Nghiên cứu tương đương sinh học viên nén gliclazid giải phóng chậm sản xuất ở việt nam theo mô hình thử đơn liều và đa liều

ANOVA Phân tích phương saiAUC Diện tích dưới đường cong AƯMC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian X thời gianBCS Hệ thống phân loại sinh dược học BMI Chỉ số khối cơ thể cc, Đườn

T I U ( 1 \ ( Ỉ Đ Ạ I H Ọ C D Ư Ọ C H À • • • N Ộ I •

TRẦN HOÀNG

THỬĐƠN LIÊU VÀ ĐA LIỀU

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Thị Vinh, người thầy

đã tận tụy hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài

Xin chân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các bộ môn khác của trường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho tôi trong quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đổc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Trung tâm đánh giá tương đương sinh học nơi tôi công tác đã luôn quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập

và nghiên cứu trong thời gian vừa qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn luôn động viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay

Trần Hoàng Học viên cao học khóa 12, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

DANH MỤC CHỬ VIÉT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIẺU

D A N H M Ụ C H ÌN H V Ẽ

ĐẬT VẤN Đ È 1

Phần 1: TỎNG QUAN 3

1.1 TỒNG QUAN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 3

1.1.1 Khái niệm chung 3

1.1.2 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 4

1.1.3 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học 5

1.1.4 Đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu 8

1.1.5 Đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứ u 9

1.2 TỒNG QUAN GLICLAZID 9

1.2.1 Tính chất lý hóa và cách sử d ụ n g 9

1.2.2 Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trường 11

1.2.3 Một sổ phương pháp định lượng Gliclazid trong dịch sinh học 12 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u TĐSH Ở TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT N A M 14

1.3.1 Trên thế giới 14

1.3.2 Trong nước 16

Phần 2: NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Thiết b ị 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 23

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học chế pham gliclazid 30

Phần 3: KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 38

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38

3.1.1 Lựa chọn chất nội chuẩn 38

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc k ý 38

3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết tách GLI trong huyết tương 40

3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43

3.2.1 Tính thích họp của hệ thống sắc ký 43

3.2.2 Đánh giá độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp 45

3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 46

3.2.4 Xác định độ đúng và độ chính x á c 49

3.2.5 Tỉ lệ thu hồi của phương pháp 51

3.2.6 Khảo sát độ ổn định 52

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CHẾ PHẨM GLICLAZID 58

3.3.1 Kết quả lâm sà n g 58

3.3.2 Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương 59

3.3.3 Các thông số dược động học 61

3.3.4 Ket quả đánh giá tương đương sinh học 68

Phần 4: BÀN L U Ậ N 78

4.1 VÈ XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GLICLAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG 7 8 4.2 VÈ THẦM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG HUYẾT TƯƠNG 79

4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ TĐSH CHẾ PHẨM GLICLAZID 80

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NG H Ị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Tóm tắt một số chế phẩm gliclazid có trên thị trường 11

Bảng 1.2: Tóm tắt một số phương pháp định lượng Gliclaãd bằng phương phápHPLC 12

Bảng 2.3: Các chất chuẩn đã sử dụng 18

Bảng 2.4: Các mẫu huyết tương trắng đã sử d ụ n g 18

Bảng 2.5: Các dung môi và hóa chất sử dụng trong phương pháp phân tíc h 18

Bảng 2.6: Các thiết bị đã sử dụng trong phương pháp phân tích 20

Bảng 2.7: Thiết bị HPLC Shimadzu 20

Bảng 2.8: Cách chuẩn bị đường chuẩn 25

Bảng 2.9: Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tư ơng 26

Bảng 2.10: Kết quả ngẫu nhiên hoá và bố trí uổng thuốc 32

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ phù họp của hệ thống sắc ký 44

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu (tR) của G L Iv à lS 46

Bảng 3.13: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLO Q ) 47

Bảng 3.14: Ket quả khảo sát đường chuẩn 47

Bảng 3.15: Sự tương quan giữa nồng độ GLI trong huyết tương và đáp ứng pic 48

Bảng 3.16: Ket quả khảo sát độ đúns, độ lặp lại trong n gày 49

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày 50

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát tỉ lệ thu hồi của I S 51

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát tỉ lệ thu hồi của G L I 52

Bảng 3.20: Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc, IS thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 53

Bảng 3.21: Ket quả độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc thời gian dài ở nhiệt độ - 40 ° c 53

Bảng 3.23: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ

đông - rã 54

Bảng 3.24: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian n g ắ n 55

Bảng 3.25: Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 56

Bảng 3.26: Độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler 57

Bảng 3.27: Nồng độ GLI tối đa trong huyết tương (Cmax) 61

Bảng 3.28: Thời gian đạt đến nồng độ tối đa trong huyết tương (Tmax) 62

Bảng 3.29: Diện tích dưới đưòng cong nồng độ - thời gian (AUC) 63

Bảng 3.30: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thòi gian X thời gian (AUMC) và thời gian lưu trú trung bình khi nghiên cứu đon liều 64

Bảng 3.31: Nồng độ Cmin trong khoảng thời gian T khi thử đa liề u 65

Bảng 3.32: Nồng độ Cav (Mg/rnl) trong khoảng thời gian T khi thử đa liều 66

Bảng 3.33: Độ dao động DF và DF/t trong khoảng thời gian I khi thử đa liều 67

Bảng 3.34: So sánh Cmax bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đon liều 68

Bảng 3.35: So sánh AUCo, bàng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều 69

Bảng 3.36: So sánh MRTbằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều 70

Bảng 3.37: So sánh Tmax theo phương pháp thống kê phi tham số, đon liều 72

Bảng 3.38: So sánh C max bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liều 73

Bảng 3.39: So sánh AUC*5 bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liề u 74

Bảng 3.40: So sánh Tmax theo phương pháp thống kê phi tham số, đa liều 76

Bảng 4.41: So sánh thông sổ DĐH của gliclazid sản xuất ở Việt Nam vói thông sổ DĐH của tài liệu đã công bổ 82

Hình 1.1: Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời g ia n 4

Hình 3.2: Phổ hấp thụ của G L I 38

Hình 3.3: Phổ hấp thụ của IS .38

Hình 3.4: sắc đồ mẫu GLI và IS trong pha động 40

Hình 3.5: sắc đồ mẫu GLI và IS trong huyết tương 40

Hình 3.6: sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng n-hexan 41

Hình 3.7: sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng dichlorom ethan 41

