nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và độc tính cấp của chè hàng rào (acalypha siamensis oliv ex goge)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI SENGPHACHANH XAYAVONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CHÈ HÀNG RÀO Acalypha siamensis O

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

SENGPHACHANH XAYAVONG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA

CHÈ HÀNG RÀO

(Acalypha siamensis Oliv ex Goge)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

SENGPHACHANH XAYAVONG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA

CHÈ HÀNG RÀO

(Acalypha siamensis Oliv ex Goge)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Vũ Văn Điền

2 PGS.TS Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI 2018

Tôi cũng nhận được sự giúp đỡ chu đáo hết lòng của Ban Giám hiệu Nhà trường, phòng Sau Đại học đã luôn luôn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Vậy tôi xin chân thành cảm ơn và bày tỏ lòng yêu mến tới PGS.TS Vũ Văn Điền và PGS.TS Đỗ Thị Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên, khích lệ dành thời gian trao đổi và định hướng trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Do điều kiện chủ quan và khách quan, chắc chắn luận văn còn có nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý của các thầy cô và hội đồng

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng 9 năm 2018

Học viên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI ACALYPHA 3

1.1.1.Thực vật học 3

1.1.2 Thành phần hóa học 6

1.1.3 Tác dụng và công dụng 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHÈ HÀNG RÀO 14

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 14

1.2.2 Thành phần hóa học 16

1.2.3 Tác dụng sinh học và công dụng 16

1.3 VẤN ĐỀ CẦN GIẢI QUYẾT 17

PHẦN 2:NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 21

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 22

2.2.3 Phương pháp thử độc tính cấp 31

PHẦN 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT 33

3.1.1 Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài nghiên cứu 33

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu Chè hàng rào 35

3.1.3 Đặc điểm bột loài Acalypha siamensis Oliv ex Goge 36

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 38

3.2.1.Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 38

3.2.2 Chiết xuất phân lập một số thành phần trong Chè hàng rào 39

3.3.THỬ ĐỘC TÍNH CẤP 49

3.3.1.Thử nghiệm thăm dò liều 49

3.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp 49

PHẦN 4:BÀN LUẬN 51

4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 51

4.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học của loài nghiên cứu 51

4.1.2 Đặc điểm vi học của loài nghiên cứu 53

4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 53

4.2.1 Phương pháp nghiên cứu 53

4.2.2 Định tính 55

4.2.3 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất 55

4.3 VỀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CHÈ HÀNG RÀO 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APCI-MS : Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectroscopy BuOH : Butanol

13C-NMR : Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13)

CC : Columm Chromatography (Sắc ký cột)

CTC : Cao phần trên mặt đất Chè hàng rào chiết cồn

COSY : Correlation Spectroscopy

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ESI-MS : ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy( Phổ khối lượng) EtOAc : Ethyl acetat

EtOH : Ethanol

1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC : Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Tóm tắt thành phần hóa học của chi Acalypha 7 Bảng 1.2 Tác dụng chống gốc tự do của một số loài thuộc chi Acalypha 13

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ của chè hàng rào 38

Bảng3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất

benzyl-O-β-D-glucopyranosid 44

Bảng3.3 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất

n-butyl-O-β-D-fructofuranosid 46 Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất acid gallic 47 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp của cao Chè hàng rào 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Ảnh Chè hàng rào 15

Hình 1.2 Cấu trúc của Acalyphaser A 16

Hình 2.1 Ảnh chụp mẫu nghiên cứu 18

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn 29

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của Chè hàng rào 34

Hình 3.2 Vi phẫu gân lá (A) 35

Hình 3.3 Vi phẫu thân Chè hàng rào 36

Hình 3.4 Đặc điểm bột lá Chè hàng rào 37

Hình 3.5 Đặc điểm bột thân Chè hàng rào 38

Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn của Chè hàng rào 41

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình phân lập hợp chất từ phân đoạn n-butanol của Chè hàng rào 43

Hình 3.8 Cấu trúc của benzyl-O-β-D-glucopyranosid 45

Hình 3.9 Cấu trúc của n-butyl-O-β-D-fructofuranosid 47

Hình 3.10 Cấu trúc của acid gallic 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật rất phong phú và

đa dạng Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung cấp nguyên liệu cho nền y học cổ truyền với hơn 4000 loài cây đã được biết dùng làm thuốc ở Việt Nam Nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng dược liệu phong phú của đồng bào vẫn là kho tàng quý giá để khám phá, tìm kiếm các loại thuốc mới có hiệu lực trong phòng và chữa bệnh Ngày nay, xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất

tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể

Chè hàng rào, còn gọi là Trà cọc rào, Chè mãn hảo, Chè tàu, có

tên khoa học là: Acalypha siamensis Oliv ex Goge thuộc họ: Thầu dầu

(Euphorbiaceae) Đây là loại thực vật đặc hữu của khu vực nhiệt đới châu Á, từ lâu đã được nhân dân các nước sử dụng làm trà uống, có tác dụng lợi tiểu, cũng được sử dụng làm thuốc tẩy, trị giun, long đờm, gây nôn[10], [63] Trên thế giới đã có một vài công trình nghiên cứu về loài

Chè hàng rào (A siamensis) nhưng chưa thật sự đầy đủ[17]

Chính vì những lý do đó, nhằm mục đích tìm hiểu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học củaChè hàng rào, để có thêm tri thức và nâng cao giá trị sử dụng cây thuốc, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và độc tính

cấp củaChè hàng rào (Acalypha siamensis Oliv ex Goge)" với mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học loài Chè hàng rào thu hái tại Nghệ An

2 Định tính các nhóm chất hữu cơ, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 3-4 hợp chất từ Chè hàng rào

