TẠO hệ PHÂN tán PIPERINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG hóa

Trong phạm vi đề tài, tập trung vào cách tạo hệ phân tán piperine từ dịch chiết và cao chiết từ hạt hồ tiêu với sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt mới HC40 bằngphương pháp đồng hóa tốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO HỆ PHÂN TÁN PIPERINE BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG HÓA

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1 HĐBM Chất hoạt động bề mặt (Surfactant)

LỜI MỞ ĐẦU

Nước Việt Nam ta tự hào khi sở hữu nhiều thảo dược quý Truyền thống “nướcNam dùng Nam dược trị Nam nhân” luôn là tiền đề và cảm hứng cho các nghiêncứu ứng dụng khoa học hiện nay Thế nên, xu hướng thế giới nói chung và ViệtNam nói riêng đang rất quan tâm, tìm kiếm, sử dụng các hợp chất nguồn gốc thiênnhiên để ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh, trong đó có piperine – chiết xuất từ hạt

hồ tiêu

Piperine được biết đến là một hoạt chất có dược tính sinh học cao, được dùngnhiều trong nghiên cứu và phòng chữa bệnh, nhưng vì tính ái dầu đặc trưng, kémtan trong nước, gây khó khăn trong ứng dụng Việc nghiên cứu làm tăng độ hòa tancủa piperine cũng như các hoạt chất ái dầu đã và đang là thách thức lớn cho các nhàkhoa học

Thế kỷ XXI – thế kỷ của cuộc cách mạng công nghiệp 4.0, trong đó có sự pháttriển bùng nổ của công nghệ nano đã mở ra một hướng tiếp cận mới về định hướngtăng độ hòa tan, nâng cao hoạt tính sinh học của piperine, mang lại nhiều thành tựunổi bật

Trong phạm vi đề tài, tập trung vào cách tạo hệ phân tán piperine từ dịch chiết

và cao chiết từ hạt hồ tiêu với sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt mới HC40 bằngphương pháp đồng hóa tốc độ cao, làm tăng độ hòa tan của piperine và khả dụngsinh học Bài báo cáo đề cập những nội dung chính sau:

- Tổng quan về cây hồ tiêu, piperine và công nghệ nano

- Thực nghiệm nghiên cứu quá trình chiết tách piprine, khảo sát điều kiện tạo

hệ phân tán, tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng quá trình tạo hệ và sản xuấtthử nghiệm piperine dạng bột bằng phương pháp sấy phun

- Kết luận, đề xuất và định hướng phát triển đề tài

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây hồ tiêu

Tên khoa học: Piper nigrum L.

Bảng 1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum) Plantae

Họ (familia) Piperaceae

Loài (species) P nigrum

Hồ tiêu còn có tên là Cổ nguyệt, Hắc cổ nguyệt, Bạch cổ nguyệt, Hắc xuyên,

… phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới, phổ biến nhất trong các tầng thấp của cácrừng mưa nhiệt đới Ở Việt Nam, hồ tiêu nhập nội từ thế kỷ XVIII, được trồng khắp

từ bắc chí nam, nhiều nhất là các tỉnh Châu Đốc, Hà Tiên, Quảng Trị, Gia Lai, ĐồngNai,

Mô tả thực vật:

Hình 1.1 Hồ tiêu

Hồ tiêu là một loại dây leo, thân dài, nhẵn không manglông, bám vào các cây khác bằng rễ Thân mọc cuốn,mang lá mọc cách Có hai loại nhánh: một loại nhánhmang quả và một loại nhánh dinh dưỡng, cả hai loạinhánh đều xuất phát từ kẽ lá Cụm hoa hình đuôi sóc,khi chín rụng cả chùm Qủa hình cầu nhỏ, khoảng 20 –

30 quả trên một chùm, lúc đầu quả màu xanh lục, sau đómàu đỏ và khi chín có màu vàng, quả có một hạt duynhất Đốt cây rất giòn nên khi vận chuyển cần cẩn thận

để cây khỏi chết [6]

Thành phần hóa học:

Trong hạt hồ tiêu chứa (1,5 – 2,2)% tinh dầu và hai alkaloid: piperine (4,5 8)% và chavixin (2,2 – 4,6)% Ngoài tinh dầu và alcaloid, trong tiêu còn chứa chấtbéo 8%, tinh bột 40% khối lượng khô của tiêu đen (hay 50% khối lượng tiêu sọ) [6]

Bảng 1.2 Một số tính chất vật lý của piperine [26]

1 Khối lượng phân tử 285,343 g/mol

2 Khối lượng riêng 1,193 g/cm3

3 Nhiệt độ nóng chảy 130 0C

5 Tính tan - Tan tốt trong các dung môi hữu cơ: chloroform

(1g/1,7 mL); ethanol (1g/15 mL); ether (1g/36mL),…

- Ít tan trong nước (0,04 mg/ mL tại 18 0C)

6 Bước sóng hấp thu cực đại  max = 343 nm

1.2.3 Tính chất hóa học

a Phản ứng phân hủy

Piperine là một alkaloid, mang tính baze rất yếu, thủy phân trong dung dịch

NH3 tạo piperidine (C5H11N) và acid piperic (C12H10O4) [31]

Hình 1.5 Phản ứng thủy phân piperine

b Phản ứng oxy hóa

Piperine có chứa nhiều nối đôi, dễ bị oxy hóa bởi chất oxy hóa mạnh nhưKMnO4 trong môi trường HCl loãng tạo ra piperidine hidrochloride, oxalic acid vàpiperianolic acid [35]