Hình 3.8: sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng MeCN-CHCl3 41

Hình 3.9: sắc đồ mẫu chuẩn + IS xử lý bằng MeCN-CHCl3 41

Hình 3.10: sắc đồ mẫu trắng xử lý bằng chiết pha rắn 43

Hình 3.11: sắc đồ mẫu chuẩn + IS xử lý bằng chiết pha rắ n 43

Hình 3.12: sắc ký đồ của dung dịch chuẩn GLI và IS trong pha đ ộ n g 44

Hình 3.13: sắc ký đồ huyết tương trắ n g 45

Hình 3.14: sắc ký đồ huyết tương trắng có pha IS 45

Hình 3.15: sắc ký đồ huyết tương trắng có pha chuẩn GLI ở nồng độ LLOQ (0,2 Ịig/mL) và IS 45

Hình 3.16: sắc ký đồ huyết tương trắng có pha chuẩn Gli và IS ở nồng độ khoảng giữa đường chuẩn (4,0 |ig/m L ) 45

Hình 3.17: Đường cong trung bình nồng độ thuổc - thời gian của 20 NTN khi thử đơn liề u 60

Hình 3.18: Đường cong trung bình nồng độ thuốc - thời gian của 20 NTN khi thử đa liều 60

ANOVA Phân tích phương sai

AUC Diện tích dưới đường cong

AƯMC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian X thời gianBCS Hệ thống phân loại sinh dược học

BMI Chỉ số khối cơ thể

cc, Đường chuân 1

cc2 Đường chuẩn 2

Ct Nồng độ thuốc tại thời điểm I

C av Nồng độ thuốc trung bình ở trạng thái ổn định

DF Dao động nồng độ thuốc trong huyết tương

EMS Trung bình bình phương của sai số

FDA Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

GCP Thực hành tốt lâm sàng

GLI Gliclazid

GLP Thực hành tốt phòng thí nghiệm

GMP Thực hành tốt sản xuất thuốc

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC Mau kiểm tra nồng độ cao

PDA Detector quang phô

QC Mau kiểm tra

TĐSH Tương đương sinh học

Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đaWHO Tổ chức Y tế thế giới

T Khoảng cách liều

Đơn vị đo chiều dài

Đơn vị đo khối lượng

Đơn vị đo thê tích

Đơn vị thời gian

CentimetMilimetMicrometNanomet

GamMiligamMicrogam

LítMililitMicrolit

GiờPhút

cmmmp.mnm

gmgHg

LmL

|iL

hmin

Gliclazid là một dẫn chất nhóm sulfonylurea được dùng trong điều trị bệnh tiếu đường, một căn bệnh gia tăng khi xã hội phát triến Tỷ lệ người bị bệnh tiểu đường trên thế giới ngày một tăng lên, nhu cầu dùng các thuốc trị bệnh tiểu đường cũng tăng theo Ở Việt nam, số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường cũng đã tới 1 - 2,5 % dân số và có tỷ lệ biến chứng, tử vong cao nhất trong các bệnh nội tiết Trên thị trường trong nước, các chế phẩm chứa gliclazid đã được lưu hành và sử dụng trong điều trị, phần lớn là các thuốc nhập ngoại Gần đây, một số cơ sở sản xuất trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất các chế phẩm có chứa gliclazid, trong đó có cả những dạng thuốc giải phóng chậm như Glidin (Công ty Dược phẩm Vellpharm) Tuy nhiên, chất lượng của các chế phẩm sản xuất trong nước chưa được khẳng định, việc cấp phép lưu hành cũng như lựa chọn trong điều trị còn đang được xem xét.

Trên thế giới, hầu hết các nước có nền công nghiệp Dược phát triển đều

đã có quy chế rõ ràng về yêu cầu dữ liệu tương đương sinh học trong việc cấp phép lưu hành, đồng thời ban hành các hướng dẫn nghiên cứu về lĩnh vực này Tuy nhiên, qui chế đăng ký thuốc của nước ta vẫn chưa yêu cầu về tương đương sinh học và sinh khả dụng Khái niệm về sinh khả dụng và tương đương sinh học mới được đề cập tới trong đào tạo và nghiên cứu khoa học khoảng gần chục năm trở lại đậy Những nghiên cứu ban đầu mang tính chất nhận thức khái niệm và tiếp cận phương pháp Nhiều vấn đề chưa được và gần như không thể giải quyết được trong thòi gian qua, đặc biệt là các vấn đề liên quan tới kỹ thuật Hạn chế về trình độ và thiểu các thiết bị hiện đại đã làm giảm giá trị và khả năng ứng dụns thực tiễn của các nghiên cứu, phần nào đó

do chưa có một yếu tố nào thúc đẩy các nhà sản xuất trong nước quan tâm đầu

tư cho những nghiên cứu này Gần đây, tình hình nghiên cứu về chủ đề này đã

được cải thiện khá nhiều nhờ có thêm kinh nghiệm thực tế và sự hưởng úng của các doanh nghiệp.

Với các thuốc dạng rắn dùng đường uống, đặc biệt thuốc giải phóng chậm, ảnh hưởng của công thức bào chế và yếu tố đường tiêu hóa lên quá trình hấp thu của thuốc khá nhiều Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá khả năng hấp thu các dạng thuốc này là rất cần thiết Hơn nữa, với các dạng giải phóng chậm, nghiên cứu sinh khả dụng còn cần để chúng tỏ quá trình giải phóng dược chất chậm trong cơ thể và giúp kiểm soát nồng độ thuốc trong máu

Đe đánh giá một cách đích thực chất lượng của chế phẩm Gliclazid sản

xuất trong nước, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu Tương

đương sinh học viên nén GUclaiỉd giải phóng chậm sản xuất ở Việt Nam theo mô hình thử đơn liều và đa liều ”.

Muc tiêu của đề tài là:

1 Xây dụng và thẩm định phương pháp phân tích Gliclazid trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC.

2 Đánh giá tương đương sinh học cho chế phẩm gliclazid giải phóng chậm sản xuất trong nước so với Diamicron® MR 30 mg.