3 Nghiên cứu sơ bộ độc tính cấp của Chè hàng rào

Để đạt được mục tiêu đề ra, luận văn được tiến hành với các nội dung sau:

Về thực vật:

- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật loài Chè hàng rào thu hái tại Nghệ An

- Giám định tên khoa học của loài Chè hàng rào

- Mô tả đặc điểm vi phẫu và đặc điểm vi học bột của thân, lá của Chè hàng rào

Về hóa học:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ phần trên mặt đất của Chè hàng rào

- Chiết xuất, phân lập và nhận dạng 3-4 hợp chất từ Chè hàng rào

Về thử độc tính

-Đánh giá độc tính cấp cao chiết EtOH của Chè hàng rào

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI ACALYPHA

Đặc điểm thực vật

Cây thảo hay cây nhỡ: Lá mọc so le có lá kèm Hoa cùng gốc hay khác gốc, xếp thành bông Đài của hoa đực có 4 phiến bao quanh 8-16 nhị có chỉ nhị dính ở gốc và có bao phấn đính ở phía trên đỉnh của chỉ nhị Hoa cái có 3 phiến đài bao quanh bầu có 3 ô và 3 vòi nhụy chia ra thành đầu nhụy, màu đỏ

và mảnh Quả nang có 3 ô [10]

Phân bố

Khoảng 430 loài ở các miền nhiệt đới và nóng Nhiều loài được trồng rộng rãi làm cây cảnh Ở Việt Nam ghi nhận sự hiện diện của 9 loài [10]

Đặc điểm một số loài thuộc chi Acalypha

A indica L - Tai tượng xanh: Cây thảo, cao khoảng 40-50 cm, phân

cành ngay từ gốc Thân và cành có lông ngắn, có rãnh Lá mọc so le, hình trái xoan, gốc hình nêm, đầu tù, dài 3,5-5 cm, rộng 2,5-4 cm, mỏng, nhăn, mép

khía răng cưa ở quãng giữa đến đầu lá, gân gốc 5, cuống lá dài 3,5-7,5 cm; lá kèm rụng sớm Cụm hoa mọc ở kẽ lá, đơn độc hoặc tụ họp ít hoa trên cuống dài 4-8 cm, gồm hoa đực ở trên, hoa cái ở dưới; hoa đực có 4 lá đài, 8 nhị; hoa cái có lá đài có lông mi ở mép, bầu có lông Quả nang có lông, hạt hình trứng Mùa hoa quả: tháng 6-7 trong năm Tai tượng xanh phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới, từ khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc tới châu Phi Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm ở các bãi hoang trên đường đi, nương rẫy và ruộng mới bỏ hoang ở miền núi [9]

A wilkesiana Muell.Arg - Tai tượng đỏ: cây nhỏ, cao vài mét Lá mọc

so le, hình trái xoan hoặc hình trứng, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, màu lục hoặc đỏ loang lổ, mép khía răng Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông ngắn hơn lá; hoa đơn tính; hoa đực có 4 lá dài, 8 - 16 nhị; hoa cái có 3 lá đài bao quanh, bầu 3 ô Quả nang Tai tượng đỏ thuộc loài cây ưa sáng và có thể sống trên nhiều loại đất.Cây trồng ở nơi được chiếu sáng đầy đủ lá có màu đỏ thẫm Ngược lại, cây mọc ở nơi bị che bóng nhiều màu đỏ của lá sẽ nhạt hơn Tai tượng đỏ sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa nhiều nhưng hầu như không đậu quả Cây có hiện tượng rụng lá và ngừng sinh trưởng do ảnh hưởng của thời tiết lạnh mùa đông [9]

A australis L - Tai tượng Úc : Cây thảo hàng năm, cao 30-60 cm,

phân nhánh ít Lá có hình phiến nhỏ, mỏng, hình bầu dục , hình mác dạng bầu dục, hình quả trám dạng trứng, dài 2,5-8 cm, rộng 1,5-3,5 cm, hai mặt có lông mềm hoặc không lông; gân gốc 3, gân bên 4-5 đôi; cuống lá dài 1-3 cm; lá kèm hình kim cao Hoa đơn tính, cùng gốc , không có cánh, cụm hoa dạng bông ở nách lá Hoa cái có 3 lá đài, bầu 3 ô, phủ lông thưa, có 3 vòi nhụy, xẻ đến tận gốc Hoa đực ở phía ngọn, có 4 lá đài hình bầu dục, 8 nhị có bao phấn hình ống thuôn Quả có 3 mảnh có lông ở gốc, đường kính 3-4 mm Cây mọc

ở các bãi đất, trên các đồi ở miền trung du lên đến độ cao 1500 m Cây ưa

sáng, ẩm Ra hoa tháng 4-8, có quả tháng 9-11 trong năm Phân bố ở Nga, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Philippin và Australia [10]

A brachystachya Hornem - Tai tượng đuôi ngắn: Cây thảo cao 30-50

cm, có nhánh hay không, thân và cành có rãnh, phủ lông ngắn Lá hình bầu dục, dài 2-6 cm, rộng 1-4 cm, đầu thuôn tù, gốc tròn hay hình tim, mép có răng to; gân từ gốc 3-5, gân bên 2-3 đôi, cuống lá rất mảnh, dài 1,5-6 cm; lá kèm hình dải nhọn, dài 4-5 mm Cụm hoa ở nách lá tạo hành bông ngắn; hoa cái ở gốc, hoa đực ở ngọn, có phủ lông tơ Lá bắc xanh chia 3 thùy, cao