Hình 1.6 Phản ứng oxy hóa của piperine [35]

1.2.4 Ứng dụng hoạt tính sinh học của Piperine

Piperine là một hoạt chất sinh học ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đời sống

Trong thực phẩm: hạt tiêu đen được mệnh danh là “vua gia vị”, được sử sụng

phổ biến do tính hăng, cay nồng và hương vị đặc trưng của nó [25]

Pattanaik, 2009 [29]

Piperine làm tăng cường hoạt tính sinh họccủa vitamin C

Vanita Somasekhar, 2016[40]

Piperine tăng sinh khả dụng của một số loạithuốc

Szallasi A, 1991 [39]

Tiền xử lý Piperine làm giảm quá trìnhperoxide hóa lipid gan, phosphatase acid vàphù nề gây ra bởi carrageenin ở chuột

Chonpathompikunlert P,

2010 [17]

Piperine hỗ trợ điều trị chứng trầm cảm,tăng cường nhận thức, cải thiện chức năngnão ở chuột đực Wistar

Vijayakumar RS, 2006 [41]

Piperine - điều chỉnh rối loạn lipid máu gây Shah SS, 2011 [36]

béo phì ở chuột ăn nhiều chất béo

Bảng 1.4 Piperine làm tăng hoạt tính sinh học của một số loại thuốc [14]

1.3 Công nghệ nano và nano Piperine

1.1.1 Công nghệ nano

Nếu thế kỷ XX được xem là cuộc cách mạng “công nghệ thông tin” thì thế kỷXXI thuộc về “cách mạng công nghiệp 4.0” Trong đó có công nghệ nano, côngnghệ nano ra đời và phát triển hứa hẹn sẽ lắp đầy mọi nhu cầu trong cuộc sốngchúng ta

Thuật ngữ “công nghệ nano” được khoa học thế giới bắt đầu sử dụng vào năm

1974 do kỹ sư người Nhật Norio Taniguchi đề xướng Công nghệ nano

(Nanotechnologies) là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích cấu

trúc, chế tạo và ứng dụng của cấu trúc, sáng chế, hệ thống được kiểm soát hình dáng

và kích thước ở quy mô nano [19]

Vật liệu nano là đối tượng của công nghệ nano, kích thước của vật liệu nanotrải một khoảng khá rộng, từ vài nm đến vài trăm nm Vật liệu nano nằm giữa tínhchất lượng tử của nguyên tử và tính chất khối của vật liệu [19]

Vật liệu nano đã và đang là một lĩnh vực nghiên cứu đỉnh cao, một vấn đề hếtsức thời sự và được các nhà khoa học rất quan tâm Các nước trên thế giới hiện nayđang bước vào một cuộc chạy đua mới về phát triển và ứng dụng của công nghệnano vì những tính chất chuyên biệt của nó Trong đó có sự nghiên cứu và phát triển

về ứng dụng của nano piperine

1.3.1 Nanopiperine

Piperine là thành phần chính trong hạt hồ tiêu, có hoạt tính sinh học cao vàđược chứng minh có rất nhiều công dụng hữu ích trong phòng ngừa và hỗ trợ điều

trị bệnh tật (Mục I.2.4) Tuy nhiên khả năng ứng dụng piperine còn nhiều hạn chế

do tinh thể kích thước to, độ hòa tan kém trong nước (Bảng 1.2), trong khi đa phần

các phản ứng chuyển hóa đều xảy ra trong môi trường nước gây khó khăn cho quá

trình hấp thu hoạt chất Muốn đạt được độ hấp thu cần thiết phải dùng thuốc ở nồng

độ cao Tuy nhiên dùng ở lượng thuốc cao có thể sẽ gây hại đến hệ thần kinh trungương và nâng cao chi phí điều trị

Vậy câu hỏi đặt ra cho các nhà khoa học: “Làm thế nào để tăng khả năng hòatan, nâng cao hoạt tính sinh học của piperine?” Công nghệ nano đã và đang là mộttrong những giải pháp được lựa chọn nghiên cứu, mang lại nhiều thành tựu nhấtđịnh

1.3.2 Tính chất của vật liệu nano

Với đặc trưng kích thước nhỏ, vật liệu nano có những tính chất nổi trội:

 Diện tích bề mặt tăng

 Dễ phân phân tán hạt trong chất lỏng

 Tăng độ tan, giảm sa lắng

 Phù hợp kích thước khe hở, lỗ trên thành tế bào (da, ruột,…) nên dễ hấpthụ, có ý nghĩa trong dẫn truyền, vận chuyển hoạt chất

 Hiệu ứng lượng tử của vật liệu nano, tính chất quang học (ứng dụngchụp ảnh quang học, thắp sáng các tế bào trong nhận biết và tải thuốc),tính chất vật lý (điện tính, từ tính,…) khác biệt đáng kể so với các vậtliệu có kích thước lớn hơn [27]

Có rất nhiều phương pháp kĩ thuật làm tăng độ hòa tan của hoạt chất ít tantrong nước như bao giữ bằng các hệ như liposomes, nano nhũ tương, nano béo rắn,nano huyền phù, nano polymer… nhưng đều có những ưu và hạn chế nhất định.Nhìn chung, việc giảm kích thước hạt xuống vùng nano sẽ làm cho diện tích bề mặthạt tăng lên đáng kể, giảm sa lắng, tăng độ hòa tan cũng như nâng cao hoạt tính củahoạt chất.