1.1 TỒNG QUAN ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 1.1.1 Khái niệm chung

- Sinh khả dụng: là thông số biểu thị tỷ lệ thuốc vào được vòng tuần hoàn

chung ở dạng còn hoạt tính so với liều đã dùng (F%), tổc độ (Tmax) và mức độ (Cmax) thuốc thâm nhập được vào vòng tuần hoàn chung Sinh khả dụng invivo được biểu thị dưới 2 khái niệm: Sinh khả dụng tuyệt đối và sinh khả dụng tương đối, trong đó sinh khả dụng tương đối thường được dùng nhiều hon trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc generic [1], [4], [13]

- Tương đương sinh học: hai thuốc được gọi là tương đương sinh học nếu

chúng là những chế phẩm tương đương bào chế hoặc là thế phẩm bào chế có sinh khả dụng tương tự nhau sau khi dùng cùng một mức liều, trong cùng một điều kiện thử nghiệm [4], [13]

- Tương đưong bào chế: những chế phẩm thuốc được coi là tương

đương về mặt bào chế nếu các thuốc này chứa cùng một lượng dược chất giống nhau, cùng một dạng bào chế và đạt các tiêu chuẩn chất lượng do dược điển quy định [4], [13]

- Thế phẩm bào chế: là những chế phẩm thay nếu chúng chứa cùng một

dược chất nhưng khác nhau về mặt hóa học (base, muối, este .) hoặc khác nhau về dạng thuốc hay hàm lượng [13]

- Nghiên cứu đon liều: nghiên cứu được thực hiện để đánh giá các thông

số dược động học sau khi dùng một liều duy nhất [19]

- Nghiên cứu đa liều ở trạng thải ôn định: nghiên cứu thực hiện để đánh giá

các thông số DĐH trong một khoảng liều ở trạng thái ổn định Cho người tình nguyện dùng thuốc đến khi đạt đến trạng thái ổn định, sau đó dùng một liều

thuốc nghiên cún để xác định thông số dược động học từ thòi điểm bắt đầu dùng liều này ở trạng thái ổn định cho đến thời điểm dùng liều tiếp theo [19].

- Thuốc giải phóng chậm (tác dụng kẻo dài): là những chế phẩm có khả

năng giải phóng dược chất liên tục theo thời gian để duy trì nồng độ dược chất trong máu trong phạm vi điều trị trong khoảng thời gian dài, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, giảm bớt tác dụng không mong muốn, giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh [12].

H ình 1.1: Đồ thị biến thiên nồng độ dược chất trong máu theo thời gian

1 Dạng quy ước MEC: Nồng độ tối thiểu có tác dụng

2 Dạng giải phóng chậm MTC: Nồng độ tối thiểu gây độc

1.1.2 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Có nhiều phương pháp đánh giá SKD và TĐSH [18, 17-33], [20] Sau đây là các phương pháp hay dùng:

- Thử ỉn vivo ở người bằng cách so sánh sự biển thiên nồng độ dược chất

hoặc chất chuyển hóa trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinh học thích hợp khác theo thời gian

- Thử in vitro nếu đã chứng minh được là có tương quan tỉ lệ thuận với

số liệu SKD ỉn vivo trên người.

- Thử in vivo ở người bằng cách đo tổng lượng dược chất hoặc chất

chuyển hóa bài tiết qua nước tiểu theo thời gian

- Thử ỉn vivo trên người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất

hoặc chất chuyển hóa theo thời gian nếu phương pháp đánh giá đủ nhậy, chính xác và tin cậy

- So sánh tác dụng lâm sàng bằng phương pháp thích hợp, tin cậy

1.1.3 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học

Hiện nay, đánh giá tương đương sinh học thực hiện theo hướng dẫn của FDA, Canada, ASEAN , và dược điển của một số nước như Mỹ, Trung

Q uốc [9], [10], [13], [14], [17], [28], [31]

1.1.3.1 Thiết kế nghiên cứu

- Thiết kế' Trong nghiên cứu TĐSH, để hạn chế sự ảnh hưởng của các

yếu tố các thể người ta hạn chế thiết kế nghiên cứu song song mà thường thiết

kế nghiên cứu chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn (ô vuông la tinh 2x2) áp dụng khi so

sánh 1 thuốc thử và 1 thuốc chứng hoặc thiết kế chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn (3x3) khi cần so sánh 2 thuốc thử và một thuốc đối chứng Đối với thuốc giải phóng chậm thiết kế như sau:

+ Thiết kế chéo (2 X 2), đơn liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự

+ Thiết kế chéo (2 X 2), đa liều, 2 thuốc, 2 giai đoạn, 2 trình tự

+ Thiết kế chéo ( 3 x 3 ), đơn liều, 3 thuốc, 3 giai đoạn, 6 trình tự.

Các nghiên cún này thực hiện trong tình trạng đói hoặc không đói

- Thời gian đào thải: Thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn dùng thuốc

phải đủ để liều đã dùng ở giai đoạn trước được đào thải hết trước khi dùng liều sau Thời gian này được tính bằng 7 lần thời gian bán thải của thuốc Đối với thuốc giải phóng chậm thời gian nghỉ có thể dài hơn phụ thuộc vào từng thuốc

- Liều thử: Mức liều thử thường dùng là liều tương ứng với 1 đơn vị có

hàm lượng cao nhất được lưu hành trên thị trường hoặc bằng mức liều thường dùng trong lâm sàng Trường hợp không thể định lượng được do nồng độ quá thấp, có thể thử với liều cao hơn nhung không được vượt quá mức liều tối đa ghi trên nhãn Trường họp thuốc có tác dụng phụ có hại hoặc quá nhiều nguy

cơ, nên thử với mức liều thấp

- Lấy mẫu: Thời điểm và khoảng thời gian lấy mẫu phải được thiết lập

sao cho có thể ước lượng tương đổi chính xác giá trị Cmax và thu được đường cong nồng độ trong huyết tương theo thời gian đế ước lượng chính xác mức

độ hấp thu Thời gian lấy mẫu đáp ứng khi giá trị AƯCo-t ít nhất bằng 80% giá trị AƯCo-00 Đe có một đường cong dược động học lý tưởng thì số điêm lấy

mẫu tối thiểu phải lấy 12 điểm, 1 điểm trước khi uống thuốc, 3 - 4 điểm ở pha hấp thu trước Cmax, 3 điểm xung quanh Cmax, 5 - 6 điểm ở pha thải trừ Toàn

bộ quá trình lấy mẫu phải tuân thủ theo quy định của GCP

1.1.3.2 Đối tượng thử

Tùy theo loại thuốc mà chọn đối tượng thử khác nhau, tốt nhất là đánh giá trên NTN Đối với thuốc có độc tích cao, thuốc có nồng độ dược chất trong máu thấp hoặc khi thăm dò trong quá trình phát triển sản phấm, nghiên cứu SKD in vivo có thể tiến hành trên động vật thí nghiệm [20]

Phải lựa chọn đủ số lượng NTN để đảm bảo kết quả phân tích thống kê Dùng tối thiểu 12 người cho một nghiên cứu số lượng NTN có thể nhiều hơn nếu dược chất thuộc loại có tốc độ và mức độ hấp thu biến thiên giữa các cá thể là khác nhau nhiều NTN khỏe mạnh, thuộc cả hai giới, tuy nhiên không nghiên cứu trên đối tượng là phụ nữ mang thai Các tiêu chí về chỉ số khối cơ thể phải đạt các yêu cầu theo cánh tính của Metropolitan Index 1983 cho người lớn NTN cần được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh và các xét nghiệm

cơ bản NTN phải có khả năng hiểu các thông tin về nghiên cứu và tự viết bản

vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu theo mẫu được Hội đồng đạo đức thông qua Các thông tin về NTN và kết quả xét nghiệm, nghiên cứu sẽ được giữ bí mật trong hồ sơ nghiên cứu Tên, địa chỉ, hình ảnh NTN sẽ không được công bố trong các báo cáo kết quả, báo, tạp chí nếu không được sự đồng ý của NTN.