7 mm, mép có lông Hoa đực có 7-8 nhị; hoa cái có bầu hình cầu, có lông, 3 vòi nhụy chẻ 3-5 Quả nang có 3 mánh, phủ lông nhung; 3 hạt hình trứng , màu cam, có mồng hình dải Cây mọc dọc đường đi, đất hoang quanh nhà hoặc ngoài đồng Ra hoa vào tháng 6 Phân bố tại các vùng nhiệt đới châu Á hoặc châu Phi [10]

A grandis Benth - Tai tượng gai: Cây thảo thân 1-5 m Lá có phiến

hình trái xoan thon, dài 12-13 cm, rộng 5,5-10 cm, đầu nhọn, gốc tròn hay hình tim, mỏng, có lông thưa ở cả 2 mặt, gân từ gốc 7-9, mép có răng to; cuống lá dài 3-6 cm, lá kèm hình mác, dài 15 mm Hoa họp thành bông, thường xếp 1-4 cái ở nách lá, hoa đực ở trên, hoa cái ở dưới, hoa đực có 8 nhị, hoa cái có lá bắc và bầu có lông Quả nang rộng 3 mm, lá bắc rộng 4-5 mm Cây mọc dọc đường đi, gần nhà, ở bình nguyên Phân bố ở các vùng nhiệt đới châu Á [10]

A hispida Burm f - Tai tương đuôi chồn: cây nhỏ hay cây bụi, cao

1-1,5 m, vỏ màu nâu xanh Lá mọc so le, phiến xoan hay bầu dục thuôn, dài

8-15 cm, đầu nhọn, gốc tròn hay hình tim, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông thưa, nhất là trên các gân, màu lục bóng, cuống lá dài 2-3 cm Cụm hoa dạng bông

ở nách lá, dài 20-40 cm, mọc thòng xuống, xù xì, màu đỏ tươi; hoa cái ở nách

một lá bắc có răng to, vòi nhụy như chổi, màu đỏ, bầu có lông Phân bố từ Ấn

Độ, Sri lanka đến New Zealand [10]

A lanceolata Willd - Tai tượng lá mác: Cây thảo hàng năm, cao 40-50

cm, thân có rãnh mịn, màu xanh, có lông mềm Lá dàng màng, hình trứng, ít khi hình mác, dài 5-8 cm, rộng 3-4,5 cm, đầu nhọn, gốc tù hay gần tròn, mép

có răng cưa, hai mặt có lông nhung ngắn; gân gốc 5-7; cuống lá mảnh, dài 4-7

cm, có lông Cụm hoa xếp thành 1-3 cái ở nách lá, dài 1,5-4 cm, có lông mềm Hoa đực ở 1/4 trên, hoa cái ở dưới Hoa đực có 4 lá đài, hình trứng, dài 0,5

mm, 10 nhị; hoa cái có lá bắc tròn, rộng 2,5-4 mm, có lông ở mặt lưng Ở đỉnh có 9-14 răng, bầu hình cầu, có lông thô; vòi nhụy 3, chia 3-6 đầu nhụy Quả nang có đường kính 2,5 mm, có lông mềm ở ngoài; hạt hình trứng, dài 1,5 mm Cây mọc ở các bãi hoang, ra hoa tháng 5-6 Phân bố tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Sri Lanka, Lào, Campuchia, Mianma, Malaysia, Phillipin[10]

acalypha, trong đó có khoảng 16 hợp chất từ 8 loài được chứng minh là có

hoạt tính sinh học [52]

Bảng 1.1.Tóm tắt thành phần hóa học của chi Acalypha

Tài liệu trích dẫn

A alnifolia

Kleinex Willd

Tannin,steroid, flavonoid, glycosid tim, carbohydrat, protein,phenolic, amino acid

cyanoacetylurea;4(2methylamino)ethyl pyridin; 1-alanin;

N-(1-oxopoenyl);methyl ester;

3,5-dimethyl-1-Dimethyl phenylsilyloxybenzen;phenol;

4-4’-methylenebis dimethyl), ethanon;

(2,6-1-(4-methoxy-3-(4-methyl phenoxy)phenyl;myo-inositol;

trihydroxy-6-methyanthracen-dimethoxy-1,4-benzoquinon;

nicotinic acid ; protocatchuic acid; daucosterol; 3,4,5-trihydroxybenzoic acid ;rutin;

butanedioic acid;

1-(2-[21], [59]

hydroxy-4,6dimethoxyphenyl) ethanon

A.brachystachya

Hornem

1,3,8-9,10-dion; acid1,2benzenedi carboxylic; 1,2-dibutyl ester;

trihydroxy-6-methyanthracen-1,2-benzenedicarboxylic acid;

1,2-bis (2-methylpropyl) ester;

lignoceric salicylat acid;

spinasterol; oleanolic acid ;

ursolic acid; 3-β-hydroxyolean -11-en-28; 13-β-olid; squalen

[50]

A communis

Müll.Arg

16 hydroxymollic; 15 hydroxymollic; acid 7-β,16-β-

A hispida

Burm.f

Phenolic, glycosid, flavonoid, steroid, saponin

Quercetin3-O-rutinosid;

kaempferol 3-O-rutinosid

[28], [40]

A indica L Phenolic, tannin,

alcaloid,saponin steroid,

flavonoid

acalyphin; tri-O-methylellagic acid; cyanogenic glycosid;

triacetonamin, acalyphamid, quebrachitol

[40], [68]

A manniana

Müll.Arg

Alcaloid, phenol, flavonoid,

anthraquinon, anthocyaninn, tannin, steroid

-

[28]

A.monostachya

Cav

Phenolic octadecanal; palmitic methyl

ester acid; linoleic methyl ester acid; phytol; eicos-9-en-1; 20-diacetat; vitamin E

[16], [40]

E-2-methyl-4-undecen; ledol;

cis-3-hexenyl benzoat;

