Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông (panulirus ornatus) bị bệnh đỏ thân nuôi lồng tại tỉnh

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đã nêu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của chủ nhiệm đề tài “Đánh giá

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đã nêu trong luận văn này là công trình

nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của chủ nhiệm đề tài

“Đánh giá thực trạng sử dụng kháng sinh, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và đề xuất giải pháp phòng trị bệnh tôm hùm nuôi lồng bè hiệu quả tại vùng biển Phú Yên”

thuộc chương trình đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh do Viện Nghiên cứu Nuôitrồng Thủy sản III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chưa được ai công bố trongbất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Trang Đặc biệt, các thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã giúp tôi có được những kiến thức chuyên ngành cơ bản, quý báu và cần thiết

Đặc biệt tôi chân thành cảm ơn TS Võ Văn Nha và TS Nguyễn Văn Minh, hai người

đã trực tiếp hướng dẫn, định hướng đề tài và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập

Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn đến:

- Các anh chị thuộc Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền trung, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

- Chi cục Thú y huyện Sông Cầu, Chi cục Thú y huyện Tuy An và bà con ngư dân ở hai huyện đã giúp đỡ tôi trong thời gian điều tra và thu mẫu

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến ba mẹ, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên

cổ vũ tôi trong suốt thời gian học tập của mình

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một vài đặc điểm về vi khuẩn Vibrio alginolyticus 3

1.1.1 Vị trí phân loại Vibrio alginolyticus 3

1.1.2 Đặc điểm phân bố của Vibrio alginolyticus 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Vibrio alginolyticus 4

1.1.4 Yếu tố gây độc của Vibrio alginolyticus 5

1.2 Những nghiên cứu trên thế giới có liên quan đến luận văn 5

1.2.1 Tình hình nuôi và bệnh trên tôm hùm nuôi trên thế giới 5

1.2.1.1 Tình hình nuôi 5

1.2.1.2 Tình hình bệnh 7

1.2.2.Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới 8

1.2.2.1 Khái niệm về kháng sinh 8

1.2.2.2 Các nhóm kháng sinh thường được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.9 1.2.2.3 Tình hình sử dụng kháng sinh 11

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản nuôi trên thế giới 11

1.2.3.1 Khái niệm về kháng kháng sinh 11

1.2.3.2 Cơ chế của sự kháng thuốc 12

1.2.3.3 Những nghiên cứu về hiện tượng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản nuôi trên thế giới 12

1.3 Những nghiên cứu ở Việt Nam có liên quan đến luận văn 13

1.3.1 Tình hình nuôi và bệnh ở tôm hùm nuôi lồng tại Việt Nam 13

1.3.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản và nuôi tôm hùm lồng ở Việt Nam 15

1.3.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập trên tôm hùm nuôi lồng ở Việt Nam 16

1.4 Đặc điểm điều kiện tự nhiên tỉnh Phú Yên 17

1.4.1 Vị trí địa lý 17

1.4.2 Địa hình 17

1.4.2.1 Vùng đất liền 17

1.4.2.2 Bờ biển 17

1.4.3 Một số đặc điểm thủy văn 18

1.4.3.1 Hải lưu 18

1.4.3.2 Độ mặn 18

1.4.3.3 Nhiệt độ 18

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus 19

2.1.2 Phạm vi: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân nuôi lồng tại vùng biển Phú Yên 19

2.1.3 Thời gian: từ ngày 06/12/2013 đến 1/11/2014 19

2.1.4 Địa điểm 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn 20

2.2.2 Phương pháp điều tra thực trạng nuôi và sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên tôm hùm bông nuôi lồng tại vùng biển tỉnh Phú Yên 21

2.2.2.1 Nguồn thông tin thứ cấp 21

2.2.2.2 Nguồn thông tin sơ cấp 21

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định hiện tượng kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân 22

2.2.3.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu tôm hùm 22

2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn Vibrio alginolyticus 22

2.2.3.3 Phương pháp lập kháng sinh đồ: 23

2.2.3.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 24

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 26

2.3.1 Phân tích hiện trạng nghề nuôi 26

2.3.2 Phần mềm xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả điều tra hiện trạng nghề nuôi và sử dụng kháng sinh ở tôm hùm

nuôi lồng tại Phú Yên năm 2014 27

3.1.1 Vùng nuôi và trình độ học vấn người nuôi tôm hùm ở Phú Yên 27

3.1.2 Hiện trạng nuôi và bệnh ở tôm hùm nuôi lồng ở Phú Yên đầu năm 2014 28 3.1.3 Hiện trạng sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm hùm lồng ở Phú Yên đầu năm 2014 29

3.1.3.1.Thực trạng sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm hùm lồng ở Phú Yên đầu năm 2014 29

3.1.3.2.Đánh giá hiệu quả của việc dùng thuốc kháng sinh trong phòng trị bệnh đỏ thân trên tôm hùm nuôi lồng tại Phú Yên dựa trên kết quả điều tra.33 3.2 Kết quả nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn 34

3.2.1 Kết quả xác định dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của tôm hùm bị bệnh đỏ thân ở những vùng thu mẫu khác nhau 34

3.2.2 Kết quả xác định hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Vibrio alginolyticus phân lập ở những vùng thu mẫu khác nhau 36

3.2.2.1 Hình thái vi khuẩn Vibrio alginolyticus 36

3.2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Vibrio alginolyticus 37

3.3.1 Kết quả kháng sinh đồ các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm hùm bông bị đỏ thân ở các vùng nuôi khác nhau 39

3.3.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh (MIC) với vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ những tôm hùm bông bị đỏ thân ở các vùng nuôi khác nhau 45

3.3.2.1 Kết quả thử kháng sinh có nồng độ cao nhất 45

3.3.2.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 45

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACIAR: (Centre for International Agricultural Research): Trung tâm Nghiên

cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia

ASIAN: (Association of Southeast Asian Nations): Hiệp hội các Quốc gia

Đông Nam Á

CARD: Chương trình Hợp tác Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

CL: Chiều dài giáp đầu ngực

CLSI: (The Clinical and Laboratory Standards Institure) Viện Tiêu chuẩn

Lâm sàng và Xét ngiệm

CFU: (Colony Forming Units): Đơn vị khuẩn lạc

MIC; (Minimal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

NTTS: Nuôi trồng thủy sản

NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

TCBS: (hiosulfate Citrate Bile Salts Agar): môi trường nuôi cấy chọn lọc cho

vi khuẩn Vibrio

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TSA: (Tryptic Soy Agar): môi trường nuôi cấy không chọn lọc

R-plasmid: (resistant plasmid): là các loại plasmid chứa một hay nhiều gen có khả năng sản xuất các loại protein (chủ yếu là các enzym) kháng lại kháng

sinh và dược chất

UBND: Ủy ban nhân dân

UI: (International Units): Đơn vị quốc tế

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1:Phân bố số lượng phiếu điều tra hiện trạng nuôi và sử dụng thuốc kháng sinh

trong phòng trị bênh tôm hùm nuôi lồng năm 2014 21

Bảng 2.2: Số lượng mẫu tôm hùm thu để phân lập Vibrio alginolyticus 22

Bảng 3.1: Trình độ học vấn của chủ hộ nuôi tôm hùm lồng đầu năm 2014 (n=221) 27Bảng 3.2: Một số bệnh/hội chứng trên tôm hùm nuôi lồng tại Phú Yên năm 2014

(n=221) 29 Bảng 3.3: Tỷ lệ số hộ sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh tôm hùm tại Phú Yên

30 Bảng 3.4: Các loại kháng sinh sử dụng trong phòng trị bệnh tôm hùm nuôi lồng tại Phú

Yên đầu năm 2014 (n=221) 31 Bảng 3.5: Tỷ lệ người nuôi tôm hùm biết đến các loại kháng sinh cấm sử dụngtrong

nuôi trồng thủy sản (n=221) 32 Bảng 3.6: Hiệu quả sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị bệnh đỏ thân năm 2014

33 Bảng 3.7: Đặc điểm các mẫu tôm hùm thu tại Phú Yên 35

Bảng 3.8: Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus

phân lập trên tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân nuôi tại vùng nuôi tỉnh PhúYên 36

