tìm hiểu quy trình kiểm nghiệm chất lượng vi sinh cho sản phẩm tôm chiên tempura

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY11.1.Lịch sử hình thành và phát triển của nhà máy11.2.Phát triển của nhà máy31.2.1.Mục tiêu phát triển31.2.2.Hoạt động chính41.2.3.Phương châm41.3.Địa điểm xây dựng nhà máy51.4.Sơ đồ bố trí mặt bằng nhà máy61.4.1.Sơ đồ mặt bằng61.4.2.Ưu điểm của việc quy hoạch bố trí mặt bằng61.5.Sơ đồ tổ chức và bố trí nhân sự61.6.Nội quy và chính sách81.6.1.Nội quy81.6.2.Chính sách đối với người lao động101.7.Các quy định về vệ sinh an toàn của nhà máy111.7.1.Các yêu cầu về dụng cụ và thiết bị an toàn lao động.111.7.2.An toàn phòng cháy chữa cháy121.7.3.Xử lí nước thải13CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỦY SẢN142.1. Các chỉ tiêu vi sinh142.1.1. Escherichia coli142.1.2. Coliforms142.1.3. Staphylococcus aureus152.2. Các phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh 1152.2.1. Phương pháp truyền thống152.2.2 Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử202.2.3 Một số phương pháp thử nhanh khác25CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG MẪU TÔM CHIÊN TEMPURA283.1. Quy trình chế biến sản phẩm 2283.2. Lấy mẫu phân tích313.2.1. Mục đích313.2.2. Nguyên tắc lấy mẫu313.2.3. Dụng cụ lấy mẫu313.2.4. Thao tác lấy mẫu323.2.5. Thiết bị chuyển mẫu323.3. Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh 2333.3.1 Xử lý mẫu trước khi kiểm nghiệm343.3.2. Quy trình phân tích Coliforms343.3.3 Quy trình phân tích E. coli373.3.4 Quy trình phân tích S. aureus41CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH VI SINH444.1 Bảng tiêu chuẩn vi sinh theo thị trường Châu Âu ( EU)444.2 Kết quả phân tích Coliforms454.2.1 Nguyên liệu454.2.2 Bán thành phẩm474.2.3 Thành phẩm484.3 Kết quả phân tích E.coli504.3.1 Nguyên liệu504.3.2 Bán thành phẩm514.3.3 Thành phẩm534.4 Kết quả kiệm nghiệm S. aureus554.4.1 Nguyên liệu554.3.2 Bán thành phẩm564.4.3 Thành phẩm58CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ605.1 Kết luận605.2 Kiến nghị60TÀI LIỆU THAM KHẢO61TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT61TÀI LIỆU WEB61PHỤ LỤC: CÁC THIẾT BỊ62

I

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

TÌM HIỂU QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CHẤT LƯỢNG

VI SINH CHO SẢN PHẨM TÔM CHIÊN TEMPURA

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÔNG NGHIỆP KHÓA: 2015 – 2019

SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRẦN THỊ THANH NGA

NGUYỄN THỊ THÚY DƯƠNG

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 03 NĂM 2019

I

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

TÌM HIỂU QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CHẤT LƯỢNG

VI SINH CHO SẢN PHẨM TÔM CHIÊN TEMPURA

TRẦN THỊ THANH NGA MSSV: 2008150021 NGUYỄN THỊ THÚY DƯƠNG MSSV: 2008150072

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:

Th.S NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 03 NĂM 2019

II

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo công ty và toàn thể cán bộ công nhân viên đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được tham quan, tìm hiểu và học hỏi các quy trình công nghệ và các kiến thức chuyên môn tại công ty

Tiếp theo cho em gửi lời cảm ơn đến trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm, nơi

đã tạo điều kiện tốt cho em trong quá trình học tập và rèn luyện tại đây Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ các thầy cô giáo trong trường, những người đã cố gắng không biết mệt mỏi vì tương lai của thế hệ trẻ bọn em Đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học, những người đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu giúp em mở mang được kiến thức và có nhiều kinh nghiệm trên con đường đời sắp tới Em xin gửi lời cảm

ơn đến cô Nguyễn Thị Quỳnh Mai, người đã luôn theo sát, giúp đỡ tận tình nhóm tụi em

tromg suốt quá trình thực tập tại Công Ty Cổ Phần Nông Nghiệp Hùng Hậu

Cuối cùng em kính chúc tất cả các quý thầy, cô luôn dồi dào sức khỏe và ngày càng thành công hơn nữa trên con đường trồng người Đồng kính chú các cô, chú, anh, chị luôn dồi dào sức khỏe và thành công Chúc cho công ty Cổ Phần Nông Nghiệp Hùng

Hậu ngày càng lớn mạnh hơn nữa

Em chân thành cảm ơn !!!

Tp HCM, ngày tháng năm 2019

III

NHẬN XÉT CỦA CÔNG TY THỰC TẬP

    

Tp HCM, ngày tháng năm 2019

IV

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA GIÁO VIÊN

    

Tp HCM, ngày tháng năm 2019

như: Staphylococcus aureus, E coli, coliform, gây hại cho con người Nguồn gốc

nguyên liệu không rõ ràng và quy trình chế biến không đạt vệ sinh đang là vấn đề lớn được mọi người quan tâm Các loại thực phẩm rất đa dạng, chế biến từ thủy sản được người tiêu dùng lựa chọn nhiều hơn Các mặt hàng thủy sản không chỉ tiêu thụ ở trong nước mà còn được xuất khẩu sang nhiều nước khác nên vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm rất được chú trọng nhằm đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng và uy tín của nhà cung cấp Trong quy trình chế biến thủy sản từ nguyên liệu ( tôm, cá ) có thể nhiễm nhiều loại vi sinh vật và quy trình chế biến có thể nhiễm thêm một số loại khác, nên các quy trình này cần được kiểm định nghiêm ngặt qua các chỉ tiêu, tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm Nắm bắt được tình hình thực tế, trong tháng 3 vừa qua nhóm em tiến hành thực hiện

đề tài: “ Tìm hiểu quy trình kiểm nghiệm chất lượng vi sinh cho sản phẩm tôm chiên tempura”

VI

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN II LỜI MỞ ĐẦU V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU IX DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ X DANH MỤC VIẾT TẮT, KÝ HIỆU XI