2-methyl-1-octadecen; E,Z-3, 13-octadecadien-1-ol; acetat;

[28], [29]

A torta Muell Alcaloid,

flavonoid, saponin, tannin,resin và carbohydrat

-

[23], [44]

A wilkesiana

Müll.Arg

Tannin,coumarin, terpen,

flavonoid, glycosidic flavonoid

3,4,5-trihydroxybenzoic acid ; corilagin; geraniin

[40], [58]

1.1.3 Tác dụng và công dụng

1.1.3.1 Công dụng trong dân gian

Loài tai tượng Úc A australis được người dân sử dụng toàn cây để

chữa chảy máu cam, thổ huyết, đái ra máu, tử cung xuất huyết, bần dập do chấn thương, lỵ trực khuẩn, lỵ amip, viêm ruột, viêm da, mẩn ngứa Ở Vân Nam Trung Quốc, loài này còn được sử dụng để chữa cam tích và chướng bụng [10]

Loài tai tượng đuôi ngắn A brachystachya được người Trung Quốc sử dụng để chữa lỵ Loài tai tượng gai A grandis người Indonesia dùng để trị tưa

lưỡi, trị tiêu chảy, chữa các loại nhọt và ngứa ở tay và chân [10]

Người Ấn Độ dùng hoa của loài tai tượng đuôi chồn để chữa tiêu chảy, còn lá giã đắp mụn nhọt và lở do bệnh phong Người Malaysia thì dùng nước sắc lá và hoa để làm dịu đau vết thương hay nhọt, hoặc uống để nhuận tràng

và lợi tiểu trong bệnh lậu Vỏ cây có tác dụng long đờm dùng trị ho và bệnh hen [10]

Loài tai tượng xanh được sử dụng trong dân gian để chữa viêm khí quản, viêm phổi, hen suyễn và táo bón Lá được dùng ngoài, trị bệnh ngoài

da, ghẻ ngứa, rắn cắn Toàn cây loài tai tượng lá mác dùng để đốt nóng lấy hơi xông chữa nhức đầu[10]

Nhân dân ta dùng cành lá loài tai tượng đỏ để làm thuốc nhuận tràng, trừ giun, trị ghẻ và chữa tê thấp[10] Ở Trung Quốc, rễ cây được dùng để chữa giun đũa, đầy bụng, phong thấp đau nhức xương và thủy thũng; lá được dùng ngoài để trị ghẻ ngứa, mụn nhọt; hoa để trị bỏng lửa[10]

1.1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Tác dụng chống vi sinh vật

Cắn MeOH chiết từ phần trên mặt đất loài Acalypha communis

Müll.Arg Nhóm của Postigo và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm sợi

tơ (Microsporum và Trichophyton) đáng kể (giá trị MIC trong khoảng

250-500 μg/mL)[64] Nhóm Das và cộng sự cũng báo cáo tác dụng ức chế

Enterococcus kháng vancomycin và Staphylococcus kháng methicillin của

một số triterpen phân lập từ phần trên mặt đất loài này[20]

Cắn cồn chiết từ loài Acalypha hispida Burm.f Được tìm thấy có tác dụng ức chế mạnh sự sinh trưởng của Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Salmonella typhii[45] Thử nghiệm của

Bokshi và cộng sự năm 2012 bằng kỹ thuật đĩa khuyếch tán cho thấy cắn

ethanol A hispida có tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ đối với rất nhiều

chủng vi khuẩn gram dương và gram âm[15]

Năm 2012, Nino và cộng sự đã tiến hành thử hoạt tính chống vi khuẩn

và chống nấm của cắn n-hexan, cắn dichloromethan và cắn MeOH chiết từ loài Acalypha diversifolia Jacq đối với các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albican, Aspergillus fumigatus và Fusarium solani Kết quả cho thấy cắn dichloromethan có tác dụng ức chế Fusarium solani (MIC =

1 mg/mL) còn cắn MeOH có tác dụng ức chế Pseudomonas aeruginosa

(MIC= 4 mg/mL)[39]

Tác dụng chống oxy hóa

Nhiều loài thuộc chi Acalypha đã được tìm thấy tác dụng chống oxy

hóa Bảng 1.2 thống kê các nghiên cứu đã được thực hiện về tác dụng chống

oxy hóa của các loài thuộc chi Acalypha

Bảng 1.2 Tác dụng chống gốc tự do của một số loài thuộc chi Acalypha

Tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư

Madlener và cộng sự (2009) và Svacinova (2011) đã báo cáo tác dụng

chống ung thư của rễ, thân, lá, cụm hoa loài Acalypha alopecuroidea Jacq

Sau khi chiết xuất với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Cắn MeOH-tetrahydrofuran (1:1) của phần rễ cho tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, bao gồm dòng tế bào ung thư vú, tế bào bạch cầu lympho người (CEM) và tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) [36], [53]

Loài Acalypha indica L Từ lâu đã được biết đến tác dụng chống khối

u Nghiên cứu của nhóm Amarnath và cộng sự năm 2013 trên dòng tế bào ung

thư tiền liệt người (PC3) việc kết hợp cắn nước A indica với vi hạt

chitosan-casein làm cải thiện đáng kể hiệu quả ức chế ung thư so với việc dùng cắn nước đơn độc[13]

Tác dụng chống viêm

Nhóm Zavala-Sánchez và cộng sự đã thử tác dụng chống viêm trên mô

hình gây phù bàn chân chuột băng carrageenan của loài Acalypha alopecuroidea Jacq Kết quả cho thấy cắn MeOH làm giảm thể tích bàn chân

chuột 82,2±4% sau 4 giờ ở liều 200 mg/kg, so với đối chứng dương

indomethacin làm giảm thể tích 37,9±8,2% ở mức liều 4 mg/kg Cắn nước A alopecuroidea làm giảm thể tích phù 70,6±6,6% ở mức liều 200 mg/kg so với chứng dương naproxen làm giảm 46,1±7,1% ở mức liều 25 mg/kg[65]

