Định lượng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ ( GC MS)

Thành phần acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong hạt đậu tương thường ít hơn trong động vật, nhưng đậu là loại cây dễ trồng đặc biệt là ở điều kiện thời tiết nhiệt đới, do đó có thể

B ộ GIÁO DỰC ĐÀO TẠO B ộ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • •

TRẦN CAO Sơ N

OMEGA 6 VÀ OMEGA 9 TRONG ĐẬU TƯƠNG

VÀ CÁC SẢN PHẩ M TỪ ĐẬU TƯƠNG BẰNG

KỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ KHố I PHổ (GC/MS)

LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC• • • •

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Xin chân thành cảm 077 các thây, cỏ Bộ môn Hóa Phân tích trường Đ ại học Dược

Hà N ội đã hướtìí Ị dan và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin chán thành càm ơìi Ban giám hiệu nhà trưỏnig, cam ơn các tlĩầv cỏ, cán bộ phòng quân lý sau đại học các p h ò n ẹ ban khác cùa tntờ ng Đ ại học Dược Hà N ội đã giúp

đờ tỏi trong suốt quá trình học tập tại tnrờng.

Cuôi cùmị xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những nẹười đã hết lòng ủng

hộ, độn % viên, giúp đỡ và tạo mọi điểu kiện cho tỏi hoàn thành tot để tài.

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2010 Dược s ĩ Trán Cao Sơn

Học viên cao học khóa 13, Chuyên ngành Kiêm nghiệm Thuôc và Độc chát

MỤC LỤC

LỜI CẢM Ơ N i

MỤC L Ụ C ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC B Ả N G vii

DANH MỤC CÁC HÌNH V Ẽ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH V Ẽ viii

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

CHƯƠNG 1 : TỒNG Q U A N 3

1.1 Tổng quan về lipid và acid béo 3

1.1.1 Vài nét về lipid 3

1.1.2 Các loại acid béo 3

1.1.3 Acid béo om ega 4

1.1.3.1 Acid béo omega-3 (acid béo n -3 ) 5

1.1.3.2 Acid béo omeea-6 (n-6) 7

1.1.3.3 Acid béo omega-9 (n-9) 8

1.2 Đậu tương và sản phẩm từ đậu tương 9

1.2.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương 9

1.2.2 Các sản phẩm từ đậu tương 10

1.3 Các phương pháp xác định acid b éo 11

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC ) 11

1.3.2 Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) 12

1.3.3 Sắc ký khí (G C ) 12

1.4 Giới thiệu về sắc ký khí khối p h ổ 14

1.4.1 Sắc ký khí 14

1.4.1.1 Khí mang 15

1.4.1.2 Buồng tiêm m ẫu 15

1.4.1.3 Cột tách và lò 16

1.4.2 Detector khối phổ trong sắc ký khí 17

1.4.2.1 Khái niệm 17

1.4.2.2 Nguyên tắc hoạt động 18

1.4.2.3 Cấu tạ o 18

1.4.2.4 Một số kỹ thuật MS : 20

1.4.3 ứ n g dụng của sắc ký khí khối p h ổ 21

1.4.3.1 Phân tích định tính : 21

1.4.3.2 Phân tích định lượng : 21

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23

2.1 Đối tượng nghiên c ứ u 23

2.2 Hóa chất, thiết b ị 24

2.2.1 Thiết b ị 24

2.2.2 Dụng c ụ 24

2.2.3 Hóa ch ất 24

2.2.4 Chất chuẩn 25

2.2.4.1 Chuẩn g ố c 25

2.2.4.2 Nội chuẩn 27

2.2.4.3 Pha dung dịch chuẩn 27

2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 28

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ 28

2.3.1.1 Mẫu đậu tương 28

2.3.1.2 Mẫu dầu đậu nành 28

2.3.1.3 Mẫu nước đậu n à n h 28

2.3.1.4 M ẫu đậu p h ụ 28

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid béo 28

2.3.2.1 Chiết chất béo khỏi nền mẫu 29

2.3.2.2 Dần xuất hóa tạo FA M E 29

2.3.2.3 Phân tích bằng GC-M S 29

2.3.3 Thẩm định phương pháp 30

2.3.3.1 Tính phù họp của hệ thống sắc k ý 30

2.3.3.2 Tính chọn lọc, đặc hiệu 30

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính 30

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 30

2.3.3.5 Độ lặp lại 31

2.3.3.6 Độ đúng 31

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu : 32

CHƯƠNG 3: TH ựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 33

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích acid b é o 33

3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích acid béo 33

3.1.1.1 Nghiên cứu điều kiện chiết m ẫu 33

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện chạy máy G C -M S 35

3.1.2 Thẩm định phương pháp 42

3.1.2.1 Tính phù họp của hệ th ố n g 42

3.1.2.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 43

3.1.2.3 Khoảng tuyến tính 43

3.1.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 46

3.1.2.5 Độ lặp lại 47

3.1.2.6 Độ đúng 50

3.2 ứ ng dụng phương pháp để phân tích một so acid béo omeea 3, 6, 9 trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tương 52

3.2.1 Xác thành phần một số acid béo omega 3, 6, 9 trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tương 52

3.2.2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến thành phần acid béo trong đậu tương 54

CHƯƠNG 4: BÀN L U Ậ N 56

4.1 Quy trình chiết chất béo và dan xuất acid béo 56

4.2 Chất nội chuẩn 58

4.3 Phân tích acid béo omega bằng GC-MS 58

4.4 Kết quả thẩm định phương pháp 59

4.5 Hàm lượng acid béo omega trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tương 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN N G H Ị 61

KẾT LUẬN 61

KIẾN N G H Ị 61

TÀI LIỆU THAM K H Ả O 63

PHỤ LỤC 68

CT Chương trình

HCBVTV Hóa chat bảo vệ thực vật

AOAC Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa

phân tích chính thức)

CI Chemical Ionization (lon hóa hóa học)

DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod)

EI Electron Impact (Va đập điện tử)

ELSD Evaporative light scattering detector (Detector tán xạ bay hơi)

ES External Standard (Chat neoại chuẩn)

FAME Fatty acid methyl ester (ester methylic của acid béo)

FID Flame Ionization Detector (Detector Ion hóa ngọn lửa)

FLD Fluorescence Detector (Detector Huỳnh quana)

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Quang phổ hong neoại biến

đổi Fourier)

GC Gas chromatography (Sắc ký khí)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sac ký lỏng hiệu năng

cao)

IS Internal Standard (Chất nội chuân)

LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

MS Mass spectrometry (Khối phổ)

RID Refractive Index Detector (Detector chỉ sổ khúc xạ)

S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

SIM Select Ion Monitoring (Chọn lọc ion)

ƯV-VIS Ultraviolet - Visible (Tử nsoại khả kiến)

DANH MỤC CÁC BẢNG•

Bảng 1.1: Một số loại acid béo omega-3 thường gặp 5

Bảng 1.2: Một số loại acid béo omega-6 thường gặp 7

Bảng 1.3: Một số loại acid béo omega-9 thường gặp 8

Bảng 1.4: Đặc điểm hai loại cột sắc ký khí - lỏ n g 16

Bảng 1.5: Các loại pha tĩnh chính dùng trong sắc ký k h í 17

Bảng 2.1: Các acid béo omega 3, 6, 9 mà đề tài nghiên cứu 23

Bảng 2.2: Thành phần của dung dịch chuẩn 37 acid b é o 25

Bảng 2.3: Cách pha các dung dịch chuẩn FAME làm v iệc 27

Bảng 3.1 : So sánh kết quả giữa một số phương pháp 35

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chương trình nhiệt độ c ộ t 37

