xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó phục vụ việc xác định các thông số dược động học viên nang fenofbrat 160mg

Do đó, điều quan trọng để có một phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ tái lặp tốt và thời gian phân tích cho mộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HUYỀN CHANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ PHỤC VỤ VIỆC XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC VIÊN NANG FENOFBRAT

160MG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HUYỀN CHANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ PHỤC VỤ VIỆC XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC VIÊN NANG FENOFBRAT

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị

Thuận – Bộ môn Hóa dược, Trường đại học Dược Hà Nội là người cô đã tận tình

hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Nhân dịp này tôi muốn gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến và

ThS Trần Ngọc Bảo – Bộ môn Công Nghiệp Dược cùng các thầy cô giáo, cán bộ

kỹ thuật viên bộ môn Hóa dược và viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện đề tài của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo sau đại học và các thầy cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi được trau dồi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè là những người đã dành cho tôi sự ủng hộ,chia sẻ và giúp đỡ tận tình

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2018

Học viên Phạm Thị Huyền Chang

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1.TỔNG QUAN 3

1.1 Fenofibrat và acid fenofibric 3

1.1.1 Tính chất 3

1.1.2 Đặc điểm dược động học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định 4

1.1.5 Liều lượng và cách dùng 5

1.1.6 Một số phương pháp định lượng fenofibrat, acid fenofibric trong huyết tương 5

1.2 Sơ lược phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 8

1.2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký 8

1.2.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 8

1.2.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11

1.3 Phương pháp phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học 12

1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 13

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 15

1.4 Sinh khả dụng 19

Chương 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 24

2.1.4 Động vật thí nghiệm 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký 21

2.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương 21

2.2.3 Thẩm định phương pháp 21

2.2.4 Ứng dụng xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat 160mg 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng FB và FA trong huyết tương chó 22

2.3.2 Ứng dụng xác định các thông số dược động học 27

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 29

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 32

3.2.1 Sự phù hợp hệ thống sắc ký 32

3.2.2 Độ chọn lọc - đặc hiệu 33

3.2.3 Độ nhiễm chéo 33

3.2.4.Tỷ lệ thu hồi 33

3.2.5 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 34

3.2.6 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng dưới 36

3.2.7 Độ đúng và độ lặp lại 38

3.2.8 Độ ổn định 43

3.3 Xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat 46

Chương 4 BÀN LUẬN 49

4.1 Về phương pháp định lượng 49

4.2 Về ứng dụng xác định các thông số DĐH 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

Kết luận 53

Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AN Chất phân tích

AUC Diện tích dưới đường cong

ASEAN Hiệp hội các nước Đông Nam Á

Autosampler Hệ thống tiêm mẫu tự động

C18 Octadecylsilan

CV Hệ số biến thiên

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

EMA Cơ quan quản lý dược phẩm Châu Âu EtOAc Ethyl acetat

LLOQ Giới hạn định lượng dưới

LOD Giới hạn phát hiện

LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MeOH Methanol

MF Ảnh hưởng của nền mẫu

MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

r Hệ số tương quan

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

SD Độ lệch chuẩn

SKD Sinh khả dụng

SPE Chiết pha rắn

Spic Diện tích pic

TB Trung bình

TĐSH Tương đương sinh học Tltk Tài liệu tham khảo

tR Thời gian lưu giữ

ULOQ Giới hạn định lượng trên UHPLC Sắc ký siêu hiệu năng cao WHO Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương 5

Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn 20

Bảng 2.2 Danh mục thuốc thử 20

Bảng 2.3 Bảng nồng độ các mẫu QC 23

Bảng 3.1 Chương trình gradient 31

Bảng 3.2 Kết quả sự phù hợp hệ thống 32

Bảng 3.3 Kết quả tỷ lệ thu hồi IS sau khi chiết 34

Bảng 3.4 Các giá trị sử dụng trọng số 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát đường chuẩn FA 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát đường chuẩn FB 36

Bảng 3.7 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FA 37

Bảng 3.8 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FB 38

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FA 39

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FB 40

Bảng 3.11 Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FA 40

Bảng 3.12 Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FB 42

Bảng 3.13 Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 43

Bảng 3.14 Độ ổn định của mẫu sau xử lý 44

Bảng 3.15 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kì đông – rã 45

Bảng 3.16 Độ ổn định trong 30 ngày của mẫu huyết tương 46

Bảng 3.17 Nồng độ FA trong huyết tương chó sau khi uống thuốc 47

Bảng 3.18 Thông số dược động học của FA theo từng cá thể 47

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid fenofibric (FA) và fenofibrat (FB) 3

Hình 1.2 Sơ đồ máy HPLC 7

Hình 3.1 Phổ xác định bước sóng hấp thụ của FA và FB 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ thu được khi chạy MeCN: đệm phosphat pH3 30

Hình 3.3 Sắc ký đồ thu được khi chạy MeOH: đệm phosphat pH3 30

Hình 3.4 Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 30

Hình 3.5 Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 31

Hình 3.6 Sắc ký đồ chương trình gradient 31

Hình 3.7 Sắc ký đồ kiểm tra sự phù hợp hệ thống 32

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu LLOQ 33

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 33

Hình 3.10 Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FA 37

Hình 3.11 Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FB 28

Hình 3.12 Nồng độ trung bình FA trong huyết tương chó theo thời gian 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, lối sống hiện đại đã làm cho bệnh lý tăng mỡ máu ngày càng trở nên phổ biến và là nguy cơ gây ra các biến chứng nguy hiểm như bệnh lý tim mạch hay chứng gan nhiễm mỡ Sử dụng kết hợp thuốc với lối sống lành mạnh giúp duy trì các chỉ số mỡ máu và ngăn chặn các nguy cơ Các thuốc đang được sử dụng phổ biến để điều trị bệnh là nhóm dẫn xuất acid fibric và nhóm statin