Bảng 3.9: Đặc điểm sinh hóa của 12 chủng Vibrio alginolyticus phân lập được ở ba

vùng địa lý khác nhau 38

Bảng 3.10: Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticusphân lập từ

tôm hùm bị bệnh đỏ thân 40 Bảng 3.11: Tỷ lệ phần trăm nhạy, nhạy trung bình và kháng của các chủng vi khuẩn

với 8 loại kháng sinh 41

Bảng 3.12: Kết quả thử kháng sinh có nồng độ cao nhất lên vi khuẩn Vibrio

alginolyticus 45

Bảng 3.13: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh đối với vi

khuẩn Vibrio alginolyticus 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus 3

Hình 1.2: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và conngười 8 Hình 2.1:

Sơ đồ vùng điều tra và thu mẫu 19 Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn 20

Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện kháng sinh đồ vi khuẩn V.alginolyticus phân lập trên tôm

hùm

bông đỏ thân 24 Hình 2.4: Sơ đồ thực hiện pha loãng kháng sinh để nghiên cứu nồng độ ức chế tối thiểu MIC 26 Hình 3.1:

Số lượng lồng nuôi tôm hùm 28Hình 3.2: Sản lượng tôm hùm nuôi lồng 28Hình 3.3: Tôm hùm bị bệnh đỏ thân 36

Hình 3.4: khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên môi trường TCBS (A) và vi

khuẩn Vibrio alginolyticus nhuộm Gram (B) 37 Hình 3.5: Đường kính vô trùng của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm hùm

bị bệnh đỏ thân thu tại Xuân Phương 40 Hình 3.6: Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế (MIC) của gentamicine lên vi khuẩn

Vibrio alginolyticus thu ở An Chấn 46

MỞ ĐẦU

Tôm hùm là loài giáp xác có hàm lượng dinh dưỡng cao, có giá trị về mặt mỹnghệ nên đã trở thành mặt hàng xuất khẩu và tiêu thụ nội địa rất được ưa chuộng Nghềnuôi tôm hùm trên thế giới tập trung nhiều ở Úc, New Zealand, Nam Phi, Cuba, Brazil,Mexico, Hoa Kỳ và một số nước khu vực Đông Nam Á (Việt Nam, Singapore,Malaysia, Philipin,…) [50] Những năm gần đây nghề nuôi tôm hùm phát triển tại cácnước Đông Nam Á, nhiều tổ chức như ACIAR, CARD đã và đang liên kết với một sốquốc gia trong khu vực ASEAN trong đó có Việt Nam để thực hiện những nghiên cứunhằm phát triển nghề nuôi tôm hùm

Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm lồng bắt đầu phát triển từ năm 2000, tôm

hùm bông (Panulirus ornatus) là loài được nuôi phổ biến nhất với những đặc điểm

riêng vượt trội về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng so với 48 loài khác cùng

thuộc họ tôm hùm gai (Palinuridae) Chúng phân bố từ vùng biển Bắc Bộ đến Nam

Trung Bộ, nhưng tập trung chủ yếu ở vùng biển Nam Trung Bộ và đã trở thành đốitượng nuôi biển quan trọng làm thay đổi đời sống kinh tế - xã hội của cộng đồng ngưdân ven biển,với kim ngạch xuất khẩu hơn 100 triệu đô la Mỹ hàng năm [8, 18]

Phú Yên là tỉnh thuộc duyên hải Nam Trung Bộ với nhiều vũng vịnh kín gió,đảo nổi, rạn đá, san hô… là nơi ưa thích cho các loài tôm hùm cư trú, sinh sống và pháttriển Đến năm 2013 cả nước có khoảng 42.500 lồng, riêng tỉnh Phú yên có trênkhoảng 20.000 lồng nuôi tôm hùm đang được người dân nuôi tự phát, với việc sửdụng nguồn thức ăn tươi sống đã dẫn đến môi trường có nguy cơ bị ô nhiễm, tạo điềukiện thuận lợi cho các tác nhân gây bệnh phát triển, làm tình hình dịch bệnh xảy rathường xuyên, gây tổn thất cho người nuôi tôm [67]

Trong số các bệnh thường xảy ra ở tôm hùm nuôi, thì nguyên nhân chủ yếu là

do vi khuẩn gây ra với những đợt dịch bệnh có qui mô lớn Đặc biệt là các vi khuẩn

Vibrio alginolyticus, V harveyi, V parahaemolyticus và Listone anguillarum là tác

nhân gây bệnh ở tôm hùm, là nguyên nhân làm tôm bị sốc, suy giảm miễn dịch hoặctổn thương [50]

Có nhiều biện pháp hạn chế việc nhiễm khuẩn trong đó sử dụng kháng sinh nhưmột biện pháp bắt buộc để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không

đúng cách và có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng đã gây những hậu quảnghiêm trọng như: tăng tác dụng phụ, tăng độc tính, gây chủng vi khuẩn lờn thuốc làmcho việc chữa trị về sau gặp khó khăn Ngoài ra sự truyền gen kháng sinh từ vi khuẩngây bệnh ỏe động vật thủy sản sang vi khuẩn gây bệnh cho người làm cho các vi khuẩngây bệnh ở người cũng bị kháng kháng sinh [5].

Chính vì vậy, nghiên cứu sự kháng kháng sinh của vi khuẩn từ đó hướng đến sửdụng kháng sinh có hiệu quả trong điều trị bệnh tôm hùm là việc làm cần thiết, gópphần hạn chế việc lạm dụng kháng sinh nhằm mục đích hướng tới “phát triển bền

vững” đó là lý do tôi chọn đề tài “Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông (Panulirus ornatus) bị bệnh đỏ thân nuôi lồng tại tỉnh Phú Yên”

Mục tiêu của đề tài luận văn:

Đánh giá được tình hình sử dụng kháng sinh và mức độ kháng kháng sinh của vikhuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân ở vùng nuôi tỉnh

Phú Yên, từ đó làm cơ sở đề xuất chủng loại và liều lượng kháng sinh điều trị bệnh do

vi khuẩn này gây ra

Nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn:

1 Điều tra thực trạng nuôi và sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh tôm hùmnuôi lồng ở vùng nuôi tỉnh Phú Yên

2 Xác định mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập

ở tôm hùm bông bệnh đỏ thân nuôi lồng tại tỉnh Phú Yên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận văn:

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài luận văn góp phần bổ sung nguồn tư liệu

nghiên cứu về mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập ở

tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài luận văn làm cơ sở để đề xuất

chủng loại và liều lượng thuốc kháng sinh điều trị có hiệu quả bệnh do vi khuẩn Vibrio

alginolyticus gây ra ở tôm hùm nuôi lồng tỉnh Phú Yên

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một vài đặc điểm về vi khuẩn Vibrio alginolyticus

1.1.1 Vị trí phân loại Vibrio alginolyticus

Theo Miyamoto (1961) [65] Vibrio alginolyticus có vị trí phân loại như sau:

Loài Vibrio alginolyticus

Hình 1.1: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus [66]

1.1.2 Đặc điểm phân bố của Vibrio alginolyticus

Vibrio alginolyticus là một loài vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng có mặt ở hầu

hết các mẫu thu từ nhiều đối tượng thủy sản khác nhau như: cá, thân mềm, rong biển,

… Vibrio alginolyticus có mặt trong môi trường nước mặn ở vùng biển nhiệt đới và là

nguyên nhân gây chết cao cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn này còn cómặt ở những người thường ăn hải sản tươi sống hoặc chưa nấu chín dẫn đến viêm dạdày, ruột và bệnh đại tràng Những bệnh này thường xuất hiện vào mùa hè khi nhiệt độtăng [57]

Vi khuẩn Vibrio alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với Vibrio parahaemolyticus đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập tại Na

Uy, Hà Lan và Nhật Bản Trong khu vực biển nhiệt đới, hai loài Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus được tìm thấy nhiều nhất, tỷ lệ các mẫu cá biển tươi sống thu

được Vibrio alginolyticus nhiều hơn là Vibrio parahaemolyticus [55]

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Vibrio alginolyticus

Vibrio alginolyticus là vi khuẩn Gram (-), hình que hơi uốn cong, kích thước 0,3 - 0,5

x 1,4 - 2,6 µm, chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiêm maomảnh nằm ở một đầu vi khuẩn Là loài vi khuẩn kỵ khí, có đặc điểm phản ứng dươngtính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với ure, arginine và không

phát sáng Vibrio alginolyticus phát triển tốt trong môi trường peptone 1% có chứa 3,