Bảng 3.3: Xác định tính phù họp của hệ th ố n g 42

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid oleic (C18:ln9) 44

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của acid linoleic (C18:2n6) 44

Bảng 3.6: Ket quả khảo sát tuyến tính của acid y-linolenic (C18:3n6) 44

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tuyến tính của acid a-linolenic (C18:3n3) 45

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tuyến tính của acid arachidonic (C20:4n6) 45

Bảne 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của EPA (C20:5n3) 45

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoản? tuyến tính của DHA (C22:6n3) r, 46

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ lặp lại trong mẫu đậu tương 48

Bảng 3.12: Ket quả xác định độ lặp lại trong mẫu dầu đậu nành 48

Bảng 3.13: Kết quả xác định độ lặp lại mẫu nước đậu nành và đậu phụ 49

Bảng 3.14: Ket quả khảo sát độ đúng của phương p h á p 50

Bảng 3.15: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp 51

Bảng 3.16: Thành phần acid béo trong đậu tương và sản phẩm đậu tư ơng 52

Bảng 3.17: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hàm lượng acid béo omega 3, 6 trong đậu tương 54

Hình 1.1: Cây đậu tương và hạt đậu tương 9

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký khí 14

Hình 1.3 : Sơ đồ cấu tạo của máy khối phổ 18

Hình 3.1 Sơ đồ quá trình chiết chất béo 33

Hình 3.2: sắc đồ hỗn hợp FAME, cột DB5 (60m X 0,25mm X 0,25 | j x n ) 36

Hình 3.3: sắc đồ hỗn hợp FAME, cột SP 2380 (30m X 0,25mm X 0,2 ịim) 36

Hình 3.4: Phổ khối điển hình của các acid béo omega 3, omega 6, omega 9 39

Hình 3.5: sắc đồ của hồn hợp chuẩn FAME lp p m 40

Hình 3.6: sắc đồ chuẩn DHA 5 |ig/ml (tR 20,22) và nội chuẩn (tR 9,50) 41

Hình 3.7: sắc đồ chuẩn EPA 5|ig/ml (tR 17.66) và nội chuẩn (tR 9,5 2 ) 41

Hình 3.8: sắc đồ chuẩn ALA (tR 11,65) và nội chuẩn (tR 9,49) 41

Hình 3.9: Mầu trắng (A) và mẫu thêm chuẩn (gồm 4 chất C18:3n6, C18:3n3, C20:5n3 và C22:6n3) ở nồng độ 0,25 |ig/ml (B ) 43

Hình 3.10: sắc ký đồ xác định LOQ của 4 acid béo C18:ln9, C18:2n6, C18:3n6 và C18:3n3 46

Hình 3.11: sắc ký đồ xác định LOQ của C20:4n6, C20:5n3 và C22:6n3 47

Hình 3.12: sắc đồ xác định độ lặp lại trên mẫu đậu p h ụ 49

Hình 3.13: sắc đồ mẫu xác định độ thu hồi 52

Hình 3.14: Hàm lượng acid béo ở các thời eian bảo quản khác nhau 55

ĐẶT VẤN ĐÈ

Ngày nay, cùng với sự phát triển về kinh tế và mức sổng ngày càng tăng, con người phải đối mặt với nguy cơ về một số bệnh đến từ chính sự phát triển đó Tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, một vấn đề của xã hội hiện đại, ngày càng gia tăng Bên cạnh việc tìm ra các phương pháp và thuốc để chữa trị nhữns căn bệnh này, thì chế độ dinh dường cũng đóng một vai trò quan trọng nhăm phòng ngừa thậm chí có thê loại trừ được phần nào các tác động của căn bệnh này

Các loại acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 khi được sử dụng với tỷ lệ hợp lý là những acid béo có nhiều lợi ích đổi với sức khỏe con người, đặc biệt là cho hệ tim mạch Ngoài ra, vai trò của chúng đối với sự tạo thành cấu trúc bộ não của trẻ sơ sinh cũng đã được nhiều nghiên cứu chứng minh Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng là dầu cá có chứa nhiều các acid béo nói trên đặc biệt là omega 3 Các loại thực phẩm chức năng loại này có rất nhiều tác dụng đối với hệ tim mạch và rất cần thiết đối với phụ nữ có thai và cho con bú Tuy nhiên, giá cả của các loại dầu cá này thường cao do quá trình chiết xuất

từ cá biển khá tốn kém, hơn nữa các sản phẩm có nguồn gốc từ cá thường có một sổ nguy cơ ô nhiễm các chất độc khi sử dụng nhiều như ô nhiễm thủy ngân và các chất polyclorbiphenyl Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất các chế pham omega nhờ công nehệ vi sinh đã m ans lại các kết quả rất khả quan

Bên cạnh các acid béo có nguồn 2ốc từ động vật, thì một nguồn lớn khác các chat omega cũng có trone một số loài thực vật, nhiều nhất là trong hạt các loài cây

họ đậu đặc biệt là đậu tương Thành phần acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong hạt đậu tương thường ít hơn trong động vật, nhưng đậu là loại cây dễ trồng đặc biệt là ở điều kiện thời tiết nhiệt đới, do đó có thể dễ dàng thu được hàm lượng lớn acid béo omega với chi phí thấp Hiện nay các sản phẩm từ đậu tương được sử dụng rất phổ biến trong cuộc sống hàng ngày bao gồm dầu đậu nành, đậu phụ, nước đậu nành Xác định hàm lượne acid béo trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương góp phần quan trọng trons việc nghiên cứu chế độ dinh dưỡng nhằm cung

cấp hợp lý hàm lượng acid béo omeaa 3, omeea 6, omega 9 cho con người Trên thê eiới chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượna acid béo trong hạt đậu tương Hiện nay ở Việt Nam một số tác eiả đã nghiên cứu phươns pháp xác định acid béo trong một sổ đối tượng như dầu thực vật, chế phẩm thực phẩm chức năng, nhưng những nghiên cứu này mới dừne lại ở việc xác định thành phần các acid béo chứ chưa nshiên cứu đầy đủ phương pháp định lượng các acid béo, đặc biệt là acid béo omeaa Hiện nay vẫn chưa có phương pháp chính thức để phân tích acid béo trong đậu tương và sản phẩm từ đậu tươne nói riêng, và trong thực phẩm cũng như dược phẩm nói chung Ngoài ra, việc nghiên cứu hàm lượng acid béo omega 3, 6 9 trong đậu tương có thể góp phần nghiên cứu các chế độ ăn nhằm mục đích nâng cao sức khỏe con người, cải thiện giống nòi Với thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài “Định lưọng một số acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 trong đậu

tương và các sản phẩm từ đậu tưong bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ

(G C/M S)” với các mục tiêu:

1 Xây dựng phươna pháp định lượng một so acid béo omega 3, omega 6 và omega 9 thường gặp trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC/MS);

2 ứ n g dụna phương pháp để nghiên cứu hàm lượng một so acid béo omeea 3,

6, 9 trong đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương

CHƯƠNG 1 : TÒNG QUAN

1.1 T ổng quan về lipid và acid béo

1.1.1 Vài nét về ỉipỉd

Lipid là các hợp chất hữu cơ có trong động vật và thực vật, có thành phần cấu

tạo khác nhau thường là este của acid béo và alcol

Lipid có thể chia làm 2 loại: [7]