Fenofibrat là một thuốc trong nhóm fibrat có hiệu lực điều trị cao, có thể dùng trong thời gian dài và an toàn khi kết hợp với các thuốc hạ lipid máu khác nên được các bác sĩ sử dụng phổ biến để điều trị cho bệnh nhân Tuy nhiên, thuốc có độ tan kém trong nước dẫn tới sinh khả dụng thấp và không ổn định Các tác dụng phụ hay gặp tuy không nghiêm trọng nhưng xuất hiện với tần suất khá cao và gây khó chịu cho bệnh nhân

Gần đây, rất nhiều nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật bào chế hiện đại với mục đích tăng sinh khả dụng, giảm liều dùng và hạn chế tác dụng không mong muốn của thuốc Điều này đặt ra yêu cầu trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc cần có một phương pháp định lượng thuốc trên động vật giúp bước đầu thử tác dụng của thuốc thông qua việc xác định các thông số dược động học Từ đó đưa ra hướng bào chế tiếp theo cũng như tiến đến nghiên cứu tác dụng và đánh giá tương đương sinh học trên người tình nguyện

Theo một số tài liệu tham khảo khi hấp thu vào cơ thể fenofibrat chuyển hóa thành acid fenofibric có hoạt tính, tuy nhiên do các mục đích bào chế khác nhau như

giải phóng chậm, giải phóng có kiểm soát, tăng tốc độ hấp thu… nên có thể trong những trường hợp này fenofibrat vẫn còn trong huyết tương chưa chuyển hóa Như vậy nhằm phục vụ nhu cầu nghiên cứu các dạng bào chế mới chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

‘‘Xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó phục vụ việc xác định các thông số DĐH viên nang fenofibrat 160 miligam’’

Chương 1 :TỔNG QUAN 1.1.FENOFIBRAT VÀ ACID FENOFIBRIC

- Tên khoa học: 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy] – 2-methylpropanoic acid

- Công thức phân tử: C17H15ClO4

- Khối lượng phân tử: 318,8

- Tính chất hóa lý: là dạng chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tương của FB bằng cách cắt liên kết ester trong phân tử FB nhờ enzyme esterase

+ Dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi trắng, không tan trong nước, độ tan tăng trong các hệ đệm, tan tốt trong MeOH Nóng chảy ở 179-183 0C

+ Có khả năng hấp thụ UV ở 288nm, nên có thể định lượng bằng HPLC [2], [21]

Fenofibrat :

- Tên khoa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy] –

2-methylpropanoat

- Công thức phân tử: C20H21ClO4

- Khối lượng phân tử: 360,8

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Thực tế không tan trong nước (<0,5mg/ml), rất dễ tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol 96% Fenofibrat thân dầu, trung tính, hệ số phân bố D/N logP = 5,24 Nóng chảy ở 79-820C[20], [21]

- Tính chất hóa học:có cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân cho acid fenofibric

(FA) và isopropanol Hấp thụ tia UV ở bước sóng 286nm nên có thể định

lượng bằng HPLC detector UV-VIS tại bước sóng này[2], [17]

1.1.2 Đặc điểm dƣợc động học

Fenofibrat được hấp thu ngay ở đường tiêu hóa cùng với thức ăn Hấp thu thuốc bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm Thuốc nhanh chóng thủy phân thành acid fenofibric có hoạt tính, chất này gắn nhiều vào albumin huyết tương và có thể đẩy các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn Nồng độ đỉnh trong huyết tương xuất hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc Ở người có chức năng thận bình thường, nửa đời trong huyết tương vào khoảng 20 giờ nhưng thời gian này tăng lên rất nhiều ở người mắc bệnh thận và acid fenofibric tích lũy đáng

kể ở người bệnh suy thận uống fenofibrat hằng ngày Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nước tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dưới dạng liên hợp glucuronic, ngoài ra còn có acid fenofibric dưới dạng khử và chất liên hợp glucuronic của nó

Không thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fibrat, thậm chí sau khi đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột [2]

1.1.3 Tác dụng dƣợc lý

Fenofibrat được dùng để điều trị tăng lipoprotein - huyết typ IIa, typ IIb, typ III, typ IV và typ V cùng với một chế độ ăn rất hạn chế về lipid Fenofibtrat có thể làm giảm 20 - 25% cholesterol toàn phần và 40 -50% triglycerid trong máu Ðiều trị bằng fenofibrat cần phải liên tục [3]

Sau khi vào cơ thể FB chuyển hóa thành FA, chất này hoạt hóa PPARII (Peroxisome Proliferator Activated Receptor type II) làm tăng phân hủy lipid và loại trừ các tiểu phân giàu triglicerid khỏi huyết tương nhờ hoạt hóa lipoprotein lipase và giảm sản xuất apoprotein CIII, tăng tổng hợp AI và AII Qua đó, fenofibrat làm giảm được các thành phần gây xơ vữa động mạch như lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL) và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu Do đó, thuốc cải thiện đáng kể

sự phân bố cholesterol trong huyết tương

1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định

Chỉ định: Fenofibrat được sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các

tuýp IIa, IIb, III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn

Trẻ > 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định căn nguyên chính xác của tăng lipid máu ở trẻ Có thể điều trị thử kết hợp với một chế độ ăn được kiểm soát chặt chẽ trong vòng 3 tháng Liều tối đa khuyên dùng là 5 mg/kg/ngày Trong một số trường hợp đặc biệt (tăng lipid máu rất cao kèm theo dấu hiệu lâm sàng của vữa xơ động mạch, cha mẹ có biểu hiện tim mạch do xơ vữa trước 40 tuổi, có đám đọng xanthom ) thì có thể dùng liều cao hơn nhưng phải do thầy thuốc chuyên khoa chỉ định

Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng fenofibrat thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác)

1.1.6 Một số phương pháp định lượng fenofibrat, acid fenofibric trong huyết tương

Bảng 1.1 Các phương pháp định lượng fenofibrat, acid fenofibric trong HT

Phương pháp

phân tích

Đối tượng

Điều kiện sắc ký

Xử lý mẫu Tltk

HPLC-UV FA -Cột: Germini C18

(250 × 4,6mm; 5µm) -Pha động: MeOH – đệm phosphat pH3 (75: 25) -Bước sóng phân tích 288nm -Chất nội chuẩn: atorvastatin -LLOQ: 0,25 µg/ml

Tủa protein bằng MeCN

[8]

HPLC-UV FA -Cột: Symmetry Shield TMRP 18

(150 × 4,60mm; 5µm) -Pha động: MeCN– acid phosphoric 0,02M (50: 50) -Bước sóng phân tích: 287nm -Chất chuẩn nội: 4’-chloro-5-fluro-2-hydroxybenzophenone (CFHB)

-LLOQ: 0,05 µg/ml

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

[21]

HPLC-UV -Cột: Lithosphere 60 RP-Select

B (250x 4mm; 5µm) -Pha động: MeCN: đệm phosphate pH 6,0 = 30: 70 -Chất chuẩn nội: Diazepam -LLOQ: 0,095 µg/ml

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

[34]

LC-MS/MS FA -Cột: C18 pha đảo (2,1 × 50mm, Chiết lỏng- [33]

5µm) -Pha động: methanol: water:

dicloromethan: isopropanol

UHPLC-MS/MS

FB, FA -Cột: Acquity® BEH C18 (50 ×

2,1 mm, 1,7 μm) -Pha động: methanol:nước

=65:35 -Bước sóng phát hiện : 284nm -Chất chuẩn nội: Fluvastatin

-LLOQ:FB: 30-90 ng/ml FA: 40-100 ng/ml

Chiết lỏng lỏng bằng hỗn hợp

-diethylether- EtOAc

[26]

CE FA, FB -Mao quản 25cm x 50µm ( ID)

-Dòng điện 5,5kV -Áp suất tiêm mẫu 3447Pa -Bước sóng phát hiện 280nm -Hệ đệm là acid boric, sodium carbonat, polyethylen glycol

6000

Tủa protein bằng MeCN

[28]

Từ các nghiên cứu tham khảo được ở trên, chúng tôi lựa chọn định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương bằng HPLC với detector UV, sử dụng hệ sắc ký pha đảo với cột C18 và xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng với dung môi ethylacetat

1.2 Sơ lược phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định

lượng trong phân tích kiểm nghiệm Ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ, dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ[2], [4]

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

1.2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký

Quá trình phân tách trong HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khỏi cột Tùy theo bản chất pha động và pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho ta sắc ký đồ Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều thành phần

1.2.4 Cấu tạo hệ thống HPLC

Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản [12], [21]được tóm tắt trên sơ đồ hình 1.2

1 Bình chứa dung môi pha động

2 Bơm cao áp

3 Bộ phận tiêm mẫu

4 Cột HPLC (pha tĩnh)

5 Detector

6 Máy ghi tín hiệu

Hình 1.2.Sơ đồ máy HPLC 1.2.4.1 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi, trong phương pháp gradient cần phải có nhiều bình dung môi

1.2.4.2 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000- 6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1at =0,98 Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)

1.2.4.3 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích của cột là 5 - 100l Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosampler)

1.2.4.4 Cột HPLC (pha tĩnh):

Cột thường được làm bằng thép không gỉ, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau Phần lớn quá trình phân tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng,

nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn Tuy nhiên, nhiệt

độ cột cũng không được phép vượt quá 60oC vì khả năng phân huỷ của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra

Sau đây là một số pha tĩnh điển hình:

- Silcagel trung tính: Dùng để tách các chất không phân cực và ít phân cực

Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước Ví dụ: Lichrosorb Si 40, Si 60, Si 100; Hypersil; M- partisil; Micropack - Si

Pha động dùng cho loại này là những chất không phân cực hay ít phân cực, thường là các dung môi hữu cơ đơn hay hỗn hợp của vài dung môi hữu cơ không

tan trong nước như: benzen, toluen, cloroform, hexan, ethyl acetat

-Silicagel đã alkyl hoá: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các

chất phân cực có khả năng tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị alkyl hoá tức là đã được gắn với mạch carbon thẳng (C8, C18) hay các carbon vòng (phenyl) vì thế nó không còn phân cực hay rất ít phân cực

Ví dụ: Hypersil ODS, lichrosorb RP18, -RP8, C8 corasil, phenyl - corasil

.Pha động dùng cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonitril,

nước hoặc hỗn hợp của chúng

- Silicagel đã được sulfonic, nitro hoá hay amin hoá: Dùng để tách các chất có

cấu tạo ion như các kim loại và hợp chất của kim loại hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành ion như các acid hay base Ví dụ: Lichrosorb - NH2; Lichrosorb - CN; Nucleosil - 5NH2; Partisil - SAX; Micropack; Hyperasil APS

