Góp phần nghiên cứu tác dụng kháng histamin của cây kim ngân hoa và ké đầu ngựa trên mô hình gây hen thực nghiệm

Các bài thuốc này đã được dùng điều trị dị ứng và một số trường hợp hen phế quản trong nhiều năm nhưng chưa thấy tác dụng bất lợi của thuốc, ví dụ như bài thuốc KI và K2 [3, 77-84], Đây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUỆ ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN cứu TÁC DỤNG KHÁNG HISTAMIN

CỦA KIM NGÂN HOA VÀ KÉ ĐẦU NGỰA TRẼN MÔ HỈNH GÂY HEN THỰC NGHIỆM

CHUYÊN NGÀNH Dược LÝ - Dược LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 03.02.02

LUẬN VĂN THẠC s ĩ D ược HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS NGUYỄN XUÂN THẮNG

HÀ NỘI - 2002

s ề đ % d M ể J T

Tôi xin gửi lời cảm ơn đối với Đảng uỷ, Ban giám hiệu và phòng đào tạo sau Đại học trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt qúa trình học tập và nghiên cứu khoa học.

Tôi xin bày tó lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Xuân

Thắng, Chủ nhiệm bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội Người thầy luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt các thầy giáo, cô giáo, các cô kỹ thuật viên Bộ môn Hoá sinh.

Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các cô kỹ thuật viên Bộ môn Dược lý, Vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chị, bạn bè đồng nghiệp và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội ngày 20 tháng 12 năm 2002

DS Nguyễn Thị Huệ Anh

HLF: Histamin liberating factor (Tác nhân giải phóng histamin)

PAF: P lated activating factor (Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu)

Dí H r '■

MỤC LỤC

Mở đầu: 1

Chương 1: Tổng quan 3

1.1 Histamin và vai trò trong phản ứng dị ứng 3

1.2 Đại cương về dị ứ ng 12

1.3 Thuốc điều trị trong dị ứ ng 16

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứ u 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.2 Súc vật thí nghiệm 23

2.3 Hoá chất thí nghiệm 23

2.4 Thiết bị dụng c ụ 23

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.6 Xử lý số liệu 30

Chương 3: Kết quả thực nghiệm 31

3.1 Kết quả về xây dựng mô hình gây hen thực nghiệm 31

3.2 Tác dụng kháng histamin của nước sắc, dịch chiết flavonoid hoa kim ngân và nước sắc qua ké đầu n g ự a 38

3.3 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng histamin của nước sắc hoa kim ngân trên mô hình gây hen thực nghiệm 41

3.4 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng histamin của nước sắc quả ké đầu ngựa trên mô hình gây hen thực nghiệm 48

3.5 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng histamin của dịch chiết flavonoid trên mô hình gây hen thực nghiệm 52

3.6 Kết quả về so sánh tác dụng đối kháng histamin của thuốc tân dược với nước sắc kim ngân hoa và nước sắc quả ké đầu ngựa 55

3.6 Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu hoá sinh và huyết h ọ c 58

Chương 4: Bàn luận 64

Kết luận và đề xuất 68

Tài liệu tham khảo 70

MỞ ĐẦU

Mấy chục năm qua, số người mắc bệnh dị ứng có xu hướng tăng nhanh ở nhiều nước như Đức, Pháp, Liên Xô cũ Ở Việt Nam theo những công trình nghiên cứu dị ứng gần đây cho thấy tỷ lệ mắc bệnh dị ứng đang gia tăng Theo dự báo của khoaịmiễn dịch lâm sàng bệnh viện Bạch Mai tỷ lệ mắc bệnh hen phế quản có thể tới 6 -7 % dân số nước ta [5, 25-26] Nguyên nhân của tình trạng này theo nhiều tác giả là do ô nhiễm môi trường, sử dụng bừa bãi hoá chất trong sản xuất, thuốc men trong sinh hoạt và nhịp độ đời sống căng thẳng

Vì lí do này cho nên hiện nay có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào lĩnh vực dị ứng mà đặc biệt là bệnh hen phế quản, một bệnh có các triệu chứng như co thắt phế quản, tăng bài tiết dịch và chất nhầy ở đường hô hấp, điển hình là nhũng cơn khó thở; nếu không điều trị kịp thời sẽ gây tử vong

Cơ chế sinh bệnh quan trọng nhất của hen phế quản là viêm, trong đó có

sự tham gia của hàng loạt các chất trung gian gây viêm như histamin, serotonin, bradykinin, một số interleukin và các sản phẩm chuyển hoá của acid arachidonic như là leucotrien, prostaglandin Các chất trung gian hoá học này tham gia vào quá trình viêm dẫn tới biểu hiện các triệu chứng của hen phế quản Trước đây, người ta đặc biệt quan tâm tới histamin- một chất trung gian hoá học nổi bật trong các phản ứng dị ứng và phản ứng viêm Ngày nay, người ta còn chú ý tới nhiều chất khác nhưng dưới góc độ hoá sinh phân tử của miễn dịch dị ứng, histamin lại được phát hiện như là một chất điều hoà miễn dịch [32,735]

Trên thực tế lâm sàng các nhóm thuốc có cơ chế tác động tới histamin được sử dụng điều trị các bệnh dị ứng và hen phế quản rất có hiệu quả như

(£ u ă n -tfă n tíư ic tô d ư tíc /tc c f€ ểu M ýến H ỹ à n /t / ý - /đ m â ầ ỉtỹ

các thuốc kháng histamin, các thuốc có tác dụng đối kháng dược lý với histamin, các thuốc làm ngăn cản quá trình giải phóng histamin Các thuốc đó phần lớn là những chất được tổng hợp hoá học có nhiều tác dụng không mong muốn Trong khi đó, ở Việt Nam có một số dược liệu và bài thuốc y học cổ truyền chữa dị ứng và hen phế quản rất hiệu quả Các bài thuốc này đã được dùng điều trị dị ứng và một số trường hợp hen phế quản trong nhiều năm nhưng chưa thấy tác dụng bất lợi của thuốc, ví dụ như bài thuốc KI và K2 [3, 77-84], Đây là hai bài thuốc sử dụng dược liệu kim ngân hoa và ké đầu ngựa.

Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của dược liệu trong điều trị bệnh dị ứng và hen phế quản chưa được nghiên cứu nhiều Với hướng nghiên cứu về tác dụng đối kháng histamin - một chất trung gian hoá học trong bệnh dị ứng và hen

phế quản - của dược liệu, đề tài này tiến hành các nội dung sau:

1- Gây mô hình hen bằng phun khí dung histamin

2- Tìm hiểu tác dụng kháng histamin của nước sắc kim ngân hoa và dịch chiết flavonoid hoa kim ngân trên in vivo

3- Tìm hiểu tác dụng kháng histamin của nước sắc quả ké đầu ngựa trên in vivo

4- So sánh tác dụng đối kháng histamin của thuốc tân dược với tác dụng của kim ngân hoa và ké đầu ngựa

s& tđ ri ttă íi t/ta c iũ dư<fc : ($ ỉtu y ê tt u ỹ à /n A fJỀươc ỉ ý - ÍỀtM c- ử ừ m b à n y

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1- HISTAMIN VÀ VAI TRÒ TRONG PHẢN ỨNG DỊ ỨNG

1.1.1- Giới thiệu về histamin

1.1.1.1- Sự phân bố trong tự nhiên và nguồn gốc của histamin trong cơ thể

Histamin là một amin phân bố rộng rãi ở thực vật, các mô của động vật Chất này còn có mặt trong thành phần dịch bài tiết hay nọc độc của một số loại côn trùng [29, 581]

Năm 1907, histamin đã được tổng hợp và sau năm đó, người ta chiết được histamin từ các mô của các loại động vật có vú [29, 582]

