NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

DANH MỤC HÌNH ẢNHSố khoa học và phát triển công nghệ HELEN 18 2.1 Sơ đồ sinh tổng hợp nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis 243.1 Khuẩn lạc của chủng vi sinh vật phân lập từ phân c

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO

BẠC CỦA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS

PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

UV – Vis Ultraviolet – Visible

TEM Transmission Electron Microscopy

XRD X-ray diffraction

hợp ở nồng độ 1mM AgNO3 theo CT2 và đối chứng (Đơn

vị: mm)

38

hợp ở nồng độ 2mM AgNO3 theo CT2 và đối chứng (Đơn

vị: mm)

40

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số

khoa học và phát triển công nghệ HELEN)

18

2.1 Sơ đồ sinh tổng hợp nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis 243.1 Khuẩn lạc của chủng vi sinh vật phân lập từ phân chim cút ủ thô 29

3.6 Phổ UV – Vis sau 6 ngày khảo sát sinh tổng hợp nano bạc từ

3.11 Dịch nano bạc tổng hợp (c) và dịch ngoại bào (d) tạo vòng

kháng khuẩn ức chế Bacillus cereus

3.15 Dịch nano bạc tổng hợp (nồng độ 2mM AgNO3) từ CT2 (i) và

dịch nổi (k) tạo vòng kháng khuẩn trên vi sinh vật kiểm định

40

E.coli

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đang phát triển mạnh

mẽ, đó là một trong những công nghệ tiên tiến hiện nay với rất nhiều lĩnh vực đượcứng dụng trong y học, điện tử, nông nghiệp, xử lý môi trường, Với kích thước nanomét các loại vật liệu nano có thể can thiệp đến từng phân tử - nguyên tử, điều này đặcbiệt quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong Y – Sinh học

Bạc là một trong những kim loại có tính sát khuẩn mạnh, từ lâu con người đãbiết ứng dụng nó, và hiện nay thì công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọngtrong các nghiên cứu về vật liệu nano Nghiên cứu chỉ ra rằng khi ở kích thước nano(từ 1 đến 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạcdạng khối, như vậy 1 gam bạc nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chấtnền [4] Điều này sẽ làm cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảmmạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể Nano bạc có tínhkháng khuẩn mạnh, vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổioxy của vi khuẩn và tiêu diệt chúng trong vài phút, ngoài ra các hạt bạc với kích thướcnhỏ chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzyme hay DNA có chứa nhóm sunfuahoặc photphate gây bất hoạt enzyme hay DNA dẫn đến gây chết tế bào Nano bạckhông gây tác dụng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm lượngbạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ nhỏ hơn 100ppm), không gây ô nhiễmmôi trường Vì vậy nano bạc đang được ứng dụng rộng rãi Trong nông nghiệp, ứngdụng công nghệ nano bạc đang được nhiều quốc gia xem là một hướng để phát triểnmột nên nông nghiệp hiệu quả, kinh tế và an toàn hơn, phòng trị các bệnh do vi khuẩn,

vi rút, nấm, gây ra trên cây trồng, vật nuôi, bảo quản nông sản Trong ngành may mặc,nano bạc có thể ứng dụng để tạo ra các loại quần áo có khả năng diệt khuẩn, vi khuẩngây mùi hôi, mốc Đặc biệt, nghiên cứu tổng hợp nano bạc để phục vụ cho các ứngdụng trong y học, nhất là hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biếnnhư hiện nay

Có nhiều phương pháp để tổng hợp nano bạc, trong đó các phương pháp hóahọc, vật lý, hóa lý kết hợp thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu

tư tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi Vì vậy, tổng hợp nano bạc bằngcon đường sinh học đang là một xu hướng mang tính tất yếu Phương pháp tổng hợpnày tạo ra các hạt nano bạc tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn so với cácphương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn Các hạt nanocũng có thể được ổn định ngay trong quá trình sản xuất bởi các polymer sinh học ỞPhương pháp sinh học thì tác nhân chính sinh tổng hợp nano bạc chính là các vi nấm,

vi khuẩn Với thời gian sinh trưởng ngắn, quá trình sinh tổng hợp tạo ra kích thước hạtnhỏ và đồng đều, không tốn dung môi hóa học và không gây ảnh hưởng môi trườngnên các loài vi nấm hay vi khuẩn là đối tượng đang được nghiên cứu Trong đó,

Bacillus licheniformis là vi khuẩn có khả năng sinh trưởng ở phổ nhiệt cao và môi

trường nuôi cấy thông thường, nó là vi khuẩn được ứng dụng trong công nghiệp khisản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt như protease, amylase, lipase v.v

Nhằm tiếp cận với phương pháp và xuất phát từ những lý luận, thực tiễn nêu

trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc

của vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút”.