1.2.3.3 Thuốc thử và thuốc đối chứng

- Thuốc thử: Thuốc dùng trong nghiên cứu SKD và TĐSH phải được sản

xuất theo tiêu chuẩn GMP Chế phẩm được lấy từ lô sản xuất công nghiệp Nếu mẫu thử lấy từ lô sản xuất thử (pilot) thì cỡ lô này không được dưới 10%

cỡ lô sản xuất chuẩn Các mẫu thuốc dùng trong nghiên cứu phải được kiểm tra chất lượng trước khi đưa vào thử

- Thuốc đối chứng: Là các thuốc phát minh cùng loại Nếu các thuốc phát

minh không có sẵn trên thị trường tại thời điểm nghiến cứu, có thế dùng một thuốc tưong đương đã được cấp phép thay thế

- Kết quả định lượng dược chất mẫụ thuốc thử và thuốc đối chứng dùng trong nghiên cứu phải có hàm lượng không được khác nhau quá 5% Neu quá thì phải hiệu chỉnh các thông số phụ thuộc liều để so sánh đánh giá kết quả

1.1.3.4 Phân tích mău sinh học

Phân tích mẫu dịch sinh học phải thực hiện theo các nguyên tắc thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP) Các thiết bị phân tích phải được bảo trì, hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo thông sổ thiết bị nằm trong giới hạn cho phép Các phương pháp phân tích sinh học dùng đê xác định dược chât hoặc chất chuyển hóa trong dịch sinh học phải đặc hiệu, được thẩm định đầy đủ và

có hồ sơ để cung cấp kết quả tin cậy Mục đích của việc thẩm định phương pháp

là đánh giá mức độ tin cậy của phương pháp dùng trong xác định nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Theo quy định của FDA, thẩm định phương

pháp gồm 6 chỉ tiêu như: (1) tính đặc hiệu, (2) độ chính xác, (3) độ đúng, (4) giới

hạn định lượng, (5) khoảng tuyến tính, (6) độ ổn định của dược chất ở điều kiện

phân tích và trong quá trình bảo quản Tất cả các chỉ tiêu phải đạt các quy định theo hướng dẫn của FDA cũng như dược điển Mỹ, Trung Quốc

1.1.3.5 Phân tích số liệu

Phân tích số liệu đánh giá TĐSH là lượng hóa sự khác nhau về SKD giữa các thuốc thử và thuốc đối chứng Phân tích thống kê được sử dụng để đánh giá sự khác nhau này Cơ sở của phương pháp là khoảng tin cậy 90% cho tỉ số của trung bình quần thể thử và quần thể đối chứng: |ì t/ịir cho một số thông số khảo sát

Thông số dược động học được tính toán từ nồng độ như AUC, MRT,

Cmax được phân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e Riêng đối với

Tmax được xử lý theo phương pháp thống kê phi tham số Phân tích phương sai được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các nguồn biến thiên như: trình tự, giai đoạn, cá thể, thuốc đến kết quả nghiên cứu

Khoảng chấp nhận của các thông số DĐH theo tiêu chuẩn của Mỹ và Châu Âu nằm trong khoảng dao động 0,80 - 1,25 của chế phẩm thử so với chế phẩm đổi chúng

Trên thể giới, thông thường các thông số DĐH được tính toán theo phầnmềm thống kê như: Kinetica, Winnolin, SAS Trong đề tài chúng tôi tínhtoán thông số DĐH được lập trên phần mềm Excel theo những nguyên tắc trên, phần mềm đã được thâm định đây đủ trước khi đưa vào sử dụng [14],

1.1.4 Đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu

Đe đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y - sinh học, đề cương nghiên cứu phải được xem xét và phê duyệt bởi hội đồng đạo đức độc lập với nhóm nghiên cún theo các quy định hiện hành Tất cả các hoạt động nghiên cứu chỉ được thực hiện sau khi đề cương được phê duyệt Bản cam kết của

người tình nguyện phải được ký trước khi tiến hành bất kỳ hoạt động gì với người tình nguyện [6], [37],

1.1.5 Đảm bảo chất lưọìig kết quả nghiên cứu

Đe đảm bảo chất lượng kết quả nghiên cứu, quá trình lấy mẫu phải tiến hành trong điều kiện cơ sở lấy mẫu phải đạt tiêu chuẩn (GCP), NTN phải được tuyển chọn đạt các yêu cầu đối với thuốc thử nghiệm, quá trình phân tích mẫu phải định lượng trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuân vê GLP và ISO Cơ sở vật chất được thẩm định và đánh giá định kỳ Tất cả các thiết bị dùng trong nghiên cứu được hiệu chuẩn theo kế hoạch, nghiên cứu viên được đào tạo về GLP, GCP và các phương pháp chung về đánh giá SKD và TĐSH [11], [37]

Khối lượng phân tử: 323,4 g/mol

Công thức cấu tạo:

Tính chất: Tinh thể hay bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong

nước, tan nhiều trong Methylenclorid, tan ít trong acetone và alcol Nhiệt độ nóng chảy 181° c Gliclazid là một acid yếu có pKa 5,8, có tính thân mỡ LogP (octanol/water) 2,1 Theo bảng phân loại dược chất của BCS thì gliclazid được xếp vào nhóm 2 có tính tan kém và tính thấm tốt Do đó có thể chiết

tách GLI trong dịch sinh học bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi hưu cơ Trong môi trường acid hấp thụ mật độ quang ở bước sóng 230

nm, môi trường bazơ là 263 nm [11], [25], [30]

Chỉ định.