- Lipid đơn giản: là các este của acid béo với các alcol khác nhau, gôm 3nhóm:

o Triglycerid: ester của acid béo với glycerin

o Cerid: este của acid béo với các monoalcol có phân tử lượng cao

o Sterid: este của acid béo với cholesterol

- Lipid phức tạp: là loại lipid mà khi thủy phân sẽ tạo thành acid béo, alcol

và các chất khác, bao ạồm

o Phospholipid: thành phần có thêm các base nitơ và gốc acid phosphoric

o Glycolipid: thành phần là các acid béo, sphingosin và monosaccarid

Lipid là thành phần quan trọng cấu thành nhiều cơ quan trong cơ thế người và

là một thành phần không thể thiếu trong chế độ ăn hàng ngày của con người Ngoàiviệc là thành phần cung cấp năna; lượng cao nhất (9.3 kcal/kg), lipid còn chứa một

so acid béo không thể thay thể và đóng vai trò là dung môi hòa tan các quan trong như vitamin E, vitamin A [7],

1.1.2 Các loại acid béo

Acid béo là thành phần cơ bản cấu tạo nên lipid, các acid béo hầu hết đều là acid monocarboxylic có cấu tạo mạch thẳng thường có từ 4 đến 26 carbon trong phân tử Trong tự nhiên, đa số các acid béo đều có số c chẵn, thường gặp từ 12 đến 22C

Acid béo có thể được xếp vào hai nhóm chính là các acid béo no và các acid béo không no [7],

- Acid béo no (bão hòa): là các acid béo mà mạch c không chứa nổi đôi, ở điều kiện tự nhiên là chất rắn

- Acid béo không no (chưa bão hòa): là các acid béo mà mạch c có chứa 1 đến nhiều nối đôi Tùy theo số nổi đôi trong phân tử, người ra lại xếp thành các nhóm nhỏ:

o Acid béo không no có 1 nối đôi (Monounsaturated fatty acids = MUFAs) có cấu tạo dạng cis

o Các acid béo trans (trans fatty acid): Acid béo không no có một nối đôi dạng trans, đây là các acid béo có hại

o Acid béo không no có nhiều nối đôi (Polyunsaturated fatty acids = PUFAs) Các acid béo loại này có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe

1.1.3 A cid béo omega

Acid omega-x là khái niệm quy ước chỉ một họ acid béo không no có liên kết đôi C-C ở vị trí n-x, có nghĩa là liên kết đôi ở vị trí X từ nhóm methyl cuối cùng của acid béo

H 3Cí0 ~(CH2)n - C p- c „ - COOHĐánh số carbon của acid béo bắt đầu từ carbon của nhóm -COO H.Ịà C l, sau

đó là C2, C3 ; carbon cạnh nhóm -C O O H là c a rồi đến Cp, Cy Và ở cuối mạch là nhóm -C H 3 Carbon của nhóm methyl này được gọi là carbon omega (C(a) Khoảng cách từ carbon omega đen nổi đôi đầu tiên sần nhất nếu có 3 carbon thì gọi là omega-3, và acid béo có cấu trúc loại này gọi là acid béo omega-3 Cũng tương tự như vậy, còn có acid béo omega-6, omega-9 Tóm lại, chừ số sau chữ omega: 3, 6 hoặc 9 nhằm chỉ vị trí của nối đôi đầu tiên tính từ c w Ký hiệu omega (co) có the được viết đơn giản là n

Trong tự nhiên, có 3 loại acid béo omeea là acid béo omega-3, omega-6 và omesa-9 Những acid béo loại này đều có vai trò quan trọng trong đối với các chức năng của cơ thể.

1.1.3.1 Acid béo omega-3 (acid béo n-3)

a Khái niệm

Các acid béo n-3 là những chất có vai trò dinh dưỡng thiết yếu điển hình là

acid a - linolenic (ALA) , acid eicosapentaenoic (EPA), và acid docosahexaenoic

(DHA) Bảng 1.1 liệt kê một số acid béo n-3 thườns gặp

Bảng 1.1: Một số loại acid béo omega-3 thưòng gặp

(DPA)

C22:5n3

aỉl-cis-1,10,13,16,19-docosapentaenoic

acidAcid docosahexaenoic

(DHA)

C22:6n3

all-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic

acid

b Tác dụng của acid béo n-3

Trong các loại acid béo thì các chất omega 3 là loại acid béo có nhiều lợi ích hơn cả, với vai trò quan trọng nhất là tác dụng trên hệ thống tim mạch Các chất này

có tác dụng bảo vệ tim mạch, làm bền vững thành mạch, tránh sự hình thành các cục máu đông qua tác động đến sự kết tụ của tiểu cầu Làm giảm lượng trialycerid

máu, giảm loạn nhịp tim, giảm tỷ lệ bị bệnh suy động mạch vành, giảm chứng nhồi máu cơ tim [21] [30] [34] Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng thường xuyên các sản phẩm có chứa acid béo n-3 làm eiảm nguy cơ đau tim và các cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ gây ra Các chat bo suns có chứa EPA và DHA có tác dụna kích thích sự lưu thông máu, làm tăng phân hủy fibrin, một hợp chất liên quan đến tạo cục máu đông và hình thành sẹo, và thêm vào đó đã được dùng để làm giảm huyết

áp, tuy nhiên những chất có bổ sung ALA lại không cho thấy tác dụng này [27],

Ngoài ra, các acid béo omeea 3 còn có tác dụng đối với sự tạo thành não bộ của trẻ sơ sinh Thành phần của não là chất béo trong đó DHA chiếm khoảng 1/4 lượng chất béo, do đó não cần một lượng acid omega-3 (nhất là DHA) đê duy trì hoạt động Nsười ta còn thấy rằng DHA kìm hãm sự lão hóa não, ngăn ngừa sự suy giảm trí nhớ Với trẻ em, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy những trẻ được bố sung DHA đạt được các điểm nhận thức cao hơn, ít mắc phải các vấn đề về hành vi

và cảm xúc, kỹ năng vận động cũng phát triển sớm hơn Còn EPA, trong cơ thể nó được xem là acid béo thiết yếu để chuyển hóa thành các chất sinh học quan trọns như prostaglandin, leucotrien [21] [23],

Đối với da, nhóm acid béo omega-3 đóng vai trò chủ chốt trong cấu trúc da

và đặc biệt là với tầng sừng vì chúng ngăn ngừa hiện tượng mất nước giữa các lớp

da, vì vậy nhóm này có tác dụng làm da mềm mại và tươi trẻ Ngoài ra, acid béo omega 3 còn được ghi nhận là làm giảm nguy cơ tiểu đường, giúp cho iTỊắt được linh hoạt, tinh nhanh; giúp người bệnh nhanh chóng thoát khỏi chứng trầm uất; tác dụng tiêu diệt tế bào uns; thư và nhiều lợi ích khác đã được chứng minh [16] [23] Một sổ nghiên cứu báo cáo có thể có tác dụng chống ung thư của acit béo omega-3 (đặc biệt là ung thư vú, đại tràng và tuyến tiền liệt) Acid béo omega-3 làm giảm tốc