2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá được khả năng sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus

licheniformis phân lập từ phân chim cút.

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho

sinh viên, kĩ thuật viên về khả năng tổng hợp nano bạc từ chủng Bacillus licheniformis

TT01

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của khóa luận sẽ xác định được một số điều kiện sinh tổng hợp

nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis có ý nghĩa trong việc ứng dụng tạo nên

các vật liệu, sản phẩm nano bạc phục vụ trong các ngành y học, nông nghiệp, điện tử,môi trường, v.v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về công nghệ nano và nano bạc

1.1.1 Vật liệu nano

Khoa học nano là khoa học nghiên cứu vật chất ở kích thước cực kì nhỏ bé –kích thước nanomet (nm), một nanomet bằng một phần tỉ của mét (m) hay bằng mộtphần triệu của milimet (mm) Công nghệ nano là các công nghệ liên quan đến việcthiết kế, phân tích, chế tạo, ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điềukhiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet (từ 1 – 100nm) Vật liệu nano là đốitượng của hai lĩnh vực khoa học nano và công nghệ nano

Năm 1959, khái niệm về công nghệ nano được nhà vật lý người Mỹ RichardFeynman nhắc đến khi ông đề cập đến khả năng chế tạo vật chất ở kích thước siêu nhỏ

đi từ quá trình tập hợp các nguyên tử, phân tử Những năm 1980, nhờ sự ra đời củahàng loạt các thiết bị phân tích, trong đó có kính hiển vi đầu dò quét (SEM hay TEM)

có khả năng quan sát đến kích thước vài nguyên tử hay phân tử, con người có thể quansát và hiểu rõ hơn về lĩnh vực nano

Phân loại vật liệu nano

Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đámnano, hạt nano

Vật kiệu nano một chiều là vật liệu trong đó có một chiều tự do, hai chiều cókích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano

Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kíchthước nano, ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano)

Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ cómột phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều,một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

Hạt nano kim loại

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạothành từ các kim loại Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp

chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano Một trong những tính chất đó làmàu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [3].

Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng Tuy nhiên,ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sâng màu da cam khi kíchthước hạt thay đổi Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi làcộng hưởng plasmon bề mặt Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự domới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng có hiện tượng quang học trên[26]

1.1.2 Hạt nano bạc

Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm.Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các hạtnano bạc không bị kết tụ Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so vớibạc bình thường Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừanhiều bệnh truyền nhiễm Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc đã đượctìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỉ 20, Nhưng sự phát minh ra thuốc khángsinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này Những năm gần đây, docông nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn với vi khuẩn,nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trrong lĩnh vực Y sinh học được quan tâmnghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [26]

Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:

Diệt trên 650 loại vi khuẩn

Hiệu quả cao

Tác dụng nhanh

Không độc

Không kích thích

Không gây dị ứng

Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:

Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hóa các enzyme mà vi khuẩn và nấmcần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của vikhuẩn Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [9]

Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rốiloạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [31].

Các hạt nano bạc tương tác với nhóm –SH của các protein, enzyme trên màng

tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng Sự vận chuyểnvật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [31]

Nano bạc giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tươngtác với các lipid màng làm tổn thương màng [31]

Hình 1.1 Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc

Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1nm – 100nm), Diện tích bề mặt tổng cộng củanano bạc rất lớn và hiệu quả hoạt động của nano bạc tăng đáng kể so với hạt bạc cókích thước lớn hơn (micro) Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kíchthước lớn và với ion Theo tính toán lý thuyết nano bạc có hoạt tính mạnh hơn ít nhất

