In vitro micropropagation of sugarcane varieties F134 and Q 15 has been studied. Rapid shoot initiation was found in MS medium containing o,5ppm á-NAA and 1ppm BA or kinetin after four weeks. The highest multiplication rate was obtained in the same medium. Good rooting ability was observed on MS medium supplemented with 0.5ppm á-NAA or on medium sans phytohormone with 7.5 percent saccharose. Better survival of plantlets was obtained in the humid soil.
Trang 1ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân
giống cây mía (Saccharum officinarum L.) Application of in vitro technique for propagation of sugarcane (Saccharum
officinarum L.)
Nguyễn Thị Nhẫn
Summary
In vitro micropropagation of sugarcane varieties F134 and Q 15 has been studied Rapid
shoot initiation was found in MS medium containing o,5ppm α-NAA and 1ppm BA or kinetin after four weeks The highest multiplication rate was obtained in the same medium Good rooting ability was observed on MS medium supplemented with 0.5ppm α-NAA or on medium sans phytohormone with 7.5 percent saccharose Better survival of plantlets was obtained in the humid soil
Keywords: Sugarcane, micropropagation, medium, multiplication
1 Đặt vấn đề
Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh
tế cao ở nước ta, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến đường Theo dự tính của các nhà chuyên môn thì triển vọng của ngành trồng mía ở nước ta là rất lớn, vì chúng ta có những điều kiện thuận lợi để nâng cao năng suất và sản lượng mía, đáp ứng được lượng đường tiêu dùng trong nước và xuất khẩu (Trịnh Minh Châu, 2003)
Hiện nay, ngành mía đường không chỉ tạo ra mặt hàng xuất khẩu quan trọng mà còn tạo công ăn việc làm, giúp người dân xoá đói giảm nghèo Mặt khác, góp phần nâng cao hiệu quả của việc sử dụng tài nguyên đất ở các vùng đất đồi khô hạn Tuy nhiên, ngành mía đường đang
đứng trước khó khăn là các nhà máy chế biến chưa hoạt động đủ công suất vì thiếu nguyên liệu (Nguyễn Đức Sơn, 2002) Vì vậy, vấn đề trước mắt là phải mở rộng vùng nguyên liệu, xây dựng cơ cấu giống hợp lý và có các bộ giống chuẩn cho từng vùng có điều kiện sinh thái khác nhau Mục đích của nghiên cứu này là góp phần giải quyết cây giống phục vụ cho việc mở rộng diện tích vùng mía nguyên liệu
2 Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các giống mía lai :
- Quế Đường 15 (Hoa Nam 52-12 x Nội Giang 59-782) là giống chín muộn được lai tạo tại Viện mía đường Quảng Tây- Trung Quốc
- F134 ( C0 290 x P0J28/78) là giống chín trung bình có nguồn gốc từ Đài Loan
Nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm là các mắt mía được lấy từ ngọn cây mía sau khi thu hoạch Ngọn mía thu về được rửa sạch, lau cồn (70o), sau đó đưa vào buồng cấy vô trùng, bóc bẹ lá, cắt các mắt mía và đỉnh sinh trưởng ngọn đưa vào môi trường nuôi cấy
Tất cả các thí nghiệm trong công đoạn in vitro đều được sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ
bản là Murashige - skoog (MS) có 3% saccaroza Riêng môi trường ra rễ có bổ sung than hoạt tính (0,5g/l) Tuỳ theo mục đích, yêu cầu của từng thí nghiệm có thể sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng sau: Kinetin (K), Benzin aminopurin (BA), α-naphtyl axetic axit (α-NAA) Các thí nghiệm được bố trí như sau:
Thí nghiệm 1: Tìm hiểu ảnh hưởng của BA và K đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy ban
đầu Thí nghiệm gồm 5 công thức:
CT1(đ/c): MS + 0,5ppm α-NAA ;