Tác dụng hạ huyết áp

Nhóm Ezekwesili và cộng sự đã mô tả tác dụng hạ huyết áp của cao

EtOH chiết từ lá loài Acalypha torta Muell Kết quả nghiên cứu trên động vật thực nghiệm bao gồm mèo, thỏ và chuột cho thấy cao A torta có khả năng giãn cơ trơn mạch máu[23], qua đó minh chứng cho việc sử dụng loài A torta

trong dân gian để hạ huyết áp

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHÈ HÀNG RÀO

Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Chè hàng

rào hay Trà cọc rào, Chè tàu, Chè mãn hảo có tên khoa học là: Acalypha siamensis hay tên khác là: Acalvpha spenophylla A.evrardii Gage vẫn chưa có

công bố trong nước nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật (vi phẫu, soi bột), thành phần hóa học của cây

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

a Đặc điểm thực vật

Các tài liệu mô tả Chè hàng rào (Acalypha siamensis Oliv ex Goge) là

cây nhỡ, cao 1-4 m có các nhánh nhẵn Lá hình mũi mác hoặc hình thoi, thon lại và tù ở gốc và ở chóp, màu lục nhạt, có kích thước thay đổi, dài 30-60 mm, rộng 18-30 mm, rất nhẵn, mép có răng thưa ở nửa phía trên, về mỗi bên có 7-

8 răng tù, hình tam giác; cuống lá có rãnh, dài 2-10 mm Hoa thành bông ở nách lá, gần như không có cuống, nhẵn hay gần nhẵn, dài 2-5 cm; các cuống

hoa đực xếp thành xim co ở phía ngọn; các hoa cái đơn độc ở phía gốc Quả rộng 4 mm Hạt hình trứng, hơi nhọn ở đỉnh, dài 2-5 mm [10], [11]

Hình 1.1 Ảnh Chè hàng rào

b Phân bố

Trên thế giới: Là loài thực vật đặc hữu của khu vực nhiệt đới châu Á,

có thể tìm thấy ở Việt Nam, Mianma, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Lào, Singapor[10]

Tại Việt Nam: Loài này thường mọc trong rừng thưa ở độ cao khoảng

300 m, ưa đất phù sa cổ hay đất thịt, thường được tìm thấy ở các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Gia Lai, Khánh Hòa, Bình Dương, Bình Phước, Thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa - Vũng Tàu[10], [11]

1.2.2 Thành phần hóa học

Các hớp chất chính của loài A siamensis là nằm trong phần trên mặt đất của Chè hàng rào (Acalypha siamensis) là các hợp chất thuộc nhóm: flavonoid,

tannin, saponin, sterol, carotenoid, đường khử, acid amin[60]

Năm 2006, nhóm nghiên cứu của Kambara và cộng sự đã phân lập được

một tetraterpen từ loài A siamensis thu hái tại Malaysia, có tên là:

Acalyphaser A [30]

Hình 1.2 Cấu trúc của Acalyphaser A

Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào khác trên trên thế giới cũng như ở

Việt Nam công bố về thành phần hóa học Chè hàng rào (Acalypha siamensis)

1.2.3 Tác dụng sinh học và công dụng

Công dụng trong dân gian

Tại Việt Nam, Thái Lan và Malaysia, hoa và lá Chè hàng rào thường dùng nấu nước hay hãm uống như trà, là một loại thức uống có tác dụng lợi tiểu, có ích cho người bị đau lưng hay có rối loạn về thận Ngoài ra, loài này cũng được dùng làm thuốc tẩy, trị giun và làm thuốc long đờm, gây nôn [10], [63]

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư

Kambara và công sự đã khảo sát tác dụng gây độc tế bào in vitro của cắn EtOH chiết từ loài A siamensis cùng với 4 loài thực vật đặc hữu khác của Malaysia Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ có cắn EtOH từ A siamensis là có

tác dụng ức chế đáng kể dòng tế bào ung thư bạch cầu lympho P388 (cụ thể ở liều 100 µg/mL ức chế sự sinh trưởng của tế bào P388 xuống còn 44%) [30]

Tác dụng kháng khuẩn

Nghiên cứu của Wiart và cộng sự năm 2004 đã chứng minh tác dụng

kháng khuẩn của A siamensis Theo đó, cắn chiết ethyl acetat và MeOH của

A siamensis có khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của các loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, và Shigella sonnei khi đem

so sánh với đối chứng dương là streptomycin [60]

Chưa có nghiên cứu trong nước nào về tác dụng sinh học của loài

A siamensis

1.3 VẤN ĐỀ CẦN GIẢI QUYẾT

Theo tổng quan tài liệu, Chè hàng rào là cây thuốc có ở Việt Nam và một số nước trên thế giới nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ về thực vật và thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học Vì vậy, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và xác định độc tính cấp của Chè hàng rào để từ đó có thể định danh đúng tên của dược liệu, tìm ra được những hoạt chất mới, tác dụng mới có ý nghĩa trong y học và cuộc sống, góp phần tăng tính an toàn và hiệu quả sử dụng loài dược liệu này

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu ngiên cứu là toàn bộ phần trên mặt đất mang lá, hoa của cây được thu hái vào tháng 08/2017 tại xóm 13, xã Quỳnh Ngọc, huyện Quỳnh Lưu, tỉnh Nghệ An