40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường Vì vậy, người ta

có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương Điều này rất có ý nghĩa

vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có thể dùng tối đa 350µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria hay còn gọi là trúngđộc bạc Nếu dùng 1 đến 2 muỗng cà phê/ngày (20ppm) tương đương 100 – 200μg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nướccung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt Điều này đảm bảo cho người

dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa ăn hay trong nước uống

mà không bị hiện tượng Argyria [26]

Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khỏe con người, các nhà khoa học cho rằngnano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con người có được là do các vikhuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng có thểdiệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khỏe Tuy nhiên cho đến nay chưa thấycông trình nào công bố sự tác hại của nano bạc Các nghiên cứu tại OdenseUniversitets Hospital [26] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được hấp thuvào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cúng như gây độc cho cơthể Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra cơ thểtheo thời gian [26] Các hãng sản xuất những sản phẩm chức nano bạc chẳng hạn nhưSamsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họvẫn khẳng định tính an toàn của nó đói với sức khỏe của người sử dụng [3]

1.1.3 Một số ứng dụng của nano bạc

Trong y học

Một số sản phẩm chứa nano bạc như khăn ăn, khăn vệ sinh khô cho cả bé lẫnngười lớn, băng đắp bỏng, đắp vết thương, găng tay, quần áo dùng trong y tế với khảnăng diệt khuẩn cao tới 99%

Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta (Canada) đã đưa bạcnano vào miếng băng gạc để băng những vết loét do bỏng vì chúng có tác dụng diệtkhuẩn mạnh hơn so với hạt bạc bình thường

Trong công nghiệp

Bạc nano được đưa vào các polymer như polyethylene (PE), polypropylene

(PP) có khả năng giết chết nhiều loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn vàng, Bacillus

pneumoniae, E.coli Ứng dụng của việc phân bố nano trong các chất dẻo, polymer,

hiện nay người ta đã sản xuất các mặt hàng tiêu dùng có tính kháng khuẩn chứ các hạtnano bạc như tủ lạnh; máy điều hòa; máy giặt, trong máy giặt công nghệ nano bạc tạothành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước, cách làm trên vừa

ít hao tốn điện năng những vẫn đảm bảo hiệu quả; ngoài ra còn ứng dụng vào bình sữacho trẻ sơ sinh; hộp đựng thực phẩm v.v

Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silverđược ứng dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ Những sảnphẩm này đã được bộ y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm và chất lượng.

Ngoài ra, ngày nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm nhưnước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, v.v

Trong nông nghiệp

Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng độ hạtnano bạc 1000ppm và chitosan 5000ppm MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnhđạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã được chứng tỏ ưu việtcủa mình, cả 2 liều lượng 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều chohiệu quả cao trong việt phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất làtrong giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun

Trong công nghệ xử lý nước

Việc sử dụng nano bạc trong công nghệ xử lý nước khá mới mẻ Do bề mặtriêng khá lớn, hạt nano bạc có hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước nhiễm khuẩn

và đã được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu [10] Phòng thí nghiệm Công nghệNano đã sử dụng vật liệu polyurethane mút xốp tẩm nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước

uống nhiễm khuẩn E.coli Nước qua hệ thống lọc PU/Ag không còn vi khuẩn và uống

được theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [5]

1.1.4 Các phương pháp chế tạo nano bạc và nhận diện nano bạc

Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phươngpháp từ trên xuống Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc cácnguyên tử kết hợp lại với nhau Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệunano từ vật liệu khối ban đầu

Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim, thì phương phápthường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên Nguyên tắc là khử các ion kim loạinhư Ag+, Au+ để tạo thành các nguyên tử Ag và Au Các nguyên tử sẽ liên kết với nhautạo ra hạt nano Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gầnđây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này

Phương pháp khử hóa học

Trong phương pháp này, ion Ag+ dưới tác dụng của chất khử sẽ tạo ra nguyên

tử Ag0, sau đó các nguyên tử này kết hợp với nhau tạo thành các hạt nano bạc [2]

Các tác nhân hóa học có thể sử dụng là: NaBH4, sodium citrate, citric acid,EDTA, ethanol, ethylene glycol, hydrogen, hydrogen peroxid, hydroxylamine,hydrazine, formaldehyde và các dẫn xuất của nó [1], [31], [30] v.v

Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta

sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích vàđẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt động bề mặt Phương pháp tĩnhđiện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử Phương pháp bao phủ phức tạpnhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có cáctính chất cần thiết cho các ứng dụng Các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước

từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này

Phương pháp khử hóa lý

Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lý Nguyên lý là dùngphương pháp điện phân kết hợp với sóng siêu âm để tạo hạt nano Phương pháp điệnphân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại Trước khi xảy ra sự hìnhthành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lênđiện cực âm Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phânthì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch[2]

Sastry và cộng sự [16] đã nhận thấy có sự hình thành các hạt nano vàng khi cho loài

nấm Verticillum sp tiếp xúc với ion vàng Klaus và cộng sự [9] cũng đã chứng minh được có sự hiện của nano bạc trong vùng chu chất của Pseudomonas stutzeri AG259

khi cho vi khuẩn này tiếp xúc với dung dịch bạc nitrate Tuy nhiên việc áp dụng đặctính khử kim loại để biến vi sinh vật thành các nhà máy sản xuất các hạt nano kim loạichỉ mới được quan tâm đến trong thời gian gần đây [8]

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi trườngnuôi cấy rẻ tiền, không phụ thuộc nhiều vào hóa chất và thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện,thân thiện với môi trường do không sử dụng các hóa chất độc hại Ngoài ra nó có thể

áp dụng với quy mô sản xuất lớn mà chi phí đầu tư ban đầu lại rất thấp Vì vậy, cácnhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp sinh tổng hợp Phương phápsinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạtđược ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các protein, chúng giúp tạo lớp bảo vệcho các hạt nano bạc

Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc

Theo một số tài liệu thì các nhà khoa học đã nghiên cứu và chỉ ra rằng một sốchủng vi sinh vật sau đây có khả năng tổng hợp nano bạc [7], [8], [31], [26], [32], [18]:

Nấm: Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus,

Aspergillus flavus, Phaenerochaete chrysosporium, Penicillium fellutanum, Verticillium sp…v.v.

Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri,, Lactobacillus sp, Bacillus licheniformis,

Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia…v.v.

Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora…v.v.

Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểutường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động củaenzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra Quá trình khử bắt đầu bởi

sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag+ để khử các ion Ag+ tạo thànhcác nguyên tử Ag Các enzyme phụ thuộc NADH như nitrate reductase đóng vai tròchất vận chuyển điện tử Bên cạnh các enzyme này, một số naphthoquinone và

anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể đóng vai trò chất

truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng củachúng [7], [34].

Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chiaquá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng [29]:

Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào Các chủng

vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas stutzeri [8],

Rhodococcus sp, Verticillium sp, Bacillus licheniformis [20]

Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm cầnphải phá vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách bỏ cácmãnh vỡ tế bào Theo S.Basavaraja [26] ưu điểm của quá trình này là có thể kiểm soátđược kích thước hạt nano bạc

Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật

Các chủng Fusarium oxysporum [7], Fusarium semitectum [26], Aspergillus fumigatus [8], Aspergillus flavus [31], Phaenerochaete chrysosporium [26], Lactobacillus sp [32], Penicillium fellutanum [18],… tổng hợp nano bạc theo kiểu này.

Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào rakhỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi

Theo tài liệu [26], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương phápphá màng tế bào để thu nhận sản phẩm

Các phương pháp nhận diện nano bạc

- Phương pháp phổ tử ngoại và phổ khả kiến UV – Vis

Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biếtcấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thướcphân tử…, khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ta một dạng phổ cóchiều cao đỉnh phổ xác định và đặc trưng cho dạng hợp chất đó Do vậy khi đo phổhấp thu của dung dịch bạc nano ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh với chiều cao lớn nhấtứng với bước sóng khoảng 380 - 450 nm Từ kết quả đó ta sẽ xác định được sơ bộ rằng

ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano [26]

Hình 1.2 Phổ UV – Vis của dung dịch nano bạc [32]

- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM) làmột công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano Nó cho phép quansát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2 nm Do đó, phương pháp nàyngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano Nguyên tắc củaphương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu đượcchính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu

Công dụng chủ yếu của thiết bị này là để xác định một cách chính xác kíchthước của hạt nano mà cụ thể ở đây là hạt nano bạc tạo thành Dựa vào ảnh chụp cácphần tử nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kíchthước và hình dáng của hạt nano tạo thành, đồng thời xem xét xem kích thước đó đãđảm bảo là tốt hay chưa để hoạch định quá trình điều chế nano bạc