độ tăng trưởna; khối u tuyển tiền liệt [16] [39],

Trong khi đó nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng khi sử dụng lượng acid béo omega-3 dưới 3 g/ngày không gây ảnh hưởng đến sức khỏe FDA khuyến cáo rằng tổng số lượng axit béo Omega-3 từ thức ăn không quá 3 gam mồi ngày , trong đó có không quá 2 eam mỗi nsày là từ các chất bổ sung dinh dưỡng [13]

ỉ 1.3.2 A cid béo omega-6 (n-6)

a Khái niệm

Sau acid béo n-3 thì acid béo n-6 là loại acid béo cần thiết đối với sức khỏe con người nhất Các acid béo n-6 quan trọng nhất được liệt kê trong bảng sau

Bảng 1.2: Một số loại acid béo omega-6 thưòng gặp

Acid linoleic C18:2n6 cis 9,12-octadecadienoic acid

Acid y-linolenic C18:3n6 cis 6,9,12-octadecatrienoic acid

Acid eicosadenoic C20:2n6 cis 11,14-eicosadienoic acid

Acid dihomo y-linolenic C20:3n6 cis 8,11,14-eicosatrienoic acid

Acid arachidonic C20:4n6 cis 5,8,11,14-eicosatetraenoic acidAcid docosatrienoic C22:2n6 cis 13.16-docosadienoic acid

b Tác dụng của acid béo n-6

Các acid béo omega 6 cũng đã được chứng minh là có vai trò quan trọng đổi với hệ thống tim mạch Tuy nhiên với lượng acid béo n-6 quá cao, đặc biệt là với acid arachidonic, lại có thể gây tác dụng tiêu cực Các tác dụng sinh học của acid béo omega-6 là trung gian chủ yếu do chuyển thành n-6 eicosanoid và gắn vào thụ thể trong các mô của cơ thể Việc chuyển đổi acid arachidonic (C20:4 n-6) ở mô thành prostaglandin và hormon leukotriene cung cấp nhiều mục tiêu phát triển dược phẩm và thuốc điều trị để giảm sự tác động quá mức của acid béo n-6 trong xơ vữa động mạch, bệnh suyễn, viêm khớp, bệnh mạch máu, quá trình viêm miễn dịch

Tác dụng của omega 6 và omega 3 có sự ảnh hưởng lẫn nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ acid béo omega-6/omega-3 tốt phải dưới 10 và tối ưu là dưới 4, nếu tỷ lệ này vượt quá 30 có thể gây tác dụng xấu đến hệ tim mạch như khả năng gây ra đột quỵ, đau tim cấp, suy mạch vành, hen suyễn Chế độ ăn phương Tây hiện đại thường có tỷ lệ của n-6/n-3 cao, đôi khi lên đến 30/1 và đã gây ảnh hưởng đến hệ tim mạch, tăng xác suất bệnh trầm cảm [36]

1.1.3.3 A c id b éo o m e g a -9 (n-9)

a Khái niệm

Các acid béo omega-9 là thành phần phổ biến của dầu mỡ động thực vật, do

đó chúng không được xếp vào nhóm acid béo thiết yểu như acid béo omega-3 và acid béo omega-6 Hai acid béo omeea-9 quan trọng nhất là acid oleic ( C l8:1, n-9),

là một thành phần chính của dầu ô liu, dầu đậu nành và acid erucic (C 22:l, n-9), được tìm thấy trone dầu hạt cải, hạt giống và mù tạt

Bảng 1.3: Một số loại acid béo omega-9 thưòng gặp

Acid eicosenoic C20:ln9 11-eicosenoic acid

Acid nervonic C24:ln9 15-tetracosenoic acid

b Tác dụng của acid béo n-9

Các acid béo omega 9 giúp làm giảm xơ cứng động mạch, tăng cường hệ miễn dịch, ổn định lượng đường trong máu, ngoài ra có thể giúp giảm ung thư, tuy nhiên tác dụng của omega-9 không rõ ràng bằng omega-3 và omega-6 Thậm chí, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy nếu dùng omega-9 quá nhiều có thể gây ung thư

và bệnh tim mạch Cơ thể người có thể tự sản sinh được omega-9 nếu được cung cấp đủ omega-3 và omega-6, do đó điều quan trọng là trong chế độ ăn cần đảm bảo cung cấp đủ acid béo omega-3, omega-6 và omega-9 với một tỷ lệ phù hợp [39]

Các acid béo omega-9 có cấu trúc hình học dạng cis Những acid béo có thành phần tương tự nhưng cấu trúc dạng trans là những acid béo ảnh hưởng rất xấu đến sức khỏe, gây ung thư và bệnh tim mạch

1.2 Đ ậu tư ơng và sản phấm từ đậu tu’O’ng

1.2.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

H ình 1.1: C ây đậu tư ơng và hạt đậu tư on g

Đậu tươns hay còn gọi là đồ tương, đậu nành có tên khoa học Glycine max thuộc họ Đậu (.Fabaceae) Đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc, là một trong

những cây trồng lâu đời nhất của phương Đône Từ nhiều thế kỷ nay, người Trung Quốc và những người phương Đôns khác, bao eồm Nhật Bản, Hàn Quốc và Đông Nam Á đã sử dụng đậu tương trong nhiều thực phẩm khác nhau như một trong những nguồn cung cấp protein hàng ngày và năng lượng quan trọng nhất Đậu tương được coi như một “kho báu lớn”, “protein thần diệu của thiên nhiên" và còn

r*

được gọi là “thịt thực vật" Đậu tương có nhiều loại khác nhau, thích nghịi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới Đậu tương là cây hàng năm, cây ngắn ngày, nên có thể bố trí vào các mô hình luân canh, xen vụ để tăng vòng quay của đất, nâng giá trị kinh tế cho người sử dụng đồng thời hạn chế nguồn sâu bệnh lưu tồn qua mùa

Giốne ĐT84 là giống đậu tương được trồng phổ biến ở nước ta Giống này do Viện

Di truyền Nông nghiệp chọn lọc từ dòng đột biển của tổ hợp lai ĐT80 X ĐH4, cây cao 50 - 60 cm, thời gian sinh trưởne từ 80 - 90 ngày, hạt có màu vàng đẹp, rốn hạt màu nâu Năng suất của aiống này đạt 12 - 27 tạ/ha ĐT84 có thể trồng cả 3 vụ trong năm, nhưng sinh trưởng tốt nhất và đạt năng suất cao nhất trong vụ hè ĐT84 được công nhận giổns quốc gia năm 1996 Giống Giống ĐT22 là giống do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ v iện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ dòns đột biến hạt lai (DT95 X ĐT12) Giống ĐT26 là giống do Trung tâm nói trên chọn tạo từ tổ hợp lai giữa ĐT2000 và ĐT12 Giống có hàm lượng protein cao (42,21%) và lipid 19,72% [8],

1.2.2 Các sản phấm từ đậu tương

Đậu tương là loại thực phẩm được sử dụng rất đa dạng, trona đó chủ yếu là hạt đậu tương Nhìn chung hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảne từ 35,5 - 40%, lipid từ 15 - 20 %, hydrat carbon từ 15 đến

16 %, và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng cho sự sổng Hạt đậu tương

có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Ngoài ra, trong đậu tương có nhiều loại vitamin: vitamin B], B2, pp, A, E, K, D, c [3 ] Theo Từ Giấy và cộng sự (2000), hàm lượng của một số acid béo không no trong đậu tương như acid linoleic là 9g/100g thực phẩm ăn được, acid linolenic là 0,3g/100s thực phẩm ăn được Trong dầu đậu nành acid linoleic chiếm tỷ lệ cao khoảng 53%, acid a-linolenic (C18:3n3) chiếm tỷ

nhược và suy dinh dưỡng Đậu tương cũns là nguyên liệu của nhiêu ngành công nghiệp khác nhau, làm thức ăn cho 2Ía súc [3],