Hình2.1 Ảnh chụp mẫu nghiên cứu

- Mẫu nghiên cứu được Ths.Nghiêm Đức Trọng-Bộ môn Thực vật

trường Đại học Dược Hà Nội Giám định tên khoa học là Acalypha siamensis

Oliv ex Goge, họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae), tiêu bản mang số hiệu:

HNIP/18520/18 và được lưu tại phòng tiêu bản Thực vật- Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội

- Mẫu nghiên cứu được cắt ngắn 3-4 cm, phơi khô hoặc sấy ở nhiệt độ

60oC đến độ ẩm ≤ 10% Mẫu được bảo quản trong túi nilon kín để phục vụ cho quá trình nghiên cứu

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

*Hóa chất và dung môi

- Các dung môi hóa chất dùng trong sắc ký, phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Các chất tẩy-nhuộm tiêu bản: Nước Javen, Cloral hydrat, đỏ son phèn, xanh methylen…

- Các dung môi gồm: EtOH 96%; MeOH; n-hexan; cloroform; ethyl acetat; n-buthanol; aceton; nước cất 1 lần

- Các thuốc thử cho phản ứng định tính: TT Diazo, FeCl3 5%, NaOH 10%

* Thiết bị, máy móc, dụng cụ

- Bể chiết siêm âm Elma S40/H

- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn trên tấm nhôm và RP-18 F254S

- Cân phân tích Ohaus

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu thử

- Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Bộ môn Dược học cổ truyền - trường Đại học Dược Hà Nội

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột đường kính từ 1-10 cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu nhám; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm; ống đong; ống đựng mẫu NMR; phễu chiết; pipet chính xác…

- Đèn soi tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) của hãng Camag

- Hệ thống cắt tiêu bản, vi phẫu thực vật

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít

- Kính hiển vi quang học Labomed Cx1, máy chụp ảnh Canon

- Máy cất quay chân không Buchi

- Máy hứng phân đoạn tự động Eyela

- Máy đo điểm chảy Gallen Kamp (Sanyo, Nhật Bản)

- Máy đo năng suất quay cực Polarimeter P3001

- Máy Nicolet 760FT-IR

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy đo phổ khối (ESI-MS)HP 5989B (Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam)

- Máy đo phổ công hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR; 13C-NMR; DEPT, COSY, NOESY, HMBC, HMQC (Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi bằng máy BRUKER AVANCE III

- Sắc ký cột (CC) được tiến hành với pha tĩnh là pha thường (Silica gel

60, 0,04-0,0 6 mm, Merck) hoặc pha đảo YMC-C18 (Fujisilisa - Nhật Bản),

và bột sắc ký Sephadex LH-20 (Sigma)

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254 (Merck-Đức)

* Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng, giống cái, chủng Swisg allrino trọng lượng 20-22 g,

do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp sử dụng cho nghiên cứu về độc tính

- Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội, 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu được nuôi dưỡng bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu thực vật học

* Nghiên cứu về hình thái: [24], [6]

+ Quan sát cây tại thực địa và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về: dạng sống; thân; lá (hình dạng phiến, chóp, gân, gốc, cuống, kích thước…); hoa (dạng cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thước, lá bắc, bộ nhị, bộ nhụy…); quả và hạt (hình dạng, màu sắc, kích thước…)

Dụng cụ sử dụng gồm: kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số, thước kẻ + Lấy mẫu toàn cây có hoa, quả, ép tiêu bản và lưu giữ tiêu bản

+ Phân tích đặc điểm của hoa, lá, căn cứ vào các khóa phân loại trong thực vật chí, xác định tên khoa học dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật

* Nghiên cứu về đặc điểm vi học:[4], [8]

+ Vi phẫu: tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 3 tính

từ đầu cành Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/2-1/3 dưới gần gốc của lá trưởng thành Sau đó, các mảnh cắt được nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển

vi

+ Soi bột: Bộ phận dùng được phơi khô, nghiền thành bột, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột qua kính hiển vi

+ Xác định tên khoa học của loài nghiên cứu dựa trên tài liệu tham khảo và so sánh với tiêu bản mẫu với sự giúp đỡ của chuyên gia phân loại thực vật của Việt Nam

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất trong dược liệu: Bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử đặc hiệu

Phương pháp: dùng các thuốc thử đặc trưng của mỗi nhóm chất để định tính các nhóm chất trong ống nghiệm Tiến hành thí nghiệm [2],[3]

a.Định tính anthranoid

Lấy 2 g bô ̣t dược liê ̣u cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml dung di ̣ch H2SO4 10% vào Đun sôi cách thủy 15 phút, lọc nóng vào bình ga ̣n Để nguô ̣i rồi lắc với 5 ml cloroform Ga ̣n lớp cloroform để làm phản ứng

* Phản ứng Borntrager

1 ml di ̣ch chiết cloroform + 1 ml dung di ̣ch NaOH 10% Lắc nhe ̣

* Phản ứng dương tính: lớp nước có màu đỏ sim

Vi thăng hoa: trải bô ̣t dược liê ̣u thành 1 lớp mỏng trong 1 nắp nhôm, đốt nhe ̣ trên đèn cồn để loa ̣i nước Đâ ̣y trên nắp nhôm 1 tấm lam kính, bên trên lam kính có miếng bông đã tẩm nước, tiếp tu ̣c đun nóng trong 5-10 phút Lấy lam kính ra để nguô ̣i soi kính hiển vi

* Phản ứng dương tính : soi trên lam kính xuất hiện những tinh thể hình kim màu vàng đến vàng cam Nếu nhỏ lên lam kính một giọt kiềm NaOH những tinh thể này sẽ tan cho một dung dịch màu hồng

b Định tính Flavonoid

Cho 5 g bột dươ ̣c liê ̣u vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml EtOH 90% Đun sôi cách thủy trong 10 phút, lo ̣c nóng Dùng di ̣ch lo ̣c để làm phản ứng

* Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda):

Cho 2 ml di ̣ch chiết vào ống nghiê ̣m, thêm 1 ít bô ̣t magie kim loa ̣i, rồi nhỏ từ từ từng gio ̣t dung di ̣ch HCl đâ ̣m đă ̣c (3-5 gio ̣t) Để yên mô ̣t vài phút

* Phản ứng dương tính: dung di ̣ch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

* Phản ứng với kiềm:

+ Phản ứng với NH3:

Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi hơ trên miệng lọ có chưa amoniac đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ dịch chiết đối chứng

* Phản ứng dương tính: màu vàng của vết di ̣ch chiết được tăng lên

+ Phản ứng với NaOH:

Cho vào ống nghiê ̣m 1 ml di ̣ch chiết, thêm vài giọt dung di ̣ch NaOH 10%

* Phản ứng dương tính: Tủa vàng thêm 1 ml muối xuất hiện màu vàng tăng lên

* Phản ứng với dung di ̣ch FeCl3 5%:

Cho vào ống nghiê ̣m 1ml di ̣ch chiết Thêm vài gio ̣t dung di ̣ch FeCl3 5% lắc nhe ̣

* Phản ứng dương tính: dung di ̣ch xuất hiê ̣n tủa xanh đen

* Phản ứng diazo hóa:

Cho 1ml di ̣ch chiết vào ống nghiê ̣m, kiềm hóa bằng dung di ̣ch NaOH 10% Thêm vài giọt thuốc thử diazoni mới pha, lắc đều, đun cách thủy vài phút

* Phản ứng dương tính: khi xuất hiê ̣n màu đỏ ga ̣ch

c Định tính coumarin

Cho 3 g bột dươ ̣c liê ̣u vào bình nón, thêm 30 ml EtOH90% Đun cách thủy sôi khoảng 3-5 phút Lo ̣c nóng, di ̣ch lo ̣c thu được đem làm phản ứng

* Phản ứng đóng mở vòng lacton:

Cho 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml di ̣ch chiết:

+ Ống 1: thêm 0,5 ml dung di ̣ch NaOH 10%

+ Ống 2: để nguyên

Đun sôi cả 2 ống nghiê ̣m, để nguô ̣i rồi quan sát

+ Ống 1: có màu vàng hoă ̣c tủa đu ̣c màu vàng

+ Ống 2: trong suốt

Thêm vào cả 2 ống nghiê ̣m mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát:

+ Ống 1: trong suốt

+ Ống 2: có tủa đu ̣c

Acid hóa bằng vài gio ̣t HCl đă ̣c, ống 1 sẽ trở la ̣i tủa như ống 2

* Phản ứng Diazo hóa:

Cho vào ống nghiê ̣m nhỏ 1 ml di ̣ch chiết, thêm vào đó 2 ml dung di ̣ch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguô ̣i Nhỏ vài gio ̣t dung di ̣ch thuốc thử diazo mới pha

* Phản ứng dương tính: xuất hiê ̣n màu đỏ ga ̣ch

Quan sát huỳnh quang các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoa ̣i khi tác

du ̣ng với dung di ̣ch kiềm:

Nhỏ vài gio ̣t coumarin lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó vài gio ̣t dung di ̣ch NaOH 5%, hơ cho khô Che 1 phần diện tích di ̣ch chiết trên giấy lo ̣c bằng 1 miếng kim loa ̣i rồi chiếu tia tử ngoa ̣i trong 1 vài phút Bỏ miếng kim loa ̣i ra, quan sát trực tiếp dưới đèn tử ngoa ̣i sẽ thấy: phần không che có huỳnh quang sáng hơn phần bi ̣ che Nếu tiếp tu ̣c chiếu tia tử ngoa ̣i, phần che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần phát huỳnh quang như nhau

d Định tính Tannin:

Cho 1 g bột dươ ̣c liê ̣u vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong khoảng 2 phút Để nguô ̣i, lo ̣c Lấy di ̣ch lo ̣c làm phản ứng;

- Ống 1: lấy 2 ml dịch lo ̣c, thêm 2 gio ̣t FeCl3 5%

Phản ứng dương tính: xuất hiê ̣n kết tủa xanh đen hoă ̣c xanh nâu nha ̣t

- Ống 2: 2 ml dịch lo ̣c, thêm 2 gio ̣t chì acetat 10% (TT)

* Phản ứng dương tính: xuất hiê ̣n kết tủa bông

- Ống 3: 2 ml dịch lo ̣c, thêm 5 gio ̣t dung di ̣ch gelatin 1%

* Phản ứng dương tính: xuất hiê ̣n tủa bông trắng

e Định tính glycosid tim

Cho khoảng 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm 60

ml EtOH 25% ngâm 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ thêm 3 ml chì acetat 30% (loại tạp chất nhầy, chất nhựa) lọc vào cốc 100 ml Nhỏ vài giọt dịch đầu tiên vào 1 ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat nếu xuất hiện tủa thì thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy lọc , thử đến khi nào không còn tủa nữa

Dịch lọc thu được cho vào bình gạn (thể tích 100 ml) lắc 2 lần với cloroform (mỗi lần 8 ml), gạn dịch chiết cloroform, loại nước (sử dụng lọc qua bông) Chia đều dịch chiết vào các ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn sau

đó tiến hành các phản ứng:

* Phản ứng Liebermann-Burchardt (phản ứng của khung steroid)

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid 1 ml anhydrid acetic, 1 ml cloroform lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid đặc, tránh xáo trộn lớp chất lỏng trong ống

* Phản ứng dương tính: xuất hiện vòng màu tím đỏ giữa hai lớp, lớp chất lỏng phía dưới có màu vàng, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá)