1.3.3 Phương pháp và các kỹ thuật tạo hệ nano

Hiện nay cơ sở của các phương pháp kĩ thuật tạo nano đều dựa trên hai nguyên

lý cơ bản là Top – down và Bottom – up

Hình 1.7 Sơ đồ nguyên lý phương pháp Top – down và Bottom – up

a Phương pháp Top – down

Nguyên lý: chia nhỏ một hệ thống lớn để cuối cùng tạo ra được đơn vị có kíchthước nano dựa trên tác động cơ học [7]

Hình 1.8 Một số kĩ thuật trong phương pháp Top – down [7]

Có thể sử dụng một số kĩ thuật như nghiền bi; đồng hóa (tốc độ cao, áp suấtcao); hỗ trợ siêu âm;…

 Kỹ thuật xay xát, nghiền bi: là phương pháp cổ điển dùng máy nghiền bi

để tạo nano Buồng nghiền bao gồm các bi nghiền, môi trường phân tán(thường là nước hoặc đệm thích hợp), vật liệu cần tạo nano và chất ổnđịnh Các bi được quay ở tốc độ cắt rất cao, va đập vào nhau Lực cắt sinh

ra giữa khối vật liệu và bi nghiền là tác nhân chính làm giảm kích thướchạt về nano [20]

 Đồng hóa tốc độ cao: sử dụng thiết bị đồng hóa áp cao để giảm kích

thước hạt thuộc pha phân tán về kích thước nano và phân bố đều chúngtrong pha liên tục Hỗn hợp được nén qua một khe hẹp rất nhỏ với áp suấtcao, chênh lệch áp suất giữa đầu vào và đầu ra của khe hẹp lớn Khi thayđổi áp suất đột ngột và tốc độ tăng lên nhiều lần làm cho hạt bị xé nhỏ ra.Kết hợp với sự va chạm tốc độ cao giữa các hạt trong hệ huyền phù(chuyển động Brown) làm hạt nhỏ thêm Đồng thời sự hình thành và vỡbọt khí tạo một lực đủ lớn (cavitation) để phá vỡ các vi hạt về kích thướcnano [22]

 Công nghệ hỗ trợ siêu âm: siêu âm cung cấp năng lượng qua hiện tượng

tạo và vỡ bọt khí (cavitation) tạo ra một áp suất lớn lên đến 2000 atm,nhiệt độ lớn hơn 5000 0C và xảy ra trong khoảng thời gian rất ngắn (µs:microsecond) cùng sự va chạm trong chuyển động Brown làm cho hạt vỡ

ra thành những hạt nhỏ hơn Kích thước hạt tùy thuộc vào tần số và côngsuất của thiết bị siêu âm [21]

Hình 1.9 Nguyên lý tạo và vỡ bọt khí trong siêu âm

Nhận xét: các kĩ thuật theo phương pháp Top – down hỗ trợ tạo hệ về kíchthước nano khá tốt, kiểm soát kích thước hạt nano tạo ra và độ đồng đều cao (nhờkiểm soát các thông số như nhiệt độ, tốc độ đồng hóa, thời gian) nhưng do tác động

cơ học nên phát sinh nhiệt dễ làm ảnh hưởng tính chất hạt vật liệu, tiêu tốn nhiềunăng lượng Mở ra một hướng công nghệ mới

b Phương pháp Bottom – up

Nguyên lý: lắp ghép những hạt cỡ phân tử hay nguyên tử lại để thu được kíchthước nano [7]

Hình 1.10 Một số kĩ thuật trong phương pháp Bottom – up [7]

Có thể sử dụng một số kĩ thuật như kết tinh, công nghệ chất lỏng siêu tới hạn,

… để tạo hạt nano

 Kĩ thuật kết tinh:

- Qúa trình kết tinh gồm 3 giai đoạn: tạo dung dịch có nồng độ quá bãohòa, tạo mầm tinh thể và phát triển tinh thể

- Để mầm có kích thước càng nhỏ đòi hỏi ở cùng một nồng độ xác định

có nhiều mầm tạo ra đồng thời Động lực tạo mầm phụ thuộc vào hàngrào năng lượng tự do Gibbs G Năng lượng tự do Gibbs càng nhỏ thì

tốc độ tạo mầm nhanh, mầm tinh thể tạo ra càng nhiều



Trong đó : sức căng bề mặt V s: thể tích phân tử

k: hằng số Boltzmann S: độ quá bão hòa, Với *

o

C S C



Từ (1-1) => Để G nhỏ cần đảm bảo hệ có sức căng bề mặt nhỏ, dung dịch

quá bão hòa, nồng độ ban đầu phải đủ lớn và độ nhớt thấp sẽ tạo được nhiều mầm

có kích thước nhỏ

 Sử dụng chất lỏng siêu tới hạn tạo nano:

- Công nghệ CO2 siêu tới hạn (CO2 Super Critical Fluid Technology): làtrạng thái CO2 được nén tới áp suất ≥ 74 atm và nhiệt độ giữ từ 31,1oCtrở lên Tính tan của các hoạt chất trong lưu chất siêu tới hạn (tăng hoặcgiảm) phụ thuộc vào áp suất và nhiệt độ của lưu chất