6, 8, 10% NaCl, nhưng lại không phát triển ở 0% NaCl Ngoài ra, vi khuẩn không sinh

H2S và mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129 [37]

Theo mô tả của Austin (2007) [28] và của Viên Đại Phúc (2011) [14] Vibrio alginolyticus có đặc điểm đặc trưng là phát triển thành từng cụm trên bề mặt thạch rắn,

trên môi trường TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng, bờ không đều, trên môi

trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang Vibrio alginolyticus có khả

năng làm tan huyết, phân giải chitin, lipid, gelatin và tinh bột nhưng không phân giải

aesculin Vibrio alginolyticus lên men đường với glycerol, maltose, mannitol,

mannose, salicin và sucrose nhưng không lên men đường với arabinose, inositol vàlactose

Ultizur (1975) [62] đã xác định Vibrio alginolyticus phát triển tốt nhất ở 37oC Yếu tốnhiệt độ, độ muối và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển của

vi khuẩn, trong đó nhiệt độ có tác động lớn nhất Ở 39oC thời gian phát triển giữa cácthế hệ là 10-11 phút, còn ở 21oC thời gian là 60 phút Cũng theo Ulitzur, sự phát triển

của các lông rung của roi và hoạt động bơi của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phụ thuộc

vào một mối quan hệ phức tạp giữa nhiệt độ, nồng độ muối và độ pH

1.1.4 Yếu tố gây độc của Vibrio alginolyticus

Theo nghiên cứu của Josenhans (2002) [39], nhiều vi khuẩn gây bệnh trênngười, động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển Đối với nhiều tác nhân gây bệnh,vận động là điều cần thiết trong một số giai đoạn của chu kỳ sống và độc tính cùng với

sự vận động được điều khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen Theo Hörmansdorfer (2000)

[38], Vibrio alginolyticus trong 13/45 mẫu thu từ nước biển và chất lắng cặn ở bề mặt

đá san hô Tất cả các chủng này đều có tính độc tạo ra sản phẩm men phân giải casein

và lipid, 11/13 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7/13 chủng thể hiện tác dụng vớilecithin và 2/13 chủng có men phân giải hồng cầu

Cũng như các loài vi khuẩn khác, khả năng tương tác giữa tác nhân gây bệnh

và vật chủ là sự bám dính và các hoạt động thủy phân Hoạt động thủy phân đã đượcxem là yếu tố độc tính bởi vì chúng cho phép vi khuẩn sống sót, sinh sản và xâm lấncác mô vật chủ Hoạt động phân giải protein của các sản phẩm ngoại bào có tương

quan với khả năng gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn Vibrio và Aeromonas Hầu hết các chủng Vibrio alginolyticus phân lập đều có sản phẩm của enzyme phân giải gelatin,

lipid, ADN và casein, tất cả các yếu tố độc này có thể giúp các sinh vật khác nhiễm vào

và sinh sôi nảy nở [26, 34]

Theo nghiên cứu của Narjol (2006) [48], Vibrio alginolyticus phân lập từ hầu ở Alaskan có chứa gen trh (thermostable direct haemolysin-related haemolysin), tiết ra chất có tác dụng làm tan hồng cầu, trước đây đã được báo cáo chỉ có ở Vibrio parahaemolyticus (là yếu tố gây độc của vi khuẩn này), gen giống trh này đã được tách dòng và giải trình tự giống đến 98% so với gen trh2 Vibrio parahaemolyticus Wang

(2007) [63] đã chứng minh rằng khả năng phân giải protein ngoại bào và các chất làm

tan huyết cũng như sự lấy sắt của Vibrio alginolyticus

1.2 Những nghiên cứu trên thế giới có liên quan đến luận văn

1.2.1 Tình hình nuôi và bệnh tôm hùm nuôi trên thế giới

1.2.1.1 Tình hình nuôi

Tôm hùm là một đối tượng nuôi đang được chú trọng trong nuôi trồng thủy sảnthế giới Là loại giáp xác có hàm lượng dinh dưỡng cao, chất lượng thịt thơm ngon nên

được nhiều người ưa chuộng Giá trị kinh tế mà nó mang lại là rất lớn, do vậy nghềnuôi tôm hùm được đánh giá cao trên toàn thế giới [51] Nghề nuôi tôm hùm trên thếgiới được hình thành từ cuối thế kỷ XIX, và được tiêu thụ hơn 90 quốc gia Các nướcsản xuất tôm hùm chủ yếu là Úc, New Zealand, Nam Phi, Cuba, Brazil, Mexico vàHoa Kỳ và một số nước khu vực Đông Nam Á [8]

Trước đây hầu như tất cả sản phẩm tôm hùm là từ khai thác, việc nuôi thươngphẩm tôm hùm không được phát triển mạnh mẽ Nhưng do sự phát triển kinh tế, nhucầu xã hội càng tăng đã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu bảo vệ nguồn lợi tômhùm và phát triển theo các hướng như nuôi tôm hùm từ con giống khai thác tự nhiênhoặc nuôi khép kín từ giai đoạn ấu trùng đến trưởng thành

Trên thế giới các loài tôm hùm đang được nuôi phổ biến là những loài thuộc họ

tôm hùm càng (Nephropidae) bao gồm các loài thuộc giống Homarus như: H americanus và H gamarus nuôi ở vùng biển Đông-Bắc Mỹ, Ca-na-đa, Pháp, Anh và Na-uy Mỹ là quốc gia đã thực hiện thành công việc nuôi khép kín tôm hùm Homarus americanus từ những năm 70 của thế kỷ XX, tại đây đã sản xuất được giống và đáp

ứng nhu cầu nuôi thương phẩm nhưng sản lượng còn chiếm tỷ lệ thấp so với khai thácngoài tự nhiên Một số nguyên nhân chính là do nhu cầu về dinh dưỡng, công nghệ chếbiến thức ăn tôm, dịch bệnh và các quy trình nuôi thương phẩm vẫn chưa hoàn thiện[50]

Ở châu Á đặc biệt là là khu vực Đông Nam Á, nghề ương nuôi tôm hùm giống ởlồng phát triển mạnh mẽ Quốc gia có nghề nuôi tôm hùm phát triển mạnh và sớm nhất

là Phi-lip-pin với nhiều trang trại nuôi tôm hùm được thiết lập từ những năm trướcthập niên 70 của thế kỷ XX Ngoài ra, Nhật Bản, Xing-ga-po, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ lànhững quốc gia châu Á nuôi tôm hùm bằng lồng/bè khá phát triển ở quy mô nông hộ

Các loài nuôi ở đây chủ yếu thuộc giống Panulirus như P japonicas ở Nhật Bản, P ornatus, P homarus, P longipes, P versicolor ở Xing-ga-po, Ấn Độ và In-đô-nê-xi-a.

Sản lượng từ nghề nuôi đóng góp lớn vào tổng sản lượng tôm hùm ở các nước này[12]

Tóm lại, từ những tổng hợp nghiên cứu về nuôi tôm hùm trên thế giới cho thấyrằng nghề nuôi tôm hùm đã đóng góp đáng kể vào sản lượng tôm hùm trên thế giới vàmang lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân, góp phần vào việc phát triển kinh tế ở các

nước đang phát triển đặc biệt là khu vực châu Á Tuy nhiên, lại gặp phải vấn đề khókhăn nhất là nguồn giống không ổn định, hầu hết con giống đều được đánh bắt ngoài tựnhiên Do vậy mà một số nước đã có những chính sách thắt chặt nhằm bảo vệ nguồnlợi tôm hùm cùng với đó là việc phát triển ồ ạt và tự phát không theo quy hoạch chưa

có định hướng của nghề, việc sử dụng nguồn thức ăn tươi sống đã dẫn đến ô nhiễmmôi trường cục bộ quanh khu vực nuôi tạo cơ hội tốt cho tác nhân gây bệnh phát triển,làm tình hình bệnh dịch xảy ra thường xuyên gây tổn thất cho nghề nuôi tôm

1.2.1.2 Tình hình bệnh

Cùng với sự phát triển nghề nuôi tôm hùm, bệnh tôm hùm ngày một gia tăng

trong đó bệnh do vi khuẩn đặc biệt do nhóm vi khuẩn Vibrio (V parahaemolyticus, V alginolyticus, V fluvialis, V harveyi) gây ra khá phổ biến và đã gây hại lớn cho người

nuôi tôm hùm Một số loại bệnh mà nguyên nhân chính từ vi khuẩn bao gồm:

