Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến vị thuốc hoàng liên (copitis chinensis franch) đến thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Bằng các phương pháp chế biến khác nhau mà cùng một vị thuốc có thể thay đổi thành phần hoá học và tác dụng sinh học của nó, trên cơ sở đó có thể dùng để chữa các bệnh khác nhau.. Với mụ

BỘ GIÁO DỤC VẢ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HẢ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG ANH

NGHIÊN CỨU Ả N H HƯỞNG

C Ủ A PHƯƠNG PHÁP CHẾ BIế N V ị T H U ốC HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRAN CH ) ĐEN THÀNH PHẦN Hó a HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC s ĩ • • Dược • HỌC•

Chuyên ngành

M ã số Người hướng dẫn

: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC c ổ TRUYỀN

: 03 02 06

: PGS.TS PHẠM XUÂN SINH

T.s CAO VĂN THU

HÀ NỘI - 2001

6

10

131518181820

2021

212121

2531313131

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật cây Hoàng liên

1.2 Phân bố và trồng hái

1.3 Thành phần hoá học của Hoàng liên

1.4 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của Hoàng liên

1.5 Chế biến Hoàng liên theo phương pháp cổ truyền

1.6 Công năng, chủ trị, liều dùng của hoàng liên

1.7 Một số phương thuốc điển hình có Hoàng liên

1.8 Phụ liệu chế Hoàng liên

1.8.1 Vai trò của phụ liệu trong chế biến ihuốc cổ truyền

1.8.2 Vài nét về phụ liệu chế Hoàng liên

CHƯƠNG 2: NGUYÊN PHỤ LIỆU,ĐỐI TƯỢNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên phụ liệu và đối tượng nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

2.2.2 Nghiên cứu về chế biến theo phương pháp cổ truyền

2.2.3 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của Hoàng liên

trước và sau khi chế

2.2.4 Xác định LD50 và một số tác dụng sinh học

CHƯƠNG 3 : THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Nghiên cứu về nguyên liệu Hoàng liên

3.1.1 Mô tả đặc điểm cây Hoàng liên

3.1.2 Đặc điểm vị thuốc Hoàng liên

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu cắt ngang thân rễ Hoàng liên

3.1.4 Đặc điểm bột thân rễ Hoàng liên

3.2 Nghiên cứu về chế biến Hoàng liên

3.3 Nghiên cứu về thành phần hoá học của HL trước và sau khi chế 36

3.5.2 Cách chế biến theo phương pháp cổ truyền 57

ADN: Acid dexoxyribonucleic

ARN: Acid ribonucleic

HLG: Hoàng liên trích nước gừng

HLGi: Hoàng liên chế giấm

P h ạm X u â n S in h - T rư ở n g b ộ m ô n D ược h ọ c c ổ tr u y ề n , TS Cao Vần Thu là n h ừ n g n g ư ở ỉ đẵ tậ n tìn h hư ơng’ dẫn, g iú p đ ỡ tô i h o à n th àn h

lu ậ n văn tố i n g h iệ p n à y.

T ôi x in ch ân th àn h b iê í ơn GS TS Phạm Thanh K ỳ - Trưởng•

bộ m ô n D ược liệu , PGS TS M ai T ố t Tô - Trưởng" b ộ m ô n D ược lự c

c ù n g cấ c th ấ y cô trong" b ộ m ô n : D ược h ọ c c ổ tru yền , D ược liệu , Dược lự c Trường' Đ ạ i h ọ c Dược H à N ội; Phòng" DƯỢc l ý - S in h hoấ, Phòng- H oấ p h â n tíc h - T iêu chuẩn Viện D ược liệu , TS Y h ọ c N g ô H y

- G iấm đ ố c T rung1 tâ m D ịch vụ y t ế - B ấc s ĩ g ’iã đ ìn h đã tậ n tìn h

g iú p đỡ, tạ o đ iề u k iệ n th u ận 1 0 ch o tô i trong- quắ tr ìn li n g h iê n cứu

và là m v iệ c tạ i c ơ sở.

T ôi x in ch ân th àn h cảm ơn B an g iấ m h iệu , Phòng" đ à o tạ o sa u

đ ạ i h ọ c cùng" cá c th ầy, cô g iấ o Trưởng- Đ ạ i h ọ c DƯỢc H a N ộ i đẵ tậ n tìn h g iả n g d ạ y tr o n g qu ấ trìn h h ọ c tậ p va n g h iê n cứu tạ i trưởng'

đ ố i v ớ i tô i.

D ong' th ờ i tô i x in cảm ơn đồng' n g h iệ p tậ p t h ể lớ p cao h ọ c

k h o ấ 4, g ia đ ìn h chồng: con và n g ười th ẫn đà động' viên, g iú p đ ỡ tô i

h o a n th a n h lu ậ n văn n à y.