Trong cơ thể một lượng nhỏ histamin có được do ăn các loại thực phẩm giải phóng histamin hoặc được hình thành nhờ vi khuẩn trong hệ đường tiêu hoá Nhưng cách hình thành chủ yếu là sự decarboxy hoá amino acid L - histidin, một phản ứng xảy ra trong các mô của các động vật có vú nhờ enzym histidin decarboxylase Sau khi hình thành histamin nhanh chóng được dự trữ hoặc bị chuyển hoá rồi thải trừ qua nước tiểu [37, 434], [1,159-172]

dạng base, dạng muối ngậm 2 phân tử hydro chlorid, dạng muối ngậm 2 phân

tử hydro sulfat

Các dạng muối thường dễ tan trong nước hơn dạng base Vì thế, histamin dạng muối gây ra tác dụng nhanh chóng khi dùng đường toàn thân [34,1587], [27, 325-326]

1.1.1.3- Sự phân bố, dự trữ histamin trong cơ thể

Hầu hết các mô của động vật có vú đều chứa histamin với hàm lượng từ 1 tới hơn 100 |ig/g Hàm lượng này trong máu và các dịch khác của cơ thể nhìn chung là rất thấp; tuy nhiên trong dịch não tuỷ của người lại chứa một lượng histamin đáng kể (Khandelwal et al., 1982) [29,581-583]

Nơi dự trữ histamin nhiều nhất là tế bào mast ở các mô Do đó, nồng độ histamin đặc biệt cao trong các mô có chứa một lượng lớn tế bào mastocyt như ở da, chất nhầy của phế quản và chất nhầy ở đường ruột, ở những vị trí

mô bị tổn thương ở mũi, miệng và bàn chân, bề mặt bên trong cơ thể, mạch máu và phế quản cũng tập trung một lượng lớn tế bào mast Trong các hạt dự trữ của tế bào mast, histamin tồn tại dưới dạng kết hợp với heparin và một protein cơ bản [8,129-133]

Ngoài ra, histamin còn có trong máu và bạch cầu đa nhân ưa kiềm Những tế bào này cũng tổng hợp histamin và dự trữ trong các hạt bài tiết của chúng

Histamin cũng được dự trữ ở những nơi không có tế bào mast như các tế bào biểu bì, các tế bào chất nhầy dạ dầy, tế bào thần kinh của hệ thần kinh trung ương, các tế bào đang phục hồi hoặc các tế bào đang phát triển mạnh [32, 735-737],

Khi lượng histamin chứa trong các hạt bài tiết của tế bào mast bị giảm đi thì phải mất nhiều tuần lễ sau nồng độ histamin mới trở về mức bình thường

vì tỷ lệ histamin hồi phục trong các hạt bài tiết rất chậm Còn những histamin

9 ? u â n m títa c A Ĩ d ư ơ c /ioc f€ J u M fê n tư jc m /i ’ c / ý - Staw ? lâ m â m tý

hình thành và được dự trữ tại các vị trí không có tế bào mast thì tỷ lệ khôi phục rất nhanh Vì thế, lượng histamin có ở các vị trí này thường xuyên được giải phóng nhiều hơn là dự trữ và đóng góp một cách có ý nghĩa vào lượng histamin tiết ra hàng ngày [29,583].

1.1.1.4- Sự bất hoạt histamin trong cơ thể

Trong cơ thể người có nhiều cơ chế khác nhau tham gia làm bất hoạt hoá histamin tự do, phòng ngừa khỏi sự tích luỹ nó Những cơ chế này có thể diễn

ra bằng các hệ men cũng như bằng cách liên kết nó với các protid khác nhau của máu, của mô, bằng heparin và các chất khác mà không làm thay đổi cấu trúc của nó [8,155]

Con đường thứ nhất: nhờ chất xúc tác imidazol-N- methyltransferase, histamin được chuyển thành methylhistamin sau đó lại tiếp tục bị oxi hoá thành methylimidazolacetic acid nhờ enzym diamin oxidase [26,261]

Con đường chuyển hoá thứ hai liên quan tới việc chuyển trực tiếp histamin thành imidazolacetic acid nhờ enzym diamin oxidase [2,77],[8,155- 156]

Con đường thứ ba: Histamin bị oxi hoá khử với sự có mặt của enzym histaminase Histaminase là enzym oxi hoá khử thuộc nhóm các enzym flavin Ngoài tác dụng với histamin, enzym này còn có khả năng phân tách các protid, acid amin và các hợp chất khác có nhóm amin Hoạt tính của enzym histaminase thường cao ở phổi, ruột và thận [8,156],

Ở người khoẻ mạnh, histamin liên kết gamaglobulin Tính chất của huyết thanh máu liên kết với histamin đã được gọi là chức năng pecxi hoá histamin của huyết thanh hay là histaminopecxia Chức năng này rất kém ở những bệnh nhân bị dị ứng [8,156-157]

Sự chuyển hoá histamin trong cơ thể được biểu diễn bằng hình 1 [2,80]

S ^ u đ n n ă n fh a c á ĩ tũ itíc /to e :C (r /m y ê it n y à n í), SW efc l ý - ỉđ n i b à /n y

ôxi hoá

▼Methylimidazolacetic

Hình 1- Sự chuyển hoá histamin trong cơ thể

1.1.1.5- Cơ chế hoạt động và tác dụng sinh học của histamin

4 Cơ chê hoat đông

Đã từ lâu các nhà nghiên cứu cho rằng histamin gây ra các hoạt động sinh học bằng cách kết hợp với các receptor đặc biệt ở trên bề mặt của màng

tế bào Ngày nay, người ta đã phát hiện ba loại receptor histamin khác nhau, được kí hiệu là H 1? H2, H3 Tất cả ba phân nhóm receptor này đều thuộc loại GPR, là nhóm receptor màng tế bào có 7 đoạn xoắn và gắn với protein G [35,413-463],[21, 94-96]

Trong cơ thể các receptor histamin có mặt ở các vị trí sau:

3 ỉu đ n t/ta c A Ĩ d iở ĩc ỈIOC f(rÁ m ỵ ê n Qì)ươc Ỉ'Ỷ - dỉ)u'ổc iứ m & àiiỹ

Ở não, thụ thể H I, H2 có vị trí ở màng tế bào sau synap, trong khi thụ thể H3 có vị trí ở tiền synap Hoạt động của các thụ thể tiền synap làm giảm giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh bao gồm: histamin, norepinerphrin, serotonin và achetylcholin Hoạt động của receptor HI chủ yếu trên tế bào nội

mô và tế bào cơ trơn, thường xuyên thúc đẩy quá trình thuỷ phân phosphoinositol và làm tăng lượng Ca+2 nội bào Hoạt động của thụ thể H2 chủ yếu trên các tế bào cơ tim, màng nhầy dạ dày và một số tế bào miễn dịch, đồng thời làm tăng cAMP nội bào

Hoạt động của thụ thể H3 làm giảm giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh từ hệ histamin và các nơron khác có thể thông qua sự giảm nồng độ Ca+2

ở các kênh Ca+2 kiểu N ở cấc đầu mút dây thần kinh [26,262-263].