- Gliclazid được chỉ định trong đái tháo đường không phụ thuộc insulin typ 2

mà chế độ ăn kiêng đơn thuần không kiểm soát được glucose huyết

- Gliclazid dùng cho người cao tuổi bị đái tháo đường

Chong chỉ định.

- Đái tháo đường phụ thuộc insulin typ 1

- Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đường

- Suy gan nặng, suy thận nặng

- Có tiền sử dị ứng vói sulfonamid và các sulfonylurea khác

- Phối họp với viên miconazol

- Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thương nặng, phẫu thuật lớn

Một sổ phản ứng ADR có thể xảy ra khi dùng thuốc.

• Thường gặp, ADR > 1/100:

- Thần kinh trung ương: Đau đầu.

- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn

- Thần kinh trung ương: Trạng thái lơ mơ, vã mồ hôi

- Tim mạch: Tăng tần số tim

- Da: Tái xanh

- Tiêu hóa: Nôn, đói cồn cào

1.2.2 Một số chế phẩm gliclazid giải phóng chậm có trên thị trưòng.

Trên thị trường chế phẩm gliclazid có nhiều loại biệt dược khác nhau dưới nhiều dạng bào chế khác nhau Hiện nay các dạng thuốc qui ước trong nước sản xuất khá nhiều, các dạng thuốc giải phóng chậm đã và đang nghiên cún sản xuất

2 Diamicron MR

(gliclazid 30 mg)

Viên nén bao phim VN-0456-06

Les Laboratories Servier Industrie (Pháp)

1.2.3 Một số phuưng pháp định lưọng Gliclazid trong dịch sinh học.

Qua các tài liệu tham khảo ta cĩ một số phương pháp định lượng được tĩm tắt như sau:

Bảng 1.2: Tĩm tắt một số phương pháp định lượng Gliclád bằng phưong pháp HPLC.

- Detector: 229 nm ° Lac vortex 10 giây Thêm 6

- Pha động: Đệm acetate ZT a> mL dicloromethan lắc, ly

- Detector: 229 nm 0 mL chloroform, lac 1 phút.

- Cột: C18 ODS, 200 X 4,6 1 mL HT + 0,1 mL Glipizid

- Pha động: MeCN - Nước mL benzen-isopropanol

lại hoà tan trong 0,16 mL

MeCN.

n-hexan Pha động: MeOH 0 ,5 % - o H dicloromethan (1:1, v/v)

5 [23] Acid formic (80:20, v/v)

- Detector: ESI-M S

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

cr 2

r— K

P 3 BI

Nhận xét:

- Phương pháp 1: Định lượng gliclazid trong chế phẩm, không có quy

trình xử lý mẫu trong huyết tương, không áp dụng được

- Phương pháp 2: Quy trình xử lý mẫu phức tạp tốn nhiều thời gian, do phải qua 2 lần chiết nên gặp nhiều sai số và thường cho hiệu suất chiết thấp.

- Phương pháp 3: Quy trình xử lý mẫu đơn giản, phương pháp có khoảng tuyến tính lớn 0,1 - 10 ịig/mL, nhưng phương pháp chưa thẩm định đầy đủ, chủ yếu dùng trong lâm sàng cá thể hóa điều trị (số lượng mẫu ít) Mặt khác Gliburid không có trong danh sách chất chuẩn quốc gia nên khó áp dụng trong điều kiện thực tế nước ta hiện nay

- Phương pháp 4: Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản : chiết lỏng - lỏng trong môi trường acid yếu nhung sử dụng dung môi độc hại (benzen) vì vậy không nên sử dụng

- Phương pháp 5: Có độ nhậy cao, giá trị LLOQ rất nhỏ 2,5 ng/mL, song sử dụng detector khối phố là một phương pháp mới với thiết bị hiện đại

đắt tiền chưa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, thông tin

về phương pháp còn chưa đầy đủ

Trên cơ sở tham thảo các phương pháp định lượng đã được công bố, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng GLI trong huyết tương NTN bằng HPLC với detector PDA

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ u TĐSH Ở TRÊN THỂ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.3.1 Trên thế giói

Đánh giá SKD và TĐSH được thực hiện từ nhiều thập kỷ trước, ở các nước có nền công nghiệp Dược phát triển như Canada, Mỹ, Pháp, Đức, Indonesia, Malaysia, Philippin và một số nước trong khu vực Mỗi quốc gia khi quy định thử nghiệm đều ban hành các hướng dẫn nghiên cứu và quy chế trong quản lý Tuy nhiên các hướng dẫn chung thì rất phổ biến, những hướng dẫn cho các dạng thuốc cụ thể thì chưa có nhiều Trong đó, Mỹ là quốc gia đầu tiên thực hiện luật bản quyền trong sản xuất dược phẩm và quy định rõ việc cấp phép lưu hành cho thuốc generic Cho đến nay cơ quan quản lý thuốc

và thực phẩm Mỹ (FDA) đã ban hành nhiều qui chế và hướng dẫn cho việc nghiên cứu và cấp phép lưu hành thuốc Các qui chế của Mỹ qui định khá rõ ràng về hồ sơ cần đệ trình khi đăng ký sản xuất và lưu hành các loại thuốc, cũng như các trường hợp thay đổi sau khi cấp phép Đồng thời FDA cũng ban hành các tài liệu mang tính chất hướng dẫn kỹ thuật cho việc thực hiện nghiên cứu như hướng dẫn về thẩm định phương pháp nghiên cứu, hướng dẫn

về xử lý và bảo quản mẫu sinh học và xem xét miễn thử SKD và TĐSH in vivo cho các thuốc dạng rắn [15], [18], [19], [35] Dược điển Mỹ ban hành chuyên luận " Hướng dẫn nghiên cứu tương đương sinh học in vivo ", kèm theo quy trình thử cho một số chế phẩm cụ thể, trong đó có 2 thuốc giải

phóng chậm (Diclofenac và Pentoxyphillin) [25]

Gần đây ở ASEAN, việc đánh giá TĐSH đã trở thành yêu cầu cấp thiết và được thực hiện trong một số năm qua Các nước này đưa ra quy chế đăng ký thuốc trong nước và một số thuốc nước ngoài xin lưu hành đều phải trình kết quả đánh giá TĐSH Sự gia tăng các thuốc generic trên thị trường cũng là một trong những yếu tố quan trọng thôi thúc các nhà quản lý của Bộ Y tế tìm ra một biện pháp để lựa chọn các thuốc generic có tương đương điều trị dùng trong lâm sàng Trên thực tế, nghiên cứu của các nước ASEAN cũng thực hiện trên chế phẩm qui ước, và hiếm có nghiên cứu trên chế phẩm giải phóng chậm.