1.2.4.5 Detector :

Là bộ phận phát hiện các chất khi có chất ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

A=k.C Trong đó :A là tín hiệu đo được

C là nồng độ chất phân tích

k là hằng số thực nghiệm của detector

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau :

+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm

+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang

+Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang

+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array,ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :

+ Detector phổ khối phân tử (MMS): là một detector rất ưu việt cho sắc ký hiện nay, nó có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao

+ Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường )

+ Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt

1.2.4.6 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang Trong các máy thế hệ cũ thì

sử dụng máy ghi đơn giản có thể đưa ra sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của pic, chiều cao… Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của pic như tính đối xứng,hệ số phân giải Trong quá trình phân tích đồng thời xử lý,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ,đường chuẩn, RSD,

1.2.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.2.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh)

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường kính cỡ hạt từ 3 – 10 µm Quá trình sắc ký có thể được thực hiện bởi nhiều kỹ thuật khác nhau như: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion,…

Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhất

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch cacbon Pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và thường được sử dụng nhiều nhất

1.2.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất cần phân tích ra khỏi cột tách

để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực như: n-hexan, n-hepta, benzen,…

Trong sắc ký pha đảo thì dung môi pha động thường là hệ dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng

1.2.5.3 Chọn hệ đệm

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất phân tích

có tính acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách Thông thường với các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp

1.2.5.4 Tốc độ dòng

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc độ dòng cho pha động để quá trình tách tốt hơn

1.3 Phương pháp phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học

Phương pháp phân tích định lượng hoạt chất trong dịch sinh học là điểm quyết định đến khả năng thành công của các nghiên cứu SKD, TĐSH, Đặc thù của mẫu dịch sinh học là nồng độ hoạt chất thấp, nền mẫu phức tạp (thường chứa muối, lipid,

protein, ), lượng mẫu ít nên không thể tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần và số lượng mẫu phân tích nhiều

Do đó, điều quan trọng để có một phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ tái lặp tốt

và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn là cầnmột kỹ thuật xử lý mẫu tối ưu và một quy trình thẩm định phương pháp chặt chẽ theo những quy định riêng nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp [11], [12]

1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu

Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu, ) thường có nồng độ dược chất thấp và chứa một tỷ lệ lớn các protein, các chất nội sinh làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất Vì vậy mẫu cần được tách chiết, xử lý để loại bỏ các tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của thiết bị phát hiện Ba kỹ thuật thường được áp dụng là: chiết pha rắn, tủa protein, chiết lỏng – lỏng

1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein

Nguyên tắc: sử dụng tác nhân gây tủa protein để loại đi phần lớn lượng protein

có trong mẫu huyết tương trước khi phân tích Một số tác nhân gây tủa là:

- Thêm dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn được với nước như MeCN, MeOH là giảm hằng số điện môi của dung dịch

- Thêm acid mạnh như acid percloric, tricloroacetic để làm thay đổi pH của dung dịch

- Thêm muối như amoni sulfat, natriclorid hoặc các ion kim loại như Cu, Zn,

Fe, để làm thay đổi lực ion

- Đun nóng mẫu làm biến tính protein

dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất bị biến đổi khi thêm acid vào trong mẫu Ngoài ra dung dịch thu được đem tiêm sắc ký thường không sạch nên làm giảm tuổi thọ của cột

Như vậy tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích và điều kiện phân tích cụ thể có thể sử dụng kỹ thuật tủa protein

1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc: chuyển chất phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không hòa tan với nước, đồng thời tách được chất phân tích ra

khỏi các tạp có trong nền mẫu

Để chiết được mẫu phân tích trong huyết tương và loại được tạp trong nền mẫu, cần phải chọn được dung môi chiết có khả năng hòa tan chất phân tích nhưng hòa tan ít tạp chất và dễ bay hơi khi đem cô Còn mẫu phân tích trong huyết tương (pha nước) cần chuyển sang dạng trung tính (các chất có bản chất base sẽ được kiềm hóa, các chất có bản chất là acid sẽ được acid hóa) trước khi chiết để tăng khả năng hòa tan chất phân tích trong dung môi chiết

Trên thực tế các dung môi hay được lựa chọn để chiết chất phân tích trong mẫu huyết tương là diethylether, chloroform, diclomethan,… Các dung môi bay hơi

có thể dùng riêng rẽ hay trộn lẫn vào nhau theo các tỷ lệ thích hợp tùy từng chất phân tích Sau khi chọn được dung môi chiết, chiết chất phân tích trong huyết tương bằng cách: lắc, ly tâm, hút lớp dung môi có thể tích xác định, đem cô, thu được cắn

và hòa tan cắn trong pha động để tiêm sắc ký

So với kỹ thuật tủa protein thì kỹ thuật chiết lỏng – lỏng phức tạp hơn, trải qua nhiều bước tiến hành và có thể cho độ thu hồi thấp hơn Nhưng phương pháp này lại cho mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu Vì vậy có thể kết hợp đồng thời

2 kỹ thuật trên để có thể làm cho nền mẫu sạch hơn và khả năng thu hồi chất phân tích tốt hơn

Hiện nay, chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật xử lý mẫu được dùng phổ biến để chiết chất phân tích trong nền mẫu huyết tương

1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn [30]