Hình 1.11 Tính tan của hoạt chất phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất của

lưu chất

- Hai phương pháp ứng dụng dòng siêu tới hạn trong việc tạo nano:

o Chất lỏng siêu tới hạn như là một dung môi: dùng dung môi siêu tớihạn bão hòa chất tan, được nén đến áp suất cao, làm giảm áp suấtđột ngột, làm các hạt nhỏ chất tan bị tách nhỏ ra và có khả năngkhuếch tán cao (Top – down)

o Chất lỏng siêu tới hạn như là một chất kháng dung môi: được sửdụng khi chất tan có độ tan kém trong dung môi Chất tan được hòavào dung môi và tiếp xúc với dòng siêu tới hạn, dung môi bay hơivào pha khí tạo ra tình trạng quá bão hòa làm các hạt bị kết tinh(Bottom – up) [2]

- Kĩ thuật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng nén vàkhuếch tán cao, tốc độ bay hơi lớn, khả năng thay đổi linh hoạt độ nhớtcủa dung dịch nhờ kiểm soát cặp thông số nhiệt độ và áp suất của lưuchất Ứng dụng thành công trong quy trình sản xuất nano carotenoid từquả gấc bằng kĩ thuật dùng chất lỏng CO2 siêu tới hạn [8]

Nhận xét: Tạo hệ hạt nano bằng phương pháp Bottom – up khắc phục đượcquá trình phát nhiệt do tác dụng cơ học của phương pháp Top – down, nhưng rất dễtạo ra vật liệu có kích thước micro, sử dụng dung môi đắt tiền, nâng cao chi phí sảnxuất.

c Kết hợp phương pháp Top – down và Bottom up

Sự kết hợp hai phương pháp này mang lại hiệu quả tối ưu hơn, giảm phát sinhnhiệt, ít tiêu tốn năng lượng, kiểm soát kích thước nano tạo ra, độ đồng nhất hạt,phân bố đồng đều, nâng cao độ bền hệ và giải quyết bài toán kinh tế

1.3.4 Một số công trình nghiên cứu hệ dẫn truyền nano piperine

Bảng 1.5 Một số công trình nghiên cứu hệ dẫn truyền nano piperine

ST

NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

1

Hệ nano polymer

piperine Năm 2015, M Pachauri và cộng sự đã tạo thành công hệ P-PEG-PNP(Piperine – PEG – PLGA nanoparticles) ở kích thước 132 nm, được đánh

giá cao về trạng thái vô định hình của piperine trong lõi ma trận PNP Sựkết hợp Aptamer và hệ P-PEG-PNP cùng khả năng tự phân hủy sinh họccủa PLGA, hỗ trợ tải thuốc vào đúng chính xác vị trí tế bào ung thư vú,giải phóng thuốc dễ dàng, nồng độ piperine tập trung cao

ổn định tạo hệ tự nhũ hóa nhằm tăng cường khả năng hòa tan và khảdụng sinh học bằng đường uống của hoạt chất tan kém trong nước(piperine) so với dạng viên nén

Bing Shao, 2015[15]

3

Hệ nano liposome

piperine Năm 2016, Pentak tạo thành công hệ liposome piperine ở kích thước 100nm – 120 nm, hiệu suất bao giữ cao 90,5% (phù hợp để bào chế

liposome mang các dược chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh nhưpiperine, albumin, ) tăng khả năng giải phóng thuốc, duy trì hàm lượng

Kiểm soát được quá trình giải phóng hoạt chất, hạn chế rò rĩ thuốc khiđưa vào cơ thể, đảm bảo phóng thích hoạt chất đúng nơi, độ bền và tính

ổn định cao Hệ được đánh giá là hệ dẫn truyền tốt các hoạt chất kỵ nước

và khó hấp thụ vào cơ thể, hỗ trợ điều trị bệnh viêm khớp ở chuột

NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

5 Hệ huyền phù

nano piperine

Năm 2014, sinh viên Đỗ Đăng Triết dưới sự hướng dẫn của PGS TS LêThị Hồng Nhan đã nghiên cứu và hoàn thiện bước đầu quy trình tạo hệhuyền phù nano piperine từ dịch chiết tiêu bằng phương pháp sục hơinước với sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt tween 80 lecithin Nồng độpiperine trong hệ phân tán là 0,3 mg/mL, kích thước trung bình đạt 10nm

Đỗ Đăng Triết, 2014[9]

6 Hệ huyền phùnano piperine

Năm 2016, sinh viên Hồ Ngọc Khoa đã hoàn thiện quy trình tạo hệ phântán nano piperine từ dịch chiết hạt hồ tiêu bằng phương pháp sục hơinước, sử dụng hoạt động bề mặt lecithin Hệ huyền phù đạt kích thước

152 nm Hệ được đưa về dạng bột nano với hàm lượng piperine 2,51%

Sản phẩm bột nano được đánh giá độ hòa tan ở pH 1,2; 4,5 và 6,8; tại

180 phút kết quả lần lượt đạt 22,3%; 21% và 43,4%

Hồ Ngọc Khoa,12/2016 [5]

Nguyễn Công Khoa,

Dương Bảo Hoàng,

2018 [3]

nano curcumin có độ tan gấp 2000 lần so với curcumin nguyên liệu.