CT2: MS + 0,5ppm α-NAA + 0,5ppm BA
Trang 2CT3: MS + 0,5ppm α-NAA + 1ppm BA
CT4: MS + 0,5ppm α-NAA+0,5ppm K
CT5: MS + 0,5ppm α-NAA + 1ppmK
Thí nghiệm 2: Tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ xytokinin (BA và K) đến khả năng nhân nhanh chồi mía trong ống nghiệm Môi trường nền là MS có 0,5ppm α-NAA (đ/c) được bổ sung
BA hoặc K ở các ngưỡng nồng độ: 0,5ppm, 1ppm, 1,5ppm, và 2ppm
Thí nghiệm 3: Xác định môi trường ra rễ của cây mía trong ống nghiệm
Theo dõi quá trình ra rễ của cây mía in vitro trên môi trường có bổ sung α-NAA với các nồng
độ 0ppm (không bổ sung); 0,25ppm; 0,5ppm; 0,75ppm; 1ppm và trên môi trường có bổ sung hàm lượng Saccaroza với các nồng độ 3%(đ/c); 4,5%; 6%; 7,5%; 9% trong môi trường không có chất
điều tiết sinh trưởng
Thí nghiệm 4: Tìm hiểu ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng, phát triển của cây mía in vitro khi đưa ra vườn ươm Các loại giá thể được sử dụng gồm:
1 Cát, 2 Cát + than trấu (1:1), 3 Đất (đất tơi xốp, nghiền nhỏ và tưới ẩm), 4 Đất + than trấu (1:1), 5 Đất ướt (đất tơi xốp, tưới nhiều nước, đảo nhuyễn gần giống như đất gieo mạ)
3 Kết quả và thảo luận
3.1 ảnh hưởng của BA và kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy ban đầu
Bảng 1 Tỷ lệ tái sinh chồi từ mô cấy ban đầu (%)
Chất
ĐTST
(ppm)
Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày Sau 15 ngày Công
thức
1
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,5
1,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
8,1 10,3 15,7 9,4 13,5
20,1 23,5 30,7 22,4 27,3
21,9 25,5 30,7 26,3 28.4
45,4 48.3 65,7 45,9 63,5
60,0 67,8 80.3 64.7 79,0
61,3 79,3 86,4 73,7 88,5
62,3 83,7 90,4 84,3 89,7
63,5 86.7 92,5 85,9 90,3
Trong nuôi cấy in vitro người ta thường thay đổi tỷ lệ auxin và xytokinin để kích thích khả
năng tái sinh chồi từ mẫu cấy (M.A Mamun, M.B.H.Sikdar, 2004) Với auxin ở nồng độ thấp (0,5ppm α-NAA) và thay đổi xytokinin (BA và kinetin) từ 0,5 đến 1,0ppm thì sau 6 ngày nuôi cấy, các mầm mía của cả 2 giống đều bắt đầu hình thành trên cả 5 công thức Sau 15 ngày, tỷ lệ tái sinh chồi đạt trên 60% ở công thức đối chứng (không có BA và K) và trên 80% ở các công thức thí nghiệm (có BA hoặc K) (bảng 1)
Như vậy, nồng độ thích hợp cho khả năng tái sinh chồi với cả 2 giống là 1ppm BA hoặc 1ppm K ở ngưỡng nồng độ này, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 89,7 – 90,4% với giống F134 và 90,3 – 92,5 % với giống QĐ15 sau 15 ngày nuôi cấy
Khả năng sinh trưởng, phát triển của chồi được thể hiện qua chỉ tiêu chiều cao và số lá (bảng 2) Các chồi mía sinh trưởng, phát triển tốt hơn trên các môi trường có xytokinin (CT2- CT5) Trên các môi trường này, sau 30 ngày nuôi cấy, giống F134 có chiều cao cây đạt từ 3,8- 8,2cm tương ứng với số lá từ 1,3- 2,5 lá Giống QĐ15 cũng có chiều cao dao động từ 5,1-12,1cm và số lá từ 1,0- 2,6 lá/cây Cùng thời gian này, trên môi trường không có xytokinin (đ/c), chiều cao cây chỉ đạt 1,9cm (F134), 0,9cm (QĐ15) và cả 2 giống đều chưa có lá
Trang 3Bảng 2 Khả năng sinh trưởng phát, triển của chồi mía từ mô cấy ban đầu
Chất
ĐTST
Công
thức
(CT)
1
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,5
1,0
0,7 0,8 0,8 0,7 0,6
-
-
-
-
-
0,4 0,6 0,6 0,6 0,5
-
-
-
-
-
0,9 2,0 1,9 1,0 1,2
-
-
-
-
-
0,7 2,4 1,0 1,3 1,7
- 0,5
-
- 0,3
1,2 2,4 5,2 2,1 3,7
- 0,5 1,0 0,4 1,3
0,8 7,0 2,6 2,7 6,1
- 2,3 0,5 0,5 1,8
1,9 3,8 8,0 5,0 8,2
- 1,3 2,3 2,0 2,5
0,9 12,1 10,9 5,1 10,6