Ạ Tác duns sinh hoc của histamin

Histamin là một amin có nguồn gốc sinh học tham gia vào quá trình điều hoà thần kinh dịch thể và trương lực của các mạch máu, các cơ quan có hệ cơ trơn, độ thấm của các mao mạch, sự tiết dịch của dạ dày, độ hoạt tính của hệ thống miễn dịch [8,157]

Sau khi gắn kết với cấc thụ thể đặc hiệu trên màng các tế bào khác nhau

histamin gây ra hàng loạt biểu hiện trên các hệ cơ quan và các tế bào đích khác nhau:

Histamin nằm trong mối tác động tương hỗ chặt chẽ với các chất trung gian khác tham gia vào sự điều hoà các quá trình thần kinh Khi gắn vào thụ thể H3 nó kích thích các đầu mút dây thần kinh nhạy cảm và tham gia trực tiếp vào quá trình dẫn xuất gây hưng phấn theo các sợi thần kinh cảm giác [26,264], [8,157],

Hơn nữa, histamin còn tham gia vào việc duy trì hoạt động tích cực bình thường của các trung tâm thần kinh giao cảm, của khứu não và tiểu não [8,158],

9Ỉ4iđn, n ă n títa c- tã d ư ơ c !w c n y m v /t, Q iíứ ỉc l ý ~ (â m b à n g

* Trên hệ nội tiế t:

Histamin là một trong những chất kích thích sự hình thành tác nhân trong vùng dưới đồi thị (hypothalamus) tham gia vào sự tổng hợp và tiết các hormon của tuyến yên Khi đưa histamin ngoại sinh vào vòng tuần hoàn chung sẽ làm thay đổi việc chế tiết neuron của các nhân thần kinh dưới đồi thị

và bằng cách đó làm tăng cường chức năng của các tuyến nội tiết khác Sự tăng cường tác động của histamin tới thượng thận khi stress làm tăng cường tác động các chất glucocorticoid [8,158]

Thông qua thụ thể H I, histamin gây co thắt cơ trơn của phế quản, ruột và

tử cung Với hệ mạch, nó làm giãn mao mạch và làm tăng tính thấm thành mạch [5,25-26], [28,307-309]

Ngoài ra, một tác dụng khác của histamin là làm tăng sự chế tiết chất nhầy trong phế quản [20,132]

Thông qua thụ thể H2, histamin làm tăng chế tiết acid và pepsin ở dạ dày, tác động điều nhịp dương tính đối với tim [35,425]

ở nồng độ sinh lý histamin kích thích các quá trình đồng hoá khôi phục

mô, thúc đẩy sự phát triển đúng của phôi Cùng với một số chất có hoạt tính sinh học khác, histamin còn đảm bảo cho sự cân bằng của các quá trình trao đổi trong các mô và các cơ quan, gây ảnh hưởng đáng kể tới diễn biến của các phản ứng cục bộ [8,158-159]

# Các chất đối kháng histamin

Dựa trên cơ chế và tác dụng sinh học của histamin, hiện nay người ta đang

sử dụng các chất có khả năng làm mất hoạt tính của histamin theo ba kiểu chính:

Kiểu đối kháng dược lý.

9?uwt mm % tíuic ầĩ ẩươc ầoc :c(rÁu/týê}i Hỹành ẩWi'c lỷ - (JỈ)ư<ĩc ừừm ứinỹ

Đó là những chất có tác dụng đối nghịch với tác dụng của histamin trên

cơ trơn Một chất điển hình là epinephrin ( Adrenalin ) Chất này hoạt động trên các receptor khác chứ không phải là các receptor histamin và gây ra các tác dụng dược lý đối nghịch với histamin Những chất tác dụng theo kiểu này đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong lâm sàng bởi vì tiêm epinephrin có thể cứu sống được bệnh nhân trong trường hợp sốc phản vệ toàn thân và những trường hợp có một lượng lớn histamin được giải phóng ra [26,264]

Đó là những chất làm giảm sự mất hạt của tế bào mast do phản ứng kháng nguyên-IgE theo cơ chế miễn dịch gây ra Hai chất đang được sử dụng điều trị hen là Cromolyn và Nedocromil có tác dụng như vậy, mặc dù cơ chế phân tử của những hoạt động đó chưa được biết Các chất chủ vận trên hệ P2- adrenergic cũng có khả năng làm giảm giải phóng histamin [26,262]

Đây là cách thứ ba để làm giảm tác dụng của histamin Trong hơn 45 năm, người ta đã biết tới các hợp chất cạnh tranh với histamin trên hoạt động của

cơ trơn Tuy nhiên, vào năm 1972 khi tìm ra Burimamide, một chất đối kháng thụ thể H2 thì người ta mới biết có những chất có khả năng đối kháng với tác dụng kích thích tiết acid dạ dày của histamin Sự phát triển về những chất đối kháng chọn lọc trên receptor H2 không chỉ định nghĩa hoạt động của histamin trên các thụ thể một cách chính xác hơn mà còn đem lại hiệu quả hơn khi điều trị loét dạ dày Hiện nay, các chất đối kháng chọn lọc trên receptor H3 không được sử dụng điều trị trên lâm sàng Chất điển hình là Thioperamide, chất này vượt qua được hàng rào máu não [26,265]

1.1.2 - Vai trò bệnh lý của histamin

Hàng ngày, trong cơ thể con người vẫn có một lượng nhỏ histamin tự do hoạt động để đảm bảo các chức năng sinh lý bình thường Nhưng trong một

số trường hợp chất này được giải phóng ra với số lượng lớn ở dạng tự do sẽ

SBrtđn ttđri títac áĩ tltừỉe /tce f€ỉiMỷêft nỹànA ẩw<2’c tý - Stafofc ủmt tiàny

gây ra các biểu hiện bệnh lý Các trường hợp đó là các phản ứng dị ứng, khi

có tổn thương tế bào, khi có chất hoá học giải phóng histamin trong cơ thể [28,305 - 309]

1.1.2.1 - Cơ chế giải phóng histamin

♦ Giải phóng kiểu miễn dich

Đây là một cơ chế bệnh lý quan trọng Histamin được giải phóng từ tế bào mast và basophil Những tế bào này gắn kháng thể IgE trên bề mặt khi tiếp xúc với kháng nguyên phù hợp sẽ gây mất hạt Sự mất hạt ngay lập tức kích thích giải phóng một lượng lớn histamin, ATP và các chất trung gian hoá học khác đã được dự trữ trong các hạt bài tiết đó Kiểu giải phóng này đòi hỏi phải cung cấp năng lượng và có sự tham gia của ion Ca+2'[3, 262], [2, 20]

♦ Giải phóng kiểu hoá hoc và cơ hoc

Các amin và cả các loại thuốc như morphin, tubocurarin có thể thế chỗ histamin trong phức hợp với heparin- protein trong các tế bào Kiểu giải phóng này không cần năng lượng và không liên quan tới sự tổn thương tế bào mast hay sự phá huỷ hạt Sự mất hạt của các tế bào mast cũng giải phóng histamin khi ion Na+I ở trong dịch nội bào nhanh chóng thay thế amin này trong phức hợp Các trường hợp tổn thương tế bào mast bằng phương pháp cơ học hay hoá học cũng gây ra sự phá huỷ hạt và giải phóng histamin Tuy nhiên, trong thực nghiệm hợp chất 48/80, 1 diamin polyme giải phóng histamin một cách đặc biệt từ tế bào mast do sự phá huỷ hạt lại đòi hỏi năng lượng và Ca+2[26,262]

1.1.2.2- Vai trò bệnh lý của histamin

Những chất này đến lượt chúng lại sản sinh một lượng dư thừa tác nhân kìm hãm histamin (HSF), HSF này ức chế rõ quá trình miễn dịch tế bào Tác dụng sau này, theo nguyên tắc liên hệ ngược, lại kích thích (và làm biến dạng) mạnh mẽ dung dịch dịch thể dẫn tới việc chuyển hướng các lympho B tăng cường tổng hợp IgE đặc thù (điều này xảy ra khi lần đầu tiên tiếp xúc với kháng nguyên).