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY 1

1.1 Lịch sử hình thành và phát triển của nhà máy 1

1.2 Phát triển của nhà máy 3

1.2.1 Mục tiêu phát triển 3

1.2.2 Hoạt động chính 4

1.2.3 Phương châm 4

1.3 Địa điểm xây dựng nhà máy 5

1.4 Sơ đồ bố trí mặt bằng nhà máy 6

1.4.1 Sơ đồ mặt bằng 6

1.4.2 Ưu điểm của việc quy hoạch bố trí mặt bằng 6

1.5 Sơ đồ tổ chức và bố trí nhân sự 6

1.6 Nội quy và chính sách 8

1.6.1 Nội quy 8

1.6.2 Chính sách đối với người lao động 10

1.7 Các quy định về vệ sinh an toàn của nhà máy 11

1.7.1 Các yêu cầu về dụng cụ và thiết bị an toàn lao động 11

1.7.2 An toàn phòng cháy chữa cháy 12

VII

1.7.3 Xử lí nước thải 13

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỦY SẢN 14 2.1 Các chỉ tiêu vi sinh 14

2.1.1 Escherichia coli 14

2.1.2 Coliforms 14

2.1.3 Staphylococcus aureus 15

2.2 Các phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh [ 1] 15

2.2.1 Phương pháp truyền thống 15

2.2.2 Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử 20

2.2.3 Một số phương pháp thử nhanh khác 25

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG MẪU TÔM CHIÊN TEMPURA 28

3.1 Quy trình chế biến sản phẩm [ 2] 28

3.2 Lấy mẫu phân tích 31

3.2.1 Mục đích 31

3.2.2 Nguyên tắc lấy mẫu 31

3.2.3 Dụng cụ lấy mẫu 31

3.2.4 Thao tác lấy mẫu 32

3.2.5 Thiết bị chuyển mẫu 32

3.3 Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh [ 2] 33

3.3.1 Xử lý mẫu trước khi kiểm nghiệm 34

3.3.2 Quy trình phân tích Coliforms 34

3.3.3 Quy trình phân tích E coli 37

VIII

3.3.4 Quy trình phân tích S aureus 41

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH VI SINH 44

4.1 Bảng tiêu chuẩn vi sinh theo thị trường Châu Âu ( EU) 44

4.2 Kết quả phân tích Coliforms 45

4.2.1 Nguyên liệu 45

4.2.2 Bán thành phẩm 47

4.2.3 Thành phẩm 48

4.3 Kết quả phân tích E.coli 50

4.3.1 Nguyên liệu 50

4.3.2 Bán thành phẩm 51

4.3.3 Thành phẩm 53

4.4 Kết quả kiệm nghiệm S aureus 55

4.4.1 Nguyên liệu 55

4.3.2 Bán thành phẩm 56

4.4.3 Thành phẩm 58

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 61

TÀI LIỆU WEB 61

PHỤ LỤC: CÁC THIẾT BỊ 62

IX

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Danh sách ban điều hành 7

Bảng 4.1 Tiêu chuẩn vi sinh vật nguyên liệu và bán thành phẩm của công ty 44

Bảng 4.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật thành phẩm của thị trường Châu Âu 45

Bảng 4.3 Kết quả kiểm nghiệm Coliforms của tôm thẻ nguyên liệu 45

Bảng 4.4 Kết quả kiểm nghiệm Coliforms của tôm chiên Tempura bán thành phẩm 47

Bảng 4.5 Kểt quả kiểm nghiệm Coliforms của tôm chiên Tempura thành phẩm 48

Bảng 4.6 Kết quả kiểm nghiệm E.coli của tôm thẻ nguyên liệu 50

Bảng 4.7 Kết quả kiểm nghiệm E.coli của tôm chiên Tempura bán thành phẩm 52

Bảng 4.8 Kết quả kiểm nghiệm E.coli của tôm chiên Tempura thành phẩm 53

Bảng 4.9 Kết quả kiểm nghiệm S aureus của tôm thẻ nguyên liệu 55

Bảng 4.10 Kết quả kiểm nghiệm S aureus của tôm chiên Tempura bán thành phẩm 57

Bảng 4.11 Kết quả kiểm nghiệm S aureus của tôm chiên Tempura thành phẩm 58

X

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công ty cổ phần Nông Nghiệp Hùng Hậu- Nhà máy số 1 1

Hình 1.2 Logo công ty cổ phần Nông Nghiệp Hùng Hậu- Nhà máy số 1 3

Hình 1.3 Sơ đồ tổ chức của công ty 7

Hình 2.1 Escherichia coli 14

Hình 2.2 Staphylococcus aureus 15

Hình 2.3 Nguyên tắc phản ứng ELISA với S: cơ chất, E: enzyme, P: phát quang 21

Hình 2.4 Các bước định lượng nhanh vi sinh vật hiện diện trên bề mặt bằng phản ứng ánh sáng 23

Hình 2.5 Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân 24

Hình 2.6 Hệ thống ISO- GRID 26

Hình 3.1 Quy trình sản xuất sản phẩm tôm chiên Tempura 28

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm tôm chiên Tempura 28

Hình 3.3 Không xuất hiện khuẩn lạc coliforms trong môi trường DLA 36

Hình 3.4 Khuẩn lạc coliforms trong môi trường đĩa thạch DLA\ 37

Hình 3.5 Ống nghiệm với kết quả âm và dương với E coli trong môi trường LB 40

Hình 3.6 Ống nghiệm cho kết quả âm và dương của E coli trong môi trường EC 40

Hình 3.7 Khuẩn lạc của E.coli trên môi trường EBM 41

Hình 3.8 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường thạch BP 43

XI

DANH MỤC VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

Chữ viết tắt/ ký hiệu Cụm từ đầy đủ

HACCP Hazard Aralysis Critical Control Point/ phân tích mối nguy hiểm

và điểm kiểm soát tới hạn

CCP Critical Control Point/ điểm kiểm soát tới hạn

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY 1.1 Lịch sử hình thành và phát triển của nhà máy

Hình 1.1 Công ty cổ phần Nông Nghiệp Hùng Hậu- Nhà máy số 1

Tên Công ty: CÔNG TY CỔ PHẦN NÔNG NGHIỆP HÙNG HẬU – NHÀ MÁY

SỐ 1

Tên tiếng anh: HÙNG HẬU AGRICULTURAL CORPORRATION – FACTORY NO.1

Tên viết tắt: HÙNG HẬU AGRICULTURAL

Công ty cổ phần nông nghiệp Hùng Hậu, tiền thân là xí nghiệp Thuỷ Sản đông lạnh Việt Hoa, trụ sở đóng tại 536 Âu Cơ, quận Tân Phú