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu và nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu tạo hệ huyền phù piperine từ dịch chiết tiêu và cao tiêu với chấthoạt động bề mặt HC40 bằng phương pháp đồng hóa tốc độ cao, sấy phun đưa hạtphân tán về dạng bột

Với mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu

- Chưng cất tinh dầu tiêu

- Chiết piperine với ethanol từ bã tiêu sau chưng cất Thu và định lượngpiperine ở dạng dịch chiết và cao chiết

- Khảo sát điều kiện tạo hệ huyền phù piperine (từ dịch chiết và cao chiết)với chất HĐBM HC40

- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng quá trình tạo hệ phân tán

- Sản xuất thử nghiệm piperine dạng bột bằng phương pháp sấy phun

Tóm tắt nội dung nghiên cứu:

Hình 2.12 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Chiết piperine

Hồ tiêu

Xử lý nguyên liệuChưng cất tinh dầu

Thu dịch chiết và cao chiết

Tạo hệ huyền phù piperine

Định lượng piperine

trong dịch và cao

Tối ưu hóa hệ huyền phù piperineTạo mẻ lớnSấy phunSản phẩm

Tinh dầu thô

2.2 Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu – hóa chất Nguồn gốc – xuất xứ

Hồ tiêu đen Thu hoạch ở Đồng Nai tháng 9/2018

6 Ống sinh hàn bầu, nhiệt kế

- Thiết bị phân tích và đánh giá:

1 Máy đo độ ẩm (Sartorius)

2 Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis (Genesys 10S UV - VIS)

3 Máy đo kích thước hạt (Horiba LA – 950V2)

4 Máy đo màu Minolta CR 300

- Thiết bị thí nghiệm:

1 Cân kỹ thuật

2 Thiết bị sấy thông gió

3 Máy xay nguyên liệu

4 Hệ thống chưng cất tinh dầu

5 Hệ thống chiết nóng

6 Thiết bị lọc chân không

7 Máy cô quay

lần, lấy kết quả trung bình tại nhiệt độ cài đặt 105 0C, thời gian thực hiện đến khigiá trị độ ẩm không đổi trong 1 phút.

(2.2)Trong đó: là độ ẩm trung bình (%)

là độ ẩm lần đo thứ i (%)

= 3 (số lần đo)

1.1.2 Đánh giá hàm lượng piperine

Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thu để đánh giá hàm lượng piperine

Đo độ hấp thu các dung dịch piperine ở bước sóng 343 nm Sử dụng máy đoquang phổ hấp thu UV – Vis (Genesys 10S UV – VIS) tại phòng thí nghiệm Hóadược – Đại học Bách Khoa TP HCM

Xây dựng đường chuẩn: piperine tinh khiết được hòa tan trong ethanol 990 để

thu các dung dịch piperine ở nồng độ C khác nhau, xác định độ hấp thu piperine A tương ứng Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa C và A theo định luật Lambert -

Beer Từ đồ thị, áp dụng phương pháp bình phương cực tiểu để xây dựng phương

0 0 0 0 0 0.01 0.01 0.01 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1

1.2 f(x) = 167.21x - 0.02 R² = 1

A = f(C)

A=f(C) Linear (A=f(C))

và pha loãng bằng ethanol 980 với hệ số pha loãng F, đo độ hấp thu A tương ứng Sau đó, sử dụng phương trình đường chuẩn A = f(C) để suy ra hàm lượng.

2.3.1 Kích thước hạt và phân bố kích thước hạt

Sự phân bố kích thước hạt và đường kính trung bình của hạt phân tán đượcxác định bằng phương pháp đo quang phổ tán xạ laser (LDS)

Nguyên lý cơ bản của phương pháp tán xạ laser: khi chiếu hai chùm ánh sáng

đỏ ( = 650 nm), ánh sáng xanh ( = 405 nm) qua dung dịch huyền phù pha loãng,các đầu dò sẽ quét một góc từ 00 - 900 để thu lại các chùm tia khúc xạ và phản xạ,hàm phân bố kích thước sẽ được tính toán dựa theo định luật tán xạ Mie, cho kếtquả hàm phân bố kích thước và tính toán giá trị đường kính trung bình (dạng mean

và median) Việc phân tích mẫu được thực hiện trên máy Horiba LA – 950V2 tạiphòng thí nghiệm Bộ môn Kỹ thuật hữu cơ – Đại học Bách Khoa TP HCM

2.3.2 Đánh giá màu sắc của sản phẩm bột

Màu sắc ngoại quan của sản phẩm có thể thay đổi bởi các yếu tố tác động khácnhau Vì thế, màu sắc sản phẩm cần được đánh giá để nhận biết sự khác biệt giữacác mẻ sản phẩm trong các điều kiện sản xuất khác nhau

Cách đo màu: sử dụng cuvet chứa mẫu (nếu là mẫu dịch) hoặc cho mẫu vàogiữa 2 lam kính thủy tinh (nếu là mẫu dạng bột) Đặt đầu dò lên bề mặt cuvet hoặclam kính chứa mẫu Mẫu được đo 3 lần bằng máy đo màu Minolta CR 300 tạiphòng thí nghiệm Bộ môn Kỹ thuật hữu cơ – Đại học Bách Khoa TP HCM và lấykết quả trung bình Sự biến đổi màu sắc trong không gian màu CIE được tính theocông thức:

(2.3)

Trong đó L: độ sáng, có giá trị từ 0 – 100 (ứng với màu đen đến màu trắng).