Khi tiếp xúc lại với kháng nguyên, các hợp chất “ kháng nguyên-IgE” hấp thụ trên bề mặt của những tế bào mastocyte cũng gây nên tác dụng giống như tác dụng do nồng độ cao của tác nhân giải phóng histamin (HLF) khi tiếp xúc lần đầu Bằng cách đó, đã đạt được sự duy trì các phản ứng loại hình kiểu tức thì, bởi vì mỗi một lần tấn công sau đó của kháng nguyên tới cơ thể do những nguyên nhân giống như trên lại kèm theo sự giải phóng cao hơn mức chuẩn của histamin Histamin này kích thích những lympho T ức chế (Ts) nhạy cảm với nó Chúng ức chế miễn dịch tế bào thông qua HSF và do vậy thúc đẩy việc duy trì mức hoạt tính cao độ của dạng phản ứng miễn dịch dịch thể, điều này thể hiện ở sự tổng hợp những lượng IgE đặc thù mới

Đối với các phản ứng của loại hình dị ứng kiểu muộn, sự tham gia của histamin như sau:

Khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên nhưng không làm giải phóng tác nhân giải phóng histamin hoặc gây cảm ứng tiết ra một lượng rất nhỏ tác nhân này dẫn tới sự vắng mặt hay tiết rất yếu histamin từ các tế bào mastocyte và làm suy yếu tác động của histamin tới các tế bào lympho T ức chế (Ts) nhạy cảm với histamin Điều này khiến cho sự hình thành HSF trong Ts giảm và làm giảm ảnh hưởng của tác nhân này tới hoạt tính của miễn dịch thể dịch và làm hoạt hoá quá mức dạng phản ứng miễn dịch tế bào [9,166-170]

♦ Vai trò trong phản ứng viêm

Trong phản ứng viêm, histamin cũng tham gia dưới vai trò là một chất trung gian gây viêm Khi cơ thể tiếp xúc với các yếu tố độc hại, bị kích thích

9 ỉu â n v ă n tẳ a c A Ĩ d ư ơ c h o c :(rỉin ự (> n n y à n ỉi { ý - *3)ưưc lâ m íìà itỹr

dược lý hay bị nhiễm trùng bởi các vi sinh vật và các động vật ký sinh sẽ xảy

ra quá trình viêm Triệu chứng chính của viêm bao gồm: đỏ da, sưng phồng, tăng thân nhiệt, đau và ngứa Các triệu chứng này phần lớn là do tác dụng dược lý của histamin được giải phóng gây ra [28,20-25], [10, 68-76]

1.2 - ĐẠI CƯƠNG VỂ DỊ ỨNG

1.2.1 - Định nghĩa

Dị ứng là một phản ứng “ khác khác với phản ứng bình thường của một

cơ thể vẫn sẵn sàng để chống lại một chất lạ [12,4-5]

Ngoài ra, theo quan điểm về miễn dịch người ta còn định nghĩa như sau:

Dị ứng là một phản ứng trung gian miễn dịch đối với một kháng nguyên lạ (kháng nguyên dị ứng) biểu hiện bằng sự viêm các mô và rối loạn chức năng của các bộ phận trong cơ thể [29,790]

1.2.2 - Phân loại

Có nhiều cách phân loại dị ứng Dưới đây là các cách phân loại thường dùng [9,15-20], [29,790-796]:

1.2.2.1- Theo kinh điển:

Dị ứng được chia thành hai nhóm lớn:

- Nhóm dị ứng tức thì

Trong cơ chế của loại dị ứng tức thì có sự tham gia của nhiều hoạt chất trung gian hoá học Đáng chú ý là histamin, serotonin, nhiều loại kinin, leukotrien(A,B,C,D), yếu tố hoạt hoá tiểu cầu PAF, yếu tố hoá ứng động bạch cầu ái toan ECF-A

- Nhóm dị ứng muộn

Trong cơ chế của loại dị ứng muộn, có sự tham gia của nhiều hoạt chất trung gian hoá học loại lymphokin [2,16-17]

1.2.2.2- Theo Gell và Coombs:

Dị ứng được chia làm 4 loại hình

s&tđn vãn f/tac á ĩ dtửỉc /toc fêfuvụền, nyành tyưtíc lý - Qbươc lâm áànp

- Trong đó, ba loại hình I, II, III thuộc nhóm dị ứng tức thì (theo phân loại kinh điển).

- Loại hình IV thuộc nhóm dị ứng muộn (theo phân loại kinh điển)

♦ Loai hình I: mẫn cảm qua trung gian IsE (loai hình phản vê )

Kháng thể IgE chiếm giữ vị trí receptor trên các tế bào mast Trong vòng nhiều phút sau khi bộc lộ kháng nguyên , một kháng nguyên đa trị kết hợp với các phân tử IgE gần kề, hoạt động và phá huỷ các tế bào mast, c ả các chất trung gian hoá học thế hệ mới (cytokin, .) và các chất trung gian hoá học thế

hệ trước (histamin, seretonin, PAF, bradikinin, .) đều gây giãn mạch, co thắt

cơ trơn, kích thích tuyến bài tiết chất nhầy, thay đổi tính thấm của mạch và gây viêm các mô

- Hình thái lâm sàng của loại hình này bao gồm:

Các bệnh cơ địa dị ứng (viêm mũi dị ứng, hen dị ứng, viêm da cơ địa và dị ứng đường ruột), sốc phản vệ, mày đay và angioedema

♦ Loai hình II: mẫn cảm qua kháng thể (loai hình gậy đôc tế bào)

Dị nguyên: hapten hoặc tế bào gắn trên mặt hồng cầu, bạch cầu Kháng thể (IgG, IgM) lưu động trong huyết thanh người bệnh Sự kết hợp dị nguyên với kháng thể trên mặt, hoạt hoá bổ thể và dẫn đến hiện tượng tiêu tế bào (hồng cầu)

- Hình thái lâm sàng:

Bệnh thiếu máu tan huyết giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu do thuốc

♦ Loai hình III: loai mẫn cảm qua phức hơy miễn dich

Dị nguyên: huyết thanh, hoá chất, thuốc Kháng thể kết tủa (IgM, IgGl, IgG3) Dị nguyên kết hợp với kháng thể kết tủa, với điều kiện thừa dị nguyên trong dịch thể, tạo nên phức hợp miễn dịch làm hoạt hoá bổ thể Các phức hợp này làm tổn thương mao mạch, cơ trơn Hiện tượng Arthus là điển hình của loại hình III

- Hình thái lâm sàng:

9ỉtÚMt, ttăn l/iac áẽ dươc ỈICC riỹàníi ọttởỉc- lý ~ ^ùtứỉe- lâm áàỉtỹ

Bệnh huyết thanh, viêm khớp dạng thấp, viêm cầu thận, ban xuất huyết dạng thấp ( hội chứng Schoelen Henoch), bệnh phổi do nấm quạt (Aspergillus), viêm nút quanh động mạch,.v.v

♦ Loai hình IV: mẫn cảm Qua truns sian tê bào Tttoai di ứng muôn)

Loại hình IV về thực chất có các đặc điểm của dị ứng nhiễm trùng Dị nguyên: vi khuẩn, virus, độc tố vi khuẩn; một số nhỏ là thuốc, hapten, tổ chức,v.v Các lympho bào T mẫn cảm làm chức năng của kháng thể dị ứng Sự kết hợp dị nguyên với lympho bào mẫn cảm, có sự tham gia của đại thực bào, giải phóng hàng loạt chất trung gian có tên gọi chung là lymphokin Những chất này gây rối loạn chức năng, tổn thươnng tổ chức trong dị ứng muộn

(viêm da tiếp xúc, u hạt, V.V.).