Sau năm 1975 trở thành xí nghiệp Thuỷ Sản số 1 trực thuộc công ty xuất nhập khẩu Việt Nam ( SeaProdex Việt Nam)

Đến năm 1979, khi ngành thuỷ sản nước ta bị sa sút do cơ chế tập trung quan liệu bao cấp, công ty Seaprodex đã mạnh dạn đề nghị thực hiện cơ chế hoạch toán độc lập, tự cân đối, tự trang trải và được Hội Đồng Bộ Trưởng ( nay là Chính Phủ) chấp nhận xí

Trước tình trạng của công ty Thuỷ Sản số 1, Công ty Seaprodex đã quyết định sát nhập Xí nghiệp đông lạnh Thuỷ Sản số 1 với xưởng thực nghiệm Bá Lợi và bắt đầu tiến hành việc đổi mới cơ cấu tổ chức, tăng cường bộ phận nghiên cứu kỹ thuật, mở rông thị trường nhằm phục hồi lại Xí nghiệp

Ngày 08/08/1988, Trung tâm kỹ thuật Chế Biến đông lạnh và Mặt Hàng Mới ra đời trực thuộc Công ty Thuỷ Sản Việt Nam

Năm 1996, Xí nghiệp lên kế hoạch nâng cấp Xí Nghiệp và đã được Tổng công ty duyệt Dự án nâng cấp Xí Nghiệp với kinh phí dự toán 811500 USD Với những cố gắng

và những thành công của mình, Xí nghiệp đã được nhân Huân Chương lao động hạng nhì

Năm 1988, Xí nghiệp được Nhà nước tặng thưởng Huân chương Lao Động hạng nhất

Theo quyết định số 15/2000 QĐ – TTG ngày 31/01/2000 của Thủ tướng Chính Phủ

về việc chuyển xí nghiệp Mặt Hàng mới thuộc Tổng Công ty Thuỷ Sản Việt Nam thành công ty cổ phần Ngày 01/07/2000 Công Ty cổ phần Thuỷ Sản số 1 chính thức đi vào hoạt động

Công ty cổ phần nông nghiệp Hùng Hậu ( tên cũ Công ty Cổ Phần Thuỷ Sản số 1) hoạt động theo Giấy chứng nhận đăng ký doanh nghiệp 0302047389 đăng ký lần đầu ngày 10/10/2000, đăng ký thay đổi lần thứ 15 ngày 01/06/2015 và đăng ký thay đổi lần thứ 16 ngày 02/11/2015 do Sở Kế hoạch và Đầu tư TP Hồ Chí Minh cấp Công ty đã đạt tiêu chuẩn về chất lượng của EU số DL01 và Công ty Chế Biến Thuỷ Sản đầu tiên ở Việt Nam đạt tiêu chuẩn ISO 9002

3

 Logo HUNGHAU có hình dạng đặc trưng là hai chữ H cách điệu lồng vào nhau thể hiện sự đoàn kết, gắn bó chặt chẽ, tạo cảm giác về sự tin gậy, vững chắc Nét chữ Hùng Hậu rõ ràng cân đối, thể hiện sự nổ lực quyết tâm trong công việc, thể hiện ý nghĩa của nền tảng phát triển bền vững

Hình 1.2 Logo công ty cổ phần Nông Nghiệp Hùng Hậu- Nhà máy số 1

Logo HUNGHAU với sự kết hợp của hai màu:

 Màu xanh dương (blue): tượng trưng cho biển rộng

 Màu xanh lá (green): là màu của cuộc sống tươi đẹp

1.2 Phát triển của nhà máy

1.2.1 Mục tiêu phát triển

Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu là một doanh nghiệp giàu kinh nghiệm trong lĩnh vực nông nghiệp Trong quá trình hình thành và phát triển, Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu không ngừng nổ lực mang đến những sản phẩm tốt nhất cho khách hàng của mình Trong tương lai Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu xác định mục tiêu cung cấp mặt hàng nông sản chất lượng cao cấp, góp phần thay đổi diện mạo cho nền Nông nghiệp theo hướng Công Nghiệp Hóa – Hiện Đại Hóa

Bằng nhiệt huyết và khát vọng chinh phục những đỉnh cao mới, Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu luôn quyết tâm theo đuổi những mục tiêu, sức mệnh của mình,

đó là:

 Trở thành tóp 100 doanh nghiệp Đông Nam Á

 Góp phần thay đổi diện mạo nền nông nghiệp Việt Nam theo hướng hiện đại

4

 Mang lại các lợi ích tốt nhất cho tất cả các cổ đông, đối tác và nhân viên của công

ty

Để đạt được tất cả các mục tiêu trên đó, Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu thấu

hiểu rằng: Phải liên kết, hợp tác với các công ty tổ chức có uy tín và năng lực để cùng

nhau phát triển bền vững

1.2.2 Hoạt động chính

Công ty đã chủ động tìm kiếm thị trường, có đủ tư cách pháp nhân ký hợp đồng với khách hành trong và ngoài nước Phân xưởng nhận nhiệm vụ sản xuất theo đúng điều khoản đã quy định trong trường hợp dưới sự thanh – kiểm tra của bản thân Công ty và cả đối tác

Mặt hàng chính của công ty phân thành các nhóm sau:

 Tôm: đông lạnh, block, luộc, đông rời,…

“AN TOÀN LÀ SỐ MỘT, CHẤT LƯỢNG CAO NHẤT”

Chất lượng là sự sống còn của Công ty, không ngừng nâng cao chất lượng để làm hài long khách hàng

Với phương châm trên, Công ty cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu cam kết:

 Cung cấp sản phẩm thỏa mãn yêu cầu về giao hàng đúng thời hạn, chật lượng an toàn thực phẩm và hợp pháp

5

 Đào tạo huấn luyện và nâng cao nhận thức của công nhân và hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng các yêu cầu dịch vụ

 Không ngừng thực hiện những hoạt động cải tiến liên tục

Thiết lập, thực hiện, duy trì và cải tiến liên tục hệ thống quản lý an toàn thực phẩm

