồng ruộng (Bradshaw và cs, 2006; Gebhardt, C., and Valkonen, J P 2001) Tất cảnhững gen kháng R là đặc hiệu chủng với phản ứng kháng nhạy Tuy nhiên, các gen

kháng như vậy có thể mất hiệu quả khi gặp các chủng P.infestans mới độc hơn có

khả năng gây nhiễm được các gen kháng trước đó Ví dụ, hiện nay các chủng phân

lập P infestans đã được xác định có thể khắc phục tất cả 11 gen kháng R trong khoai tây (Bradshaw và cs, 2006) Tuy nhiên, khi quy tụ các các gen kháng đặc hiệu

chủng thường tạo ra được tính kháng mạnh hơn và bền hơn như đã được quan sátthấy ở nhiều loài thực vật, bao gồm cả khoai tây (Collins và cs, 1999; Naess, S và

Trang 33

Page 22

cs, 2001) và cà chua (Gardner, R và cs, 2010; Panthee, D R và cs, 2010)

Hình 1.4 Bản đồ các gen kháng đặc hiệu chủng bệnh mốc sương ở khoai tây

(Nguồn: Sokolova và cộng sự, 2011, Bradshow và cs, 2006 và Lokossou và cs, 2010)

Trong số 11 gen kháng bệnh mốc sương (R) đã được xác định trong S.

demissum, bốn gen kháng R1, R2, R3a, và R3b, đã được nhân dòng (73.170 Gen

kháng R1 tạo ra tính kháng bệnh mốc sương cả ở lá và củ, là gen kháng bệnh mốcsương đầu tiên được nhân dòng và mô tả đặc điểm (Ballvora, A, 2002) Gen R1 cómột vùng xoăn kép (coiled-coil)và được cho là các vùng NBS (nucleotide bindingsite) và LRR (leucine-rich repeat) Các nghiên cứu dựa trên Effector với gen độc

Avr2 đã chỉ ra rằng gen kháng R2 và gen “tương tự R2” (R2-like), nằm trên nhóm

liên kết IV gần chỉ thị TG339 trong một cụm gen kháng bệnh mốc sương lớn (Park,

T H và cs, 2005), có chức năng tương đương với Rpi-blb3 và Rpi- abpt (Hein, I vàcs; Vleeshouwers, V và cs, 2011) chia sẻ cấu trúc NBS-LRR Sử dụng bản đồ chitiết và quy trình sàng lọc bệnh chính xác, đã xác định được gen kháng R3 bao gồm

hai gen liên kết chặt làR3a và R3b, nằm trên đầu cuối của nhiễm sắc thể 11, cách nhau khoảng 0,4 cM (Huang, S và cs, 2004) Trong khi R3aquy định khả năng kháng ở lá thì R3bquy định tính kháng ở củ với các chủng phân lập P infestans (Li,

G và cs, 2011) Các nghiên cứu tiếp theo đã được xác định rằng gen kháng R3a mã

hóa một protein CC-NBS-LRR và có 82% nucleotide tương đồng với gen kháng

Trang 34

Page 23

R3b, 2 gen này cùng nằm trong cụm gen R3 (101) GenR3b mã hóa protein đặc hiệu

nhận biết gen độc AvR3b, đây là một yếu tố không độc (avirulence) mới được xác định từ P infestans Gen kháng R3b không nhận biết được proteinAvR3a mã hóa bởi gen không độcAvR3a Điều này đã chỉ ra rằng mặc dù các gen R3a và R3b có mức

tương đồng cao nhưng rõ ràng chúng có khả năng nhận biết các thụ thể đặc hiệukhác biệt (Li, G và cs, 2011)

Hình 1.5 Bản đồ gen RB/Rpi-blb1 (Nguồn: Song và CS, 2003)

Ít nhất 3 gen kháng đã được báo cáo trong loài dại S bulbocastanum quy định tính kháng phổ rộng chống lại nhiều chủng phân lập P infestans (Vleeshouwers, V,

2011 và Van der Vossen, E, 2005) Gen đầu tiên là gen RB được lập bản đồ trên

nhiễm sắc thể số 8 ở khoai tây và sau đó đã được nhân dòng và mô tả đặc điểm(Hình 2.5) (Song, J, 2003) Một gen tương tự cũng được lập bản đồ và nhân dòng

bởi một nhóm nghiên cứu khác, trong đó tên của nó được gọi là Rpi-blb1(Van der Vossen, E, 2005) Đáng tiếc là loài dại S bulbocastanum không thể lai trực tiếp với loài khoai tây trồng S tuberosum, làm cho việc nghiên cứu chọn giống về gen này

tưởng như trở thành vô nghĩa May mắn thay, gần đây một gen tương đồng với gen

RB (tên khác là Rpi-blb1) đã được phát hiện trong loài S stoloniferum là một loài có