- Máy đo nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) được sử dụng để phân tích cácvật liệu có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số mạng và các đỉnh đặc trưng cho cáccấu trúc đó Đối với kim loại, phương pháp XRD cho phép xác định chính xác sự tồntại của kim loại trong mẫu dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các đỉnh chuẩn củanguyên tố đó

Hình 1.3 Phổ XRD của nano bạc (Nguồn: Công ty TNHH nghiên cứu khoa học

và phát triển công nghệ HELEN)

1.2 Khái quát chung về bacillus licheniformis

1.2.1 Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis là vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất Nó được tìm

thấy trên lông chim, đặc biệt là ngực và lưng bộ lông, và thường xuyên nhất trong các

loài chim ở trên mặt đất và các loài chim thủy sinh B licheniformis còn được tìm thấy

và phân lập ở các suối nước nóng [26]

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa

Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di động và khả năngTạo nội bào tử (endospore) [26] gần như hình cầu giúp nó tồn tại trong thờigian dài khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt

Bộ gen: Có chiều dài là 4,22Mb chứa khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192protein [34]

Đặc điểm sinh hóa: B licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử dụng

khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Có thểtổng hợp một lượng lớn enzyme amylase và protease [1] Có khả năng gây ngộ độcthực phẩm với các triệu chứng như: đau bụng, tiêu chảy, nôn mữa [7]

1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Là vi khuẩn chịu nhiệt có thể sống ở nhiệt độ 55oC, dễ nuôi cấy ở môi trườngthông thường như LB, pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 7

Không giống với các thành viên khác trong chi Bacillus là các vi sinh vật hiếu khí, Bacillus licheniformis là vi sinh vật kị khí tùy ý.

Sau 18 – 20 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt môi trường

Bacillus licheniformis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc

có màu trắng đục, lồi, bề mặt sần sùi

Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử lýnước thải do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào, ngoài ra còn đượcdùng làm thuốc trừ nấm bệnh trên cây trồng

1.2.5 Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợpnano bạc nội bào khi cho nó tiếp xúc với dung dịch muối nitrate bạc [20], [25]

Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở loài này vẫn chưa được xác định cụ

thể Nhưng theo Kalimuthu cùng cộng sự (2008) [20] thì B licheniformis có khả năng

tổng hợp NADH và các enzyme phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong

đó quan trọng nhất là enzyme nitrate reductase (enzyme khử nitrate) được mô tả nhưhình 1.2 Enzyme này có vai trò khử gốc NO3- và vận chuyển electron từ chất choelectron là NADH đến chất nhận là Ag+ để khử Ag+ thành Ag0

Hình 1.4 Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn Bacillus licheniformis [20]

1.3 Một số nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc từ vi sinh vật ở trong nước và trên thế giới

1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259

phân lập từ mỏ bạc có thể khử Ag+ trong dung dịch muối AgNO3 thành các hạt Agnano trong vùng chu chất của nó [8]

Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn)hoặc đa bào (nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag+ tạo bạc nano theo các cơchế ngoại bào hoặc nội bào Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp

nano bạc của nấm Fusariuim oxysporum [7] Sastry và cộng sự nhận thấy Verticillium

sp và Fusariuim oxysporum khi tiếp xúc với ion Au3+ và Ag+ sẽ nhanh chóng khử cácion này tạo thành hạt nano kim loại N.Duran nghiên cứu cơ chế khử Ag+ thành Ag0

của F.oxysporum [34] S.Basavaraja khảo sát quá trình sinh tổng hợp bạc nano ngoại bào bởi nấm Fusarium semitectum [26] K.C.Bhainsa xác định có sự hình thành nano bạc khi cho nấm Aspergillus flavus tiếp xúc với muối bạc nitrate K.Kalimuthu khảo sát khả năng tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis [16] N.Saifuddin nghiên cứu phương pháp tổng hợp nano bạc nhờ Bacillus subtilis [29] N.Mokhtari sử dụng Klebsiella pneumonia để thu nhận bạc nano [20].