1.3 Địa điểm xây dựng nhà máy

 Trụ sở chính

Công ty có trụ sở chính đặt tại 1004A Âu Cơ, phường Phú Trung, quận Tân Phú, TP.HCM, cách các vùng nguyên liệu lớn: Vũng Tàu, Long An, Bến Tre, Tiền Giang, Phan Thiết từ 2-6h giờ xe Vị trí này cũng rất thuận lợi cho việc nhập nguyên liệu và chuyển sản phẩm đi các vùng khác trong khu vực

Tổng diện tích 13.419 m2 trong đó diệc tích nhà xưởng 4500 m2 ( gồm 2 phân xưởng sản xuất)

Mặt tiền phía Nam Công ty tiếp giáp với Âu Cơ, phía Bắc Công ty tiếp giáp với các

cơ sở cơ khí và khu dân cư, phía Tây tiếp giáp với kênh Tân Hóa và phía Đông tiếp giáp với khu dân cư

 Nhà máy số 1

Đóng tại lô C2-1, D4, khu Công nghiệp Tân Phú Trung, phường 22, huyện Củ Chi, TP.HCM

 Khu công nghiệp Tân Phú Trung

Nằm phía Tây Bắc TP.HCM, mặt tiền quốc lộ 22, thuộc xã Tân Phú Trung, huyện

Củ Chi Phía Bắc giáp tỉnh Tây Ninh, Phía Đông giáp huyện Hóc Môn, thuộc vùng quy hoạch khu đô thị Tây Bắc Thành Phố với diện tích 6000 ha

6

 Quốc lộ 22: đi quan quận 12, huyện Hóc Môn, Củ chi ( TP.HCM), tỉnh Tây Ninh, cửa khẩu Mộc Bài (tỉnh Tây Ninh) và đến cửa khẩu Xa Mát biên giới CamPuChia,

là đường nằm trong dự án Xuyên Á giữa TP.HCM và Campuchia

 Quốc lộ 1A: Tuyến đường giao thông xuyên suốt Việt Nam, bất đầu từ của khẩu Nghị Quan trên biên giới giữa Việt Nam và Trung Quốc, kết thúc

1.4 Sơ đồ bố trí mặt bằng nhà máy

1.4.1 Sơ đồ mặt bằng

1.4.2 Ưu điểm của việc quy hoạch bố trí mặt bằng

Công ty có mặt bằng rộng rãi, phòng tiếp nhận nguyên liệu có cửa vào riêng, các phòng xử lý nguyên liệu và bán thành phẩm đủ rộng, đảm bảo vệ sinh

Khu vực xử lý phế liệu có cửa ra vào riêng nên việc đưa phế liệu ra ngoài không qua khu vực chế biến nên không gây nhiễm chéo

Đường lưu thông trong Công ty rộng rãi thuận tiện cho việc vận chuyển, đi lại

Bố trí các kho khá hợp lý, bố trí dây chuyền sản xuất, quy trình đi theo đường thẳng, tránh được sự nhiễm chéo

Hệ thống kho lạnh: đầy đủ

Phòng điều hành sản xuất ở các vị trí dễ quan sát toàn bộ phân xưởng sản xuất, văn phòng Công ty đặt riêng với khu sản xuất

Công ty có nhà nghỉ trưa cho công nhân, có nhà ăn sạch sẽ thoáng mát

Đường ống thông thoát nước nhanh, nước xử lý được đưa đến hệ thống xử lý nước thải của công ty nhằm đảm bảo vệ sinh

Mỗi khu vực sản xuất đều có lối đi riêng, có màn chắn, có hồ nhúng ủng đặt ngay cửa ra vào, phòng thay đồ bảo hộ ngăn nắp, sạch sẽ, được vệ sinh thường xuyên

1.5 Sơ đồ tổ chức và bố trí nhân sự

a) Sơ đồ tổ chức

b) Sơ đồ tổ chức của công ty được trình bày như trong sơ đồ sau:

7

Hình 1.3 Sơ đồ tổ chức của công ty

c) Danh sách ban điều hành

Danh sách ban điều hành công ty được trình bày như sau:

Bảng 1.1 Danh sách ban điều hành

HỘI ĐỒNG QUẢN TRỊ

BAN KIỂM SOÁT

BAN GIÁM ĐỐC/ KẾ TOÁN TRƯỞNG

8

1.6 Nội quy và chính sách

1.6.1 Nội quy

Nội quy của xưởng chế biến rất nghiêm ngặt:

- Khi ra ngoài khu vực sản xuất phải thay bảo hộ lao động Không được đeo khẩu trang dưới mũi, không được vén ống tay áo bảo hộ lao động ( BHLĐ) trong quá trình sản xuất, BHLĐ phải viết tên, thêu tên theo quy định

- Trước khi vào xưởng phải rửa tay, lăn tóc theo quy định

- Khi mở cửa, mở vòi nước phải tháo bao tay

- Không nghe điện thoại và không để diện thoại reo trong xưởng

- Móng tay phải cắt ngắn, không được sơn móng tay, không được sử dụng kem bôi

da tay

- Không mang thuốc tẩy vào khu vực sản xuất

- Không ăn uống tại khu vực sản xuất như: Hành lang, phòng tahy BHLĐ và trong xưởng

- Không để đồ ăn, thức uống trong xưởng, khu vực thay BHLĐ

- Không hút thuốc trong khu vực nhà máy

- Vệ sinh găng tay, yếm sạch sẽ mỗi giờ, nghỉ giữa ca và nghỉ cuối ngày

- Không được nằm trên BHLĐ, không đặt áo BHLĐ và lưới tóc trực tiếp dưới nền

- Dụng cụ sản xuất không được để trực tiếp dưới nền

- Vệ sinh và khử trùng dụng cụ trước và sau khi sử dụng

- Thùng rác chỉ được đựng rác, không đựng các loại dụng cụ, vật tư hóa chất

- Không được mang vật lạ vào xưởng như tâm, đinh,dây thun, mảnh nhựa, chìa khóa

9

- Không sử dụng dụng cụ sản xuất bể vỡ nếu không có sự đồng ý của QA &QC

- Sau khi đi vệ sinh phải rửa tay theo quy định

- Trước khi vào phòng sản xuất đeo găng tay, nhúng găng tay vào thao nước chlorine 50ppm, vắt khăn lau