Phổ biến nhất trona các sản phẩm từ đậu tươna có thể kể đến dầu đậu nành, đậu phụ và sữa đậu nành Đây là những sản phẩm thực phẩm được sử dụng phổ biến

ở hầu hết các gia đình và có ảnh hưởng nhất định đến sức khỏe của người tiêu dùng

1.3.1 Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Kỹ thuật HPLC sử dụne các loại detector khác nhau như UV-VIS (tử neoại - khả kiến), RID (detector chỉ số khúc xạ), FLD (detector huỳnh quane), ECD (detector điện hóa) hoặc ELSD (detector tán xạ bay hơi) đã được nhiều tác giả sử dụng để nghiên cứu phương pháp xác định acid béo Trước hểt có thể kể đến phương pháp sử dụng cột pha đảo c 18 để phân tích hỗn hợp ester methylic của acid béo bằng RID [18], Cho đến nay, cột C18 vẫn được sử dụng phổ biến cho các phươns pháp phân tích acid béo tuy nhiên cần nhữne chế độ chạy gradient-phức tạp khi phân tích hỗn hợp các acid béo Các acid béo có thể được phân tích ở dạng tự do hoặc dẫn xuất thành dạng ester nhằm tăng độ phân giải píc Pha động được sử dụng

có sự khác nhau khi phân tích acid béo tự do hay dạng ester, đối với dạng ester thì

hệ dung môi nước acetonitril thường được sử dụng, trong khi đối với dạng tự đo thì cần phối hợp thêm acid acetic vào methanol và nước để tạo môi trường acid (với pH

< 4) Một số nghiên cứu khác lại sử dụng sắc ký trao đổi ion pha đảo kết hợp detector điện dẫn để phát hiện acid béo [18] Dù vậy, trong số các detector trên thì detector ƯV-VIS được sử dụng nhiều nhất, có lẽ do sự phổ biến của nó Thông thườna detector UV-VIS được sử dụng để phát hiện các acid béo có nối đôi liên hợp

như các acid béo omega-3 và omeea-6, đối với các acid béo khác cần có sự dẫn xuất hóa để tạo các chất dẫn xuất phù hợp So với detector ƯV-VIS, detector huỳnh quang thườne cho độ nhạy cao hơn, tuy nhiên cũn2 cần phải dẫn xuất hóa các acid

để tạo dẫn xuất phát huỳnh quana [17] Ngoài ra, detector tán xạ bay hơi cũng đã được một số tác giả nghiên cứu tuy nhiên những ứng dụng còn tương đối hạn chế Những phương pháp này nói chung khó có thể phân tích được hỗn hợp thành phần nhiều acid béo do khả năng tách hạn chế, đồna thời cần quá trình dẫn xuất hóa tương đối phức tạp [15] [24] [40] [41]

Kỳ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector khối phổ (LC-MS) được

sử dụng phổ biến gần đây có thể khắc phục những nhược điểm nói trên Do ưu điểm

là khả năng tách về khối, LC-MS có thể phân biệt được các chất đồng rửa giải qua cột Hai chế độ ion hóa phổ biến là ion hóa phun điện (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) đều có thể sử dụng được Phương pháp này có độ nhạy tốt và không cần dẫn xuất các acid béo tuy nhiên lại khá phức tạp và tốn kém, hơn nữa các loại acid béo trong thực phẩm nói chung thông thường tồn tại ở mức khá lớn nên không cần yêu cầu thiểt bị phân tích có độ nhạy quá cao [20] [28]

1.3.2 Quang ph ổ hồng ngoại biến đỗi Fourier (FTIR)

Phương pháp này cung cấp các thông tin khá hữu ích trong việc xác định thành phần các loại acid béo đồng thời có thể định lượng một so acid béo thông qua việc so sánh chiều cao của píc ở các bước sóng khác nhau với chuẩn F Andun và các cộng sự đã xây dựng được phươna pháp FTIR để phân tích các acid béo no, acid béo không no, EPA và DHA trong thịt mỡ lợn cho kết quả tương đối tốt với hệ

số tương quan tuyến tính > 0,99 Một số nghiên cứu khác phân tích acid béo no và không no trong dầu ăn cho sai số dưới 2,5% Tuy nhiên, phươne pháp này tương đối khó áp dụng và độ ổn định không cao trong định lượng [12] [13] [14]

1.3.3 Sắc kỷ kh í (GC)

Sắc ký khí có nhiều ưu điểm để áp dụng phân tích các acid béo Với khả năng có thể phân tích được tất cả các loại acid béo trong cùng một lần chạy máy,

kết quả phân tích tin cậy và chính xác phương pháp này đã và đang được áp dụng rộng rãi [19].

Do khả năng bay hơi hạn chế của các acid béo chuỗi dài và nhiệt độ bay hơi của các acid béo thườna khá rộne nên để đạt được độ phân giải cần thiết khi phân tích bằng sắc ký khí cần trải qua quá trình dẫn xuất hóa để tạo các dẫn chất dễ bay hơi Phổ biến nhất và dễ thực hiện nhất là quá trình tạo các dẫn chất ester của acid béo, trong đó ester methylic là loại dẫn xuất hay được thực hiện nhất Có nhiều phương pháp khác nhau đã được mô tả để tạo dẫn xuất ester methylic, bao gồm ester hóa với methanol trong môi trường acid sulfuric hoặc acid hydrocloric, esterhóa với methanol trone môi trường kiềm hoặc sử dụng các chất xúc tác khác như

ĩdiazomethan, bor trifloric [32] [35]

Nhiều loại pha tĩnh có bản chất phân cực khác nhau đã được sử dụng để phát triển các phươne pháp phân tích Các loại cột khôns phân cực hoặc phân cực yếu cũne được một số tác aiả sử dụng để tách các ester methylic của acid béo, nhưng phổ biển và cho hiệu quả tách tốt hơn cả là các loại cột phân cực Những loại này có thể có độ phân cực rất cao như các loại cột có bản chất alkylpolysiloxan, độ phân cực cao với bản chất là polyethylenglycol hoặc độ phân cực trung bình [35]

Để phát hiện các ester methyl của acid béo, có thể sử dụng detector ion hóa neọn lửa (FID) FID cho độ nhạy tốt với các acid béo và có khoảng động học tuyến tính rộng, có thể phân tích được các acid béo ở các mức nồng độ khác xa nhau Phương pháp này cũng đã được tổ chức AOAC chấp nhận và được sử dụng rộng rãi trên thế giới Hạn chế của phương pháp này là khi sử dụng detector FID để phân tích các chất mới thì không thể xác định được và yêu cầu phải có chất chuấn đế định tính, đồng thời độ nhạy của detector FID cũng tương đối thấp [35],

Gần đây, với sự phát triển của kỳ thuật khối phổ thì sắc ký khí khối phổ (GC- MS) đang là phương pháp được áp dụng nhiều nhất các acid béo trona thuốc và thực phẩm GC-MS độ nhạy tốt, độ chính xác cao và độ ổn định tương đối tốt, hơn nữa với thư viện phổ có thể xác định các chất mới dễ dàng [26] [31] [33]

Ở Việt Nam, một sổ tác siả đã nghiên cửu phươna pháp định lượng các acid béo trong dầu gấc hoặc trong một số sản phẩm dầu cá dùne làm thực phâm chức năng bằng sắc GC-FID và GC-MS [2] [6] Tác giả Nguyễn Tường Vy và cộng sự đã phân tích các thành phần của acid béo dầu gấc bằng cả GC-FID và GC-MS xác định được 18 loại acid béo trone dầu £ấc [10] [11], Tác giả Phạm Thị Kim Trang đã có nghiên cứu acid béo trong dầu thực vật, nhưng chỉ dừng lại ở mức xác định thành phần [6] Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều chọn sử dụng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ để phân tích acid béo.