Đã có báo cáo rằng các hạt nano bạc có độ ổn định cao (40 nm) có thể đượctổng hợp bằng cách hấp thụ các ion bạc dung dịch với sự có mặt của môi trường của vi

khuẩn không gây bệnh, Bacillus licheniformis (Kalishwaralal và cộng sự 2008b) Hơn

nữa, các tinh thể bạc nano bạc phân tán tốt (50 nm) được tổng hợp bằng cách sử dụng

vi khuẩn Bacillus licheniformis (Kalishwaralal và cộng sự 2008a) Saifuddin

(Saifuddin và cộng sự, 2009) [33] đã mô tả một cách tiếp cận mới tổng hợp tổng hợp

để hình thành các hạt nano bạc bằng cách sử dụng sự kết hợp của môi trường trên bề

mặt của B subtilis và bức xạ vi sóng trong nước Họ đã báo cáo sự tổng hợp tế bào

ngoại bào của các hạt nano Ag phân tán (5-50nm) bằng cách sử dụng các chất siêu phủ

của B subtilis, nhưng để tăng tỷ lệ phản ứng và giảm sự kết hợp của các hạt nano được

tạo ra, họ đã sử dụng bức xạ vi sóng có thể cung cấp sự nóng lên đồng nhất xungquanh Các hạt nano và có thể hỗ trợ quá trình chín của các hạt không có sự tổng hợp.Các tinh thể nano bạc của các chế phẩm khác nhau được tổng hợp thành công bởi

Pseudomonas stutzeri AG259 (Klaus và cộng sự, 1999) [9] Các chủng vi khuẩn kháng

bạc, Pseudomonas stutzeri AG259, phân lập từ một mỏ bạc, tích tụ các hạt nano bạc

bên trong nội tạng, cùng với một số sulfua bạc, có kích thước từ 35 đến 46nm

(Slawson và cộng sự, 1992) Các hạt lớn hơn được hình thành khi P stutzeri AG259

thử thách với nồng độ cao của ion bạc trong quá trình nuôi cấy, dẫn đến sự tạo thànhcác hạt nano bạc trong tế bào có kích thước khác nhau từ vài nm đến 200 nm (Klaus-Joerger et al 2001, Klaus và cộng sự, 1999) [9] Trong một nghiên cứu khác, đã đượcbáo cáo về sự tổng hợp nhanh các hạt nano kim loại bạc bằng cách sử dụng sự giảmcác ion Ag+ trong dung dịch bởi các siêu vi trùng của Klebsiella pneumonia, E coli, và

Enterobacter cloacae (Enterobacteriacae) (Shahverdi và cộng sự, 2007) [36] Quá

trình tổng hợp là khá nhanh và các hạt nano bạc đã được hình thành trong vòng 5 phútcủa các ion bạc tiếp xúc với tế bào lọc Enzyme nitrat reductase có thể có trách nhiệmcho việc hấp thụ các ion bạc Người ta cũng cho biết phát xạ ánh sáng nhìn thấy có thể

làm tăng tổng hợp các hạt nano bạc (1-6 nm) bởi các chất siêu phủ của K pneumoniae

(Mokhtari và cộng sự, 2009) [32] Các hạt nano bạc phân tán và ổn định cũng đượctổng hợp thành công với công nghệ sinh học [Ag (NH3)2]+ sử dụng Aeromonas sp SH10 và Corynebacterium sp SH09 (Mouxing và cộng sự, 2006) Người ta đã tiên

đoán rằng [Ag (NH3)2]+ phản ứng đầu tiên với OH- tạo ra Ag2O, sau đó chuyển hóa

thành độc lập và giảm đến các hạt nano bạc bằng sinh khối Các dòng Lactobacillus,

khi tiếp xúc với ion bạc, dẫn đến sự tổng hợp các hạt nano trong tế bào vi khuẩn (Nair

và Pradeep 2002) [32] Người ta đã báo cáo rằng sự phơi nhiễm của vi khuẩn lactic có

trong sữa chua với hỗn hợp các ion bạc có thể được sử dụng để phát triển các hạt nanobạc Sự tạo mầm của hạt nano bạc xảy ra trên bề mặt tế bào qua đường và các enzymetrong thành tế bào, và sau đó các hạt nhân kim loại đã được vận chuyển vào tế bào, nơichúng được tổng hợp và phát triển thành những hạt lớn hơn