Đặc biệt hình thái lâm sàng phổ biến nhất của loại hình này là viêm da do kháng nguyên tiếp xúc trực tiếp với da Phản ứng dị ứng thường xảy ra sau 1 tới 2 ngày kể từ khi tiếp xúc

1.2.3 - Chất trung gian và các tê bào tham gia phản ứng dị ứng

1.2.3.1 - Các chất trung gian hoá học:

Trong phản ứng dị ứng tức thì có sự tham gia của hàng loạt các chất trung gian hoá học khác nhau như: histamin, serotonin, bradykinin, leucotrien, prostaglandin, ECF-A, PAF, NCF

Trong phản ứng dị ứng muộn có sự tham gia của các chất trung gian gọi là lymphokin [12,20-28]

1.2.3.2- Các tế bào tham gia phản ứng dị ứng

Mastocyte là tế bào có trong các tổ chức khác nhau của cơ thể (chủ yếu ở niêm mạc và tổ chức liên kết), có khả năng tổng hợp và giải phóng các chất trung gian hoá học như: histamin, serotonin, bradykinin, heparin, leukotrien, prostaglandin, [9,129-130]

Q?uứn nmi títac- áĩ dươc ểiũc : TrJuMýên ngành Q)(M‘ ỉý - ỉđm bờ/nỹ

Ở người mastocyte có nhiều ở lưỡi, niêm mạc ruột, dạ dày, niệu quản, bàng quang, tử cung, các mạch máu lớn nhỏ, các tổ chức liên kết, phổi, phế quản, da, có ít ở tim, tuyến thượng thận V V [5,38-45].

Ở các động vật khác như: chuột lang và chuột cống trắng, mastocyte có nhiều ở dịch treo phúc mạc ruột, tổ chức liên kết, quanh các mạch máu [1, 224-226]

Trong các trường hợp dị ứng tức thì số lượng tế bào mastocyte giảm mạnh [1,228]

♦ Basoyhil

Trong máu ngoại vi basophil chiếm tỷ lệ rất thấp (0-1%) Trong các hạt của basophil chứa một lượng lớn histamin, heparin, acid hyaluronic, S.R.S.A, leucotrien, bradykinin,neutrophil, yếu tố hoá hướng động eosinophil

Trong các bệnh dị ứng có nhiều thay đổi về số lượng basophil Ví dụ: khi

bị viêm mũi dị ứng phấn hoa các tế bào này tăng lên trong máu ngoại vi và số lượng các tế bào này giảm khi hết khó thở trong hen phế quản [9,132-133]

1.2.3.3- Những biến đổi vê máu và bạch cầu

Bộ ba Lewis là biểu hiện bệnh lý điển hình của phản ứng dị ứng kiểu tức thì Điều đó cho thấy sự liên quan của dị ứng với viêm Hiện tượng viêm chỉ

là một hình thái lâm sàng của dị ứng Tuy nhiên, trong viêm nồng độ fibrinogen trong máu tăng cao Tỷ số albumin/ globulin (A/G) giảm do giảm albumin, tăng các thành phần globulin, đặc biệt là globulin p và Ỵ Tỷ số A/G

là một trong những chỉ tiêu đánh giá mức độ viêm [5, 41], [17, 28-30]

Một số thí nghiệm người ta cũng nhận thấy có sự tăng bạch cầu ưa acid ở các bệnh nhân dị ứng Tuy nhiên, vấn đề này vẫn đang được tiếp tục theo dõi [1,228]

1.2.4- Một sô hình thái lâm sàng của dị ứng typ.I

ă!u ân wăn //ta c á ĩ diù ỉc /w c : €fuM ýên n g à n h lỷ - (m u bàn y

1.2.4.1- Hen p h ế quản

Là bệnh đường hô hấp có ba đặc điểm : hội chứng co thắt, viêm đường

hô hấp, tăng tính phản ứng đường hô hấp [8,169-170]

1.3 - THUỐC ĐIỂU TRỊ TRONG DỊ ÚNG

1.3.1 - Thuốc tân dược

1.3.1.1- Kháng histamin

Kháng histamin là những chất ức chế cạnh tranh trên thụ thể H I Những thuốc này được sử dụng điều trị các loại dị ứng qua trung gian IgE Một số lượng lớn thuốc nhóm này được bán trên thị trường như: Kháng histamin thế

hệ I (chlopheniramin, brompheniramin, clemastin, hydroxyzin); kháng Histamin thế hệ II (loratadin, fexofenadin, cetirizin)

Các kháng histamin thế hệ I có tác dụng không mong muốn là gây buồn ngủ Một số thuốc kháng histamin thế hệ II không có tác dụng này [20, MO­MS]

1.3.1.2- Thuốc tác dụng trên thần kinh giao cảm

Các chất chủ vận adrenergic được sử dụng với các đặc tính trên cả a- adrenergic (với tác dụng co mạch) và P-adrenergic (tác dụng giãn phế quản) Các chủ vận a-adrenergic có thể được dùng theo đường uống (pseudoephedrin, phenylpropanolamin) hoặc dùng tại chỗ để nhỏ mũi (phenylephrin, naphazolin, oxymetazolin) làm co mạch mũi hoặc được dùng nhằm làm co mạch kết mạc mắt

ỈSrmtt -vãn t/iac áĩ(lưổc ỈIVC :v)/uttyên n ỹàn /i SWfcfc' ỉý - QỀưưt' /âm ếàtiỹ

sử dụng các chế phẩm nhóm này theo đường tại chỗ hàng ngày có thể làm tăng phản ứng ngược giãn mạch một cách nhanh chóng Tác dụng phụ của các chế phẩm co mạch đường uống chủ yếu là mất ngủ, mạch nhanh, rùng mình [29,793-796].

1.3.1.3- Glucocorticoid

Nhóm thuốc này có hiệu quả trong hầu hết các bệnh dị úng bởi hoạt động chống viêm do tác dụng ức chế miễn dịch của chúng Hiệu quả điều trị của nhóm thuốc này rất tốt nhưng lại có quá nhiều tác dụng phụ và độc tính Rất nhiều thuốc corticoid có mặt trên thị trường theo các dạng bào chế và đường dùng khác nhau như: đường uống, tiêm bắp, truyền, dạng khí dung vào phế quản và mũi, nhỏ mắt, nhỏ mũi Tuy nhiên, tác dụng phụ xảy ra cả khi dùng theo đường tại chỗ và toàn thân như: đục thuỷ tinh thể, loét giác mạc, viêm kết mạc, glaucom, bệnh Cushing, [20,132-139]

1.3.1.4- Cromolyn sodium và sodium nedocromil

Hai thuốc này được dùng để điều trị dự phòng nhờ tác dụng ngăn chặn đáp ứng với kháng nguyên bằng cách ổn định tế bào tế bào mast, thông qua một cơ chế hoạt động phân tử đặc biệt chưa được biết [20, 140-145]

1.3.1.5- Tác nhản kháng cholinergic

Ipratropium bromid rất hiệu quả trong điều trị viêm mũi dị ứng Sự bài tiết của tuyến màng nhầy chịu sự kiểm soát của hệ cholinergic và bị ức chế bởi tác nhân kháng cholinergic Tuy nhiên, chất này không làm giảm hắt hơi, ngứa, hay nghẹt mũi [29,795]

1.3.2- Dược liệu chữa dị ứng

Mặc dù, các thuốc tân dược dùng trong điều trị dị ứng rất nhiều nhưng mỗi thuốc chỉ tác dụng trên một khâu của phản ứng Trong đó, các thuốc đông y lại có xu hướng lập lại sự cân bằng của cơ thể Các dược liệu phối hợp trong bài thuốc đông y nhằm tác dụng tới nhiều giai đoạn của bệnh Vì thế, điều trị dị ứng bằng các bài thuốc đông y đã mang lại hiệu quả rất tốt đặc biệt

với một số thể bệnh như mày đay, hen hay các dị ứng thuộc loại hình kiểu tức thì.

Theo quan niệm của đông y dị ứng là các phản ứng của cơ thể khi bị hàn, nhiệt hoặc do phong gây ra Do đó, thông thường trong bài thuốc đông y chữa

dị ứng thường phối hợp các dược liệu có tác dụng thanh trừ nhiệt, thấp và dược liệu có tác dụng khu phong, hoạt huyết [14,15-16] Một số trường hợp nhẹ có thể chỉ dùng một dược liệu cũng mang lại hiệu quả điều trị tốt

Tuy nhiên, tác động cụ thể của các dược liệu này trên cơ chế của phản ứng dị ứng chưa được nghiên cứu một cách cụ thể Hiệu quả điều trị của dược liệu so với tân dược cũng đang được so sánh

Dưới đây là hai dược liệu có tác dụng chữa dị ứng thường dùng trong các bài thuốc đông y

1.3.2.1- Kim ngân [18,75-77].