T ôi x in trâ n trọng" cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2001

Phạm Thị Phương Anh

ĐẶT VÂN ĐỂ

Với trên 4000 năm lịch sử đựng nước và giữ nước, dân tộc Việt Nam đã sản sinh ra 1 nền y học cổ truyền không ngừng phát triển qua các thời đại,đặc

biệt ở thời đại mà chúng ta đang sống

Hiện nay thuốc cổ truyền đã và đang trở thành một xú thế phát triển manh, không những ở nước ta mà còn ở nhiều nước tiên thế giới Người ta ưa chuộng thuốc cổ truyền vì nó có những Uiế mạnh: Có tác dụng chữa bệnh tốt, ngay cả đối với nhiều bệnh nan giải như một số bệnh mạn tính : gan, thận, khớp v.v hơn nữa nó còn có tác dụng điều hoà âm dương, cân bằng sự hoạt động giữa các bộ phận trong cơ thể

Người ta thấy rằng khi sử dụng thuốc cổ truyền hầu như rất ít có những phản ứng không mong muốn Nói một cách khác khi sử dụng chúng, người bệnh cảm thấy yên tâm hơn, an toàn hơn Để phát huy tác dụng thuốc y học cổ truyền, điều cần quan tâm là phương pháp chế biến Phương pháp chế biến cổ truyền rất đa dạng và phong phú Cho đến nay có thể khẳng định được rằng các vị thuốc cổ truyền dùng để uống đều phải qua khâu chế biến Bằng các phương pháp chế biến khác nhau mà cùng một vị thuốc có thể thay đổi thành phần hoá học và tác dụng sinh học của nó, trên cơ sở đó có thể dùng để chữa các bệnh khác nhau

Với mục đích góp phần vào nghiên cứu chế biến và tác dụng sinh học của các vị thuốc nói chung, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chế biến vị thuốc Hoàng liên, một vị thuốc quý hiếm, được sử dụng rộng rãi, từ lâu trong Đông

y nói chung và Y học cổ truyền Việt Nam nói riêng

Đề tài được tiến hành nhằm 3 mục tiêu chính là :

1 Tìm hiểu một số thay đổi thành phần hoá học chính (berberin) và tác dụng sinh học của Hoàng liên sống và Hoàng liên chế

2 Tìm hiểu ảnh hưởng của một số phương pháp chế biến cổ truyền khác

nhau tới LD50 và lác dụng sinh học, để đánh giá "tính khoa học " của phương

pháp và kỹ thuật chế biến

3 Góp phần xây dựng tiêu chuẩn của Hoàng liên chế

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY HOÀNG LIÊN.

Có nhiều loài Hoàng liên chân gà như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall,Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta Họ Hoàng liên: Ranunculaceae

Hoàng liên : Coptis chinensis

Franch, là một cây thuốc thuộc loại

quí hiếm, được ghi vào sách đỏ Việt

Nam [1]

Họ Hoàng liên: Ranunculaceae

Tên khác :Hoàng liên chân gà,

xuyên liên ,phàng lình (H'mông)

[20].Read Coptis (Anh) Coptide

savoy arde(Pháp [1,20] Gia liên

< (Trung Quốc)[20]

H ình 1.1 Coptis chinensis Franch[l]

Hoàng liên : Coptis chinensis Franch là cây thuộc thảo, sống nhiều năm Thân rễ màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc tập trung ở gốc, lá dài mảnh chia làm 3 thùy chính Mép khía răng không đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy dạng lông chim, không đều Hai thùy bôn giống nhau có cuống ngắn hơn thuỳ giữa Lá có màu lục, bóng, cụm hoa gồm

I

3-5 cái mọc tụ tán trên 1 cuống chung dài khoảng 25cm Hoa nhỏ màu vàng,

lá bắc nhỏ, bao hoa mầu lục Năm lá đài hình mác, 5 cánh hoa Ihuôn dài, nhị khoảng 20 cái Lá noãn 8 - 1 2 cái rời nhau Ra hoa từ tháng 10 - 12 Quả đại

1.2 PHÂN BỐ VÀ TRỔNG HÁI.

Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh”(Trung Quốc) có ghi Hoàng liên

thuộc loại thượng phẩm, cây cao cấp quý hiếm mọc ở trên núi Thái Sơn có

nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết Giang (23,24)

Ở Việt Nam, Hoàng Liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở

vùng núi có độ cao từ 1.500 - 2.000m trong các khu rừng rậm rạp có nhiều cây

cổ thụ, ở nơi nửa tối, nửa sáng

Ở Lao Cai Hoàng Liên mọc tại dãy Hoàng Liên Sơn (xã Tả van, San Sả

Hồ, Lao Chải) Quảng Bạ (Hà Giang) [120]

Hoàng liên ưa chỗ mát, ẩm ướt, nhiệt độ

nơi trồng phải thấp từ 20 - 25°c Muốn

trồng Hoàng liên, chọn các quả già

nhưng chưa nứt vỏ, hái quả về phơi, khi

vỏ nứt sẽ chọn các hạt mập chắc, có hạt

phải tranh thủ gieo ngay để lâu sẽ mất

khả năng mọc Nếu chưa gieo phải lấy

đất lẫn cát ẩm trộn với hạt Trong vòng 1

tháng phải trồng, để lâu không mọc

H ình 1.2 Bản đồ phân bô'hoàng liên[l]

(Coptis chỉnensis Franch).