Bệnh đỏ đuôi (Gaffkaemia)

Đây là một loại bệnh gây nguy hiểm ở tôm hùm gai (Homarus americanus, H gammarus, Panulirus argus) Nguyên nhân từ một loài vi khuẩn kí sinh không bắt buộc Aerococcus viridians Vi khuẩn này không di động, kỵ khí, gram dương, lên men

glucose, sống tự do trong môi trường nước, tấn công vào tôm hùm xuyên qua lớp vỏmàng và đi vào tế bào cơ bên trong, sau đó vào gan tụy và tế bào máu, làm tôm kém

ăn, lờ đờ, vùng bụng của đuôi tôm chuyển sang màu hồng nên gọi là bệnh đỏ đuôi[58]

Bệnh vỏ (shell disease)

Được tìm thấy đầu tiên ở tôm hùm Homarus americanus, “hội chứng bệnh vỏ” được

định nghĩa là bệnh ăn mòn dần lớp vỏ ngoài bắt đầu từ những điểm nhỏ ở lớp biểu bìtrước khi kết hợp lại để tạo thành tổn thương bào mòn liên tục và gây hoại tử lớp vỏngoài của các loài giáp xác Bệnh thường xảy ra ở con cái, ở vùng ven bờ có tỉ lệ caohơn so với vùng biển ngoài khơi và tỉ lệ cao nhất là ở mùa thu Yếu tố liên quan đếnbệnh vỏ chủ yếu từ việc nuôi mật độ cao, nuôi thời gian dài, chất lượng nước xấu,

nước có hàm lượng kim loại và chất hữu cơ lơ lửng cao Có ba nhóm vi khuẩn Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas luôn được tìm thấy trên tôm hùm bị bệnh vỏ, nấm và cả

những vi khuẩn gram âm cũng có thể là nguyên nhân gây bệnh, do vậy nguyên nhângây bệnh vỏ ở tôm vẫn chưa được xác định một cách chắc chắn [51]

Bệnh do vi khuẩn Vibrio spp gây ra (Vibriosis)

Tôm hùm đang tiếp xúc với một số lượng lớn các vi khuẩn chịu mặn trong đó

có nhiều loài vi khuẩn Vibrio gọi là bệnh Vibriosis; Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus và Listonella (Vibrio) anguillarum là tác nhân gây

bệnh ở tôm hùm thương phẩm là nguyên nhân làm tôm bị sốc, suy giảm miễn dịchhoặc tổn thương Tỉ lệ chết 75% ấu trùng trong khoảng thời gian bốn tuần Dấu hiệutổng quát bao gồm ấu trùng đục với những đốm nhỏ màu đỏ phân bố khắp cơ thể Vềmặt mô học, các ống gan tụy bị teo và đầy mảng bám vi khuẩn, vi khuẩn được phân lậptrong môi trường nhân tạo Thí nghiệm lây nhiễm ấu trùng khỏe mạnh qua tiếp xúcbằng phương pháp tắm kết luận rằng ấu trùng bị thương là dễ bị nhiễm trùng hơnnhững ấu trùng không bị thương, do đó vi khuẩn có nhiều khả năng là một tác nhân

gây bệnh thứ cấp Hai loài tôm hùm Panulirus argus và P laevicauda từ các cảng cá tại hai địa điểm ở Brazil đã bị nhiễm V alginolyticus (tỷ lệ = 45,7%), V parahaemolyticus (8,6%) và V anguillarum (2,8%) [51]

1.2.2 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới

1.2.2.1 Khái niệm về kháng sinh

Thuốc kháng sinh là những chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, mà hiệnnay chúng ta chỉ mới biết được một số chất, phần lớn chúng là do vi trùng, nấm và xạkhuẩn sinh ra Kháng sinh có tác dụng diệt hay ngăn cản sự phát triển của các vi sinhvật gây bệnh và không gây bệnh cho vật chủ [3]

Ảnh hưởng của vi khuẩn kháng kháng sinh trên động vật nuôi đến sức khỏe conngười là một vấn đề còn nhiều tranh luận Bằng nhiều con đường khác nhau, vi khuẩngây bệnh trên động vật nuôi có thể truyền gen kháng kháng sinh sang vi khuẩn gâybệnh ở người Khi đó, việc điều trị bệnh cho con người trở nên khó khăn và phức tạp

1.2.2.2 Các nhóm kháng sinh thường được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

Nhóm beta-lactamin

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu

có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và một ít vi khuẩn Gram (-) Do màng tế bào của vikhuẩn Gram (-) có tỉ lệ lipit cao nên nó kỵ nước, còn nhóm b-lactamin phải khuếchtán qua các ống dẫn protein nằm trên bề mặt màng [24, 50]

Đại diện của nhóm này thường được dùng trong thủy sản là amoxilline, ampicillin [7]

Nhóm tetracyclin

Là thuốc ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao Nó phụthuộc vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc Đây là nhóm kháng sinh có phổhoạt rất rộng Tác dụng cả đối với nhóm vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) nhưng vikhuẩn Gram (+) mẫn cảm với thuốc hơn là Gram (-), virus có kích thước lớn, ký sinhtrùng [16, 17]

Nhóm này gồm các loại kháng sinh tetracyclin (oxytetracycline, clortetracyclin,dimeclocyclin, methylencyclin) doxycyclin, minocyclin…

Trong đó, doxycyclin không bị ảnh hưởng bởi thức ăn trong ruột và hấp thu quaruột cao gấp 10 lần so với các kháng sinh khác cùng nhóm Do đó, các kháng sinhthuộc nhóm này ngoài doxycyclin thì không nên điều trị bằng cách trộn vào thức ăn.Tetracycline dùng để trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm trùng ruột Điều cần lưu ý làkhi điều trị bệnh bằng các kháng sinh thuộc nhóm này không nên kết hợp vớiampicillin, erythromycin, colistin… bởi vì kết hợp như thế sẽ gây ra tác dụng đốikháng làm giảm tác dụng của thuốc chẳng những không khỏi bệnh mà còn gây ra hiệntượng kháng thuốc [24]

Nhóm quinolone

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, thông qua việc ức chế tổng hợpAND của vi khuẩn Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua hai thế hệ với phổkháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau Thế hệ thứ nhất có phổ kháng khuẩnhẹp, tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram (-) Thế hệ thứ hai có phổ kháng khuẩn vừanhanh vừa mạnh, phổ kháng khuẩn được mở rộng trên vi khuẩn Gram (-) và Gram(+) [17]

Các loại kháng sinh thuộc nhóm này là enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,ciprofloxacin, oxonilic acid… [17]

Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm quinolone được sử dụng

khá phổ biến trong điều trị bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn Vibrio spp gây ra Các

loại kháng sinh thường được sử dụng là norfloxacin và oxonilic acid [5]

Nhóm phenicol

Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm hãm sự phát triển (kìm khuẩn) đồngthời cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm trongnhững điều kiện nhất định khi sử dụng nồng độ cao Thuốc có tác dụng ức chế vi

khuẩn với nồng độ thấp Hoạt phổ của phenicol rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vikhuẩn Gram (+) và Gram (-), vi rút có kích thước lớn [17]

Thuốc kháng sinh thường được dùng trong nuôi trồng thủy sản làchloramphenicol

Nhóm sulphamid (sulfonamide)

Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram (-) vàmột số vi khuẩn Gram (+) Sulphamid với liều kìm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản pháttriển của vi khuẩn do thuốc cạnh tranh với acid para amonozenzoic một số yếu tố sinhtrưởng cần cho sự phát triển của tế bào trong đó có cả tế bào vi khuẩn [17]

Các loại thuốc thuộc nhóm này thường được dùng trong thủy sản làtrimethoprim, sulfamethizole và dạng kết hợp để trị bệnh đỏ mỏ, viêm ruột, xuấthuyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn gây ra trên cá và bệnh phát sáng do vi khuẩngây ra trên tôm [5, 16]

Nhóm rifamycin

Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram (-) và vikhuẩn Gram (+) (trừ cầu khuẩn đường ruột) Hai kháng sinh của nhóm này làrifamycin SV và rifampicin