Nguyên tắc: dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật tách sắc ký có sự khác nhau về

ái lực của chất phân tích và các tạp chất với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng

Quy trình này gồm bốn bước chính:

- Hoạt hóa cột bằng các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm thích hợp

- Nạp mẫu: mẫu được hòa tan trong dung môi và cho qua cột

- Rửa: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại tạp

- Rửa giải: dùng dung môi thích hợp để đẩy chất phân tích ra khỏi cột

Lấy dung dịch rửa giải, tiến hành bay hơi dung môi để thu được cắn Hòa tan cắn trong pha động và tiêm sắc ký

Ngoài ra, người ta cũng có thể chiết tách mẫu theo kiểu lưu giữ tạp chất trên cột và cho hoạt chất đi qua

Để xây dựng 4 bước qui trình chiết trên cần xác định: hiệu quả của dung môi rửa giải chất phân tích và hiệu lực tách chất phân tích của pha rắn Tùy thuộc vào bản chất của từng chất phân tích mà người ta sử dụng các loại cột có bản chất khác nhau và các hệ thống dung môi khác nhau để chiết tách

So với hai kỹ thuật trên, kỹ thuật SPE phức tạp và chi phí tốn kém hơn, nhưng nền mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu Tuy nhiên do chi phí tương đối cao nên hiện nay kỹ thuật này ở Việt Nam chưa được sử dụng nhiều để chiết mẫu huyết tương

Sau khi khảo sát căn cứ vào hiệu suất chiết hoạt chất, độ lặp lại giữa các lần chiết, thời gian chiết, tính kinh tế,… để lựa chọn quy trình xử lý mẫu huyết tương tối ưu nhất

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói riêng Mục đích của thẩm định là chứng minh phương pháp đủ độ nhạy, độ tin cậy

và lặp lại tốt

Hiện nay, có khá nhiều hướng dẫn về việc thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học [11], [12], [17], như của tổ chức FDA (2013), EMA (2011)

ASEAN hoặc trong dược điển các nước, quy định về cách tiến hành và phương pháp đánh giá không khác nhau nhiều Theo hướng dẫn của FDA và EMA thẩm

định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học gồm các chỉ tiêu sau:

1.3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống

Nguyên tắc: Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng

độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic (độ phân giải, hệ số đối xứng,

số đĩa lý thuyết, ) của các lần sắc ký

Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 2,0% và diện tích pic phải ≤ 5,0%

nếu không có quy định khác Trường hợp giá trị RSD>5%, phải có sự giải thích phù hợp

1.3.2.2 Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Một phương pháp được coi là chọn lọc với chất phân tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ AN tương ứng với nồng độ thấp nhất của đường chuẩn), các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn với các pic tạp, tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng trên ít nhất 6 nguồn gốc khác nhau so với mẫu chuẩn tại thời gian lưu AN phải không vượt quá 20%, tại thời gian lưu IS phải không vượt quá 5%

1.3.2.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp

phân tích sinh học có thể phát hiện từ nhiễu nền một cách đáng tin cậy (S/N=3)

Giới hạn định lượng dưới là nồng độ thấp nhất của chất cần thử có thể định lượng được với độ đúng và độ lặp lại thích hợp LLOQ được chấp nhận nếu đáp ứng

của chất phân tích phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

Phân tích các mẫu chứa chất phân tích ở nồng độ LLOQ và LOD đã chuẩn bị ở

trên

Yêu cầu: Với LOD tỷ số S/N=3, với LLOQ đáp ứng pic của chất phân tích

trên mẫu LLOQ ít nhất bằng 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng Độ đúng phải đạt từ

80-120%, RSD độ lặp lại phải ≤20%

1.3.2.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Mối quan hệ tỷ số diện tích pic AN/IS với nồng độ của AN được đánh giá bằng phương trình hồi quy Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp đến cao nhất trên đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

Để thiết lập mối tương quan giữa nồng độ của chất chuẩn với đáp ứng của thiết bị phân tích, số lượng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm 1 mẫu trắng, một mẫu trắng có chuẩn nội và ít nhất 6 điểm chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát phải bao hàm được khoảng nồng độ có thể đạt được trong quá trình phân tích mẫu

Theo FDAđường chuẩn nên là đường đơn giản nhất mô tả chính xác mỗi quan

hệ giữa nồng độ và đáp ứng đo được Khi phân tích dịch sinh học, khoảng nồng độ chất phân tích thường rộng và trải dài trên nhiều khoảng tuyến tính khác nhau Một đường hồi quy tuyến tính không sử dụng trọng số sẽ tạo ra sai số lớn vì mô hình này giả định SD tương đương nhau trên toàn bộ phạm vi của các mẫu Trong một đường cong hiệu chuẩn điển hình, phương sai (SD2) tăng khi tăng nồng độ Giải pháp để nâng cao độ chính xác cho các dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất là sử dụng trọng số

Từ kết quả phân tích, dùng T-test để xác định mức độ đồng nhất của tập hợp kết quả thu được trên hai mức nồng độ LLOQ và ULOQ, nếu kết quả F test cho thấy không có sự khác biệt giữa giá trị SD2 ở hai nồng độ thì không cần sử dụng trọng số và ngược lại Hệ số trọng số phù hợp (1, 1/x, 1/x2 , 1/x1/2) là hệ số mô tả tốt nhất tương quan giữa đáp ứng pic và nồng độ của chất chuẩn ( tổng phần dư của độ đúng là nhỏ nhất) Theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, tiến hành tính tổng phần

dư độ đúng để chọn hệ số weighting phù hợp nếu F-test cho thấy có sự khác biệt giữa giá trị SD ở hai nồng độ LLOQ và ULOQ