1.4 G iói thiệu về sắc ký khí khối phổ

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất dựa vào sự phân bố của các chất eiữa hai pha, pha động là chất khí và pha tĩnh có thể là chat ran (sac ký khí rắn) hoặc chất lỏng (sắc ký khí lỏng) Thực ra trong sắc ký khí, pha động chỉ đóng vai trò làm chức năng vận chuyển chứ không tương tác với chất phân tích [1],

Sắc ký khí chỉ có thể áp dụng để phân tích được các chất ở thể khí và bền với nhiệt Đổi với những chất không có tính chất phù hợp thông thường cần tạo dẫn xuất có khả năng bay hơi tốt và có thể phân tích được bằng sắc ký khí [9]

T

\ /on

Detetor khối phô :Khí

1.4.1.1 K h í m a n g

Các loại khí mang sử dụng trong sắc ký khí khối phổ cần phải đảm bảo độ trơ và sạch Khí mang không được tương tác với các chất phân tích do đó yêu câu đầu tiên là phải trơ về mặt hóa học, thông thường thì heli, hydro, argon hoặc nitơ có thể đáp ứng được yêu cầu này Hơn nữa, khí mang cần đảm bảo độ tinh khiết đế khôna đưa các chất tạp bẩn vào cột phân tích Hiện nay, khí mang được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký khí khối phổ là heli [1]

1.4.1.2 Buồng tiêm mâu

Trước khi đi vào cột phân tích, thông thường mẫu ở dạng lỏng được cho vào buồng bay hơi rồi cho dòng khí mang đua vào cột Có 3 cách tiêm mẫu chính: [9]

- Tiêm mẫu chia dòng (split): Sau khi vào buồng bay hơi, mẫu được chia nhánh sao cho chỉ có một phần nhỏ của lượng mẫu ban đầu đi vào cột Các tỷ

lệ chia dòng phổ biến nhất trong khoảna từ 1:50 đến 1:100 Cách tiêm mẫu này có ưu điểm là giảm lượng mẫu vào cột trong trường hợp mẫu bấn hoặc

có nồng độ cao Tuy nhiên, do lượns mẫu vào cột nhỏ nên có thể làm siảm

độ nhạy, đồng thời gây ra hiện tượns thành phần mẫu vào cột có thế không giống thành phần mẫu ban đầu do các cấu tử có độ bay hơi khác nhau

- Tiêm mẫu không chia dòng (splitless): Mẩu sau khi vào buồng bay hơi đượcđưa toàn bộ vào đầu cột và được ngưng tụ lại ở đây, sau đó tăng nhiệt độ đếlàm bay hơi dần các cấu tử Phương pháp này có thể làm tăng độ nhạy vàphản ánh tươne đối chính xác thành phần mẫu ban đầu, tuy nhiên có the gây

ra sự doãng chân píc và nhanh làm hỏns cột phân tích

- Tiêm mẫu trực tiếp (on-column): Một số trườne hợp đặc biệt, khi thành phần mẫu chứa các chất không bền nhiệt, có nhiệt độ hóa hơi thấp nên khône thế bơm vào buồng bay hơi Khi đó có thể tiêm thẳng vào đầu cột và gia nhiệt từ

từ để bay hơi mẫu Phương pháp này có ưu điểm là toàn bộ mẫu được đưa vào cột nên phản ánh trung thành nhất thành phần ban đầu của mẫu Tuy nhiên, để thực hiện tiêm trực tiếp vào cột thì cần thiết kế đặc biệt của buồng

tiêm mẫu, cũng như thường chỉ áp dụng cho các loại cột có đường kính trong lớn (> 0,53mm) và phải dùng kim tiêm nhỏ nên dễ xảy ra hiện tượne gãy kim trong đầu cột.

ỉ 4.1.3 C ộ t tá ch và lò

Cột là trung tâm của hệ thốna sắc ký Trons sắc ký khí, có hai loại cột: cột nhồi và cột mao quản Ngày nay, do có nhiều ưu điểm nên người ta sử dụng phô biến cột mao quản Nhiệt độ cột sắc ký là một yếu tố quan trọng cần kiếm soát Lò

là bộ phận chứa cột và có chức năng điều nhiệt cho cột sắc ký [1],

B ản g 1.4: Đ ặc điểm hai loại cột sắc ký khí lỏng

Nguyên liệu chê tạo Thủy tinh, thép không £Ỉ Silica nung chảy

Kích thước Dài l-3m, dường kính trong

2-3 mm

Dài 10-100m, đường kính trone 0,l-0,7m m

(WCOT) hoặc chất mang bao pha tĩnh (SCOT)

Sô đĩa lý thuyêt

Hiệu suât tách ca ố tăng độ nhạy, giảm thời gian phân tích, có thể ghép trực tiếp với khối phổ

Các loại pha tĩnh: Trong sắc ký khí, pha tĩnh đóng vai trò chủ yểu trong

việc tách các chất khỏi nhau Tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà lựa chọn loại pha tĩnh cho phù hợp Các loại pha tĩnh có thể được xếp vào 5 nhóm dựa vào tính phân cực của nó bao gồm nhóm không phân cực, nhóm phân cực yếu, nhóm phân cực trung bình, nhóm phân cực và nhóm phân cực cao [9]

Bảng 1.5 nêu bản chất các loại cột thườne sử dụng hiện nay xếp theo 5 nhóm như trên Thực tế với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng xuất hiện những loại cột đặc biệt với độ chọn lọc rất cao, tuy nhiên với các loại cột nêu trong bảns này có thể đáp ứng được các yêu cầu trons phân tích sắc ký khí.

B ảng 1.5: C ác loại pha tĩnh chính dù n g trong sắc ký khí

Tên pha tĩnh

Tên thương mại

Tính phân cực

Nhiệt độ tối đa

HCBVTV

Polyethylen

Glycol

CarbowaxSupelcowax

Phân cực 250°c Acid tự do, alcol,

ether, tinh dầuPoly(dicyano

dimethyl) siloxan

OV-257SP2380

Phân cực

nhiều nối đôi, alcol

1.4.2 Detector khối phổ trong sắc kỷ kỉtỉ

1.4.2.1 Khái niệm

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z)

v ề bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượns của chúng

TRƯỜNG ĐH ĐƯỢC HÀ NỘI

X M " ĩ ĩ* !>\1K’q a y T-: '\-i .năm 20

ĐKCB: J

1.4.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Mầu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ sổ m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ

1.4.2.3 Cấu tạo

Sơ đồ cấu tạo của máy khối phổ gồm có 3 phần chính là nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phát hiện Hình 1.3 mô tả cấu tạo của một thiết bị khối phổ [1] [9]

Hệ chân không (áp suất 10'3 - 10'6 Pa)

Nạp mẫu

-Nguồn ion hóa - >

Bộ phận tích khối -

Bộ phận phát hiện

Bơm

H ình 1.3 : Sơ đồ cấu tạo của m áy khối phổ

a Bộ nạp m ẫu : nạp mẫu gián tiếp, đâu ra của cột mao quản GC được nôi trực tiêpvới bộ nguồn ion của máy khôi phô

b Nguồn ion hóa (Ion source) : ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng

thái khí hoặc hơi

Một số kĩ thuật ion hóa hay được sử dụng trong sắc ký khí khối phổ :

*t* lon hóa trên cơ sở va đập điện tử (EI): Mầu sau khi qua cột sắc ký ở dạng

hơi đi vào buồng ion hóa, ở đây xảy ra tương tác với chùm electron có

năng lượng thường là 70 eV tạo thành các các electron thứ cấp và một số phân mảnh của phân tử.