Các vi sinh vật sử dụng hệ enzyme khử nitrate để đưa AgNO3 về Ag tạo nênnhững hạt nano có kích thước rất nhỏ, chỉ khoảng dưới 40nm, do đó làm tăng hiệu quảkháng khuẩn khi so sánh với phương pháp hoá – lý cổ điển [8]

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước

Hiện nay, hướng sinh tổng hợp nano bạc ứng dụng công nghệ vi sinh vật đangđược nghiên cứu và mới phát triển tại Việt Nam Một số nghiên cứu tiêu biểu như:

Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn Hoàng

Ngọc Phương và cộng sự (2009)), Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng sinh khối

vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis (Phan Huê Phương (2010)) nghiên cứu này đã

mở ra con đường sinh tổng hợp nano bạc bằng cách khảo sát sinh khối ủ với AgNO3

Nghiên cứu sử dụng dịch nội bào Bacillus subtilis để tổng hợp hạt nano bạc (AgNP –

silver nanoparticle) Nhóm tác giả Trần Đăng Khoa, Đỗ Thụy Thủy Tiên, Ngô ĐạiNghiệp (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) sử dụng dịch

nội bào vi khuẩn Bacillus subtlis chuyển hóa AgNO3 thành dung dịch AgNP Hạt nanobạc được tổng hợp tốt nhất ở 600C với pH = 7.0 và tỷ lệ dịch nội bào với bạc nitrate là3:17

Như vậy, nano bạc tổng hợp từ vi sinh vật có nhưng ưu điểm như: kích thướchình cầu, được bảo vệ bởi protein nội bào, không sử dụng hóa chất độc hại, thân thiệnvới môi trường Sẽ có ý nghĩa trong việc ứng dụng sản xuất phục vụ các lĩnh vực điềutrị trong vật liệu Y – Sinh, dược phẩm, các loại chế phẩm trong nông nghiệp Việc

nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis

phân lập từ phân chim cút là nghiên cứu cần thiết

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu phân chim cút được lấy tại xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng

Nam

- Vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút ủ 25 – 30 ngày

- Ba dòng vi khuẩn gây bệnh được dùng kiểm định trong nghiên cứu này bao

gồm E.coli, Bacillus cereus, Ralstonia solanacearum (giống bảo quản lạnh sâu -22oC)được cung cấp bởi được cung cấp bởi khoa sinh – môi trường, Đại học Sư phạm – Đạihọc Đà Nẵng

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Địa điểm thu mẫu ở thực địa:

Xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:

Phòng thí nghiệm Vi sinh – hóa sinh – sinh lý thực vật, PTN Công nghệ sinhhọc, PTN sinh học phân tử thuộc khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm –Đại học Đà Nẵng

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis từ phân

chim cút

Nội dung 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ dịch ngoại bào và

sinh khối Bacillus licheniformis:

- Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis;

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 (1mM, 2mM) đến quá trình sinh

tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis;

- Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD);

- Phân tích hình dạng hạt nano bạc thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua(TEM)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm sinh tổng hợp nano bạc được bố trí theo sơ đồ sau đây:

Hình 2.1 Sơ đồ sinh tổng hợp nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis

Bảng 2.1 Bố trí các lô thí nghiệm, [25], [35]

Dịch ngoại bào (vi sinh

tiết ra môi trường) +

Sinh khối + Dung dịch

Nuôi cấy chìm trong môi trường LB lỏng

Ly tâm 6000rpm/15 phút

Trộn 5g sinh khối ướt với 100ml nước cất, lắc 150rpm, 1-2 ngày

Ly tâm thu dịch, trộn với 100ml

2mM)Che kín bình, lắc 150pm, 5 ngày

Dung dịch AgNO3

(1mM, 2mM)

(1mM, 2mM)

Ở CT1, 100ml dịch nổi sau ly tâm (dịch ngoại bào) sẽ được ủ với 100ml

AgNO3 1mM và 2mM, các bình ủ sẽ được che kín, lắc ở 150rpm trong thời gian từ 1 –