- 2,6 2,5 1,0 2,5
(Ghi chú: h là chiều cao trung bình của chồi (cm) ; sl là số lá trung bình/chồi)
Như vậy, trên môi trường dinh dưỡng MS có 0,5 ppm α-NAA có thể bổ sung BA hoặc kinetin ở nồng độ 1ppm để kích thích khả năng tái sinh chồi mía từ mẫu cấy ban đầu
3.2 ảnh hưởng của nồng độ xytokinin (BA và K) đến khả năng nhân nhanh chồi mía
trong ống nghiệm
Trên nền MS có 0,5ppm α-NAA, khi tăng nồng độ BA và K đã cho thấy tác động của chúng đến hệ số nhân chồi sau 4 tuần cấy chuyển (bảng 3)
Bảng 3 Hệ số nhân chồi (HSN) sau 4 tuần cấy chuyển
Số chồi cấy* Sau1 tuần* Sau 2 tuần* Sau 3 tuần* Sau 4 tuần* (lần sau 4tuần)HSN
CT Nồng
độ
Bổ sung BA
1
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
4,0
3,9
4,0
4,1
4,0
4,1 4,0 4,2 4,0 4,1
5,5 5,4 6,8 6,1 5,7
6,1 5,3 7,2 5,9 6,1
8,6 8,8 9,7 8,3 8,4
8,9 8,9 10,9 8,5 8,5
12,0 11,6 14,5 10,3 11,1
11,9 11,9 15,0 11,2 11,8
13,2 14,7 17,8 13,9 13,5
13,9 15,8 18,6 15,3 13,6
3,3 3,8
4,5
3,4 3,4
3,4 4,0
4,4
3,8 3,2
Bổ sung kinetin
1
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
4,0
3,9
3,9
4,1
4,0
4,1 4,2 4,0 4,0 4,0
6,9 6,7 8,5 6,8 5,9
7,5 6,6 9,0 7,0 6,4
9,3 9,7 12,1 9,4 9,6
10,5 9,9 12,7 10,0 10,2
11,4 13,7 16,8 15,1 14,2
12,9 14,6 17,4 15,0 15,4
13,8 17,9 20,7 17,3 16,9
14,3 18,2 22,0 18,3 17,8
3,4 4,6
5,3
4,2 4,2
3,5 4,3
5,5
4,6 4,4
( Ghi chú: * Đơn vị tính là số chồi trung bình/1bình cấy)
Khi bổ sung BA và kinetin với nồng độ 1ppm vào môi trường nuôi cấy, hệ số nhân chồi khi cấy chuyển ở thời điểm 4 tuần là 4,4 –4,5 lần với BA (bảng3) và 5,3 –5,5 lần với kinetin (bảng 4) Khi tăng BA và Kinetin lên 1,5 và 2ppm thì hệ số nhân của cả 2 giống đều giảm Tuy nhiên, tốc độ giảm hệ số nhân nhanh hơn khi tăng BA ở nồng độ 2 ppm, hệ số nhân của giống F134 chỉ còn 3,4 (vượt đ/c 0,1) và giống QĐ15 là3,2 (kém đ/c 0,1) Trong khi cũng ở nồng độ 2ppm của kinetin, hệ số nhân vẫn vượt đối chứng 0,8 (F134) và 0,9 (QĐ15)
Như vậy, môi trường nhân nhanh được chọn vẫn là MS có 0,5ppm α-NAA và 1 ppm BA (hoặc 1 ppm kinetin)
3.3 ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA và saccaroza đến quá trình ra rễ của chồi mía
trong ống nghiệm
Giống QĐ15
Kết quả hình 1a cho thấy: Có 3 trong số 5 công thức có tỷ lệ chồi ra rễ 100% sau 3 tuần nuôi cấy Tuy nhiên, chất lượng bộ rễ được đánh giá cao nhất ở công thức có nồng độ α-NAA là 0,5ppm, với số rễ trung bình/cây là 8,3 rễ, sau đó là nồng độ 0,75ppm (3,9 rễ/cây) Trên môi trường dinh dưỡng không có α-NAA tỷ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 83,3% và trung bình chỉ có 2,8 rễ/cây
Trang 4100 100 95.8
2.6
6.3
3.9
0
20
40
60
80
100
0,0(đ/c) 0,25 0,50 0,75 1,00
NAA (ppm)
0 1 2 3 4 5 6
Tỷ lệ cây ra rễ Số rễ/cây
95.8 100
79
5.2 5.3
3 2.5
8.2
0 20 40 60 80 100 120
Saccaroza (% )
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tỷ lệ cây ra rễ Số rễ/cây (a) (b)
Hình 1 Khả năng ra rễ của giống QĐ15 sau 3 tuần nuôi cấy
Saccaroza là thành phần quan trọng của môi trường nuôi cấy Nhưng khi sử dụng ở nồng
độ cao đã có tác dụng xúc tiến nhanh quá trình ra rễ của chồi mía (hình 1b) Sau 3 tuần nuôi cấy
đã có 100% số chồi ra rễ ở hàm lượng saccaroza từ 6% đến 7,5% Tuy nhiên, số rễ trung bình/cây đạt cao hơn ở hàm lượng saccaroza 7,5% Khi tăng nồng độ saccaroza lên 9% không chỉ làm giảm số rễ/cây mà tỷ lệ cây ra rễ cũng đã giảm chút ít
Giống F134
Bảng 4 Khả năng ra rễ của giống mía F134 sau 3 tuần nuôi cấy
Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 3 tuần Công