- Phải treo ủng tại khu vực dành riêng cho ủng

- Khi nhặt, rửa sản phẩm rớt đất phải tháo găng tay

- Cửa thoát hiểm chỉ dung trong trường hợp khẩn cấp để thoát hiểm Công nhân không được tự ý đi qua các cửa thoát hiểm trong giờ sản xuất Trừ khi chuyển mâm, khuôn,

hồ nhưng phải được sự cho phép của QA & QC, sau khi qua phải đóng cửa ngay

- Chuyển rác qua cửa số nhỏ sát đất, đối với phòng nào không có cửa chuyển rác thì phải chuyển vào cuối buổi trưa và cuối ca sản xuất

- Công nhân tuyệt đối không được đi qua cửa chuyển hàng, cửa chuyển rác Trừ công nhân vệ sinh được đi qua cửa chuyển rác

- Khi có nhiều loại hàng hóa cùng một cửa sổ thì phải nhập tuần tự từng loại, nếu sản phẩm trước ít hơn nhập sản phẩm sau thì sau khi nhập sản phẩm trước, phải vệ sinh cửa sổ bằng cách nhúng Chlorine 50ppm để lau bệ cửa

- Không để ử hàng hóa tại cửa số chuyển hàng

- Không chồng chất mâm hàng hóa cao quá đầu nguy cơ đổ vỡ, rơi rớt sản phẩm

- Ướp đá đầy đủ để giữ lạnh sản phẩm trong quá trình sản xuất

- Thay BHLĐ khi chuyển đổi mặt hàng từ ít sạch sang sạch hơn ( tùy tình hình thực tế,

QA và QC sẽ quyết định)

- Công nhân nữ phải cuốn toc vào trong nón lưới

- Công nhân làm vệ sinh lau trần, tường, cống, rãnh, đổ rác,…thì không được tiếp xúc sản phẩm

- Hóa chất phải được để đúng nơi quy định

- Mâm và bao PE trải mâm phải luôn khô và sạch

- Pha chế và sử dụng hóa chất tẩy rửa như Chlorine, xà phòng…phải tuân thủ quy định

10

- Cồn chỉ để khử trùng bề mặt dụng cụ, thiết bị, tay, bao tay Tuyệt đối không xịt cồn khử trùng trực tiếp vào sản phẩm

- Không đứng hoặc ngồi trên bệ cửa, xe chuyển hàng và kệ để hàng

- Mâm, trạc chứa hàng và dụng cụ sản xuất phải luôn đặt cách mặt đất ít nhất 60cm, riêng khoai tây sau khi bào vỏ, chấp nhận chuyển từ nơi bào vỏ đến cửa phòng tiếp nhận rau củ bằng xe cách mặt đất 30cm

- Không được mang bao bì như thùng carton, bao ngoài cùng của các loại bột, khay vào khu sản xuất

- Các cây cào nước bàn phải luôn đặt trong một rổ riêng của từng phòng và đặt trên

kệ, không để lẫn lộn với các dụng cụ khác

- Phải luôn mang bao tay trong các trường hợp sau: Đẩy xe hàng, bưng mâm, trải mâm, cầm dụng cụ sản xuất, cào bàn

- Khi bưng mâm, không được ngón tay chạm vào sản phẩm

1.6.2 Chính sách đối với người lao động

a Chế độ làm việc

- Thời gian làm việc: Công ty tổ chức 8h/ngày, 5.5 ngày/tuần, nghỉ trưa 1 giờ Công

ty tổ chức 1 ca/ ngày Khi có yêu cầu về tiến độ, nhân viên công ty có trách nhiệm làm thêm giờ và công ty sẽ đảm bảo quyền lợi của người lao động theo quy định của Luật lao động với đãi ngộ thỏa đáng

- Điều kiện làm việc: trang bị đầy đủ phương tiện bảo hộ lao động, tuân thủ quy định vệ sinh an toàn lao động

11

c Chính sách lương, thưởng, phúc lợi

Việc khen thưởng gắn liền với hiệu quả kinh doanh và mức độ hoàn thành tốt nhiệm

vụ của mỗi thành viên

 Lương thưởng theo năng lực

 Được đóng BHXH, BHYT, BHTN,…theo quy định Nhà nước

 Tháng lương 13

 Thưởng theo thành tích hàng quý

 Thưởng cá nhân, tập thể tiêu biểu, xuất sắc

 Thưởng lễ, Tết

 Tham gia hoạt động giải trí do Công ty tổ chúc các kỳ nghỉ

 Cấp đồng phục bảo hộ lao động, cung cấp suất ăn trưa, hỗ trợ xe đi lại một phần chi phí nhà ở nhân viên

1.7 Các quy định về vệ sinh an toàn của nhà máy

1.7.1 Các yêu cầu về dụng cụ và thiết bị an toàn lao động

Các đồ bảo hộ lao động: Yến, găng tay, ủng đều được vệ sinh và khửu trùng

Hóa chất rửa thường dùng là xà phòng, hóa chất khử trùng thường là chlorine

 Điều kiện cá nhân

Công nhân thường xuyên phải tiếp xúc với nước, không khí ẩm và lạnh Thêm vào đó tôm được bóc bằng tay dễ phát sinh bệnh nghề nghiệp, tôm có mùi tanh và trng không khí sẽ có một ít bị phân hủy tạo ra chất độc như NH3 và H2S, dễ bị nhiễm bệnh ngoài da

Do đó, công nhân phải được trang bị đầy đủ quần áo bảo hộ lao động, găng tay, mũ, ủng, cao su, …

Công nhân kho lạnh phải có quần áo ấm, mặt nạ, găng tay để chống lại không khí lạnh đến – 18o

C trong phòng bảo quản trữ đông

c Các phương tiện vế sinh và khử trùng

Phương tiện rửa và khử trùng tay: Sử dụng vòi nước vận hàng bằng chân Hệ thống vòi nước lắp đặt nơi cần thiết Có bình xịt cồn nơi cần thiết

Bồn nước để sát trùng ủng Hàm lượng chlorine trong nước sát trùng ủng đạt 100 –

200 ppm Nước rửa tay không bị chảy vào bồn nước sát trùng ủng

Phòng thay đồ bảo hộ lao động: Mỗi khu vực sản xuất đều có phòng thay đồ bảo hộ lao đông riêng Được bố trí thích hợp, đủ tiện ích, đủ số lượng, thoáng mát đảm bảo vệ sinh

Nhà vệ sinh cách ly an toàn với khu vực chế biến Có hành lang đi từ khu chế biến đến nhà vệ sinh Thường xuyên làm vệ sinh sạch sẽ Cung cấp đủ nước sạch, đủ giấy vệ sinh và phòng chứa rác