Ở Châu Âu, năm 1987 đã có hướng dẫn về nghiên cứu SKD (Investigation

of Bioavailability), năm 1991 quy định chính thức đầu tiên về nghiên cún SKD

Chi phí đánh giá TĐSH của thuốc trên người tình nguyện khá tốn kém Theo thống kê của FDA, thực hiện đánh giá một chế phẩm có thể chi phí từ

10.000 đến 100.000 USD Vì vậy người ta quy định cụ thể những trường hợp cần thử in vivo, nhất là thử trên người tình nguyện.

1.3.2 Trong nước [7], [9], [10], [11].

Ở nước ta, khái niệm TĐSH mới được phổ biến trong vài năm trở lại đây, chưa có văn bản chính thức quy định về đánh giá SKD và TĐSH Năm

2008, bản Hướng dẫn thực hành tổt thử thuốc trên lãm sàng (GCP) đã được

ban hành (số 799/2008/QĐ-BYT) là tài liệu hướng dẫn chi tiết về đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu thực hiện trên người Đồng thời kèm theo quyết định số 2626, ngày 17/05/2008, Bộ Y tế cũng ban hành quy chế hoạt động của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Bản quy chế này quy định cụ the các hoạt động của hội đồng theo chuấn mực GCP hiện hành.Trong thời gian gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đã thực hiện một

số nghiên cứu bào chế dạng phóng thích kéo dài: bào chế viên Nifedipin, Salbutamol, Ketoprofen, Theophylin Một số nghiên cứu khác về tương đương điều trị cũng đã bước đầu đề cập đến như nghiên cứu đánh giá tương đương điều trị của chế phẩm Rifampicin, Omeprazol Trường đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã thực hiện nghiên cứu "Thiết kế và toi un

hóa công thức viên nén gliclazid 30 m gphóng thích kéo dài" trên cơ sở khóa

luận tốt nghiệp dược sĩ đại học nên mới chỉ so sánh công bằng phương pháp thử độ hòa tan, chưa có đánh giá một cách đầy đủ trên in vivo [7] Những nghiên cứu này đã góp phần tích cực trong đào tạo đội ngũ cán bộ nghành Dược có thêm kiến thức về SKD và TĐSH Kết quả có ý nghĩa lớn trong đào tạo, nhưng còn hạn chế về thực tiễn đánh giá sản phẩm thuốc; các quy định về GCP (trong pha lâm sàng) cũng như GLP (trong phân tích) chưa được áp dụng và tuân thủ một cách đầy đủ Vói chế phẩm TDKD, chưa có một nghiên cứu đặc biệt nào được áp dụng để đánh eiá về ảnh hưởng của thức ăn hoặc đánh giá ở trạng thái ôn định

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương là đon vị đầu tiên triển khai thực hiện nghiên cứu đánh giá TĐSH một cách chính quy theo yêu cầu của nhà nước Việc tiếp cận với phương pháp nghiên cứu, tài liệu hướng dẫn, chuấn bị

cơ sở vật chất đã được thực hiện từ năm 2003 Cho đến nay một số nghiên cứu đã được thực hiện, có thể theo yêu cầu cơ quan quản lý để xem xét cấp phép lưu hành hoặc một sổ nghiên cứu khác theo yêu cầu của chính doanh nghiệp nhằm tự đánh giá chất lượng thuốc của mình như Công ty c ổ phần Dược Hậu Giang, Công ty c ố phần Dược Imexpharm

Trước nhu cầu hội nhập và mục tiêu tăng cường đảm bảo chất lượng thuốc, Cục quản lý Dược đang soạn thảo ban hành danh mục các thuốc yêu cầu phải cung cấp dữ liệu về SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành Danh mục này

đã được gửi lấy ý kiến của các doanh nghiệp trong và ngoài nước đang kinh doanh dược phẩm tại Việt nam Do đó thuốc tác dụng kéo dài đều bắt buộc phải có kết quả đánh giá SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành Chính vì vậy, việc đánh giá TĐSH cho chế phẩm giải phóng chậm là cần thiết

\

Phần 2: NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2.4: Các mâu huyêt tương trăng đã sử dụng

r

Bảng 2.5: Các dung môi và hóa chăt sử dụng trong phương pháp phân tích

Tên thuốc thử Đô tinh khiết • Nơi sản xuất

- Trong đánh giá TĐSH hai chế phẩm viên nén gliclazid 60 mg: Sử dụng các mẫu huyết tương của NTN sau khi uổng thuốc thử hoặc thuốc đối chứng.

- Thuốc thử: Viên nén Glidin (Gliclazide controlled release tablets 60 mg)SKS: 06031

- Thuốc đối chứng: Diamicron® MR (Gliclazide 30 mg)

SKS: 797982 Ngày sản xuất: 08/2007 Hạn dùng: 08/2010

Nơi sản xuất: Công ty Les Laboratories Servier - France

Địa chỉ: 905, route de Saran 45520 Gidy - Pháp

Số đăng ký Việt Nam: VN-0465-06

Mô tả: Viên nén hình thuôn dài, màu trắng Một mặt khắc logo của hãng Les Laboratoires Servier (2 hình tam giác và 1 dấu hoa thị), một mặt khắc chữ DIA 30 Đóng gói 30 viên/vỉ, 2 vỉ trong hộp carton có in nhãn Trên nhãn hộp và

vỉ có ghi tên thuốc, hàm lượng, nơi sản xuất, số lô, ngày sản xuất và hạn dùng

- Cả hai thuốc dùng trong nghiên cứu đã được kiểm tra chất lượng theo

phiếu kiểm nghiệm số 38N 35 và 38N 36, hàm lượng gliclazid trong che

phẩm Glidin: 97,1% và Diamicron*MR: 97,4 % Kết quả kiểm tra chất lượng

cho thấv hàm lượng của hai thuốc khác nhau không quá 5%

2.1.2 Thiết bị

Sử dụng các thiết bị phân tích của Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương Tất cả các thiết bị đều được bảo trì, hiệu chuân định kỳ hàng năm theo đúng quy định của GLP và ISO

Bảng 2.6: Các thiết bị đã sử dụng trong phương pháp phân tích.

Cân phân tích Sartorius-CP224S, Đức

Cân kỹ thuật Sartorius-TE412, Đức

Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 - 16K, Đức

Máy lắc xoáy Velp, Italia

Micropipet Eppendorf, Đức

Đâu tip cho micropipet Eppendorf, Đức

Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp

Bảng 2.7: Thiết bị HPLC Shimadzu.