❖ lon hóa hóa h ọ c (CI): Cũng sử dụng chùm electron làm nguồn ion hóa,

nhưns chùm electron ion hóa các phân tử khí và ít ion hóa các phân tử mẫu (tỷ lệ phân tử khí thường cao gấp 103, 104 lần so với phân tử mẫu) Một trona nhữns tác nhân khí được sử dụng phổ biến nhất là khí metan (C H Ạ với áp suất lTorr các ion chính tạo thành là CH5+, C2H5+, C3H5+

c Bộ phân tích khối (Mass analyzer): Tách các ion theo tỷ số m/z Một số thiết bị phân tích khối lượng thường được dùng trong sắc ký khí:

♦> Thiết bị phàn tích tứ cực :

Cấu tạo bới 4 thanh điện cực đặt song song tạo thành 1 khoảng trống, trong

đó một trường điện từ được tạo ra bàng sự kết hợp giữa dòns một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Trường tứ cực được xác định sao cho các ion có thể đi tới detector Các tứ cực đóng vai trò như bộ lọc khối Khi một trường điện từ được

áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỷ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này

❖ Bay ton :

Cũng là một thiết bị tứ cực Gồm các điện cực hình trụ, điện cực hình mũ và điện cực vòng Mỗi điện cực này có các bề mặt hình hypebol ở bên trong Các điện cực hình mũ tạo ra một điện thế nền và áp thêm một tan so radio để điều.chỉnh dao động thế, còn điện cực vòng áp thể 1 MHz và điện thế 1 chiều (DC) Các ion được tạo ra bans cách đưa vào các electron phát ra từ một dây dẫn hoặc các ion có thể được đưa vào bẫy từ một nguồn bên ngoài Trên cơ sở tăne biên độ của thế RF, chuyển động của các ion tăng dần lên đến khi đường đi của chúng không ổn định dọc theo trục hình học của bẫy Ket quả là các ion này bị phóng ra khỏi các khe hở của điện cực hình mũ bên trái và được thu thập lại ở bộ khuếch đại electron Quá trình phóng các ion này theo trình tự tăng giá trị m/z và tín hiệu thu được phản ánh phố khối của các ion bị bẫy

❖ Phân tích thời gian bay :

Dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năna lượng Các ion

có cùns năng lượng nhưng khác nhau về khối lượne nên thời gian các ion đi tới

detector sẽ khác nhau Do có năng lượng động học hay vận tốc, các ion này sẽ bay

với khoảne cách xác định là d trong một khoảng thời sian t trong đó t phụ thuộc

vào tỉ số m/z Hiện nay có loại thiết bị phân tích thời gian bay phản xạ electron giúp

giảm sự phân bổ năng lượng động học của các ion đi tới detector và do đó sẽ làm

tăng độ phân giải của thiết bị

d Bộ phận p h á t hiện (Mass detection) : Thườns có hai loại nhân electron và nhân

quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện và khuếch đại đê đo

bằng hệ điện tử của máy khối phố

❖ Nhân electron (electronmultiplier) : Tác động của một ion lên bề mặt của

bán dẫn sẽ tạo ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của

các bán dẫn khác để tạo ra các electron khác Quá trình cứ thế tiếp diễn

để tạo ra nhiều electron Các electron được thu nhận và sổ lượng của

chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu - tức là số lượng ion đến detector

❖ Nhân quang (photomultiplier) : Các electron tạo ra theo cách trên va

chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon Các photon này được

thu nhận và số lượna của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu

1.4.2.4 Một sổ kỹ thuật M S :

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN): Hỗn hợp các chất phân tích

sau khi được tách và đưa vào detector khối phổ, khối phổ ghi nhận tổng cường độ

các ion sinh ra từ mỗi chất Chế độ Full scan cho đầy đủ thông tin về chất phân tích

hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

- K ỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM):

Khối phổ kế chỉ nhận diện một số ion và ghi sắc đồ theo ion lựa chọn Kỹ

thuật này làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín

hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N)

Kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 đến 100 lần

1.4.3.1 Phân tích định tỉnh :

+ So sánh thời sian lưu tR của chất phân tích với tR của chất chuẩn đối chiếu

trong cùng điều kiện sắc ký

+ So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu

+ So sánh phổ khối của chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều kiện sắc ký và so sánh phổ khối của chất phân tích với phố khối các chất có trong thư viện phổ -> phương pháp này cho kết quả tin cậy nhất

ỉ 4.3.2 Phân tích định lượng :

Một số phương pháp định lượng:

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích : Hàm lượne phần trăm của một thành

phần trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành phần có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng) Phương pháp này thường cho kết quả không tin cậy nếu không dùng hệ số đáp ứng fj

- Phương pháp ngoại chuẩn : Đường chuẩn được lập dựa trên mối tương quan

eiữa các lượng chất chuẩn đối chiếu khác nhau và diện tích pic tương ứng của chúng Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượng dựa trên đường chuẩn này Trong trường hợp này, các thône số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng phải rất ổn định và lượng bơm phải có độ lặp lại cao Phương pháp ngoại chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượne, nhanh, đơn giản, dễ làm Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền mẫu, thành phần hóa học và vật lý dễ mắc sai số lớn Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm chuẩn

- Phương p h á p thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều

kiện như phân tích mẫu bình thường Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất

có trong mẫu Phương pháp này có ưu điểm là loại trừ được phần nào ảnh hưởng của yếu tố nền tuy nhiên quá trình thực hiện tương đối mất thời gian, khó có thể áp dụng khi phân tích hàng loạt mẫu, hơn nữa không phải lúc nào chuẩn thêm vào và chất có sẵn trong mẫu có khả năng thu được giống nhau

- Phương pháp nội chuẩn : Trong phương pháp này, người ta chọn một chất

chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu

Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn Phương pháp này có độ chính xác cao,

vì nó có thể loại bỏ được các yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu chất phân tích Hơn nữa, phương pháp này còn có ưu điểm là do dựa trên hệ số tương quan về tín hiệu giữa chất cần phân tích và một chất nội chuẩn nên đây là phương pháp rất thích hợp khi nền mẫu quá phức tạp Song trong nhiều trường hợp rất khó có thể tìm được chất nội chuẩn thích hợp đế có thể xác định chất cần tách do nó phải thỏa mãn các yêu cầu như thời gian lưu gần sát với thời gian của chất phân tích, sự có mặt của chất nội chuẩn không ảnh hưởng lên tín hiệu của chất cần phân tích thu nhận được