1.7.2 An toàn phòng cháy chữa cháy

Với slogan: Quyết tâm “ phòng cháy tốt, chữa cháy giỏi ”

13

Luật phòng cháy chữa cháy cho doanh nghiệp: theo luật phòng cháy chữa cháy Việt Nam, tất cả các doanh nghiệp hoạt động đều phải thành lập tổ chức phòng cháy chữa cháy tại cơ sở Với khẩu hiệu trên Công ty Cổ phần Nông nghiệp Hùng Hậu đã nâng cao tầm quan trọng của việc phòng cháy chữa cháy

Theo quy định hiện hành với doanh nghiệp có trên 100 nhân viên chính thức thì đội phòng cháy chữa cháy phải có ít nhất 25 người, mỗi phân xưởng, có các ca làm việc khác

nhau phải có ít nhất 5 -7 người được tập huấn phòng cháy chữa cháy

1.7.3 Xử lí nước thải

a An toàn nguồn nước

Nước tiếp xúc với thực phẩm và các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm phải đảm bảo

an toàn vệ sinh theo tiêu chuẩn 28 TCVN 130: 1998 và 505 - BYTVN hoặc chỉ thị 80/778 của EEC

b An toàn nguồn nước đá

Nước dùng để sản xuất nước đá phải đạt yêu cầu về an toàn vệ sinh thực phẩm theo yêu cầu an toàn nguồn nước Hiện tại nhà máy có hệ thống sản xuất đá vảy nhằm phục vụ toàn bộ quy trình sản xuất của công ty Kho chứa đá vảy có bề mặt hẵn , không thấm nước , kín , cách nhiệt , có ô cửa đóng kín , tránh khả năng lây nhiễm từ phía công nhân, dễ dàng vệ sinh

c Hệ thống xử lý nước thải

Quy trình xử lý nước thải : nước thải từ công ty sẽ được giữ lại tại bể chứa qua

hệ thống tách chất thải chỉ lấy nước , còn chất thải khác được đưa đi xử lý

Bể hiếu khí , hiếu khí triệt để, để chất hữu cơ có khả năng phân hủy sinh học , thời gian lưu nước , tính toán 24h/ bể Số lượng 2 bể ( sục khí 3 giờ ) lắng ⁄ giờ thải nước ra môi trường Khử trùng diệt vi sinh vật nước thải ra môi trường ( nước sạch )

14

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH TRONG

THỦY SẢN 2.1 Các chỉ tiêu vi sinh

2.1.1 Escherichia coli

Hình 2.1 Escherichia coli

E coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài

động vật máu nóng Hầu hết các dòng E Coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng

trong việc ổn định sinh lý đường ruột Tuy nhiên có 4 dòng có thể gây bệnh cho người và

một số loài động vật là Enteropathogenic E Coli ( EPEC), Enterotoxigenic E Coli ( ETEC), Enteroinasive E Coli ( EIEC), Enterohaemorrhagic E Coli ( EHEC)/ Verocytoxin E Coli ( VTEC) hay E Coli O157: H7 Các loài E Coli hiệ diện rộng rãi

trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong

môi trường Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E Coli dễ dàng nhiễm vào thực

phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến Các

dòng E coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa Biểu hiện lâm sàng

thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người

2.1.2 Coliforms

Coliform và Feacal coliform ( coliform phân) là một loại vi khuẩn gram âm kỵ khí,

hình que, không tạo bào tử Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng nhóm này được chia thành hai

15

nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân Vi khuẩn coliform thường có nguồn gốc từ ruột

của các động vật máu nóng Coliform phân có khả năng phát triển trong môi trường có mặt các muối mật hoặc các chất bề mặt tương tự, là các oxidaza âm, và tạo ra axit và khí

từ lactose trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 44 ± 0,5 °C

2.1.3 Staphylococcus aureus

Hình 2.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ

khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và

da Staphylococcus aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt,

không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này sau 4-6 h người bi ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6-8 h Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp và các loài thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loài vi sinh vật này Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

2.2.1 Phương pháp truyền thống

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau như đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng trực tiếp thông qua

16

mức độ ánh sáng ( độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loang tới hạn ( phương pháp MNP)

2.2.1.1 Phương pháp đếm tế bào qua kính hiển vi

Có hai cách đếm trực tiếp qua kính hiển vi hoặc mẫu được làm khô ( cố định) trên lam kính trước khi đếm,hoặc sử dụng các buồng đếm đặc biệt dùng cho các mẫu dạng đông Về bản chất buồng đếm là những lam kính trên có khắc rãnh phân thành mạng lưới các ô vuông nhỏ có kích thước xác định Trên mỗi ô vuông giữa lam kính và lamel là một thể tích xác định, tuy khó nhưng rất chính xác Đếm số tế bào trên các ô dưới kính hiển vi

và nhân với thể tích tương ứng có thể quy ra số tế bào vi sinh vật trong 1ml mẫu

Phương pháp đơn giản này cho pháp đánh giá nhanh số tế bào vi sinh vật có trong mẫu thử, song nó có một số hạn chế sau :

- Không phân biệt được tế bào sống và chết

- Những tế bào nhỏ khó nhìn dưới kính hiển vi và có thể sót khi đếm

- Khó đạt độ chính xác cao

- Cần có kính hiển vi phân pha khi mẫu không được nhuộm Phương pháp không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật với mật độ thấp Dùng buồng đếm Retroff Hauser chẳng hạn nếu huyền phù vi sinh vật có mật độ 1.5 triệu/ml thì trung bình trên một ô vuông chỉ có 1.25 tế bào, nghĩa là với mật độ tế bào dưới 1 triệu/ml sẽ có rất ít tế bào được nhìn thấy dưới kính hiển vi

2.2.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc ( phương pháp đếm đĩa)

Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu

Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản Cách thường dùng để tính tế bào sống là xácđịnh số tế bào trong mẫu có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch thích hợp Vì lẽ này phương pháp xác định số tế bào sốn như trên được gọi là phương pháp đếm đĩa hay đếm khuẩn lạc