Yêu cầu: Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85%-115%, trừ

tại điểm LLOQ được chấp nhận 80%-120% Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và Cmax đạt tiêu chuẩn Khoảng tuyến tính có hệ số r≥0,95

1.3.2.5 Độ nhiễm chéo

Chuẩn bị và xử lý các mẫu sau theo quy trình: 6 mẫu HT trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong HT ở nồng độ ULOQ, 6 mẫu chuẩn pha trong HT ở nồng độ LLOQ Tiêm mẫu 6 LLOQ trước, rồi tiêm xen kẽ các các mẫu trắng sau mẫu ULOQ Ghi lại sắc

ký đồ và đáp ứng pic

Yêu cầu: Đáp ứng của mẫu trắng ở điều kiện xác định AN tại thời điểm trùng

với tR của AN không được vượt quá 20% đáp ứng của mẫu LLOQ Đáp ứng của mẫu trắng ở điều kiện xác định IS tại thời điểm trùng với tR của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của mẫu LLOQ

1.3.2.6 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Độ lặp lại là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị RSD% Độ lặp lại bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày

Yêu cầu: Với mỗi nồng độ độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%,

riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận từ 80% đến 120% Độ lặp lại trong ngày giá trị RSD% phải ≤15% Riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận ≤20% Độ lặp lại khác ngày giá trị RSD% phải ≤ 15%, riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận ≤ 20%

1.3.2.7 Tỷ lệ thu hồi

Là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của AN và IS sau quá trình chiết tách xử

lý mẫu Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của các mẫu QC

có qua chiết tách với đáp ứng của các mẫu chuẩn không được xử lý qua chiết tách (pha trong pha động)

Yêu cầu:Tỷ lệ thu hồi không nên quá cao (dưới 110%), không nên quá thấp

(trên 30%) và ổn định (tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không được khác nhau quá 15%)

1.3.2.8 Độ ổn định

Trong các nghiên cứ SKD, TĐSH, quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng mẫu lớn Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình bảo quản và phân tích Trong quá trình thẩm định phương pháp cần thực hiện các loại ổn định sau:

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm: độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông, độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản

- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler)

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn và nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện dài ngày

Yêu cầu: các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu (trừ độ ổn định

của dung dịch) nếu giá trị nồng độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các lần phân tích không quá 15%

1.4 Sinh khả dụng

Sinh khả dụng (SKD): là đặc tính biểu thị mức độ và tốc độ hấp thu của một dược chất hoặc nhóm dược chất còn nguyên hoạt tính từ dạo bào chế vào đại tuần hoàn đưa đến nơi tác dụng[6], [31] SKD của các dạng thuốc rắn dùng theo đường uống

bị giới hạn trước hết bởi tốc độ và mức độ hòa tan của dược chất từ dạng thuốc[13]

Mức độ hấp thu được phản ánh bằng diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC) AUC cho biết tổng lượng dược chất được hấp thu từ dạng bào chế vào hệ tuần hoàn.Tốc độ hấp thu phản ánh bằng thời gian thuốc đạt cực đại (Tmax)

và nồng độ cực đại của thuốc trong máu (Cmax)

Có hai cách đánh giá sinh khả dụng in vivo: SKD tương đối và SKD tuyệt đối,

trong đó SKD tương đối hay được sử dụng trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm generic

- SKD tuyệt đối: là so sánh SKD của một thuốc ở dạng bào chế nào đó với

dạng thuốc tiêm tĩnh mạch (có SKD coi là 100%)

- SKD tương đối: là SKD của một thuốc so sánh với SKD của một thuốc khác

cùng hoạt chất không dùng đường tiêm tĩnh mạch

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương chó

2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn

Tên chất chuẩn Nơi cung cấp Số lô Hàm lượng

Fenofibrat Viện kiểm nghiệm TTW 0113295.01 99,82%

Acid fenofibric Selleck USA S452701 99,67%

Natri diclofenac Viện kiểm nghiệm TTW 0216130.02 99,83%

Bảng 2.2.Danh mục thuốc thử

1 Methanol HPLC Fisher-Hàn Quốc

2 Acetonitril HPLC Merck- Đức

3 Ethyl acetat P.A Fisher-Hàn Quốc

4 Kali dihydrophosphat P.A Merck- Đức

5 Natri hydroclorit P.A Merck- Đức

Viên nghiên cứu: Viên nang Fenofibrat 160mg do phòng bào chế - Viện công

nghệ dược phẩm Quốc Gia sản xuất

Huyết tương trắng được tách từ máu chó nuôi bình thường, không dùng thuốc trong ít nhất 1 tuần trước khi lấy máu

Huyết tương thực: được lấy ở các thời điểm nhất định sau khi cho chó uống một liều viên nghiên cứu fenofibrat (do nhóm dược lý cung cấp)

2.1.3 Thiết bị dụng cụ

Thiết bị:

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao của shimadu, cột Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm); bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45 µm); cân phân tích Mettler Toledo

XPE 105; máy lắc xoáy Vortex ZX3; máy lắc ngang GFL 3006; Máy ly tâm Herme Z306; máy bay hơi dung môi Hanon HN200; máy sinh khí nitơ; tủ lạnh âm sâu Sanyon MDF U333; Tủ sấy Memmert ULM 500; máy cất nước hai lần Hamilton