thức
Nồng độ
Bổ sung α-NAA
Bổ sung hàm lượng saccaroza
Ghi chú: SR là số rễ tb/cây ; % là tỷ lệ cây ra rễ
Trên giống F134 cũng có kết quả tương tự như giống QĐ15 Nồng độ α-NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ của giống mía này cũng là 0,5ppm Tuy nhiên, tỷ lệ cây ra rễ của giống này luôn thấp hơn giống QĐ15 ở tất cả các cặp công thức tương ứng Sau 3 tuần, công thức có tỷ
lệ cây ra rễ cao nhất cũng chỉ đạt 90% (CT3- bảng4)
Nồng độ saccaroza có khả năng kích thích nhanh sự ra rễ vẫn là 6 -7,5% (bảng 4) Tuy nhiên, sau 3 tuần nuôi cấy chưa có công thức nào đạt tỷ lệ cây ra rễ 100% và nồng độ saccaroza cao (9%) chưa biểu hiện rõ ức chế sinh trưởng, phát triển của bộ rễ như giống QĐ15
3.4 ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây mía in vitro khi
đưa ra vườn ươm
Trang 5Bảng 5 Tỷ lệ sống của cây mía in vitro ngoài vườn ươm(%)
Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày Công
1
2
3
4
5
Cát (đ/c)
Cát + than trấu (1:1)
Đất
Đất + than trấu (1:1)
Đất ướt
80
80
80
80
80
97,5 96,2 91,2 93,7
100
97,5 95,0 90,0 97,5
100
95,7 92,5
87, 90,00
100
95,0 95,0 85,0 95,0 97,5
91,2 92,5 86,2 85,5 97,5
90.0 90,0 77,5 92,5 95,0
QĐ15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ban
đầu
Thời gian theo dõi (tuần)
F134
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Ban
đầu
Thời gian theo dõi (tuần)
Hình 2 Động thái tăng trưởng chiều cao cây mía
Tỷ lệ sống của cả 2 giống thí nghiệm đều đạt cao nhất trên nền đất ướt (95 –97,5% sau 15 ngày) Tuy nhiên, ngoài giá thể bằng đất, các giá thể còn lại đều có thể sử dụng để trồng cây mía
in vitro khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống đạt trên 90% Riêng giống F134
có biểu hiện sai khác không rõ trên nền đất (CT3) và đất + than trấu (CT4)
Ngoài tỷ lệ sống cao, động thái tăng trưởng chiều cao cây của cả 2 giống đều vượt trội trên
nền đất ướt (hình2) Như vậy, đất ướt là loại giá thể rất thuận lợi cho khả năng hồi phục nhanh của cây mía khi chuyển từ điều kiện bán tự dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn của cây mía khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm
4 Kết luận
Trên môi trường MS có 0,5ppm α-NAA, khi bổ sung 1ppm BA hoặc kinetin đều có tác dụng kích thích nhanh sự hình thành chồi từ mẫu cấy ban đầu.Và đây cũng là môi trường cho HSN cao trong giai đoạn nhân chồi (4,4 - 4,5 lần đối với BA và từ 5,3 –5,5 lần đối với kinetin sau 4 tuần) Cây mía in vitro ra rễ thuận lợi hơn trên môi trường có α-NAA ở nồng độ 0,5ppm hoặc trên môi trường dinh dưỡng có hàm lượng saccaroza cao (6 đến 7,5%)
Khi đưa cây mía ra vườn ươm có thể trồng trên cát, cát + trấu (1:1) hoặc đất + trấu (1:1) nhưng tốt nhất là trên nền đất ướt Cây mía trồng trên nền đất ướt không chỉ có tỷ lệ sống cao hơn và khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cũng tốt hơn
Có sự sai khác không nhiều giữa giống F134 và QĐ15 trong công đoạn nhân in nhanh in vitro
Trang 6
Tµi liÖu tham kh¶o
TrÞnh Minh Ch©u (2003), “ Mét sè ý kiÕn vÒ ch−¬ng tr×nh mét triÖu tÊn mÝa ®−êng mÝa ®−êng”
T¹p chÝ NN & PTNT- Sè 11-2003, trang 47-50
NguyÔn §øc S¬n (2002), “ Mét sè biÖn ph¸p ®Èy m¹nh th©m canh t¨ng n¨ng suÊt mÝa cña tØnh
Thanh Ho¸”, T¹p chÝ NN & PTNT, sè 12/2002, trang 69-71
3.M.A Mamun, M.B.H.Sikdar (2004), “In vitro micropropagation of some inportant sugarcane
varieties of Bangladesh”, Asian Journal of plant Sciences 3(6),666-669, 2004, pp.72-76