Có hai phương pháp đếm đĩa là phương pháp cấy trang và phương pháp đổ đĩa

17

Theo phương pháp cấy trang một lượng dịch mẫu không quá 0.1ml được dàn đều trên bề mặt đĩa thạch bằng que cấy trải vô trùng, sau đó ủ đĩa cho khuẩn lạc xuất hiện và đếm số khuẩn lạc tạo thành Cần chú ý là thạch phải khô để dịch mẫu dính xuống Không cấy quá 0.1ml mẫu bớt lượng chất lỏng dư dính xuống có thể làm cho các khuẩn lạc mọc lan khó đếm

2.2.1.3 Phương pháp màng lọc

Phương pháp màng lọc ( Membrane Filter Method) thường được dùng để định lượng vi sinh vật (đặc biệt là vi sinh vật chỉ thị) trong mẫu nước khi tiến hành các xét nghiệm môi trường ( nơi có mật độ vi sinh vật nói chung và vi sinh vật chỉ thị nói riêng tương đối thấp).Bản chất của phương pháp này là tập trung vi sinh vật ít ỏi trong một mẫu nước có khối lượng khá lớn trên màng lọc khuẩn và định lượng chúng theo số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc trên một môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Dựa trên mẫu nước ban đầu và quy ước coi mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một vi khuẩn người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước

Về thực chất đây là sự kết hợp của hai phương pháp vốn được sử dụng rộng rãi trong công tác kiểm nghiệm vi sinh vật Đó là phương pháp lọc vô khuẩn (thường dùng

để lọc thanh trùng một số dung dịch kém chịu nhiệt, dễ bị biến chất hoặc phân hủy khi khử trùng ở nhiệt độ cao)và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa

Hiện nay người ta đã chế tạo được nhiều màng lọc khuẩn khác nhau với kích thước lôc vào khoảng 0,2-1 µm Những vật liệu thường được dùng để chế tạo màng lọc khuẩn

là sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi amiante, sợi polypropylene…là những vật liệu có khả năng chịu được nhiệt độ và áp suất cao của nồi hấp tiệt trùng Màng lọc loại này thường được cung cấp trạng thái vô trùng

Phương pháp màng lọc hiện vẫn không ngừng được cải tiến theo nhiều hướng khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng Một tring những ví dụ điển hình cho các hướng cải tiến

đó là phương pháp lọc qua màng lưới kỵ nước Ở đây người ta dùng những màng lọc đã được in thành thành các ô vuông bằng một loại vật liệu kỵ nước Những đường kẻ kỵ

18

nước này có tác dụng ngăn cản sự mọc lan của các khuẩn lạc và như vậy chia bề mặt màng lọc thành những ô đều nhau có kích thước xác định Số ô vuông có khuẩn lạc mọc được đếm và quy về số ô có xác suất lớn nhất ( MNP) của lượng vi sinh vật có trong một thể tích mẫu theo công thức:

MNP = N.Ln (N/n-x)

2.2.1.4 Phương pháp đo độ đục

Mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ thống huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cần ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan

hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550-610nm.Trong trường hợp này,trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một hệ số huyền phù có độ đục xác định

và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác,

ví dụ phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp …

Quy trình xác định mật độ tế bào bằng độ đụ gồm các bước như sau:

- Pha loãng một huyền phù chứa loài vi sinh vật cần kiểm nghiệm có mật độ bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1;0,2;0,3;0,4; và 0,5 Đo OD 610nm của các huyền phù vừa được pha,ghi nhận số đo thực tế

- Dùng phương pháo đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào ( N/ml) của các huyền phù này

- Tính giá trị log ( N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục Vẽ đường biểu diễn của log ( N/ml) (trục tung) theo OD610nm ( trục hoành) Xác định khoảng tuyến tính giữa log ( N/ml) và OD610nm

19

- Xác định lượng tế bào theo độ đục

Đo độ đục của huyền phù tế bào vi sinh vật cần xác định

Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và OD

để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu Lưu ý N/ml =10a với a=log ( N/ml) Phương pháp định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng trong trường hợp không cần biết giá tri tuyệt đối của mật độ tế bào thì không cần phải xây dựng đường tương quan tuyến tính gữa độ đục và mật độ.Phương pháp này cho kết quả nhanh thường được ứng dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật

2.2.1.5 Phương pháp MPN

Phương pháp MPN ( Most Possible Number) dùng để đánh giá lượng vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật có thể có trong một đơn vị thể tích mẫu với độ chính xác tương đối cao tuy dựa trên những thao tác và trang thiết bị khá đơn giản Phương pháp này (còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ), dựa trên kỹ thuật nuôi ủ vỉ sinh vật cần định lượng trong một môi trường lỏng thích hợp Nội dung của phương pháp như sau: Cho vào một số ống nghiệm xác định ( có chứa môi trường lỏng thích hợp cho sự phát triển dạng vi lượng sinh vật cần định lượng) một thể tích chính xác dung dịch mẫu với các nồng độ pha loãng khác nhau (1/10; 1/100; 1/1000…) Sau khi ủ trong những điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa trên những tính chất như sinh hơi, đổi màu chuyển đục,…xác định số ống nghiệm có vi sinh vật phát triển (ống dương tính) ở từng nồng độ pha loãng Lập các chỉ số gồm các ống nghiệm dương tính ở mỗi loại nồng độ pha loãng ( theo thứ tự giảm dần của nồng độ) Tra chỉ số trên theo bảng MPN của Mac Crady ( từng được xây dựng trên cơ sở xử lý xác suất thống kê một khối lượng lớn các kết quả thử nghiệm) để xác định số có xác suất lớn nhất của lượng vi sinh vật trong một đơn vị thể tích

Phương pháp MPN có thể thực hiện theo hai cách:

20

- Với một nồng độ pha loãng

- Với vài nồng độ pha loãng

Phương pháp dùng một loạt ống nghiệm với một nồng độ pha loãng duy nhất phù hợp hơn khi mật độ vi khuẩn ước định giữa mức thấp nhất và mức cao nhất rõ ràng là không chênh lệnh nhau gấp 100 lần và khi mật độ vi khuẩn ước định rất thấp, chẳng hạn khi kiểm tra mẫu nước đã thanh trùng Trong những trường hợp khác người ta thường dùng vài nồng độ pha loãng khác nhau Phương pháp ba nồng độ thường được dùng phổ biến nhất