Autosampler Shimadzu SIL-20AC

Detector PDA Shimadzu SPD-M20A

Buông ôn nhiệt cột Shimadzu CTO-20A

Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả Shimadzu LC Solution Shimadzu

2.2 P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊ N c ứ u

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.2.1.1 Khảo sát lựa chọn nội chuẩn

Dựa trên nguyên tắc chất nội chuẩn cho vào chất cần phân tích với mục đích làm giảm sai sổ trong quá trình sử lý mẫu đến quá trình phân tích Do vậy chất nội chuẩn phải có công thức phân tử tương tự như chất phân tích, tính chất lý hóa tương

tự nhau đế trong quá trình xử lý chiết, tách, chạy sắc ký dễ dàng hon

2.2.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc kỷ

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UY-VIS Trên cơ sở lựa chọn 2 loại cột C]8 có sẵn là Phenomenex và Lichrospher

C hương trình sắc ký được xây dựng trên chuẩn GLI trong pha động và trong

huyết tương nhằm khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

- Khảo sát lựa chọn bước sóng cho detector PDA

- Khảo sát thành phần pha động, pH

- Khảo sát tốc độ dòng

- Khảo sát thể tích tiêm mẫu

2.2.1.3 X à \ dựng phương pháp x ử ỉý mâu

Khảo sát trên mẫu chuẩn GLI hòa tan trong pha động, mẫu huyết tương trắng

và mẫu thử tự tạo GLI nồng độ 2,5 ug/mL chuẩn trong huyết tương trắng (nồng độ

- Mau chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng

để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ GLI từ 0,2 - 2,5 |ig/mL

- Mau chuẩn trong pha động: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong pha động được dung dịch GLI nồng độ 2,5 |ig/mL

Tiến hành khảo sát theo các phương pháp sau:

a) Phương pháp kết tủa protein [5]

Nguyên lỷ của phương pháp: Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết

tương, nước tiếu ) thường chứa protein cản trở cho việc phân tích các

chất Do vậy, người ta thường dùng kỹ thuật kết tủa loại protein trước khi phân tích.

Các tác nhân gây tủa protein: Khảo sát trên 2 loại dung môi hưu cơ:

Acetonitril, methanol

Quy trình tủa protein: Hút (0,5 - 1 mL) mẫu thử, thêm tác nhân gây tủa

protein thích họp Lắc xoáy, ly tâm lấy dịch trong (10000 vòng/phút X 5 phút)

Tiêm sắc ký

b) Phương pháp chiết lỏng - lỏng [5]

Nguyên lý của phương pháp: Chiết lỏng - lỏng là một phương pháp phân

tách dùng trong xử ỉý mẫu để tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về tính tan trong hai pha chất lỏng không trộn lẫn, thông thường là pha nước và pha dung môi hữu cơ Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm hoá học, dùng để chiết hoạt chất từ pha lỏng này vào pha lỏng kia

Dung môi chiết: Khảo sát trên các loại dung môi sau: n-hexan,

chloroform, dichloromethan, hỗn hợp chloroform - MeCN, dichloromethan - ether với tỷ lệ thích hợp

Quy trình chiết lỏng - lỏng: Hút (0,5 - 1 mL) mẫu thử, thêm dung môi

chiết thích hợp (5-10 mL) Lắc cơ học, ly tâm lấy dịch chiết dung môi (4-5 mL) Bốc hơi dung môi (t°c/ khí nitơ) thu được cắn Hòa tan trong pha động Tiêm sắc ký

c) Phương pháp chiết pha rắn (Rắn - lỏng) [5]

Nguyên lý của phương pháp: Chiết pha rắn (Solid-phase extraction-SPE) là

một phương pháp phân tách dùng trong xử lý mẫu để tách riêng chất cần phân tích ra khỏi các tạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về ái lực của chất cần phân tích và các tạp vói pha động dạng lỏng và pha tĩnh dạng rắn Các tạp trong mẫu sẽ được rửa giải để loại đi trong khi chất cần phân tích được lưu giữ

lại trên pha tĩnh hoặc ngược lại Sau đó, chất phân tích được lưu giữ trên pha rắn

sẽ được rủa giải ra khỏi cột chiết pha rắn bằng dung môi thích hợp

Lựa chọn cột chiết pha ran: Tiến hành khảo sát trên cột Strata -X-C.

Quy trình chiết pha rắn:

Hoạt hoá cột: 3 mL MeOH X 2 lần

3 mL nước

3 mL đệm phosphat pH 3,0 Dung môi loại tạp: 3 mL đệm phosphat pH 3,0

3 mL nước

1 mL MeOH X 2 lần Dung môi rửa giải: 1 mL MeOH chứa N H4O H 1% (tt/tt) X 3 lần

2.2.2 Thấm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo

sát, theo các chỉ tiêu quy định của dược điến T rung quốc và M ỹ, theo hướng

dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học FDA [13], [28], [29], [31], [34] để đảm bảo nghiên cứu là phù hợp

+ Mầu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nong độ GLI từ 0,08 - 5,4 |ig/mL (Từ 1/30 Cmax đến 2 - 3 lần Cmax)

- Mầu trắng: Huyết tương trắng không chứa GLI

- Mầu thử: Huyết tương NTN sau khi uổng GLĨ.

- Mau QC: Chuẩn bị tương tự như các mẫu chuẩn Mau QC chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu chuẩn Nồng độ mẫu LQC (0,45 ng/mL), MQC (2,40 ng/mL), HQC (5,40 ịig/mL)

2.2.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc kỷ

Xác định tính thích họp của hệ thống sắc ký bằng cách tiêm dung dịch phân giải của GLI nồng độ 2,5 ịig/mL và IS nồng độ 40 (ig/mL trong pha động Hệ số phân giải giữa hai pic GLI và IS không được nhỏ hơn 2 Tiêm 6

lần dung dịch phân giải, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic GLI và IS phải nhỏ hơn 2%.