Những màu có cùng độ sáng nằm trên cùng một mặt phẳng

C: độ bão hòa màu, có giá trị từ 0 – 100 (với 0 nằm ở trung tâm của

vòng tròn tương ứng với màu sắc trung tính và 100 ở rìa vòng tròn ứng với các màu

có độ bão hòa màu cao nhất)

h: góc màu (liên quan đến tông màu), góc màu được biểu diễn trên

vòng tròn màu, theo ngược chiều kim đồng hồ, có những giá trị đặc biệt: 0 hay 360o

(màu đỏ), 90o (màu vàng), 180o (màu xanh lục), 270o ( màu lam)

Hình 2.14 Không gian màu CIE

2.4 Nội dung nghiên cứu

1.1.1 Chưng cất tinh dầu

Hồ tiêu sau khi thu hoạch ở Đồng Nai, được loại bỏ tạp, chọn những hạt tođen, đều, rửa sạch, sấy thông gió đến độ ẩm dưới 12% Xay nhỏ hồ tiêu đến kíchthước mong muốn bằng máy xay nguyên liệu, kiểm tra độ ẩm dưới 12%, xác địnhkhối lượng khô mnlk(g) của nguyên liệu

Với mnl: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

: độ ẩm trung bình (%) xác định theo mục 2.3.1

Tiến hành chưng cất tinh dầu tiêu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trực

tiếp Cân 50 g hồ tiêu, tỉ lệ R:L = 1:4, điều kiện chưng cất: t = 120 phút,  = 155 0C.Tinh dầu tiêu thô được làm khan bằng Na2SO4 khan và lưu giữ lại Bã sau chưngđược thu hồi, sấy khô, dùng chiết piperine

Hiệu suất của quá trình chưng cất tinh dầu được đánh giá thông qua đại lượngthành phần phần trăm tinh dầu tính theo khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối Biểuthức tính:

HTD = x 100% (2.4)Trong đó: HTD thành phần phần trăm tinh dầu tính theo khối lượng nguyên liệu khôtuyệt đối (mL tinh dầu/ gam nguyên liệu khô)

: thể tích tinh dầu thu được (mL)

: khối lượng nguyên liệu khô (g)

Bảng 2.7 Điều kiện chiết piperine

Khối lượng tiêu Thể tích dung môi Thời gian Nhiệt độ Điều kiện

m1 = 30 g VEthanol 980 = 187,5 mL t = 3 h  = 70 0C Khuấy gianhiệt

mtiêu = 50 g Vnước = 200 mL

khan

Tiêu đen

Xử lý nguyên liệuXay nhỏ

Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Lưu lạiLàm khan

Sấy khôChiết piperine *

w < 12%

Tinh dầu thô

Thu bã

a Quy trình chiết

Hình 2.16 Sơ đồ quy trình chiết piperine

b Hàm lượng piperine và hiệu suất quá trình chiết

Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thu và phương trình đường chuẩnpiperine ở bước sóng 343 nm (theo mục 2.3.2) để xác định nồng độ piperine trongdịch chiếtvà hiệu suất quá trình chiết Hiệu suất quá trình chiết được đánh giá thôngqua lượng piperine chiết được tính theo khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối:

Trong đó: Hpiperine: hiệu suất quá trình chiết piperine tính theo khối lượngnguyên liệu khô tuyệt đối (g piperine/ g nguyên liệu khô)

: nồng độ piperine (g/L); : thể tích dịch chiết (mL): khối lượng nguyên liệu khô (g)

Đã qua xử lý

t = 70 0C

= 3h Khuấy gia nhiệt

Cao tiêu đã được nâng cao hàm lượng so với dịch chiết Hiệu suất thu caođược xác định theo biểu thức:

Hcao = x 100% (2.6)Trong đó: Hcao : hiệu suất thu cao (gam cao khô/ gam nguyên liệu khô)

: khối lượng nguyên liệu cao thu được (g)

: độ ẩm trung bình cao (%)

: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

: độ ẩm trung bình nguyên liệu (%)

2.4.2 Tạo hệ huyền phù piperine

Tiếp nối các luận văn nghiên cứu trước đây của nhóm PGS, TS Lê Thị Hồng

Nhan: sinh viên Hồ Ngọc Khoa (12/2016) tạo hệ huyền phù nano piperine từ dịch

chiết tiêu và chất HĐBM lecithin (kích thước hạt trung bình 152 nm) [5]; sinh viên

Nguyễn Công Khoa (01/2018) tạo hệ huyền phù piperine từ bột piperine tinh khiết

với HC40 bằng phương pháp đồng hóa tốc độ cao (kích thước hạt trung bình 4,2

m, cho độ hòa tan cao ở tất cả pH) [4]; sinh viên Dương Bảo Hoàng (04/2018) tạo

thành công hệ huyền phù nano curcumin với HC40 (kích thước hạt trung bình 30 –

40 nm) [3] Dựa vào khả năng tương hợp sinh học cao của piperine và curcumin,

mở ra khả năng tạo hệ huyền phù kết hợp giữa nano piperine và nano curcumin với

sự hỗ trợ của chất HĐBM mới HC40

Trong phạm vi đề tài, tiến hành khảo sát sơ bộ các điều kiện tạo hệ huyền phùpiperine từ dịch chiết và cao tiêu với chất HĐBM HC40 Sử dụng nguyên tắc kếthợp bottom up và top down để tạo hệ huyền phù Cao tiêu hòa tan trong dung môithuận (ethanol) hoặc dịch chiết được cho từ từ vào dung môi nghịch: nước và chấtHĐBM với sự hỗ trợ của máy đồng hóa tốc độ cao FJ - 200

Quy trình tạo hệ huyền phù

Hình 2.17 Sơ đồ quy trình tạo hệ huyền phù piperine

Các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước hệ huyền phù piperine từ cao tiêu vàdịch chiết với HC40 bao gồm:

 Tỉ lệ piperine so với chất HĐBM HC40

 Tốc độ đồng hóa

 Thời gian đồng hóa

 Nồng độ của piperine

Lần lượt khảo sát sơ bộ các yếu tố theo các nội dung sau:

- Sự ảnh hưởng của các yếu tố

- Kích thước hạt pha phân tán

- Sự phân bố kích thước hạt

- Hàm lượng piperine thực tế Đạt

2.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ piperine và chất hoạt động bề mặt HC40

Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ piperine và HC40 khi tăng tỉ lệ từ 1:10 đến1:25

Bảng 2.8 Các tham số ảnh hưởng của tỉ lệ piperine và HC40

Mẫ

u

Thành phần (mẻ 50 mL)

Điều kiện đồng hóa

Piperine (g) HC40 (g) Ethanol (mL) Nước (mL)

Tương ứngvới thể tíchdịch chiếtchứa 0,05gpiperine

Vừa đủ

Máy đồng hóa FJ-200Tốc độ: 10000 rpmThời gian: 30 minNồng độ cao piperine:1g/L

2.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa

Chọn tỉ lệ piperine và HC40 tối ưu (theo kết quả thí nghiệm 1) Tiến hành

khảo sát tốc độ đồng hóa ở mức 2, 3, 4 (7000 rpm, 10000 rpm và 13000 rpm) đểđánh giá ảnh hưởng của tốc độ đến khả năng tạo hệ huyền phù

Bảng 2.9 Các tham số ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa

2.4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng hóa

Chọn tỉ lệ piperine : HC40 và tốc độ đồng hóa tối ưu (theo kết quả thí nghiệm

1 và 2) tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng đến khả năng tạo hệ huyền phù tại các thời

gian đồng hóa 15 phút, 30 phút và 45 phút

Bảng 2.10 Các tham số ảnh hưởng của thời gian đồng hóa

2.4.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ piperine

Chọn tỉ lệ piperine : HC40, tốc độ và thời gian đồng hóa tối ưu (theo kết quả

thí nghiệm 1, 2, 3) khảo sát sự ảnh hưởng hệ huyền phù tại các nồng độ piperine:

2.4.3.5 Tình chất của hệ huyền phù và tối ưu hóa

Tất cả các hệ huyền phù tạo thành đều được xác định kích thước hạt và sự

phân bố kích thước hạt (theo 2.3.3), đánh giá hàm lượng piperine thực tế trong hệ (theo 2.3.2) và tối ưu hóa sự ảnh hưởng các yếu tố đến kích thước trung bình hệ

phân tán (median) dựa trên kết quả khảo sát sơ bộ

2.4.3 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng hệ huyền phù piperine

2.4.4.1 Quy hoạch thực nghiệm

Bảng 2.12 Các yếu tố ảnh hưởng và phạm vi khảo sát:

thiểu

Điều kiện tối đa

Phương pháp: quy hoạch thực nghiệm

Phần mềm: Design Expert 11

2.4.4.2 Phương pháp phân tích và đánh giá

Đáp ứng của quá trình tối ưu là kích thước trung bình hệ phân tán (median,

m) sau quá trình tạo hệ huyền phù phân tán piperine

Giải bài toán tối ưu hóa hàm đa mục tiêu bằng cách chập hàm mục tiêu theothuật toán hàm dự đoán được đưa ra bởi phần mền Design Expert:

- Phân tích tương tác giữa mô hình và thực nghiệm

- Kiểm tra sự tương quan giữa mô hình và thực nghiệm dựa trên tiêuchuẩn Fisher với mức ý nghĩa p < 0,05

Phân tích phương sai ANOVA:

Dự đoán sự ảnh hưởng của các thông số thông qua việc phân tích hệ số củacác biến và suy ra phương trình hồi quy

Căn cứ vào R2 và R2 Adjusted (sau khi điều chỉnh những thí nghiệm không cónghĩa) biểu thị mối tương quan giữa mô hình và thực nghiệm Với R2 là hệ số của

sự biến đổi các đáp ứng được giải thích bằng phương trình hồi quy

Bảng 2.13 Đánh giá mối tương quan giữa mô hình và thực nghiệm

R2 < 0,1 Tương quan ở mức thấp0,1  R2  0,25 Tương quan ở mức trung bình0,25  R2  0,5 Tương quan khá chặt chẽ0,5  R2 < 0,8 Tương quan chặt chẽ0,8  R2 Tương quan rất chặt chẽ

R2 có giá trị trong khoảng từ 0 đến 1 R2 càng gần 1 thì chứng tỏ mô hình càngtốt R2 cho thấy sự đánh giá cao về khả năng phù hợp thực nghiệm với dự đoán

R2 adjusted: hệ số của sự biến đổi các mô hình đã được điều chỉnh cho phùhợp với độ tự do của số

Phương trình theo biến mã hóa có dạng:

y = 0 + 1x1 + … + kxk + … + ijxixj + … + ijkxixjxk , Với i  j  k = 1, 2, 3, kTrong đó, 0 là hệ số hồi quy