Nhóm aminoglycosides

Có phổ kháng khuẩn rộng tác động trên vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Do tínhphân cực cao nên các aminoglycosides tan tốt trong nước, không hấp thụ qua đườngtiêu hóa nên thường được sử dụng bằng phương pháp tiêm [17]

Một số loại kháng sinh thuộc nhóm này hay được sử dụng trong nuôi trồng thủysản là: streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin

1.2.2.3 Tình hình sử dụng kháng sinh

Từ lâu việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản đãđược nhiều người dân sử dụng một cách rộng rãi nhưng không đúng qui định Trongmột nghiên cứu phỏng vấn ở Thái Lan vào năm 2000 cho thấy 20% số người nuôi tôm

đã sử dụng kháng sinh để phòng chống lại các bệnh về vi rút Thêm vào đó hơn 60%các trại sản xuất giống tôm và cá đã sử dụng kháng sinh để phòng bệnh [22] Theo kếtquả khảo sát về việc sử dụng kháng sinh ở các nước Châu Á (2005) cho thấy lượng

kháng sinh các nước sử dụng trong một năm là khá lớn: Trung Quốc 1.500 tấn, NhậtBản 1.100 tấn, Hàn Quốc 550 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn, Philippine 350tấn, Pakistan 200 tấn, Đài Loan 180 tấn, Malaysia 150 tấn, Bangladesh 100 tấn, ViệtNam 50 tấn và Indonesia 20 tấn [60] Các kết quả nghiên cứu đó đã cho thấy mộtlượng lớn các loại kháng sinh được sử dụng cùng với việc sử dụng bừa bãi trong một

thời gian dài sẽ dẫn đến nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc

Trên thế giới việc dùng thuốc kháng sinh để chữa trị các bệnh do vi khuẩn ởtôm hùm đã được bắt đầu từ rất sớm, được nghiên cứu bởi một số tác giả như: Nilson(1976); Rosemark & Colink (1983); Fisher (1988) dùng hóa chất malachite green5ppm để xử lý bệnh do nấm gây ra ở tôm hùm [42] Bayer & Dainel (1987), Evan

(1994) đề xuất sử dụng oxytetracycline để trị bệnh đỏ đuôi ở tôm hùm gai (Homarus americanus, H gamarus, Panulirus argus) [31, 35]

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản nuôi trên thế giới

1.2.3.1 Khái niệm về kháng kháng sinh

Hiện tượng kháng kháng sinh là khi mầm bệnh hay vi khuẩn không bị diệt bởithuốc kháng sinh Chúng vẫn tồn tại trong môi trường có kháng sinh và sinh sản ra

những thế hệ con cháu không có tính cảm ứng (sensible) với một hay nhiều loại kháng

sinh nào đó Nói cách khác các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinhvật tạo ra kháng thể bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh nào đó Nhữnggen này có thể được hình thành ở vi khuẩn thông qua sự trao đổi gen với các loài vikhuẩn tạo ra chủng vi khuẩn kháng sinh, nghĩa là tạo ra chủng vi khuẩn có khả năngtrung hòa hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh [17]

1.2.3.2 Cơ chế của sự kháng thuốc

Một số loài vi sinh vật có khả năng kháng một số loại thuốc kháng sinh nhấtđịnh Sự kháng thuốc kháng sinh có thể coi như là đặc tính vốn có hoặc có thể đượchình thành trong quá trình tiến hóa của các vi sinh vật Có nhiều cách khác nhau gây ra

sự kháng thuốc của vi sinh vật Có ba cơ chế thường gặp của hiện tượng kháng khángsinh ở vi khuẩn:

- Thay đổi vị trí đích tác động của thuốc trên vi khuẩn ví dụ như làm thay đổiprotein trên vi khuẩn mà thuốc kháng sinh sẽ tiếp xúc để tác động

- Bất hoạt hóa kháng sinh bằng enzyme beta lactamase

- Thay đổi sự thu nhận kháng sinh bằng cách làm giảm độ thẩm thấu của màng

tế bào vi khuẩn nên thuốc không tác động được

1.2.3.3 Những nghiên cứu về hiện tượng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh ở thủy sản nuôi trên thế giới

Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên độngvật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu Từ những năm 50 củathế kỉ XX các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã nghiên cứu sự lan truyền rộng rãi của cácloài vi khuẩn có khả năng kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng [17].Việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản có thể dẫn đến

sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh và gây tác hại đến động vậtnuôi và con người Vì vậy, vấn đề sử dụng kháng sinh từ lâu đã được nhiều quốc giatrên thế giới quan tâm kiểm soát nhưng cũng chưa được triệt để

Mirand (2003) đã phát hiện ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng vớioxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá ở Chile [33] Pender (2007) đã nghiên cứu sự

kháng thuốc của Aeromonas được phân lập từ môi trường nước của các ao nuôi cá da

trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan, cho kết quả sự kháng thuốc của vi

khuẩn Aeromonas đối với ampicilin và oxytetracyclin là 100%, sulfamethoxazole là

24%, trimethoprim là 3%, ciprofloxacin và chloramphenicol là 0% [49]

Năm 2004, Jacintha Sugnaseelan đã kiểm tra sự kháng thuốc của 43 dòng vi

khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ sò huyết nuôi ở Malaysia với 15 loại kháng sinh

cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn đều thể hiện tính kháng với một hoặc nhiều loại

kháng sinh, 100% chủng Vibrio alginolyticus kháng với vancomycin, 97,7% kháng với

penicillin, 95,4% kháng với bacitracin [59] Rim Lajnef (2012) [42] khảo sát sự kháng

kháng sinh trên 69 chủng Vibrio alginolyticus từ những vùng nuôi ở Bắc Châu Phi, kết

quả nghiên cứu của tác giả đã cho thấy có 59/69 chủng (85%) kháng với ít nhất 6 loạikháng sinh cùng một lúc, trong đó có 94,2% chủng kháng với tetracycline, 85,5%kháng với erythromycin, 84% kháng với kanamycin, 76,8% kháng với gentamycin và75,3% kháng với cefotaxim Tỉ lệ thấp đối với các loại kháng sinh như: trimethoprim-sulfamethoxazole (20%), ciprofloxacin (26%) và nalidixic acid (31,8%) Như vậy sự

kháng thuốc của vi khuẩn đã tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và các loạikháng sinh bị kháng

Trên tôm hùm một số tác giả cho rằng đã xuất hiện vi khuẩn gây bệnh ở tômhùm kháng thuốc Theo Sophie Brillon, Yvan Lambert, Julian Dodson (trích dẫn bởi

[50] ) về khả năng kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn Vibrio thì có 6 chủng

kháng với erythromycin và 2 chủng đã kháng với kháng sinh ampicillin vàcarbenicillin Các kháng sinh như novobiocin, amoxillin cũng được đề xuất sử dụngthay cho trong trường hợp chủng vi khuẩn gây bệnh kháng với oxytetracyline

1.3 Những nghiên cứu ở Việt Nam có liên quan đến luận văn

1.3.1 Tình hình nuôi và bệnh ở tôm hùm nuôi lồng tại Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu nuôi tôm hùm có hệ thống và chi tiết cũng chỉ mớiđược bắt đầu từ cuối thập niên 80 trở lại đây, khi nghề khai thác tôm hùm có dấu hiệusuy giảm Điểm khởi đầu là việc nghiên cứu kỹ thuật nuôi nâng cấp một số loài tômhùm có giá trị kinh tế ở vùng ven biển miền Trung vào năm 1991 của Nguyễn Thị BíchThúy [19]

Năm 1992, Nguyễn Văn Chung và cộng sự đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh

học của tôm hùm sỏi (Panulirus stimpsoni) làm cơ sở để xác định vị trí và kỹ thuật

nuôi đối tượng này ở vùng biển tỉnh Quảng Bình và Quảng Trị Hồ Thu Cúc (1993)nghiên cứu kỹ thuật nuôi tôm hùm trong lồng và trong ao đất ở vùng ven biển tỉnhKhánh Hòa từ đó làm cơ sở cho việc phát triển nghề nuôi tôm hùm lồng ở đây Từ năm

2000, nghề nuôi tôm hùm lồng đã lan rộng từ Đà Nẵng đến Bình Thuận nhiều nhất làtỉnh Phú Yên và Khánh Hòa (chiếm khoảng 95% số lượng lồng nuôi) Các đối tượng

nuôi chủ yếu gồm: tôm hùm bông (P ornatus), tôm hùm đá (P homarus) và một ít tôm hùm sỏi (P stimpsoni) [23]