Trang 35

Page 24

thể lai được với khoai tây trồng S tuberosum mặc dù tỷ lệ lai thành công thấp, mở ra

cơ hội chuyển gen kháng này sang khoai tây trồng thông qua lai hữu tính (Wang,

M., Allefs và cs, 2008) Thêm vào đó, gen tương tự RB (Rpi-blb1) có 83,5%

nucleotide tương đồng và tạo ra tính kháng phổ rộng đối với bệnh mốc sương khoai

tây đã được nhân dòng từ mẫu giống khoai tây dại PI275260 thuộc loài S.

verrucosum, một loài cũng có thể lai được với khoai tây trồng Thật thú vị, gen chức

năng tương đồng ở loài này có tên RBver chứa một đoạn chèn lặp lại giàu leucinehoàn chỉnh so với RB/Rpi-blb1, và chỉ khác với alen mẫn cảm của nó bốn amino acid Rõ ràng, bởi vì gen RB/Rpi-blb1đã được nhân dòng, nên chúng có thể

được chuyển vào cả khoai tây và cà chua thông qua phương pháp chuyển gen

Nguồn khángbệnh mốc sương thứ hai đã được xác định trong loài dại S.

bulbocastanum, từ đó đã xác định và lập bản đồ gen Rpi-blb2 nằm trên nhiễm sắc

thể số 6 (165) Gen này đã được lập bản đồ chi tiết và được nhân dòng, cho thấy có

82 % trình tự tương đồng ở mức độ acid amin so với gen Mi-1 quy định tính kháng

tuyến trùng nốt sưng rễ và 2 gen này đều nằm trên cùng một vùng ở nhiễm sắc thể

số 6 (Van der Vossen, E và cs 2005).

Trang 36

Page 25

Hình 1.6 Bản đồ gen Rpi-blb2 (nguồn: Van der Vossen và cs, 2005)

Một nguồn kháng bệnh mốc sương thứ ba được tìm thấy trong loài S.

bulbocastanum dẫn đến việc xác định và lập bản đồ chi tiết gen Rpi-blb3đến vùng

0,93 cM của nhiễm sắc thể 4 (Park, T H và cs, 2005) Ngoài các gen kháng bệnh mốc sương lớn từ S demissum và S bulbocastanum, một vài gien kháng bệnh mốc

sương khác đã được xác định trong các loài khoai tây dại khác, bao gồm S

berthaultii Hawkes (Ewing, E E và cs 2000), S mochiquense Ochoa (Smilde, W.

D và cs 2005), S phureja Juz & Bukasov (Śliwka, J và cs, 2010), S pinnatisectum Dunal (97), và S Ruizceballosii và S kurtzianum (Śliwka, J, và cs 2010).

Bên cạnh các gen kháng bệnh mốc sương khoai tây lớn kể trên, một số QTLquy định tính kháng số lượng hay tính kháng đồng ruộng đối với bệnh mốc sương

đã được xác định trong khoai tây Các QTL kháng đã được xác định dựa trên cácloại quần thể khác nhau:

1) Lai cùng loài giữa các giống khoai tây trồng S tuberosum (Śliwka, J và cs, 2007),

Trang 37

Page 26

2) Lai giữa các loài khoai tây trồng S phureja và S tuberosum

3) Lai giữa loài khoai tây trồng S tuberosumvới các loài dại khác, bao gồm

S berthaultii, S microdontum, S paucissectum, S vernei (Simko, I và cs,

đồng nhất giữa các quần thể và có thể thay đổi theo loài và các chủng phân lập P.

infestansđược sử dụng, thay đổi theo phương pháp đánh giá bệnh, phương pháp

phân tích bản đồ, và điều kiện môi trường của các thí nghiệm Tuy nhiên, theo cácnghiên cứu lập bản đồ QTL khác nhau, một QTL kháng lớn nằm trên nhiễm sắc thể

số 5 thuộc vùng lân cận gen R1, có vẻ ổn định qua nhiều nghiên cứu, cho thấy nó

có tiềm năng để phát triển các giống kháng mới Thật không may, QTL này cũngliên quan tới tính trạng thời gian sinh trưởng dài (Visker, M H P W và cs 2005),làm giảm giá trị của nó trong chọn giống Hiện vẫn chưa biết liệu có phải có mộtgen duy nhất tại vị trí này với quy định cả tính kháng mốc sương và thời gian sinhtrưởng của cây hay do một gen độc lập khác liên kết chặt với gen kháng bệnh mốcsương làm ảnh hưởng đến cả hai đặc điểm là tính kháng bệnh mốc sương và thờigian sinh trưởng dài

Trang 38

Page 27

Hình 1.7 Một số chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng sương mai

1.5.3 Cơ chế kháng của cây với nấm Phytophthora infestans

Khả năng kháng Phytophthora infestans của cây đặc trưng bởi phản ứng tự

vệ làm cho các tế bào bị xâm nhiễm tự chết nhanh chóng, gọi là phản ứng siêu nhạy

(HR) Ở giai đoạn đầu xâm nhiễm, Phyotophthora infestans xâm nhập vào tế bào và

tiết vào tế bào chủ các effectors Các effector hoạt động như các yếu tố không độc