- Tên khoa học: Lonicera japonica, thuộc họ Cơm cháy Caprifoliaceae

- Bộ phận dùng: hoa, cành, lá phơi hoặc sấy khô

- Thành phần hoá học : saponozit, inozit, lonixerin.(flavonoid)

- Tác dụng dược lý: tác dụng kháng sinh, tác dụng tăng đường huyết, tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ

- Công dụng và liều dùng: chữa mụn nhọt, rôm sảy, lên đậu, lên sởi, tả lỵ, giang mai

Trên thực nghiệm gần đây kim ngân hoa được dùng chữa viêm mũi dị ứng và một số trường hợp dị ứng khác có kết quả Đông y dùng dược liệu này theo quan điểm thanh trừ nhiệt, thấp Các trường hợp dị ứng người ta thường dùng kim ngân hoa

Liều thường dùng từ 6g - 12g

(£ iiđ n năn tíư ic á ĩ dươe /toc : €Jưiiýên HẨjàn/i *Ềtứỉe- ( ý - w ươc /đ m &àrtỹ

1.3.2.2- Ké đầu ngựa [18, 78-79].

- Tên khoa học: Xanthium strumarium L, thuộc họ Cúc Asteraceae

- Bộ phận dùng: quả hay toàn bộ phần trên mặt đất của cây ké đầu ngựaphơi hoặc sấy khô

- Thành phần hoá học: flavonoid, xanthetin và xanthamin, iod,

- Tác dụng dược lý: chưa có tài liệu công bố Tuy nhiên, năm 1959 đã chữarất hiệu quả cho một số bệnh nhân bị bệnh ngoài da Trong hai năm 1969,

1970 đã dùng cao ké chế thành viên chữa bướu cổ đạt kết quả điều trị trên

80 % Những tài liệu cũ dùng chữa các trường hợp da xù xì màu đỏ như bị hủi Tại nhiều vùng ở Việt nam, Liên xô cũ và Trung quốc nhân dân vãn dùng ké uống chữa mẩn ngứa, mụn nhọt và bướu cổ

- Công dụng và liều dùng: ở Việt nam, Trung quốc ké dùng chữa mụn nhọt,

lở loét, bướu cổ, ung thư phát bối, mụn nhọt không đầu, đau răng, đau cổ họng, viêm mũi Nhân dân Liên xô cũ ngoài các công dụng trên còn dùng chữa hắc lào, nấm tóc

Liều thường dùng từ 4g - 8g

1.3.2.3- Giới thiệu vềflavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất polyphenol, phần lớn có màu ( xanh, đỏ ,tím, vàng ), được phân bố rộng rãi trong các loại thực vật; đặc biệt hay gặp trong các dược liệu có tác dụng: thanh nhiệt, tiêu viêm, giải độc,

bổ gan, v.v như kim ngân hoa, quả ké đầu ngựa, bồ công anh,

Flavonoid có cấu tạo khung c 6 - c 3 - c 6, tức là hai vòng benzen A và B nối với nhau qua 3 mạch carbon [22,8-19]:

SPftdn nmt áĩ r/ưtìc hoc :((rJu(/yên nyàti/t /ý - (ẾiởU' (ăm áàrtỹt

Đa sô trường hợp mạch 3 carbon đóng vòng tạo thành dị vòng c có Oxy:

Đính vào các vòng A, B, c còn có nhiều nhóm thế, đặc biệt là hai nhóm chức carbonyl và - OH phenol khiến các flavonoid có khả năng phản ứng rất lớn và gây nhiều tác dụng sinh học Các chất flavonoid có tác dụng sinh học được gọi là bioflavonoid Một số tác dụng sinh học của bioflavonoid có thể kể đến là:

Phân tử flavonoid có các nhóm thế - OH phenol nên có thể tương tác với các protid enzym làm thay đổi hoạt tính của nhiều enzym trong các hệ thống sinh học Các kết quả thực nghiệm đã chỉ ra nhóm chất này có tác dụng kìm hãm hoạt tính của các enzym oxi hoá khử, kìm hãm sự sinh tổng hợp protein trong các tế bào ung thư; tác dụng làm thay đổi hoạt tính của kinase Một số flavonoid có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase và lipooxigenase là những enzym xúc tác sự tổng hợp prostanglandin từ phospholipid

Flavonoid có khả năng hoạt hoá enzym histaminase và một số enzym khác để hạn chế sự giải phóng histamin và các chất trung gian trong cơ thể

$uđn năn Htac bĩ dtửỉc Aoc tâ/ưvyên ngànÁ Qbươc lý - SW/fr- lâm bàng

gây ra hiện tượng viêm nhiễm, dị ứng và choáng phản vệ Ngoài ra, flavonoid còn tác dụng lên hàng loạt các enzym khác như cathepsin, enzym alsosereductase, [22,12-19].

Hiện nay nhiều nhà khoa học và sinh học cho rằng flavonoid là chất chống oxy hoá lý tưởng của con người Tính chất này của flavonoid được thể hiện trên tác dụng chống viêm, tác dụng ức chế sự oxy hoá lipid, tác dụng bảo vệ màng tế bào gan, hạn chế sự chuyển hoá các chất độc [42,78]

Ngoài ba tác dụng sinh học chính kể trên, một số flavonoid còn thể hiện các tác dụng khác như: tác dụng chống dị ứng và làm giảm phản ứng quá mẫn trong choáng phản vệ, tác dụng chống ung thư, tác dụng chống loạn nhịp tim

và thiếu máu cục bộ, tác dụng chống co thắt cơ trơn, tác dụng lợi tiểu, thông

m ậ t [22,19-21]

Q?umt -tùm, l/toe áĩ dư<ỉc ỉtoc ^ iu ty ê n nyànA ^tươc /Ỷ ~ Stafefr (âm bàìtỹ

CH Ư Ơ N G 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Thuốc tân dược:

- Loratadin lOmg (kháng histamin thế hệ II) với biệt dược Clarityne của hãng Scherring Plough

- Theophillyn lOOmg của công ty dược phẩm trung ương II

2.1.2 Dược liệu

** Kim ngân hoa:

- Hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japonica Thunb., thuộc

họ Cơm cháy Caprifoliaceae

Hoa cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb., Caprifoliaceae) được thu hái

ở xã Phụng Công, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên vào tháng 3-5 và được

Bộ môn Thực vật trường đại học Dược- Hà Nội định tên khoa học Nguyên liệu sau khi thu hái được nhặt bỏ tạp chất, phơi trong râm mát và sấy ở nhiệt

độ 50° - 60° đến khô

Dùng nước sắc kim ngân hoa

- Dùng dịch chiết flavonoid của kim ngân hoa

(Dịch này được chiết theo quy trình của Bộ Môn dược liệu - trường Đại học Dược Hà Nội)

9ỉtwm -#ăn t/iac á ĩ dtttìc /toe :C é'huyên ttỹà n ả ^ươc ỉý - (Jtt4ữc- ỉđm ếàrtỹ

Dùng nước sắc quả ké đầu ngựa.