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Đ ối tư ợng nghiên cứu

Mầu dùng để nghiên cửu là hạt đậu tương và các sản phẩm chính chế biến từđậu tương bao gồm dầu đậu nành, đậu phụ, nước đậu nành

Tiến hành lựa chọn một số loại acid béo omega 3, 6, 9 điển hình thường cótrong đậu tương để phân tích như trong bảng 2.1:

B ản g 2.1: C ác acid béo om ega 3, 6, 9 mà đề tài nghiên cứu

hiệu

Công thức cấu tạo

2.2 H óa chất, thiết bị

2.2.1 Thiết bị

- Máy sắc ký khí khối phổ (GC-MS) (Thermo Finnigan, USA)

- Cột sắc ký khí SP 2380 (30m X 0,25mm X 0,20 |im)

- Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (Shel Lab)

- Máy ly tâm (Mikko)

- Cân phân tích độ chính xác 0,1 mg (XT220A, Thụy Sĩ)

- Bếp cách thủy (GFL, Đức)

- Máy lac Vortex Genie 2 (Mỹ)

- Bep cách thủy nổi với sinh hàn (Eyela, Nhật)

- Máy rung siêu âm (Elma, Đức)

- Natri methylat (Merck)

- Dung dịch bor triflorid 50%/ methanol (Sigma)

- Methanol (Merck)

Toluen (Merck)

- n-Hexan (Merck)

- Natri clorid (Truns Quoc)

- Nước tinh khiết

2.2.4 Chất chuẩn

2.2.4.1 Chuân gôc

a Chuẩn gốc hỗn hợp acid béo (hãng Sigma) có nồng độ tổng 10 mg/ml Thành phần hỗn hợp chuẩn như ở bảng 2.2 Các thành phần in đậm là các acid béo mà đề tài nghiên cứu

B ảng 2.2: T hành phân của du ng dịch chuân 37 acid béo

% khôi lượng

Nông độ (ng/ml)

Methyl cis-5,8,11,14,17- eicosapentaenoat (EPA)

b Chuẩn đơn các acid béo sau:

- Methyl linolenat

- Methyl y-linolenat

- Methyl cis-4,7,10,16,19-docosahexaenoat (DHA)

Pha các duns dịch chuẩn đơn trong n-hexan để thu được các dung dịch chuẩn

có nồng độ 5 |!g/ml

2.2.4.2 Nội chuẩn

Chất nội chuẩn methyl nonadecanoat C19:0 (Sigma)

Cân chính xác khoảne 0,2g nội chuẩn C19:0, hòa tan trong n-hexàn và định mức đến 100ml bằng n-hexan, thu được dung dịch nội chuẩn 2000 ng/ml

Pha dung dịch nội chuẩn có nồng độ 50 |ig/ml trong n-hexan

2.2.4.3 Pha dung dịch chuân

Chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt từ 0,1 đến 10 |ig/ml

có nồne độ chất nội chuẩn cố định là 5|ig/ml như mô tả ở bảng 2.3:

B ản g 2.3: C ách pha các dung dịch chuẩn FA M E làm việc

Dung dịch chuẩn

hỗn hợp 20

ng/ml (nl)

Dung dịch chuân hỗn hợp 2 Jig/ml

(Ml)

Dung dịch nội chuẩn nồng độ

50 ^Ig/ml (jil)

n-hexan (Hi)

Nông độ acid béo (ng/ml)

2.3 P h ư on g pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và x ử lý mẫu sơ bộ

2.3.1.1 Mâu đậu tương

- Mầu giổng đậu tương lấy ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Mỗi mẫu lấy 200g cho vào túi polyethylen khô, sạch, đóng kín, điền đầy đủ thông tin chuyển về phòng thí nghiệm phân tích

- Mầu được nshiền nhỏ bane máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ mịn.đồng đều Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm

r

2.3.1.2 Mau dầu đậu nành

- Lấy mẫu ở các chợ ở khu vực nội thành Hà Nội, các mẫu dầu đậu nành là những dầu được công bố trên nhãn chai 100% đậu nành hoặc có thành phần pha trộn là dầu đậu nành Mỗi mẫu lấy tối thiểu 500ml

- Mầu được lắc kỹ trước khi đem phân tích

2.3.1.3 Mau nước đậu nành

- Lấy mẫu ở chợ Nguyễn Cao thuộc quận Hai Bà Trưng Mỗi mẫu lấy tối thiếu 500ml

- Mầu được lắc kỹ trước khi đem phân tích

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid béo

♦> N guyên ỉỷ : Mầu được thuỷ phân để tách chất béo trong khỏi nền mẫu, chất

béo sau đó được chiết bang ether và tạo dẫn xuất ester methylic (FAME) với chất

xúc tác bor triflorid FAME được chiết bằng n-hexan và được phân tích bằng sắc ký khí khối phổ.

2.3.2.1 Chiết chất béo khỏi nền mẫu

Các chất béo (lipid) tồn tại trong mẫu thường ở dạng kết hợp với các thành phần khác, do đó cần thủy phân để tách riêng chất béo khỏi nền mẫu [7] Sử dụng HC1 để thủy phân tách chất béo khỏi nền mẫu

Dung môi hữu cơ không phân cực sẽ hoà tan chất béo có trong nền mẫu, dựa vào sự phân bố lỏng - lỏng Trong đề tài này chúng tôi thực hiện chiết acid béo khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ Mầu đậu tương sau khi được thuỷ phân bang HC1, sẽ được chiết bằng hỗn họp dung môi hữu cơ ether ethylip và ether petrol Dịch chiết hỗn họp được loại ether bằng máy cô quay chân không rồi đem dẫn xuất hoá tạo dẫn xuất ester methylic

23.2.2 Dan xuất hóa tạo FAME

Có nhiều phương pháp để tạo dẫn xuất ester methylic của acid béo, trong đề tài này chúng tôi đã khảo sát 3 phương pháp khác nhau để dẫn xuất acid béo về dạng FAME như sau:

- Sử dụng dung dịch natri methylat trong methanol

- Sử dụng dung dịch bor florid trong methanol

Sử dụng dung dịch natri hydroxid trong methanol phối hợp boron florua

2.3.2.3 Phân tích bằng GC-MS

Sử dụng cột phân cực SP 2380 (30m X 0,25 mm X 0,2 |im) có bản chất là poly(dicyano dimethyl) siloxan

Cột SPB 5 (60m X 0,25mm X 0,25 |im) có bản chất là 5% phenyl polydimethyl siloxan

Khí mang He (> 99,999%)

Detector khối phổ với nguồn ion hóa EI và thiểt bị phân tích khối loại bẫy

2.3.3 Thầm định phương pháp

2.3.3.1 Tỉnh phũ hợp của hệ thong sẳc kỷ

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn có nồng độ xác định, tiến hành phân tích trên GC-MS lặp lại 6 lần Xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, diện tích pic và tỷ số diện tích pic chất phân tích/diện tích píc nội chuẩn

2.3.3.2 Tỉnh chọn lọc, đặc hiệu

Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các tạp chất hoặc các chất khác Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn

Trong sắc ký khí khối phổ có thể xác định tính chọn lọc, đặc hiệu' thông qua thư viện phổ chuẩn các acid béo Dựa vào các mảnh phổ có thế xác định sự có mặt của các acid béo

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó

Phương trình hồi quy tuyến tính y = a X X + b

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn

X là nồng độ chất khảo sát

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit o f detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)

Giới hạn định lượng LOQ (Limit o f quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trons mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