Phú Yên là tỉnh thuộc duyên hải Nam Trung Bộ-Việt Nam với nhiều đảo ngầm,đảo nổi, rạn đá, san hô và những vùng vịnh kín gió là nơi ưa thích cho các loài tômhùm cư trú, sinh sống và phát triển Nơi đây tập trung tôm hùm giống tự nhiên nhiều

và vì thế đã trở thành vùng nuôi tôm hùm thương phẩm chính của cả nước, mang lạigiá trị kinh tế lớn cho người dân ven biển Tuy nhiên, do sự phát triển mang tính tựphát, thiếu quy hoạch cùng với việc sử dụng nguồn thức ăn tươi sống và việc quản lýchưa tốt đã dẫn đến môi trường bị ô nhiễm tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân gây

bệnh phát triển, làm tình hình dịch bệnh xảy ra thường xuyên, gây tổn thất cho ngườinuôi tôm

Năm 2001 Võ Văn Nha và Nguyễn Thị Bích Thúy bước đầu đã tìm hiểu vànghiên cứu một số bệnh thông thường ở tôm hùm bông nuôi lồng và thử nghiệmphương pháp phòng trị bệnh tại vùng biển Phú Yên Kết quả ban đầu cho thấy, tômhùm bông nuôi lồng ở khu vực này gặp một số dấu hiệu bệnh lý như: trắng râu, longđầu, đầu to, đỏ thân, đen mang… Tuy nhiên nguy hiểm và bắt gặp phổ biến là hiệntượng đỏ thân và đen mang Khi xuất hiện các dấu hiệu đỏ thân, tôm hùm bông bị chết3-7 ngày sau đó Dấu hiệu đỏ thân xuất hiện ở mọi kích cỡ tôm từ 30-1.100 gam/con,

đỏ thân ở tôm hùm bông là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus [10]

Đến cuối năm 2006 và đầu năm 2007, tại các vùng nuôi tôm hùm thuộc các tỉnhven biển miền Trung-Việt Nam đã xuất hiện bệnh sữa gây chết nhiều tôm hùm nuôi.Tôm hùm bệnh với các dấu hiệu dễ nhận biết như: các đốt phần bụng của tôm chuyểnsang màu trắng đục, dịch tiết của cơ thể bao gồm cả máu bị đục như sữa và không bịđông Tổng thiệt hại ở các vùng nuôi vào cuối năm 2006 và đầu năm 2007 do bệnhsữa gây ra trên 161 tỷ đồng Những nghiên cứu bước đầu của Đỗ Thị Hòa và cộng sự(2008) đã xác định bệnh sữa trên tôm hùm nuôi là do vi khuẩn ký sinh nội bào giống

với Ricketsia (Ricketsial like bacteria) [4, 35] Năm 2007, kết quả đề tài cấp Bộ

“Nghiên cứu xây dựng giải pháp bảo vệ và phát triển nguồn lợi tôm hùm”, Võ VănNha đã chỉ ra rằng, tôm hùm nuôi lồng ở miền Trung thường gặp 14 loại bệnh khácnhau, trong đó các bệnh đỏ thân và bệnh sữa gây thiệt hại nhiều nhất [13]

1.3.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản và nuôi tôm hùm lồng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm biển ngàycàng gia tăng nhất là việc sử dụng kháng sinh do sự chuyển đổi nhanh chóng từ nuôi

quảng canh sang thâm canh Có ít nhất 373 loại thuốc và hóa chất sử dụng trong nuôitrồng thủy sản trong đó có 138 loại kháng sinh [15, 22]

Nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm hùm ở Việt Nam khởi đầu bằng việc đề xuất

sử dụng Fomaline của Nguyễn Thị Bích Thúy và Võ Văn Nha (2003) [12] Năm 2003,các vùng nuôi tôm hùm ở Phú Yên , Khánh Hòa kháng sinh ít được sử dụng (Phú Yên7,1%, Khánh Hòa 5,8%) bởi lẽ thuốc kháng sinh dùng cho tôm hùm là thuốc phòng trịbệnh tôm sú, do vậy hầu như không có hiệu quả [8] Năm 2005-2006 đã có những thửnghiệm điều trị bệnh tôm hùm đỏ thân bằng cách dùng thuốc kháng sinh: trộn vào thức

ăn doxycyline hay cotrimoxazol (5g/kg thức ăn) cùng kết hợp với vitamin C (10g/kgthức ăn) vào thời điểm tôm thường mắc bệnh sẽ hạn chế xuất hiện bệnh đỏ thân ở tôm

hùm bông P ornatus [11] Đến năm 2007 phác đồ điều trị bằng kháng sinh

Oxytetracyline theo đường tiêm và đường tiêu hóa đã được đề xuất để điều trị bệnh sữatôm hùm ở nhiều vùng nuôi [2] Kể từ đó kháng sinh đã được sử dụng nhiều trongphòng trị bệnh sữa, bệnh đỏ thân ở tôm hùm

Bên cạnh sử dụng thuốc kháng sinh người nuôi đã sử dụng các loại thảo mộc đểphòng trị bệnh cho tôm theo kinh nghiệm dân gian như khả năng kháng khuẩn củaallixin chiết xuất từ tỏi và flavonoid chiết xuất từ cây chó đẻ răng cưa với liều lượng

12,5 ppm có thể ức chế tối thiểu sự phát triển của vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây

bệnh đỏ thân trên tôm hùm [6] Đây là một hướng phát triển ứng dụng phương thuốcthảo mộc thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong trị bệnh nhiễm khuẩn ở tôm hùmnuôi thương phẩm

Năm 2008, khi đánh giá về hiện trạng sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh ở tômhùm, Võ Văn Nha cho rằng, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị bệnh sữa ởtôm hùm đã trở thành phổ biến ở hầu hết các hộ nuôi tôm hùm lồng tại Vạn Ninh vàSông Cầu ( chiếm hơn 85% trong số 150 hộ điều tra), 4 nhóm kháng sinh được dùngphổ biến đó là: nhóm fluoroquinolone; tetracycline; sulfamide và nhóm aminosida [9] Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh ở tôm hùm đã kéo dài trong một thời giankhá lâu cùng với việc sử dụng nhiều lần trong suốt quá trình nuôi sẽ có ảnh hưởng đếnviệc kháng thuốc của các chủng gây bệnh, hay vấn đề tuân thủ quy định không sử dụngkháng sinh nằm trong danh sách cấm hoặc dư lượng kháng sinh cho phép trong cơ thể

tôm vẫn chưa được đánh giá cụ thể Vì vậy việc nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh

là một vấn đề cấp thiết hiện nay

1.3.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập trên tôm hùm nuôi lồng ở Việt Nam

Nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong mô hình nuôi tôm ở ViệtNam, Lê Xuân Tuấn (2005) cho thấy tác hại việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biếntrong nuôi trồng thủy sản làm cho tồn lưu kháng sinh trong nước, trong bùn và tạo sựkháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường Kiểm tra sự kháng thuốc của hai loại vi

khuẩn Bacillus và Vibrio được phân lập trong mẫu bùn với các kháng sinh norfloxacin,

oxolinic acid, trimethoprim và sulfamethoxazole đã chỉ ra có hiện tượng kháng khángsinh với trimethoprim và sulfamethoxazole [43] Ở đồng bằng sông Cửu Long đã phânlập được 169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh kếtquả cho thấy 2% kháng với chloramphenicol, có 34% kháng nhiều loại kháng sinh nhưchloramphenicol, ampicilline, tetracycline, trimethoprim, sulfamchoxazole,nitrofurantion [52]

Theo Bùi Quang Tề (2006) hai loại kháng sinh clortetracyclin, doxycyclin vẫn

còn nhạy với nhóm vi khuẩn Vibrio spp Vì vậy hai loại kháng sinh này được dùng để

điều trị bệnh phát sáng trên tôm sú và dùng để thay thế các thuốc bị cấm nhưchloramphenicol, nitrofuran [16]