* Phản ứng dương tính : xuất hiện dung dịch màu đỏ (cam)

* Phản ứng Keller-kiliani ( đường 2,6-desoxy)

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml EtOH 90% Lắc đều cho tan hết Thêm vài giọt dung dịch sắt III clorid 5% trong acid acetic Lắc đều, nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml dung dịch acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn lớp chất lỏng trong ống nghiệm

* Phản ứng dương tính: giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng tím đỏ.( lắc nhẹ lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá)

* Phản ứng Xanthydrol ( phần đường 2,6-desoxy )

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml thuốc thử xanthydrol, đun sôi cách thủy 3 phút

* Phản ứng dương tính : xuất hiện màu đỏ

f Định tính alcaloid

Cho 3 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml Thấm ẩm bằng dung dịch amoniac, đậy kín trong 30 phút Cho them 15 ml cloroform, lắc đều, để yên 1 giờ Lọc dịch chiết cho vào bình gạn, lắc 2 lần với 10ml H2SO4

1N để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid cho vào các ống nghiệm, mỗi ống 1

Quan sát hiện tượng tạo bọt:

+ Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh (30 giây) theo chiều dọc của ống nghiệm Để yên và quan sát

* Phản ứng dương tính: có màu từ hồng đến đỏ hoặc có màu xanh dương đậm hay xanh lá

h Định tính chất béo

Cho khoảng 3 g dược liệu vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Soxhlet Chiết hồi lưu trên bếp cách thủy với dung môi chiết là ether dầu hỏa trong 3 giờ thu được dịch lọc Nhỏ một giọt dịch lọc lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Phản ứng dương tính khi xuất hiện vết mờ trên giấy lọc

i.Định tính steroid

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa ở trên Bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acid, thêm 0,5 ml cloroform lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ từng giọt H2SO4

* Phản ứng dương tính: dung dịch xuất hiện màu xanh lá

k Định tính acid hữu cơ

Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc

* Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch

m Định tính acid amin

Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi cách thủy 5 phút, lọc nóng Lấy 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy 10 phút

* Phản ứng dương tính: dung dịch chuyển sang màu tím

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập một số thành phần

a Chiết xuất các phân đoạn

- Dược liệu đã xay thô được chiết bằng phương pháp ngâm kiệt với dung môi EtOH 96%; cất thu hồi dung môi được cặn, phân tán cặn vào nước,

lần lượt lắc phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần(n-hexan; cloroform; ethyl acetat; n-butanol) Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n-hexan (cắn Hexan); cắn cloroform; cắn ethyl acetat (cắn EtOAc); cắn n-buthanol (cắn BuOH); cắn nước (cắn H2O)

EtOH thu hồi

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

Dịch chiết cồn

Dịch nước

Ngâm ở nhiệt độ phòng với EtOH 96%

48 giờ/lần x 5lần thu hồi dung môi

Chiết lỏng-lỏng với n-hexan

Thu hồi dung môi

Cao PĐ cloroform

Thu hồi dung môi Chiết lỏng-lỏng với cloroform

Cao PĐ ethyl acetat

Thu hồi dung môi Chiết lỏng-lỏng với ethyl acetat

Dịch nước

Cao PĐ n-butanol

Thu hồi dung môi Chiết lỏng-lỏng với n-butanol

Bột dược liệu

b Phân lập một số thành phần từ Chè hàng rào

Quá trình nghiên cứu phân lập các chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu như sau:

+ Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột:

Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải

Căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó, làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột

+ Hứng và gộp dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh, mỗi ống 5 ml Dịch rửa giải trong các ống được gộp lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

- Dùng các chất nhồi cột sắc ký: Sắc ký cột với chất nhồi khác nhau: silica gel pha thường, pha đảo YMC, Sephadex LH-20 hoặc sử dụng HPLC

+ Phương pháp vật lý: dựa vào góc quay cực

+ Phương pháp hóa học: dựa vào phản ứng hóa học đặc trưng

+ Phương pháp hóa lý: đo phổ tử ngoại, hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H- NMR), cacbon (13C- NMR) và các kỹ thuật một chiều (1D- NMR) và hai chiều (2D- NMR) tùy theo chất cụ thể

2.2.3 Phương pháp thử độc tính cấp

a Phương pháp: Thử theo hướng dẫn của Bộ Y tế và OECD [1],[5],[46]

b Chuẩn bị mẫu thử

- Dược liệu là cành mang lá, hoa cắt đoạn 3-4 cm, sấy khô ở nhiệt độ

60oC, tán thành bột thô(0,9 kg dược liệu), chiết bằng phương pháp ngâm kiệt

ở nhiệt độ phòng với EtOH 96% đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm, chiết 05 lần mỗi lần để 48 giờ, gộp dịch chiết lại, lọc, cất thu hồi dung môi và

cô thành cao đặc tỷ lệ 5:1 (5 phần dược liệu thu được 1 phần cao) Khi thử cao đặc được phân tán đều vào nước cất thành hỗn dịch với hàm lượng thích hợp và cho chuột uống qua kim đầu tù

thấp nhất gây chết 100% động vật (nếu thuốc có độc) hoặc xác định được liều cao nhất chuột có thể dung nạp được qua đường uống (nếu thuốc không có độc)

- Thử nghiệm chính thức: động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật

- Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi uống chế phẩm thử lần cuối)

d Theo dõi, đánh giá

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu…

- Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

- Số động vật chết: xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng72 giờ để tính toán LD50

- Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu có dấu hiệu đáng nghi ngờ mà không xác định được rõ nguyên nhân, cần làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

- Tiếp tục theo dõi động vật cho đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử