Thử Nghiệm Huyết Thanh Học Và Hóa Miễn Dịch Trong Chuẩn Đoán Nhiễm Trùng

ð Hữu dụng cho lâm sàng: thấp ð Ý nghĩa để chẩn đoán xác định: cao Huyết thanh lần 1 Huyết thanh lần 2 Biện luận kết quả dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM Hiệu giá kháng thể thử n

THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC

& HÓA MIỄN DỊCH

Phạm Thái Bình

ÁP DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN

TÁC NHÂN NHIỄM TRÙNG

THỬ NGHIỆM

HUYẾT THANH HỌC

Mục đích của thử nghiệm huyết thanh học

Tìm kháng thể đặc hiệu với một loại kháng nguyên của tác nhân nhiễm trùng có trong huyết thanh của bệnh nhân.

Chẩn đoán gián tiếp tác nhân nhiễm trùng.

Biện luận kết quả thử nghiệm huyết thanh học

ð Biện luận thử nghiệm huyết thanh

học phải dựa trên giá trị định lượng

của kết quả thử nghiệm.

ð Kết quả định lượng thường được

hiển thị bằng hiệu giá kháng thể.

ð Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng

cao nhất của huyết thanh bệnh

nhân mà thử nghiệm vẫn còn

dương tính.

Biện luận kết quả huyết thanh học dựa vào:

− Giá trị huyết thanh kép

− Hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM

− Hiệu giá kháng thể đặc hiệu so với giá trị cắt

Biện luận kết quả dựa vào giá trị huyết thanh kép

7-14 ngày

Hiệu giá lần 2

Hiệu giá lần 1

(+):

ð Đối với các kết quả định lượng hiển thị

bằng giá trị OD thì các nhà sản xuất thường

đưa ra một công thức để xác định như thế

nào là có sự gia tăng có ý nghĩa định lượng

của huyết thanh lần 2 so với lần 1

ð Hữu dụng cho lâm sàng: thấp

ð Ý nghĩa để chẩn đoán xác định: cao

Huyết thanh lần 1

Huyết thanh lần 2

Biện luận kết quả dựa vào hiệu giá kháng thể đặc hiệu IgM

Hiệu giá kháng thể

thử nghiệm

(giá trị OD)

≥

(+):

Hiệu giá kháng thể trung bình của người bình thường (giá trị OD)

ð Huyết thanh được lấy 1 lần và xác định

kháng thể đặc hiệu IgM

ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao

ð Ý nghĩa để chẩn đoán xác định: cao

Biện luận kết quả dựa vào hiệu giá kháng thể so với giá trị cắt

hoặc

Hiệu giá thử nghiệm

Hiệu giá cắt

(+):

thanh

k × ODgiá trị cắt

ð Xác định hiệu giá (giá trị OD) của huyết

thanh thử nghiệm và so sanh với hiệu giá

(giá trị OD) cắt của quần thể

ð Hiệu giá (giá trị OD) cắt của quần thể được

xác định bằng điều tra dịch tễ học

ð Hữu dụng cho lâm sàng: cao

ð Ý nghĩa để chẩn đoán xác định: trung bình

Một số thử nghiệm huyết thanh học thông dụng

ð Tụ trực tiếp (direct agglutination)

ð Tụ hồng cầu thụ động (passive haemagglutination)

ð Kết hợp bổ thể (complement fixation)

ð ELISA phát hiện kháng thể (antibody detection ELISA)

Tụ trực tiếp (Direct agglutination)

Kháng nguyên

dạng hạt

Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần tìm

Nguyên tắc

Thừa kháng nguyên

KHÔNG TỤ

Thừa kháng thể KHÔNG TỤ

Kháng nguyên/kháng thể tương xứng TỤ

Tụ trực tiếp (Direct agglutination)

Hiện tượng tiền vùng (prozone)

Thử nghiệm Widal phát hiện sự ngưng kết

của kháng thể đối với kháng nguyên O

và H của Salmonella.

ð Widal (+):

− Nhiễm trùng do Salmonella.

− Đã chủng ngừa thương hàn trước đó

− Có phản ứng chéo với nhiễm trùng không

phải Salmonella.

− Nhiễm trùng do các tác nhân khác như sốt

rét, sốt xuất huyết, Enterobacteriaceae.

ð Widal (-):

− Không có nhiễm trùng do Salmonella.

− Đang trong tình trạng mang mầm bệnh

− Sự hạn chế về kỹ thuật hoặc sai sót trong

thực hiện thử nghiệm

− Ảnh hưởng do điều trị kháng sinh

Tụ trực tiếp (Direct agglutination)

Ứng dụng

Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần tìm

Kháng nguyên hoà

tan gắn lên bề mặt

hồng cầu

Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination)

Nguyên tắc

Tụ hồng cầu thụ động (Passive Haemagglutination)

Ứng dụng

Thử nghiệm TPHA (Treponema pallidum Haemagglutination)

chẩn đoán giang mai.

Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)

Nguyên tắc

Kháng nguyên

(đặc hiệu với kháng

thể muốn tìm)

Huyết thanh (có kháng thể đặc

hiệu muốn tìm)

Bổ thể

Kháng nguyên

(đặc hiệu với kháng

thể muốn tìm)

Huyết thanh (không có kháng thể

đặc hiệu muốn tìm)

Bổ thể

Phức hợp KN-KT tiêu thụ hết bổ thể

Bổ thể không

bị tiêu thụ

HCC-αHCC

HCC-αHCC

Hồng cầu còn nguyên vẹn

Hồng cầu bị ly giải (do bổ thể tấn công)

Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)

Ứng dụng

Thử nghiệm CFT (Complement Fixation test) chẩn đoán:

− Brucella

− Campylobacter

− Chlamydia

− Leptospira

− Legionella pneumophila

− Mycoplasma pneumoniae

− Influenza A virus

− Rotavirus

− …

ELISA phát hiện kháng thể (Antibody detection ELISA)

Nguyên tắc

ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay)

Giếng ELISA

gắn KN đặc hiệu

Mẫu thử chứa

KT muốn tìm

Cộng hợp là kháng thể gắn men và đặc hiệu loài KT muốn tìm

KT gắn vào KN và bị

Cơ chất sinh màu (TMB, OPD…)

Cộng hợp gắn vào KT

Xuất hiện màu, nhờ vậy có thế phát hiện và định lượng được

KN dựa vào trị số OD

ELISA phát hiện kháng thể (Antibody detection ELISA)

Ứng dụng

ELISA phát hiện kháng thể chẩn đoán:

− S typhi

− Chlamydia

− Leptospira

− …

THỬ NGHIỆM HÓA MIỄN DỊCH

Mục đích của thử nghiệm hóa miễn dịch

Phát hiện kháng nguyên của vi sinh vật, nhờ đó xác định tương đối trực tiếp tác nhân nhiễm trùng.

Biện luận kết quả hóa miễn dịch

ð Kết quả hóa miễn dịch chỉ cần giá trị định tính.

ð Xác định có (dương tính) hoặc không có (âm tính)

kháng nguyên vi sinh vật gây bệnh, không cần giá trị

định lượng.

Một số thử nghiệm hoá miễn dịch (ELISA…) kết quả có thể biểu hiện giá trị

OD, nhưng giá trị OD này giúp người làm xét nghiệm so với OD nền để

xác định kết quả (+) hoặc (-)

Khi trả lời cho lâm sàng không cần đưa kết quả giá trị OD vì như vậy có

thể làm rối trí lâm sàng do lâm sàng hiểu nhầm trị số OD càng lớn thì

nhiễm trùng càng nặng

Một số thử nghiệm hoá miễn dịch thông dụng

ð Tụ latex (latex agglutination)

ð Tủa trong thạch (ouchterlony)

ð Điện di miễn dịch đối lưu (counter current immuno-electrophoresis)

ð Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

ð Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immuno-fluorescent)

ð Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (indirect immuno-fluorescent)

ð ELISA tóm bắt kháng nguyên (antigen capture ELISA)

ð Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng nguyên (antigen detection

Immuno-chromatography)

ð Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng thể (antibody detection

Immuno-chromatography)

Tụ latex (latex agglutination)

Nguyên tắc

Hạt latex (polystyrene

0.81µm) gắn kháng thể đặc

hiệu kháng nguyên

Kháng nguyên hoà tan có trong mẫu thử Hạt latex tụ lại

Tụ latex (latex agglutination)

Ứng dụng

Phát hiện kháng nguyên hòa tan của vi khuẩn.

Tủa trong thạch (ouchterlony)

Kháng nguyên Kháng thể

Ủ nhiệt độ phòng, hộp ẩm

Phát hiện kháng nguyên hòa tan của vi khuẩn

Sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể sẽ hình thành vạch kết tủa thấy được giữa hai giếng trong thạch

Trên bản thạch điện di agarose, khoan 2 giếng, 1 giếng cho kháng nguyên (gần cực âm), một giếng kháng thể (gần cực dương)

Kháng

nguyên Kháng thể

+

-Trong thời gian điện di (22.5V/cm chiều dài, hay 7-8mA/cm chiều rộng), kháng nguyên di chuyển về cực (+), kháng thể di chuyển về cực (-)

+

-Điện di miễn dịch đối lưu

(Counter current immuno-electrophoresis)

Phát hiện kháng nguyên hòa tan của vi khuẩn

Mẫu thử có

kháng nguyên

muốn tìm

KT đặc hiệu

KN muốn tìm Phức hợp KN-KT

HC đã gắn KN

Mẫu thử không

có kháng nguyên

muốn tìm

KT đặc hiệu

KN muốn tìm KT còn tự do HC đã gắn KN Hồng cầu tụ lại

Hồng cầu không tụ

Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

Ngăn tụ hồng cầu (Haemagglutination Inhibitor)

Kháng nguyên dạng hạt

(vi khuẩn, virus…) muốn

tìm hay muốn định type đánh dấu huỳnh quangKháng thể đặc hiệu Kháng thể bám vào kháng nguyên, làm

kháng nguyên bị đánh dấu huỳnh quang

Thấy được kháng nguyên phát HQ khi xem qua kính hiển vi HQ

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

(Direct immuno-fluorescent)

Kháng nguyên dạng hạt

(vi khuẩn, virus, …) đã biết

đặc hiệu KT muốn tìm

Mẫu thử có KT đặc hiệu muốn tìm Kháng thể bám vào kháng nguyên Cộng hợp: Khángthể gắn HQ đặc

hiệu loài kháng thể muốn tìm

Thấy được kháng nguyên phát HQ khi xem qua kính hiển vi HQ

Cộng hợp gắn vào kháng thể đặc hiệu làm phức hợp KN-KT

bị đánh dầu HQ

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

(Indirect immuno-fluorescent)

Quệt cổ tử cung nhuộm kháng thể

huỳnh quang đặc hiệu C trachomatis

Giếng ELISA

gắn KT đặc hiệu

KN muốn tìm

Mẫu thử chứa

KN muốn tìm

Cộng hợp là kháng thể gắn men và đặc hiệu KN muốn tìm

KN bị KT đặc hiệu tóm bắt trên giếng Cộng hợp gắn vàoKN nhờ vậy đánh

dấu men phức hợp KN-KT

Cơ chất sinh màu (TMB, OPD…)

Xuất hiện màu, có thể phát hiện và định lượng được KN dựa vào trị số OD

ELISA tóm bắt kháng nguyên

(Antigen capture ELISA)

Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng nguyên

(Antigen detection Immuno-chromatography)

Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Carbohydrate C

của S pyogenes

Kháng thể đặc hiệu kháng thể chuột

Kháng thể đơn dòng

được gắn hạt vàng thể

keo và đặc hiệu kháng

nguyên Carbohydrate C

của S pyogenes

Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng nguyên

(Antigen detection Immuno-chromatography)

Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng thể

(Antibody detection Immuno-chromatography)

Kháng thể đặc hiệu loài kháng thể HBsAb (anti-human IgG)

Kháng thể đặc hiệu HBSAg

Kháng nguyên HBSAg

gắn hạt vàng thể keo

Sắc ký miễn dịch phát hiện kháng thể

(Antibody detection Immuno-chromatography)