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký trên phù hợp để phân tích đồng thời FB, FA và IS bao gồm:

- Detector và bước sóng phát hiện: Chọn bước sóng sao cho tại đó đáp ứng của chất phân tích là tối ưu

- Chất chuẩn nội: Tín hiệu của chuẩn nội phải phân biệt rõ với chất phân tích và các tạp khác, có thời gian lưu và đáp ứng càng gần chất phân tích càng tốt

- Pha động: Lựa chọn thành phần tỷ lệ và tốc độ dòng cho thời gian lưu của chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp

2.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương

- Lựa chọn dung môi: ít độc hại, thông dụng, rẻ tiền

- Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu: đơn giản, nhanh, cho nền mẫu sạch, chiết được chất phân tích tốt

2.2.3 Thẩm định phương pháp định

Sau quá trình khảo sát xây dựng phương pháp, lựa chọn được phương pháp phân tích FA, FB thích hợp để tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học Chúng tôi tiến hành thẩm định độ phù hợp hệ thống, tính chọn lọc/đặc hiệu,độ nhiễm chéo,

hiệu suất chiết, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới,đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ ổn định

2.2.4 Xác định thông số dược động học viên nang fenofibrat 160mg

Sử dụng động vật thí nghiệm như mục 2.1.4 Cho chó nhịn ăn 24h rồi cho uống một liều đơn viên nghiên cứu fenofibrat Mẫu máu được lấy ra từ tĩnh mạch cổ ở thời điểm trước khi uống thuốc và 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 12;

24 giờ sau khi uống thuốc, thêm chất chống đông heparin Huyết tương được tách ra từ mỗi mẫu bằng cách ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút và bảo quản đông lạnh ở -30°C cho đến khi phân tích [18] [20]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượngFB và FA trong huyết tương chó

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu phân tích

 Chuẩn bị các dung dịch gốc trong MeOH :

+ Dung dịch chuẩn gốc FA (FB): Cân chính xác một lượng FA (FB) pha vào MeOH để được dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml

+ Dung dịch chuẩn nội gốc natri diclofenac (IS): Cân chính xác một lượng IS, pha vào MeOH để được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 1mg/ml + Dung dịch QC gốc FA (FB): Cân chính xác một lượng FA (FB) pha vào MeOH để được dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml

 Các dung dịch làm việc:

+ Chuẩn làm việc 1 có nồng độ 50µg/ml: Pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn gốc

FA (FB) bằng MeOH để thu được chuẩn làm việc 1

+ Chuẩn làm việc 2 nồng độ 5µg/ml: Pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn làm việc 1 của FA (FB) bằng MeOH để thu được chuẩn làm việc 2

+ Chuẩn nội làm việc: Pha loãng IS gốc 10 lần bằng MeOH thu được IS làm việc có nồng độ 100µg/ml

+ Pha tương tự như các chuẩn làm việc 1 và 2 để thu được các QC làm việc của

FA (FB) có nồng độ 5µg/ml và 50µg/ml

 Chuẩn bị các dung dịch trong huyết tương:

+ Dãy đường chuẩn FA: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FA có nồng độ 5µg/ml và 50µg/ml, pha thành dãy chuẩn FA có nồng độ trong huyết tương bằng: 0,1: 0,2; 0,5; 1; 10; 50 (µg/ml)

+ Dãy đường chuẩn FB: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FB có nồng độ 5µg/ml và 50 µg/ml, pha thành dãy chuẩn FB có nồng độ trong huyết tương bằng: 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 50 (µg/ml)

+ Mẫu QC kiểm tra: Từ các dung dịch QC làm việc pha thành 3 dung dịch hỗn hợp QC có nồng độ trong huyết tương lần lượt là LQC, MQC, HQC

Bảng 2.3 Bảng nồng độ các mẫu QC

Mẫu QC Mã Khoảng nồng độ Giá trị (µg/ml)

FA FB Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC ≤ 3 x LLOQ 0,2 0,5 Mẫu kiểm tra nồng độ

trung bình MQC

Gần điểm giữa của đường chuẩn 25 25 Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC 70% - 80% ULOQ 40 40 Các dung dịch trong huyết tương tiếp tục được đưa vào xử lý để thu được các dung dịch tiêm sắc ký theo quy trình xử lý mẫu dưới đây

 Quy trình xử lý mẫu :

Mẫu trắng: Hút 1 ml HT trắng, cho thêm 100µl dung dịch chuẩn IS (100µg/ml) và 0,5ml dung dịch NaCl bão hòa vào lắc đều 5 giây Sau đó chiết bằng 5ml dung môi EtOAc, lắc ngang 15 phút tốc độ 300 lần/phút, ly tâm 20 phút tốc độ

5500 vòng/phút Hút 3ml lớp dung môi hữu cơ cô nitơ ở nhiệt độ phòng tới cắn Hòa tan cắn trong 1,0ml pha động, MeOH: đệm phosphat pH3 (0,01M) = 70: 30, sau đó tiến hành chạy sắc ký

Mẫu thẩm định: Hút các dung dịch chuẩn làm việc với thể tích tương đương với lượng cần dùng, cô cạn dưới dòng khí nitơ Thêm 1ml HT trắng, voltex 60s và tiến hành tương tự như quy trình chiết mẫu trắng

Mẫu thực: Sử dụng 1 ml mẫu HT thực chiết theo quy trình xử lý mẫu trắng

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích FB, FA

 Độ chọn lọc :

Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, 06 mẫu chuẩn trong huyết tương có chứa FB, FA ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội Ghi lại sắc ký đồ

và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu FB, FA, IS

 Độ nhiễm chéo

Chuẩn bị và xử lý các mẫu sau theo quy trình: 6 mẫu HT trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong HT ở nồng độ ULOQ, 6 mẫu chuẩn pha trong HT ở nồng độ LLOQ Tiêm mẫu 6 LLOQ trước, rồi tiêm xen kẽ các các mẫu trắng sau mẫu ULOQ Ghi lại sắc

ký đồ và đáp ứng pic

 Hiệu suất chiết

Chuẩn bị các lô mẫu QC trên nền mẫu huyết tương, mỗi lô gồm 06 mẫu độc lập, song song chuẩn bị các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha động có nồng độ tương ứng mẫu QC Phân tích các mẫu QC theo phương pháp đã xây dựng Định lượng trực tiếp các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua giai đoạn chiết tách Hiệu suất chiết được tính bằng tỷ lệ diện tích peak của chất phân tích trong mẫu trải qua chiết tách so với diện tích peak trong mẫu chuẩn trong pha động không qua quy trình xử lý chia cho hệ số thu hồi

 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính :

Từ dung dịch gốc của các chất chuẩn nghiên cứu tiến hành pha một dãy ít nhất

5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảng tuyến tính cần khảo sát Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn làm được giữ hằng định Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan

hệ giữa tỉ lệ diện tích píc chất chuẩn/chuẩn nội (Ss/Sis) và nồng độ chất chuẩn Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax+b và hệ số tương quan r từ đó kết luận tuyến tính của phương pháp

 Giới hạn phát hiện LOD, LOQ

Được tính dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường tuyến tính LOD được tính theo công thức : LOD = 3,3 x S/a

Trong đó, S là độ lệch chuẩn của đáp ứng và a là hệ số góc của đường chuẩn

Từ kết quả đường chuẩn xác định độ tuyến tính, tính toán được giá trị LOD.LOQ là một thông số quan trọng của phép định lượng các chất có nồng độ thấp trong mẫu LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp LOQ được tính theo giá trị LOD theo công thức: LOQ = 3,3 x LOD

 Độ ổn định

 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35 ± 50C và để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu đông trở lại trong 12 – 24 giờ Lặp lại chu kỳ đông rã 2 lần nữa Sau 3 chu kỳ đông – rã 2 lần nữa, tiến hành phân tích xác định nồng độ FB,

FA có trong mẫu So sánh kết quả xác định nồng độ FB, FA có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu)

 Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 6 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông

Nồng độ FB, FA trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

 Độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian dài

Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35 ± 50

C, phân tích mẫu ở thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định khoảng sau 30 ngày So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu

Nồng độ FB, FA trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto – sampler)

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong auto – samplersau một thời gian xác định (khoảng 15 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý

Nồng độ FB, FA trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

C cho đến khi định lượng (tối đa 30 ngày) Trước khi phân tích thì phải ngâm trong nước ở nhiệt độ phòng để rã đông huyết tương

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm tóan học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán : kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

Các thông số dược động C maxvà T maxcủa thuốc được xác định trực tiếp theo đường cong nồng độ theo thời gian Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC) được tính theo công thức:

[ ] ∑ ( ) ( )

Với Ci là nồng độ FA trong HT tại thời điểm ti; Cn là nồng độ dược chất tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn có thể định lượng được Thông thường Cn rất nhỏ,

lấy mẫu cuối cùng tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của lnC theo thời gian

λz được tính từ độ dốc đường cong logarit nồng độ dược chất trong HT theo

thời gian tại những điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ

Chương 3 THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp

 Khảo sát pha động :

Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động là MeOH: đệm phosphat pH3 và MeCN: đệm phosphat pH3 với tỷ lệ 70: 30 và tốc độ 1 ml/phút thu được sắc ký đồ dưới đây:

Hình 3.2 Sắc ký đồ thu được khi chạy MeCN: đệm phosphat pH3

Hình 3.3 Sắc ký đồ thu được khi chạy MeOH: đệm phosphat pH3

Hệ pha động MeOH: đệm phosphat 0,01M pH3 (70:30) cho đường nền ít nhiễu hơn, các pic tách tốt hơn nên chúng tôi sử dụng hệ này để tiến hành các khảo sát tiếp theo

Tuy nhiên với hệ MeOH: đệm phosphat pH3 (= 70: 30) thời gian lưu của FB quá dài (32,4 phút), do đó chúng tôi thay đổi tỷ lệ dung môi (80: 20 và 90: 10) nhằm rút ngắn thời gian lưu Các hình dưới đây là sắc ký đồ thu được:

Hình 3.4 Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20

Hình 3.5 Sắc ký đồ thu được khi chạy hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10

Kết quả khảo sát cho thấy ở tỷ lệ 80: 20 thời gian lưu của FB vẫn dài (18,3 phút), còn ở tỷ lệ 90: 10 pic FA và IS chưa tách hoàn toàn, do đó chúng tôi tiến hành tăng tốc độ dòng lên 1,5 ml/phút và chạy chương trình chạy gradient theo chương trình được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Chương trình gradient

Thời gian MeOH: đệm phosphat pH3 (0,01M)0→12,5 70: 30→ 90: 10

12,5→13,5 90: 10→ 70: 30Sắc ký đồ thu được khi chạy chương trình gradient như sau:

Hình 3.6 Sắc ký đồ thu được khi chạy chương trình gradient