6 ngày, thu dịch tổng hợp

Ở CT2, trộn 5g sinh khối ướt với 100ml AgNO3 1mM và 2mM các bình ủ sẽ được che kín, lắc ở 150rpm trong thời gian từ 1 – 6 ngày, sau đó tiến hành phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng cách cho vào máy siêu âm với sóng siêu âm tần số 37 KHz trong 15phút (chia thành 5 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 phút) Ly tâm 6000rpm/15 phút, bỏ xác tế bào,thu dịch tổng hợp

Ở CT3, sinh khối sau khi lắc với nước cất từ 1 – 2 ngày (dịch lọc) sẽ được ly tâm bỏ sinh khối và dịch lọc sẽ ủ với AgNO3 1mM và 2mM, các bình ủ sẽ được che kín, lắc ở 150rpm trong thời gian 1 – 6 ngày, thu dịch tổng hợp

Sau khi thu được dịch tổng hợp nano bạc từ các công thức trên, tiến hành quét phổ UV – Vis ở bước sóng 300 – 70nm, kiểm tính tra kháng khuẩn của dịch nano bạc, phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), chụp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM

2.3.2 Phương pháp thu mẫu và phân lập

- Thu mẫu: Mẫu phân chim cút sau 25 – 30 ngày được thu tại xã Điện Thắng –thị xã Điện Bàn – tỉnh Quảng Nam, mẫu được bảo quản nhiệt độ phòng

- Phân lập: Các mẫu được phân lập trên môi trường thạch Luria – Bertani (LB),pH7 bao gồm: pepton 10g/l, cao nấm men 5g/l, NaCl 10g/l, agar 20g/l

Mẫu được rửa sạch trong nước cất vô trùng và tiến hành pha loãng mẫu vớinước cất vô trùng ở các nồng độ từ 10-3 – 10-7 Hút 100µl dịch pha loãng mỗi mẫutrang đều khắp mặt thạch LB trên đĩa petri Nuôi ở tủ ấm ở nhiệt độ 30 – 32oC trongkhoảng 18 – 20 giờ để thu các được các khuẩn lạc riêng lẽ

Mẫu phân chim cút sau đó sẽ được ủ theo quy trình ủ tạo phân hữu cơ vi sinh vàtiến hành phân lập chủng vi khuẩn từ phân chim cút đã ủ thô

Xác định chi Bacillus dựa trên đặc điểm hình thái, nhuộm gram.

2.3.3 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử

Kết hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa đã được xác định Tiến hànhđịnh danh dựa trên trình tự đoạn gen 16S - rRNA, được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR

và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, nhập kết quả trên BLAST NCBI, xây dựng câyphát sinh loài

2.3.4 Phương pháp phá vỡ tế bào vi khuẩn

Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm có tần số từ 20 KHz đến 1MKHz [7].Cho mẫu vào máy có tần số 37 KHz, mẫu phá vỡ tế bào được siêu âm trong vòng 15 phút chia thành 5 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 phút

2.3.5 Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis

Các thí nghiệm được thực hiện theo các công thức như hình 2.1 và bảng 2.1.Sau khi thu được dịch tổng hợp từ các công thức: CT1, CT2, CT3 Tiến hànhtiến hành lấy dịch tổng hợp ở 2 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày để kiểm tra phổ UV –Vis

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO 3 (1mM, 2mM) đến quá trình sinh

tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis

Các thí nghiệm được thực hiện theo các công thức như hình 2.1 và bảng 2.1.Sau khi thu được dịch tổng hợp từ các công thức: CT1, CT2, CT3 Tiến hành

thử hoạt tính kháng khuẩn trên các vi sinh vật: E.coli, B.cereus, R.solanacearum theo

phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Well diffusion assay) [19]

Các chủng vi sinh vật kiểm định như đã nêu ở phần đối tượng nghiên cứu đượctrang đều trên môi trường thạch đặc trưng cho vi khuẩn (môi trường LB) trong đĩaPetri

Tiến hành hút 100μl dịch vi sinh vật kiểm định trang đều lên mặt thạch

Dùng ống nghiệm đường kính khoảng 2cm vô trùng đục 2 lỗ thạch đối xứng Dùng pipet hút khoảng 300 – 400µl dịch nano bạc thô cho vào các lỗ thạch

Ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở 30oC, Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn thuđược

Khả năng kháng khuẩn của dịch sinh tổng hợp được xác định bằng sự hiện diện