Cần lưu ý rằng phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ loại vi sinh vật nào với điều kiện phải dùng môi trường tăng sinh chọn lọc ( môi trường lỏng) cho kêt quả

dự kiến phù hợp, chẳng hạn như BGBL kết hợp với chế độ nhiệt 37OC cho coliforms,

44OC cho coliforms phân,…

2.2.2 Phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử

Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn Tuy vậy, nhược điềm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được nhu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cây, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được xây dựng và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau Các phương pháp này nhầm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện và có độ nhạy và độ chính xác cao

Các pương pháp nhanh và tự động hoá trong phân tích vi sinh vật thực phâm đều dựa trên nguyên tắc của vi sinh học, sinh hoá học, hoá lý, miễn dịch học, sinh học phân tử học để phát hiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại của chúng trong thực phẩm môi trường Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn

bị mẫu phân tích,… đều được nghiên cứu cải tiến theo hướng tự động hoá, đơn giản hoá cho kết quả nhanh và chính xác

21

2.2.2.1 Phương pháp Elisa ( Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đây sự phát triển của các kỹ thuật chuẩn đoán bằng huyết thanh Các phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả trong việc chuẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác định các chất độc hại trong môi trường như độc tố, dư lượng kháng sinh,… Nguyên tắc của phương pháp ELISA dựa trên phản ứng ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu, Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện băng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu ( bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme)

Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme ( linked immunosorbent assay) Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng ( kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng ( well) nhỏ nhầm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách

enzyme-sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tính hiệu ( thường là horseradish peroxidase hay aikaline phosphatase) Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặt hiệu của enzyme phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng Như vậy chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên

Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng ELISA với S: cơ chất, E: enzyme, P: phát quang

Hiện nay ELISA đã được sử dụn rộng rãi để phân tích Salmonella, E Coli gây bệnh ( các dòng EHEC, STEC, IEHEC ), Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư

lượng kháng sinh đối với vi sinh vật, phương pháp ELISA có thê sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp

22

2.2.2.2 Phương pháp LAMP

"LAMP” ( Loop-mediated Isothermal Amplification) là phương pháp khuẻch đại

nueleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm Sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen đích (target gene) và quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ ỗn định dùng phản ứng thay thế mạch Khuếch đại và phát hiện gene có thê được hoàn thành chỉ trong 1 bước bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở nhiệt độ có định ( khoảng 65OC) Phương pháp này cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng DNA được khuếch đại đến 109

2.2.2.3 Phương pháp phát quang sinh học ATP

Phân tử Adenosine triphosphate ( ATP) có mặt trong tất cả các tế bào sống, nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại ATP có thể được phát hiện và định lượng thông qua cường độ ánh sáng phát ra do sự kết hợp với enzyme Luciferase Kĩ thuật này thể phát hiện được 1pg ATP, tương ứng với khoảng 1000 tế bào

vi khuẩn ( 10-15 ATP/ tế bào) Quá trình phân tích chỉ diễn ra trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc

Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960 Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải Ngày nay phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ tinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh thực phẩm Để đánh giá chất lượng vi sinh thực phẩm thì lượng ATP của vsv phải được

đo và điều này đòi hỏi những quy trình tách chiết ATP ra khỏi tế bào vsv

Phản ứng phát sinh học trải qua 2 giai đoạn:

Hình 2.2 Các bước định lượng nhanh vi sinh vật hiện diện trên bề mặt bằng phản ứng

ánh sáng

2.2.2.4 Phương pháp lai phân tử ( Gene probes)

Phương pháp sử dụng mẫu dò trong việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm thông qua sự phát hiện một trình tự DNA đặc trưng Các mẫu dò thường được sử dụng RNA ribosime ( rRNA) làm mục tiêu Nguyên tắc của phương pháp mẫu dò là lai phân

2.2.2.5 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR ( polymerase chain reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase

và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Kỹ thuật này được Karl Mullis ( Mỹ) phát minh vào 1985

Hình 2.3 Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân

Ưu điểm của phương pháp PCR

 Thời gian cho kết quả nhanh

 Ít tốn k m về mặt nhân sư Có thể tự động hóa để làm chi phí phát hiện các

vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

Nhược điểm:

 Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase

 Mật độ vsv trong mẫu thấp, đôi khi cần tăng sinh

 Không phân biệt được tế bào sống và chết, có thể dẫn đến dương tính gải

 Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus

2.2.3 Một số phương pháp thử nhanh khác

2.2.3.1 Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ

Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng bậc 10 tạo một thể tích lớn nguyên liệu ban đầu ( 250ml) Nhưng có thể dùng vài mililite cho những bước tiếp theo trong quá trình phát hiện Như vậy chúng ta có thể dùng bước tăng mật độ các vi sinh vật mục tiêu trong mẫu để rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện

Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là miễn dịch phân tách

( Immunomagnetic separation- IMS) Với phương pháp này giai đoạn phân lập có thể được rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng quy trình tương

tự không cần nuôi cấy IMS sử dụng những hạt siêu thuận tử được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu Các hạt này có chức năng phân tách chọn lọc

và vi sinh vật mục tiêu này ra khỏi một hỗn hợp quần thể

Màng lcoj có thể làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon,… Kích thước lổ sử dụng là 0,45µm ( hoặc 0,22µm) đường kính 13mm đến 150mm Tạo lực đẩy qua màng bằng hút chân không hoặc lực ép

Độ nhạy của kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp ( DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế bào trước khi nhuộm được lọc bởi màng lọc có thể phân biệt tế bào sống và chết bằng cách nhuộm nhân với fluorochrome acridine orange Màu sắc phát quang trong tế bào thay đổi trong suốt quá trình tăng trưởng Thuốc nhuộm màu phát đỏ với RNA và màu xanh với DNA Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào chết cho màu xanh lục Năm 1991, phương pháp ISO- GRID ứng dụng trên đối tượng salmonella đã được AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm

Hình 2.1 Hệ thống ISO- GRID

2.2.3.3 Kỹ thuật màng petri ( Petrifilm)

Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi là Petrifilim Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ trên được nâng lên và nhỏ vào 1ml dịch mẫu rồi đậy lại Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vsv trong thời gian ủ Có thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilim

27

Petrifilim đã được dùng để kiểm tra tổng số vsv hiếu khí, số coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men Ưu điểm của kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian

ủ và bảo quản Thời gian sử dụng lâu dài do dùng môi trường đông khô và không cần xử

lý nhiệt như phương pháp thông thương Có thể dùng nước cất vô trùng để làm ướt lại môi trường đông khô Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilim để đếm tạp khuẩn bề mặt