2.2 Súc vật thí nghiệm

Chuột lang đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng khoảng 300g

do trại chăn nuôi súc vật thí nghiêm Học viện quân y 103 cung cấp

2.3 Hoá chất thí nghiệm

- Histamin (do công ty Europe Continents s A tại Pháp cung cấp )

- Dung dịch acid acetic bão hoà, xanh metylen [10,15]

- Thuốc nhuộm Giemsa [10,15]

- Các hoá chất dùng trong điện di [19,30]

2.4 Thiết bị dụng cụ

- Máy phun khí dung nén khí của Nhật Bản hiệu OMRON CX3

- Máy điện di Biometra

- Ống xông thuốc

- Máy ly tâm Hettich

- Tủ lạnh

- Tủ sấy

- Máy điều nhiệt Mtakutesz

- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius

- Đồng hồ bấm giây điện tử

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Quy trình chiết xuất flavonoid của hoa kim ngân [17,21-22]

- Mô tả quy trình

9Pumt 'tỉ-ătt d ĩ dươc ỉưic :(€huụển n ỹ à ti/t QDươc lý - (Jj)ư<ỉc ùím bmta

Dược liệu được sấy 60° - 65°c trong tủ sấy lh, đem tán nhỏ thành bột Sau

đó, cân 500g bột dược liệu, chiết cách thuỷ hồi lưu bằng cồn 80° (1,51 X 3) Gộp các dịch chiết thu được, cất thu hồi dung môi đén khi còn khoảng 50% thì đem cô cách thuỷ đến cắn Hoà tan cắn trong 500ml nước cất, lọc loại tạp Dịch lọc cho vào bình gạn lắc với ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết ether không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết ether Tiếp tục chiết bằng cloroform trên bình gạn cho tới khi dịch chiết cloroform không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết cloroform Dịch nước cho vào bình gạn, chiết bằng ethyl acetat, gộp dịch chiết ethyl acetat, cô cách thuỷ hết dung môi ethyl acetat.Thu được cắn ílavonoid toàn phần

- Quy trình được biểu diễn qua sơ đồ 1:

ă h ú vrt ■ttăn tíu tc b ĩ dtềơe /w c n ỹ à n /i (ẵ)ư<k: l ý - ỉâ m b à rty

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết flavonoid toàn phần từ hoa kim ngân

2.5.2 Gây mô hình hen bằng phun khí dung histamỉn

- Sơ đồ máy (ảnh chụp ):

Hình 1: Thực nghiệm gây hen cho chuột lang bằng khí dung histamin

- Mô tả chi tiết máy:

♦ 1 - Máy phun khí dung

với các chỉ số kỹ thuật:

+ Chỉ số phun khí trung bình là 0,25ml/ phút + Kích thước hạt < 5 0 |am MMAD

(MMAD: Đường kính trung bình của khí phun ra) + Dòng khí phun tối đa là 10 1/ phút

+ Áp suất khí tối đa là 2,5 bar (250 kPa )

♦ 2 - Ống chứa thuốc ( dung tích ống chứa là 6 m l)

♦ 3 - Hộp giữ chuột

♦ 4 - Đồng hồ tính thời gian

Qỉuân »ăn títac àĩ dtửk- ítoc :c€/ưi/ụên nỹàn/i ^Ị)ươc lý ~ Qtìitâc (đnt íiàny

- Cách tiến hành thí nghiệm:

* Bước 1: Chuẩn bị thí nghiệm

+ Pha dung dịch histamin ở các nồng độ 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%.+ Chọn chuột lang khoẻ mạnh có trọng lượng từ 300g - 320g Đặt chuột vào hộp giữ chuột

* Bước 2: Tiến hành gây hen cho chuột lang

+ Cho dung dịch histamin với các nồng độ 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% lần lượt vào ống đựng thuốc

+ Phun dung dịch histamin vào mũi chuột cho tới khi chuột xuất hiện khó thở, phế quản co thắt dữ dội thì ngừng phun

+ Để cứu sống chuột khi bị hen quá nặng: cung cấp cho chuột nhiều không khí qua đường hô hấp

* Bước 3: Đánh giá kết quả

+ Tính thời gian từ khi bắt đầu phun dung dịch histamin cho chuột cho tới khi chuột bị co thắt phế quản: T (T tính bằng giây)

2.5.3 Xác định tác dụng kháng histamin của dược liệu trên mô hình gây hen thực nghiệm trên chuột lang.

- Cách tiến hành như sau:

1- Chọn các lô chuột gồm có lô chứng và lô thử

Mỗi lô gồm 6 con có trọng lượng tương đối đồng đều khoảng 300g/con.2- Lô chứng là lô chuột được uống 2ml nước cat.(Tj)

3- Lô thử là lô chuột uống 2ml dược liệu theo các nồng độ khác nhau.(T2)4- Sau đó, phun dung dịch histamin với nồng độ 0,5%

Xác định thời gian đến khi chuột lên cơn co thắt phế quản (T)

- Đánh giá kết quả: Theo công thức tính của Armitage và cộng sự [41, 213- 216]

1- So sánh thời gian trước khi lên cơn hen

Lô chứng là Tl; Lô thử là T2

J?'uẩn Kăn tíiac (ũ dươc /toe : mtuyều ngành Ọtìươc lý - %iửlc ÙPm ủàny

Dược liệu có tác động tới hàm lượng histamin khi T2 > T l.

2- Tính theo tỷ lệ %: p (cho biết tác dụng chống co thắt phế quản của chuột)

p % = [1 - ( T 1 /T 2 ) ] X 100

2.5.4 So sánh tác dụng chống hen của dược liệu và Theophillin.

- Cách tiến hành như sau:

1- Chọn các lô chuột gồm có lô so sánh và lô thử

Mỗi lô gồm 6 con có trọng lượng tương đối đồng đều khoảng 300g/con.2- Lô so sánh là lô chuột cho uống Theophiliin.(T3)

3- Lô thử là lô chuột uống dược liệu theo các nồng độ khác nhau.(T2)

4- Sau đó, phun dung dịch histamin với nồng độ 0,5%

Xác định thời gian đến khi chuột lên cơn co thắt phế quản (T)

- Đánh giá kết quả: Theo công thức tính của Armitage và cộng sự [41, 213- 216]

1- So sánh thời gian trước khi lên cơn hen

Lô so sánh là T3; Lô thử là T2

So sánh giá trị T3 và T2 Từ đó rút ra nhận xét về tác dụng của duợc liệu

so với loại thuốc tân dược dùng chống hen đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng

2- So sánh 2 tỷ lệ %: P3 và P2

Lô so sánh là P3; Lô thử là P2

P3 % = [ 1 - ( TI /T3)] X 100.

P2 % = [1 - ( T 1 /T 2 ) ] X 100.

2.5.5 So sánh tác dụng kháng histamin của dược liệu và thuốc kháng

histamin tân dược.

- Cách tiến hành như sau:

1- Chọn các lô chuột gồm có lô so sánh và lô thử

Mỗi lô gồm 6 con có trọng lượng tương đối đồng đều khoảng 300g/con.2- Lô so sánh là lô chuột cho uống Loratadine (Clarityne 10mg).(T4)

9ỷuđn ttăn tầac ẩtửk /toe :cệ/iu/yên nymiA %ttơc- ỉý - tđĩĩi bmta

3- Lô thử là lô chuột uống dược liệu theo các nồng độ khác nhau (T2)

4- Sau đó, phun dung dịch histamin với nồng độ 0,5%

Xác định thời gian đến khi chuột lên cơn co thắt phế quản (T)

- Đánh giá kết quả: Theo công thức tính của Armitage và cộng sự [41, 213-

216]

1- So sánh thời gian trước khi lên cơn hen

Lô so sánh là T4; Lô thử là T2

So sánh giá trị T4 và T2 Từ đó rút ra nhận xét về tác dụng của duợc liệu

so với loại thuốc tân dược nhóm kháng histamin đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng

2- So sánh 2 tỷ lệ %: P4 và P2

Lô so sánh là P4; Lô thử là P2

P4 % = [ 1 - ( TI / T4)] X 100

P2 % = [1 - ( T 1 /T 2 ) ] X 100

2.5.6 Phương pháp xác định một sô chỉ sô hoá sinh khác.

2.5.6.1 Điên di protein huyết thanh [19,29-47]