Trang 39

-Page 28

Avirulence (Avr) và kích hoạt gen kháng R tương ứng theo mô hình gen đối gen.Khi các protein R nhận biết được các effector, khả năng miễn dịch được kích hoạtdẫn đến phản ứng siêu nhạy lập tức xảy ra bằng cách tích lũy H2O2 ở vị trí xâmnhiễm và cảm ứng nhanh chóng quá trình chết tế bào theo lập trình (Programmedcell death - PCD) tác động đến các tế bào xung quanh vị trí bị xâm nhiễm (Bolwell,1999) làm hạn chế sự xâm nhiễm Quan hệ gen đối gen được giả thiết dựa trêntương tác trực tiếp giữa protein R và Avr Sự tương tác này được gọi là mô hìnhelicitor – receptor, trong đó các elicitor là các protein Avr đóng vai trò chất kíchhoạt còn receptor là các protein kháng đóng vai trò là chất tiếp nhận Phản ứngkháng chỉ hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor

1.5.4 Các nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai

Một số loài Solanum dại và trồng đã được kiểm tra khả năng kháng bệnh

sương mai và do đó được sử dụng để lập bản đồ di truyền của gen R / QTLs Một

loạt các gen R có trong các loài hoang dại bao gồm R1- R11 từ S demissum;

RB/Rpi-blb1, Rpi - blb2, Rpi - blb3, Rpi - bt1 và Rpi - abpt từ S bulbocastanum; Rpi

- bst1 từ S brachistotrichum; Rpi - edn1.1 từ S edinense; Rpi - hjt1.1, Rpi - hjt1.2

và Rpi hjt1.3 từ S hjertingii ; Rpi mcd1 từ S microdontum; Rpi snk1.1 và Rpi

-snk1.2 từ S schenckii; Rpi - veR1 từ S verrucosum; Rpi - pnt1 từ S pinnatisectum; Rpi - sto1 và Rpi - sto2 từ S stoloniferum; Rpi - pta1 từ S papita; Rpi - plt1 từ S polytrichon; Rpi - mcq1 từ S mochiquense; Rpi - phu1 từ S phureja; Rpi - vnt1.1, Rpi - vnt1.2 , Rpi - vnt1.3 từ S venturii ; Rpi - dlc1 từ S dulcamara; Rpi - ber1 và Rpi - ber2 từ S berthaultii; Rpi - avl1 từ S avilesi; Rpi - cap1 từ S capsicibaccatum

và Rpi - qum1 từ S circaeifolium spp quimense.

Loài S demissum của Mexico mang gen kháng bệnh sương mai là nguồn cung cấp 11 gen trội R (R1-R11) đã được lai với loài khoai tây trồng là S.

tuberosum trong những năm 1950 và 1960 để tạo giống kháng (Bradshaw và

Ramsay 2005) Đây là nguồn gen kháng tiềm năng với tác nhân gây bệnh phục vụcông tác chọn tạo giống cây trồng

Nghiên cứu của Đào Mạnh Hùng và CTV (1995) thì trên các giống Ba Lan,giống Hồng Lan bị bệnh sương mai phá hại nặng, giống HP1, HP5 có khả năng chịu

Trang 40

Page 29

bệnh khá lớn Theo Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự (1982) các giống nhập nội từ châu

Âu như: Hungari, Bungari, Liên Xô cũ thường bị nặng và tốc độ phát triển bệnhcũng khá nhanh, một số giống khoai tây Đức nhập nội như: Cardia, Mariella, giốngkhoai tây Pháp, giống Thường Tín… đều là những giống nhiễm bệnh nặng

Gen R1 là một gen kháng sương mai quan trọng, có tính kháng cao, kháng được các chủng đặc hiệu (Stewart và cộng sự, 2003) Gen R1 được xác định nằm

trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số V là gen kháng trội có nguồn gốc từ loài

khoai tây dại Solanum demissum (Leonards-Schippers và cs.1992; Ballvora và cs.

2002) Gen này được định vị giữa maker RFLP GP21 và GP179; nằm trong vùng

“nóng” chứa nhiều gen kháng (Gebhardt và Valkonen 2001) Maker 2sf2/76-2SR) đã được sử dụng để phát hiện gen R1 bởi Ballvora và cộng sự năm

R1F/R(76-2002

Gen R3a được xác định nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số XI là gen kháng trội có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum demissum (Huang và

cộng sự,

2005) Gen R3a có tính kháng cao, kháng chủng đặc hiệu của tác nhân gây bệnh

sương mai Sokolova và cộng sự (2011) đã tìm ra maker R3-1380 để phát hiện

gen kháng R3a.

Cả 2 gen R1 và R3a đã được lai tạo vào giống khoai tây truyền thống để tạo

giống kháng hữu hiệu (Umaerus và Umaerous 1994) Trong những năm gần đây,nhóm nghiên cứu của Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen Cây trồng, Họcviện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và sử dụng 2 gen trên vào chương trìnhchọn tạo giống khoai tây lai Bước đầu đã chọn được một số tổ hợp lai cho Ưu thếlai cao và kháng sương mai tốt

Định dạng
Số trang	107
Dung lượng	8,96 MB