Võ Văn Nha (2005) đã nghiên cứu khả năng kháng sinh ở vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm hùm bông nuôi lồng bị bệnh đỏ thân Kết quả thử độ nhạy của 18 loại kháng sinh trên vi khuẩn Vibrio alginolyticus cho thấy, chỉ có 3 loại

kháng sinh có độ nhạy cao với vi khuẩn gây bệnh trong điều kiện thí nghiệm(gentamicine, acide nalidixic, doxycycline) Phần lớn các loại kháng sinh còn lại nhưcefoperazone, cefalexine, oxacilline, ofloxacine, colistine, norfloxacine, amoxicillin,penicillin, ampicillin, kanamycine, vancomycine ít nhạy với vi khuẩn gây bệnh ở tômhùm [9]

Vi khuẩn Vibrio alginolyticus là tác nhân gây ra nhiều vấn đề trong nuôi trồng

thủy sản Theo một số báo cáo trên thế giới loại v khuẩn này có liên quan đến dịchbệnh ở cá nuôi và tự nhiên, cũng như dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của nhuyễnthể và giáp xác Tại Việt Nam, có rất ít báo cáo về vi khuẩn này, đặc biệt là vấn đềkháng kháng sinh Trên đối tượng tôm hùm, Võ Văn Nha (2005) đã có nghiên cứu sử

dụng một số loại kháng sinh có hiệu quả để điều trị bệnh do Vibrio alginolyticus gây ra

trên tôm hùm, nhưng nghiên cứu vẫn chưa đi sâu vào hiện tượng kháng kháng sinh của

vi khuẩn Như đã trình bày ở trên, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong thờigian dài sẽ gây ra những hậu quả nghiêm trọng nhất là khi vi khuẩn đã kháng vớikháng sinh… Chính vì vậy, đề tài là hướng đi mới và cấp bách trong tình hình hiệnnay, khi tôm hùm đang là đối tượng có giá trị kinh tế và được ưa chuộng nhất Kết quảcủa đề tài sẽ làm cơ sở góp phần hạn chế việc lạm dụng kháng sinh nhằm mục đíchhướng tới “phát triển bền vững” trong nuôi trồng thủy sản

1.4 Đặc điểm điều kiện tự nhiên tỉnh Phú Yên

1.4.1 Vị trí địa lý

Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung Bộ, trong đất liền diện tích đất tự nhiên 5.045

km2, trải dài từ 12042’36” đến 13041’28’’ vĩ độ bắc và từ 108040’40’’ đến 109027’47’’kinh độ đông Bắc giáp tỉnh Bình Định, nam giáp tỉnh Khánh Hòa, Tây giáp tỉnh ĐắkLắk và Gia Lai, Đông giáp với biển Đông Tỉnh Phú Yên có tám huyện/thị trong đó cóbốn huyện/thị ven biển là Sông Cầu, Tuy An, Tuy Hòa, Đông Hòa [1]

rạn ghềnh, rạn ngầm là nơi cư trú ưa thích của tôm hùm [21]

1.4.3 Một số đặc điểm thủy văn

1.4.3.1 Hải lưu

- Hoạt động của hải lưu hoạt động quanh năm ở bờ biển Đông theo chi phối của

chế độ gió mùa [21]

- Thời kỳ gió mùa Đông Bắc: Hải lưu chảy theo hướng Bắc Nam, tốc độ dòngchảy đạt tới 50-60 m/s (từ tháng 12 đến tháng 2 năm sau), nhỏ nhất 25 m/s (tháng 4)

- Thời kỳ gió mùa Tây Nam: Hải lưu chảy theo hướng Nam Bắc, tốc độ dòngchảy 30-50 m/s và chảy sát bờ biển miền Trung

Hoạt động của hải lưu tạo nên vùng “nước trồi” từ tháng 4 đến tháng 8, từ mũiĐại Lãnh đến mũi Cà Ná Vùng nước trồi đã ảnh hưởng đến vùng biển phía Nam PhúYên cùng với dòng hải lưu mùa hè mang dòng nước ấm từ phía Nam lên tạo thànhvùng tập trung cá nổi rộng lớn

Phân tích một số đặc điểm thủy lý thủy văn cho thấy Phú Yên là tỉnh có môi trường tựnhiên thích hợp cho tôm hùm cư trú do vậy mà nghề nuôi tôm hùm rất phát triển, lànơi tập trung lồng nuôi và sản lượng cao nhất của cả nước Năm 2012 cả nước cókhoảng 50.000 lồng nuôi tôm hùm thì riêng tỉnh Phú Yên đã chiếm tới khoảng 35.000lồng, chủ yếu ở Sông Cầu, vùng biển Vũng Rô (Đông Hòa) cũng đang tập trung gần10.000 lồng nuôi tôm hùm

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus

2.1.2 Phạm vi: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân nuôi

lồng tại vùng biển Phú Yên

2.1.3 Thời gian: từ ngày 06/12/2013 đến 1/11/2014

2.1.4 Địa điểm

- Địa điểm thu mẫu và điều tra: Các hộ nuôi tôm hùm lồng tại hai xã XuânPhương, Xuân Thịnh (thuộc thị xã Sông Cầu) và An Chấn (thuộc huyện Tuy An) củatỉnh Phú Yên (Hình 2.1)

- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng nghiên cứu bệnh thủy sản và dự báo thuộcTrung tâm quốc gia quan trắc và cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủysản khu vực miền Trung, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

Ghi chú:

1 Xuân Thịnh (vùng nuôi

thuộc đầm Cù Mông)

2 Xuân Phương (vùng nuôi

thuộc Vịnh Xuân Đài)

3 An Chấn (vùng nuôi hở

thuộc biển Đông)

Hình 2.1: Sơ đồ vùng điều tra và thu mẫu 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn

1

2

3

Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn

2.2.2 Phương pháp điều tra thực trạng nuôi và sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên tôm hùm bông nuôi lồng tại vùng biển tỉnh Phú Yên

2.2.2.1 Nguồn thông tin thứ cấp

Các thông tin được thu thập bằng phiếu điều tra thứ cấp (phụ lục 1) tại các cơ quanquản lý ngành như Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Phú Yên, Phòng kinh

tế và Chi cục thú y huyện Tuy An và thị xã Sông Cầu, từ đây làm cơ sở thực tế để xácđịnh: vùng điều tra, số lượng mẫu điều tra phỏng vấn, số mẫu tôm hùm bông thu phântích (tất cả đều dựa theo nguyên tắc lựa chọn ngẫu nhiên và theo công thức Yamane,1967)

Bảng 2.1: Phân bố số lượng phiếu điều tra hiện trạng nuôi và sử dụng thuốc kháng

sinh trong phòng trị bênh tôm hùm nuôi lồng năm 2014

Địa điểm (xã) Số hộ nuôi (hộ) Số hộ điều tra (hộ)

2.2.2.2 Nguồn thông tin sơ cấp

Phỏng vấn trực tiếp người dân bằng bộ phiếu câu hỏi được xây dựng sẵn (phụ lục 2)nhằm mục đích thu thập những thông tin:

- Các thông tin về chủ hộ nuôi: Họ tên, nơi ở, trình độ học vấn , chuyên môn

- Tình hình nuôi và bệnh trên tôm hùm nuôi lồng năm 2013-2014

- Các loại kháng sinh được sử dụng điều trị bệnh tôm hùm nuôi lồng ở địa

phương

- Liều lượng sử dụng kháng sinh dùng trong điều trị bệnh

- Phương pháp sử dụng các loại kháng sinh trong phòng trị bệnh

- Hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh của người nuôi

Việc điều tra sẽ đánh giá được hiện trạng sử dụng kháng sinh và danh mục các loạikháng sinh trong điều trị bệnh đỏ thân ở tôm hùm từ thực tế

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu xác định hiện tượng kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân

2.2.3.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu tôm hùm

Thu mẫu tôm hùm có dấu hiệu đỏ thân nhằm mục đích mô tả các dấu hiệu bệnh

lý, phân lập Vibrio alginolyticus, thu và lưu giữ chủng Vibrio alginolyticus để thực hiện

những nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu được thực hiện trên 3 dòng Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm

hùm bị bệnh đỏ thân ở 3 xã: Xuân Phương (đặc trưng cho vùng nuôi thuộc đầm CùMông), Xuân Thịnh (đặc trưng cho vùng nuôi thuộc vịnh Xuân Đài) và An Chấn (vùng nuôi thuộc biển Đông) thể hiện Bảng 2.2

Bảng 2.2: Số lượng mẫu tôm hùm thu để phân lập Vibrio alginolyticus

Địa điểm (xã) Chiều dài (cm)