2.2.2.2 Đánh giá độ chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu

có nguồn gốc khác nhau, Huyết tương trắng có pha nội chuẩn (IS), Huyết tương trắng có pha chuẩn GLI ở nồng độ LLOQ và IS

Yêu cầu: Pic của GLI phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi

các pic tạp có trong mẫu Đáp úng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của GLI không được vượt quá 20% đáp ứng của GLI ở nồng độ LLOQ Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của IS

2.2.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Mối quan hệ giữa đáp ứng pic (diện tích pic) với nồng độ của GLI được

đánh giá bằng phương pháp bình phương tối thiểu và được biểu hiện qua

phương trình hồi quy tuyến tính Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

- Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhậy, độ chính xác, độ đúng của phương pháp Tham khảo một sổ tài liệu, nồng độ GLI cực đại trong máu

Cmax khoảng 2,5 |ig/mL khi dùng liều 60 mg Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn GLI trong huyết tương ở nồng độ khoảng 0,08 - 0,25 ịig/mL (1/30 -1/10 Cmax) với 6 mẫu độc lập Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng

tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ Xác định

độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch c v % giữa giá trị các lần định lượng

Yêu cầu: Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

tại cùng thời gian lưu Độ đúng phải bằng 80% - 120% so với nồng độ thực

Độ chính xác thể hiện bằng giá trị c v % khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%

Yêu cầu' Độ lệch so vói giá trị thực của các nồng độ phải < 15%, trừ tại

điểm LLOQ được chấp nhận < 20% Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn Hệ số tương quan r > 0,98

2.2.2.4 Xác định độ đúng và độ chính xác

- Độ đúng {accuracy): giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích

với giá trị thực của mẫu đã biết Tiến hành trên 3 nồng độ LQC, MQC và HQC, mỗi nồng độ làm 6 mẫu.

- Độ chính xác { p r e c is io n là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt

khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị cv (%) Tiến hành trên 3 nồng độ LQC, MQC và HQC, mỗi nồng độ làm 6 mẫu.

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày

Xác định nồng độ của mẫu kiểm tra (QC):

Bảng 2.9: Chuân bị các mâu QC trong huyêt tương

(|1 g/niL)

Mầu kiểm tra nồng độ thấp LQC < 3 XLLOQ 0,45

Mau kiếm tra nồng độ trung

Gần điếm giữa của đường chuân 2,40Mau kiếm tra nồng độ cao HQC 75% - 90% ULOQ 4,50

Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch cv% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày Xác

định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch c v % giữa giá trị các lần

định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau

Yêu cầu: Độ đúng tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến

115% Độ lặp lại trong ngày: Giá trị c v % phải < 15% Độ lặp lại giữa các ngày: Giá trị c v % phải < 15%

2.2.2.5 Tỉ lệ thu hồi của phương pháp

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương úng, tiến hành chiết tách như mẫu QC Xác định tỉ lệ thu hồi của IS và GLI bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của IS

và GLI trong các mẫu QC vói đáp ứng của IS và GLI trong mẫu chuấn pha trong dung môi pha mẫu Tỉ lệ thu hồi được tính theo công thức:

H ( % ) = - ! - x 1 0 0%

ScTrong đó:

- ST: Diện tích pic IS, GLI hòa tan trong huyết tương

- Sc: Diện tích pic IS, GLI hòa tan trong dung môi pha mẫu

Yêu cầu: Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích họp khi tỉ lệ thu hồi

không quá 110% và không thấp hơn 30% Giá trị c v % giữa các đáp ứng của IS

và giữa các đáp úng của chất phân tích trong các mẫu QC ở mỗi nồng độ phải nhỏ hon hoặc bằng 15% Tỉ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khác nhau quá ± 15%

2.2.2.6 Khảo sát độ ổn định

a) Độ ổn định dung dịch chuẩn GLI gốc và IS

Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

Phân tích, so sánh 3 mẫu có nồng độ khác nhau của dung dịch chuẩn GLI gốc và IS sau khi để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (lần

lượt là 6 giờ) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng Nồng độ

dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.

Độ ôn định dài ngày

Phân tích, so sánh 3 mẫu có nồng độ khác nhau của dung dịch chuẩn GLI gốc và IS sau khi bảo quản ở nhiệt độ -40 ° c những khoảng thời gian nhất định (1, 2 và 4 ngày với dung dịch GLI gốc; 1, 7, 22 và 50 ngày với

dung dịch IS) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.

b) Độ ổn định của mẫu huyết tương

Độ ôn định của mâu huyêt tưong sau 3 chu kỳ đông — rã

Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC, mỗi nồng độ làm tối thiểu 5 mẫu Chia làm 2 phần, mã hóa và ghi nhãn Phần 1 tiến hành định lượng ngay lấy kết quả ban đầu Phần 2 tiến hành để 3 chu kỳ đông - rã

- Chu kỳ 1: Mầu LQC, HQC sau khi chuẩn bị song, để đông 24 giờ trong

tủ bảo quản - 40° c , lấy ra để tan chảy hoàn toàn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

- Chu kỳ 2: Sau đó để trở lại vào tủ bảo quản trong vòng 24 giờ, lấy ra đê tan chảy hoàn toàn ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

- Chu kỳ 3: Tương tự, để đông - rã tiếp

Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ GLI có trong mẫu So sánh với kết quả xác định nồng độ GLI có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) Nồng độ GLI trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị c v % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC, mỗi nồng độ làm tối thiểu 5 mẫu, sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (6 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông Nồng

độ GLI trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị cv% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

Khoảng thời gian thử nghiệm độ ổn định dài ngày tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương của người tình nguyện Dự kiến đánh giá trên 20 NTN, thời gian thải trừ hết thuốc từ giai đoạn I sang giai đoan II là 10 ngày, tiến hành khảo sát độ ôn định trong 75 ngày Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -40°c, mỗi nồng độ tối thiểu 5 mẫu, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định So sánh nồng

độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu Nồng độ GLI trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị cv% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %

Độ on định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampỉer)

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC, mỗi nồng độ làm tối thiểu 5 mẫu, bảo quản trong auto-sampler sau một thời gian xác định và nồng

độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị cv% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc băng 15%

2.2.3 Đánh giá tương đương sinh học chế phẩm gliclazid

2.2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn, đơn liều và

đa liều (6 liều liên tục), trên người tình nguyện khoẻ mạnh trong tình trạng

đói Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 10 ngày

Trình tự (nhóm) Giai đoạn I Giai đoạn II

Trong đó: A - thuốc thử, B - thuốc đối chứng

2.23.2 Tuyến chọn người tình nguyện

- Đánh giá chung về tình hình sức khoẻ, khám tống quát về tim mạch, tiêu hoá, thần kinh, huyết áp, nhịp thở, tất cả phải trong giới hạn bình thường

- Các chỉ sổ xét nghiệm đều phải trong giới hạn bình thường X ét nghiệm

máu bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit; Xét nghiệm sinh hoá lâm sàng bao gồm: AST(GOT), ALT(GPT), ure, creatinine, glucose

- Xét nghiệm kháng thể HIV và kháng nguyên viêm gan B phải âm tính.c) Tiêu chuân loại trừ

- NTN nghiện ma tuý, rượu hoặc thuốc lá