Nguyên tắc:

Protein là những phân tử lưỡng tính, điện tích quyết định bởi pH môi trường Tại pH= 8,6 các phân tử protein mang điện tích âm sẽ chuyển động về phía cực dương của điện trường Riêng thành phần Ỵ-globulin chuyển động về phía cực âm Tuỳ theo điện tích và kích thước, các phân tử sẽ chuyển động nhanh chậm khác nhau Trên giấy thạch protein huyết thanh tách thành các thành phần albumin và globulin a 1? oc2, ị3, Ỵ Dựa vào các thành phần được phân tách, ta tính được tỷ số albumin/globulin (A/G) của từng lô chuột thử và

so sánh với lô chuột chứng

2.5.62 Xác đình thời gian đôriỉỉ máu [10,12-13]

- Cách tiến hành:

- Sát trùng, lấy máu

ă ỉu đ n vă n l/ia c (ũ dư<ỉc /ư>e :c€JuMfền n y à n /i Qtìươc lý- - Qíìiứic- ỉđ m ờ m tỹ

- Đặt giọt máu đường kính khoảng 7mm trên phiến kính.

- Để yên trong 2 phút, sau đó cứ nửa phút nghiêng phiến kính một lần Nếu thấy giọt máu không thay đổi hình dáng tức là máu đã đông

2.5.63 Đếm số lương bach cầu và xác đinh công thức bach cầu [10, 16-18]

Dùng 2 ngón tay bịt kín hai đầu ống trộn, lắc đều trong 1 phút

- Nhỏ máu vào buồng đếm

- Đếm bạch cầu, rồi tính kết quả theo công thức:

N= A/100*20*25N- Số bạch cầu trong lm m 3 máu

A- Số bạch cầu đếm được trong 100 ô

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1- Kết quả về xây dựng mô hình gây hen

3.1.1 Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa nồng độ histamin và thời gian lên cơn co thắt p h ế quản của chuột lang.

Để tìm ra nồng độ histamin thích hợp cho phép quan sát thời điểm xuất hiện sự co thắt phế quản chính xác nhất và tính chính xác của phương pháp quan sát cao nhất, chúng tôi tiến hành phun dung dịch histamin với các nồng

độ 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% rồi theo dõi thời gian xuất hiện cơn hen Thí nghiệm được tiến hành trên 5 lô chuột, kết quả được trình bày ở bảng3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Mối tương quan giữa nồng độ histamin và sự co thắt phế quản.(n=6 ở mỗi lô)

* Ghi chú: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình ± S.E của 6 chuột

Ẩ itâ ti n m i lỉta c A Ĩ d tứ u.• ểw c :c€ J iw ự ê n n ^ à n /t Q ltM : l ý ~ (ă m á m tỹ

Mối tương quan này còn được minh hoạ ở hình 3.1 dưới đây:

độ sai lệch của phương pháp quan sát là lương đối nhỏ

Vì thế, chúng tôi quyết định chọn dung dịch histamin 0,5% đế phun trong các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Mối quan hệ giữa thời gian uống dược liệu và tác dụng chống hen

ph ế quản của dược liệu.

Đối với bất kỳ một thuốc nào được sử dụng theo đường uống đều đòi hỏi phải có thời gian hấp thu Tại thời điểm thuốc được hấp thu tới mức bão hoà

sẽ đo được tác dụng của thuốc tốt nhất Vì lí do này, chúng tôi tiến hành cho

rf /táH ră n t/ta c ứ đtử ỉc /w r M ỉm -yềtt n ạ à n ít Q tft.'c f j Qư<ĩc fứm M/ưỵ

chuột uống thuốc; sau đó để các khoảng thời gian khác nhau rồi mới xông histamin để biết tác dụng tốt nhất của thuốc.

3.1.2.1 Môi tương quan siữa thời gian uống nước sắc hoa kim nsán và tác duns chống hen vhếquản:

Thí nghiệm được tiến hành với 5 lô chuột:

Lô chứng: chuột được uống 2ml nước cất và được phun dung dịch histamin 0,5%

Lô 1: chuột được uống 2ml nước sắc hoa kim ngân với liều 3g/kg, để thời gian 30 phút Sau đó, phun dung dịch histamin 0,5% tới khi có sự co thắt phế quản

Lô 2: chuột được uống 2ml nước sắc hoa kim ngân với liều 3g/kg, để thời gian 60 phút Sau đó, phun dung dịch histamin 0,5% tới khi có sự co thắt phế quản

Lô 3: chuột được uống 2ml nước sắc hoa kim ngân với liều 3g/kg, để thời gian 90 phút Sau đó, phun dung dịch histamin 0,5% tới khi có sự co thắt phế quản

Lô 4: chuột được uống 2ml nước sắc hoa kim ngân với liều 3g/kg, để thời gian 120 phút Sau đó, phun dung dịch histamin 0,5% tới khi có sự co thắt phế quản

So sánh thời gian đến khi chuột có sự co thắt phế quản nhằm tìm ra thời gian uống thuốc cho tác dụng chống hen cao nhất Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Ịfăn títac áĩ dươc ỉwc :c€/iitụên n<jàn/i Ọỉ)ưtìc lý - ọtươc ừừm íìànỹ

Bảng 3.2 - Tác dụng chống hen phê quản của nước sắc kim ngân hoa theo thời gian uống thuốc (n=6 ở mỗi lô).

Lô chuột

;

Thời gian uống thuốc (phút)

Thời gian gây hen (giây)

Tỷ lệ phòng chống

co thắt phế quản(%)

* Ghi chú: Lô chuột thử được cho uống kim ngân hoa với liều 3g/kg

Số liệu trong bảng là giá trị trung bình ± S.E của 6 chuột

P: mức ý nghĩa thống kê khi so sánh với thời gian gây hen của lô chứng

Sau khi so sánh, chúng tôi thấy: để thời gian uống thuốc 60 phút rồi mới xông histamin thì chuột xuất hiện cơn co thắt phế quản là 216,7 giây chậm hơn rõ rệt khi chuột uống thuốc 30 phút rồi xông histamin và tỷ lệ phần trăm bảo vệ chuột chống lại sự co thắt phế quản là 44,9% cũng cao hơn khi để chuột uống thuốc được 30 phút (p < 0,001) Thời gian xuất hiện sự co thắt phế quản của lô chuột để 90 phút là 204,0 giây và lô chuột để 60 phút là216,7 giây; các số liệu này sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Thời gian xuất hiện sự co thắt phế quản của lô chuột để 120 phút và lô chuột để 60 phút là các số liệu sai khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Tuy nhiên, thời gian xuất hiện sự co thắt phế quản của lô để 120 phút ngắn hơn lô để 60 phút rất nhỏ

Sftmt, -vãn t/iac áĩ dươc /ưx :vỉ/unfên nỹmiẮ (Ềư<ừ:- ỉ ý - tâ m - bmta

3.1.2.2 Môi tương quan siữa thời eian uống dich chiết flavonoid của hoa kim nsân và tác duns chống hen phê quản:

Tương tự như thí nghiệm với nước sắc kim ngân hoa, chúng tôi tiến hành xác định thời gian để hấp thu dịch chiết cho tác dụng tốt nhất

Kết quả thu được minh hoạ ở bảng 3.3:

Bảng 3.3 - Tác dụng chống hen phế quản của dịch chiết flavonoid của hoa kim ngân theo thời gian uống thuốc (n=6 ở mỗi lô).

Lô chuột Thời gian

uống thuốc (phút)

Thời gian gây hen

(giây)

Tỷ lệ chống hen (%)

ỉênân nmt Mac á ĩ dươc Acc f€ftm ýền nym th Qbưổc lý - ỌỀtửỉc íđnt iìàn/ý