1 là hệ số tuyến tính

ij, ijk là hệ số tương tác cặp, tương tác ba

2.4.4 Sấy phun tạo sản phẩm dạng bột

Do hệ huyền phù tạo thành dễ bị biến đổi tính chất hóa lý theo thời gian, khólưu trữ nên cần đưa sản phẩm về dạng bột để nâng cao thời gian bảo quản và dượctính sử dụng Hệ huyền phù tối ưu được tạo bột bằng phương pháp sấy phun với giámang là đường maltodextrin

Qúa trình tạo bột sản phẩm được thực hiện trên hệ thống thiết bị sấy phun tạiphòng thí nghiệm Hóa dược – Đại học Bách Khoa TP HCM

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đánh giá và xử lý nguyên liệu

Hình 3.18 Hồ tiêu đen

- Hạt hồ tiêu đen thu hoạch tại huyệnVĩnh Cửu - Đồng Nai vào tháng09/2018

- Hồ tiêu hình cầu, vỏ ngoài màu đen,kích thước hạt trung bình 4 – 6 mm

- Có mùi thơm đặc trưng của tiêu

- Hồ tiêu được loại bỏ tạp, rửa sạch,sấy thông gió đến độ ẩm = 9,17%

3.2 Quy trình chưng cất tinh dầu

Chưng cất tinh dầu hồ tiêu theo điều kiện mục 2.4.1:

Hình 3.20 Hệ thống chưng cất tinh dầu tiêu và tinh dầu tiêu

Bột hồ tiêu có độ ẩm = 9,23% Khối lượng nguyên liệu khô trong 50 g bột hồ

tiêu: m nlk = 45,39 g Sau quá trình chưng cất thu được 0,72 mL tinh dầu tiêu (hiệusuất thu tinh dầu tính theo nguyên liệu khô 1,59%) Tinh dầu tiêu có màu vàng nhạt,nhẹ hơn nước, mùi cay nồng rất mạnh

Hình 3.21 Bã hồ tiêu thu hồi sau chưng

Bã hồ tiêu sau chưng được thu hồi, sấy thông gió đến độ ẩm = 7,41% (khối

lượng nguyên liệu khô trong 30g bã hồ tiêu: m nlk = 27,78g) và xay thành bột Bã hồtiêu có màu nâu sáng, mất phần lớn mùi cay nồng đặc trưng của tiêu, mùi thơm rấtnhẹ và dễ chịu Bã hồ tiêu được dùng chiết piperine với dung môi ethanol 98%

3.3 Chiết tách piperine

Chiết tách piperine theo điều kiện mục 2.4.2 Dịch chiết hồ tiêu sau lọc có màu

nâu đậm, mùi thơm nhẹ dịu Dịch chiết dùng xác định hàm lượng piperine và côthành cao, nâng cao hàm lượng piperine Cao tiêu dạng sệt, màu đen ánh nâu Dịchchiết và cao chiết được bảo quản lạnh, kín, tránh ánh sáng trực tiếp

Hình 3.22 Dịch chiết cồn piperine và cao tiêu

Bảng 3.14 Kết quả quá trình chiết piperine

Mẫu Dịch chiết bột hồ tiêu với ethanol Trung bình

Hiệu suất quá trình chiết

piperine tính theo khối lượng

nguyên liệu khô, H piperine (%)

Khối lượng cao thu được,

m cao (g) 2,57 2,83 2,78 2,73

Hiệu suất thu cao, H cao (%) 8,79 9,65 9,49 9,31

So sánh với kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm Hồ Ngọc Khoa [39]: nồng

độ piperine 5,21 mg/mL, nồng độ piperine trong dịch chiết thu được tương đối

được nâng cao Dịch chiết đã giảm phần lớn mùi hăng, nồng đặc trưng của tiêu, mùirất nhẹ, cho cảm quan tích cực khi ứng dụng dịch chiết tiêu và các chế phẩm liênquan vào lĩnh vực dược học.

Bảng 3.15 Kết quả định lượng piperine trong cao tiêu và dịch chiết tiêu

Mẻ 2

1mL dịch chiết chứa 6,99 mg piperine 1mg cao tiêu chứa 0,33 mg piperine

Pha loãng cao tiêu và dịch chiết tiêu với cùng nồng độ, xác định phổ đồ hấp thu UV –Vis của mẫu

Hình 3.23 Phổ đồ hấp thu UV – Vis của mẫu

dịch chiết tiêu pha loãng trong ethanol

100 200 300 400 500 600 700 800 900 0

0.5 1 1.5 2 2.5

Acao = f(Ccao)

Hình 3.24 Phổ đồ hấp thu UV – Vis của mẫu

cao tiêu pha loãng trong ethanol

Từ hình 3-7 và hình 3-8, phổ đồ hấp thu của dịch chiết và cao tiêu tương

đồng, không xuất hiện peak lạ, đều có chân đường nền thấp, chứng tỏ piperine tanrất tốt trong ethanol, không bị hiện tượng tán xạ bởi các hạt không tan Ở bước sóng343nm, piperine hấp thu mạnh

3.4 Tạo hệ huyền phù piperine và đánh giá kết quả

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ piperine và chất hoạt động bề mặt HC40

Bảng 3.16 Điều kiện khảo sát tỉ lệ tạo hệ huyền phù piperine (mẻ 50 mL)