Mẫu tôm hùm: Thu chọn lọc những con còn sống, có dấu hiệu đặc thù của bệnh

đỏ thân như: tôm yếu lờ đờ, bỏ ăn, nhìn phần bụng tôm thấy có màu đỏ hồng hoặc đỏtím, khớp đôi chân bò rời ra, râu dễ gãy Tất cả các mẫu tôm sau khi thu được phải vậnchuyển nhanh về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp được sục khí

Xử lý mẫu tôm hùm: Tôm được sát trùng bề mặt bằng cồn 70o trước khi lấy máu

hay nội quan bên trong

2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn Vibrio alginolyticus

- Thu mẫu bệnh phẩm: Dùng panh, kéo đã sát trùng bằng cồn 70o để lấy gan

tụy tôm bệnh

- Đưa mẫu vào các ống nghiệm có chứa 2-3 ml nước muối sinh lý đã vô trùng

- Rửa mẫu bằng nước muối sinh lý 2-3 lần, sau đó nghiền nát mẫu gan tụy tôm

bệnh trong nước muối sinh lý

- Mẫu sau khi xử lý tiến hành nuôi cấy trên môi trường TCBS (thiosulfat citratebile saccharose) Thời gian nuôi cấy 24 giờ ở 30oC

- Chọn những khuẩn lạc vàng có hình dạng khác nhau để làm thuần vi khuẩn

- Xác định tên vi khuẩn gây bệnh: Các đặc điểm về hình thái, sinh hóa đã đượckiểm tra bằng việc sử dụng bộ kít API 20E và soi trên kính hiển vi ở độ phóng đại từthấp đến cao (100x đến 1000x) Vi khuẩn được định danh theo khóa phân lập Bergey[32] dựa trên phương pháp nghiên cứu của Frerich (1984) [36]

2.2.3.3 Phương pháp lập kháng sinh đồ:

Từ kết quả điều tra hiện trạng sử dụng kháng sinh, đưa ra lựa chọn các loại kháng sinh

là thành phần chính của các sản phẩm thường được sử dụng trong thực tế để tiến hànhlập kháng sinh đồ, 8 loại kháng sinh đã được chọn làm thí nghiệm bao gồmdoxycycline, tetracycline, flumequine, ofloxacine, streptomycine, ciprofloxacine, acidnalidixic và gentamicine

Phương pháp thực hiện: Dựa trên phương pháp Kirbry-Bauer (Hình 2.3) cụ thểđược mô tả như sau [30]:

Bước 1: Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn Vibrio alginolyticus

đã được làm thuần ở các lần phân lập khác nhau, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nướcmuối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng

Bước 2: Điều chỉnh mật độ vi khuẩn được xác định dựa vào phương pháp so màu trênmáy quang phổ U-5100 (Hitachi-Nhật): dung dịch trộn đều trên máy voltex sau đóđem đo trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm, điều chỉnh độ đục ở mứcOD= 0,1± 0,02, khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm tương ứng khoảng 1 x 108

cfu/ml

Bước 3: Lấy 0,2 ml vi khuẩn từ ống nghiệm đã điều chỉnh mật độ trải đều trên đĩathạch, sau đó gắn các đĩa kháng sinh (Hãng Biorad-Mỹ) vào đĩa thạch (đĩa kháng sinh

là những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh) và ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC

Bước 4: Sau 24 giờ, đo đường kính vô trùng (mm) bằng thước kẹp có độ chínhxác đến 1mm Dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng của tài liệu CLSI- TheClinical and Laboratory Standards Institure (2006) để xác định loại kháng sinh nhạy,trung gian và kháng [64]

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện kháng sinh đồ vi khuẩn V.alginolyticus phân lập trên tôm

ủ 24 giờ

Vi khuẩn Vibrio alginolyticus

Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước

muối sinh lý

Điều chỉnh độ đục vi khuẩn ( Nồng độ

tương ứng 108 cfu/ml)

Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường TSA

Đặt khoanh giấy kháng sinh lên bờ mặt

đĩa thạch

Đo vòng vô khuẩn

Xác định khả năng kháng kháng sinh của

vi khuẩn V.alginolyticus

aminoglycosides cụ thể thực hiện theo hai bước:

Bước 1: Thử kháng sinh ở nồng độ cao nhất

Bước này làm cơ sở cho bước 2 (xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh lên

- Cho 1ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào 3 ống nghiệm trên

- Ủ qua đêm tất cả các ống nghiệm ở nhiệt độ 30oC

- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệuphát triển của vi khuẩn Từ đó xác định được nồng độ thuốc ban đầu cho thí nghiệmnồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Bước 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (được mô tả theo Hình 2.4)

- Cho 1,8ml môi trường pepton (1%) vô trùng vào ống nghiệm đầu tiên và 1mlmôi trường pepton vào 8 ống nghiệm còn lại

- Cho 0,2 ml thuốc kháng sinh với nồng độ 2000 ppm vào ống nghiệm đầu tiên(số

1)

- Chuyển 1ml có thuốc từ ống nghiệm số 1 sang ống nghiệm số 2, trộn đều

- Theo cách này tiếp tục cho đến ống nghiệm số 8, riêng ống nghiệm số 9không cho thuốc kháng sinh vì là ống nghiệm đối chứng Thay đổi pipét giữa các lầnchuyển sang ống nghiệm để ngăn chặn thuốc kháng sinh dính trên bề mặt ngoài củapipét làm sai lệch nồng độ thuốc ở các ống nghiệm

- Hút 1 ml môi trường lỏng có thuốc từ ống nghiệm số 8 bỏ ra ngoài

- Tạo huyền dịch vi khuẩn ở nồng độ 1 x 105 cfu/ml trong môi trường pepton(1%)

- Thêm 1 ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào mỗi ống nghiệm (9 ống) Lúcnày ống nghiệm đầu tiên có nồng độ kháng sinh 100 ppm (vì thêm 1ml vi khuẩn nênnồng độ giảm xuống ½) Các ống nghiệm tiếp theo nồng độ kháng sinh sẽ bằng mộtnửa nồng độ của ống nghiệm trước nó

- Ủ qua đêm tất cả các ống nghiệm ở nhiệt độ 30oC

- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệuphát triển của vi khuẩn Nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó vi khuẩnkhông phát triển được chính là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Hình 2.4: Sơ đồ thực hiện pha loãng kháng sinh để nghiên cứu nồng độ ức chế tối

thiểu MIC 2.3 Phương pháp xử lý số liệu

2.3.1 Phân tích hiện trạng nghề nuôi

Phân tích số liệu kinh tế-xã hội (độ tuổi, trình độ học vấn, kinh nghiệm nuôi tôm…) vàquy trình kỹ thuật nuôi theo phương pháp thống kê mô tả

Tính toán số lượng phiếu điều tra dựa vào công thức Yamane

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả điều tra hiện trạng nghề nuôi và sử dụng kháng sinh ở tôm hùm nuôi lồng tại Phú Yên năm 2014

3.1.1 Vùng nuôi và trình độ học vấn người nuôi tôm hùm ở Phú Yên

Theo kết quả khảo sát Phú Yên có 3 huyện/thị xã trọng điểm nuôi tôm hùmlồng là thị xã Sông Cầu, huyện Đông Hòa và huyện Tuy An Trong đó huyện ĐôngHòa và huyện Tuy An có số lượng lồng nuôi ít Ở huyện Tuy An chủ yếu là ương tômcon, tại huyện Đông Hòa từ tháng 6/2012, UBND tỉnh Phú Yên có thông báo vịnhVũng Rô đã được quy hoạch xây dựng cảng biển các hộ dân nuôi thủy sản trong vịnhphải dừng việc đầu tư mới và tự tháo dỡ di dời lồng, bè, trả lại mặt nước trước31/12/2014 Do vậy, hiện nay nghề nuôi tôm hùm lồng ở Phú Yên tập trung chủ yếu ởthị xã Sông Cầu

Trình độ văn hóa của người dân có ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận thông tinứng dụng khoa học – kỹ thuật vào nuôi tôm hùm lồng cũng như việc phòng trị bệnhtrên tôm hùm Kết quả điều tra cho thấy trình độ học vấn của người dân nuôi tôm hùmtại Phú Yên tương đối thấp (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Trình độ học vấn của chủ hộ nuôi tôm hùm lồng đầu năm 2014 (n=221)