- Bộ phân dùng: Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3 - 5cm, rộng 0,2 - 0,5cm Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông

giống hình chân gà nên còn được gọi là hoàng liên chân gà Mặt ngoài mầu

vàng nâu mang vết tích của rễ phụ ,và của cuống lá Thể chất cứng rắn, vết bẻ

ngang không phẳng Phần gõ màu vàng tươi ,vị rất đắng lồn tại lâu trong miệng [1,10,11,20].

1.3 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA HOÀNG LIÊN.

Thân rễ hoàng liên chứa nhiều alcaloid (5 - 8%) ,trong đó chủ yếu là berberin, worenin, jatrorhizin, palmatin, coptisin, columbamin Ngoài ra còn

có các alcaloid có nhân phenol, cũng như các alcaloid không có nhân phenol

Berberin tinh khiết kết tinh dạng tinh lliể màu vàng, điểm nóng chảy 145°c, tan trong 22 phần nước ở 20°c, tan trong elhanol, ít tan trong cloroform, benzen, không tan trong ether ethylic ƯVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [1, 4, 7, 32]

Hàm lượng berberin đạt 5 - 6% có khi tới 9% [20]

Theo qui định của Dược điển Việt Nam I ( tập 2), hàm lượng berberin phải đạt ít nhất là 4% [6]

Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohyđrat Hàm lượng alcaloid thay đổi tuỳ theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây Ở Nga Vĩ Sơn (Tứ Xuyên, Trung Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ cây ra hoa Ngoài thân rễ, lá cũng có berberin, hàm lượng cao nhất

ở lá già ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9

-10 Lá già chứa 2,5 - 2,8% berberin vào tháng 7 - 1 0 [7, 11, 20, 22, 32]

Bằng phương pháp phân tích trên sắc ký lỏng cao áp với sự lựa chọn của

2 pha dung môi thích hợp ,từ dịch chiết thô của Hoàng liên người ta đã phân lập được 4 alcaloid là: palmatin, berberin,epiberberin,và coptisin [25]

Công thức cấu tạo của một số alcaloid phân lập từ thân rễ Hoàng liên

1 4 MỘT SỐ NGHIÊN c ứ u VỂ TÁC DỤNG Dược LÝ CỦA HOÀNG LIÊN

- Tác dụng kháng khuẩn: Nước sắc hoàng liên và hoạt chất berberin đều

I

có phổ kháng khuẩn rất rộng Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở

các độ pha loãng sau:nồng độ 1:5120 có tác dụng với Shigella shiga ; nồng độ 1: 2560; có tác dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1:1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus;[3,17,20]

Dung dịch berberin clohydrat dùng phương pháp pha loãng trong ống nghiệm ,nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae; nồng độ

1:16000 có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Staphylococcus aureus ;nồng độ

magnoflorin

1:8000 có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae

,Streptococcus viridans, [3,17,20]

Tiêm tĩnh mạch Berberin clohydrat với liều lượng 19mg/kg trên chó đã

cứu sống được súc vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm bởi Staph aureus

[20]

Dịch chiết thô của Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh trùng đường

ruột Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100|Lig/ml.

- V ề cơ ch ế tác dụng kháng khuẩn: berberin ức chế sinh tổng hợp ARN

và protein ở các trực khuẩn Các chất vitamin B6, nicotinamid, acid

p.aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin.Với các chủng tụ cầu

vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực trùng lỵ khi dùng berberin sulfat dài ngày

thường xảy ra hiện tượng kháng thuốc, nhưng đối với các bài thuốc có hoàng

liên như bài " Hoàng liên giải độc thang " thì không có hiện tượng kháng

thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn lại mạnh hơn.[4,20]

Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền

với enzim ADN topoisomerase I của động vật có vú Hai tiền chất berberin là

epiberberin và gloenlandicin đã được xác định là những tiểu phân hoạt động,

có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I ; song chúng lại

không phân tách ADN qua trung gian topoisomerase II Chỉ có berberin và

một tiền chất berberin là chất đặc hiệu phân tách ADN qua trung gian

topoisomerase II trên in vitro

Những kết quả này chứng tỏ alcaloid gốc berberin là một nhóm hợp

chất có thể tạo phức hợp không bền với topoisomerase I và II [24]

Berberin, jatrorhizin, palmatin, được phân lập từ Hoàng liên Coptis

chinensis có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase) Jatrorhizin ức chế

không cạnh tranh MAO-A và B (ở ty lạp thể não chuột cống) với giá trị IC là

4 và 62 M Còn berberin chỉ ức chế cạnh tranh MAO-A với giá trị IC làl26M

Trong khi đó palmatin không Ihể hiện tác dụng này, mặc dù đã dùng tới liều 200pM [28].

- T á c dụng kháng virut: Nước sắc hoàng liên với nồng độ 50% thí

nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế sự phát triển của virut cúm chủng PR8, [20]

- Tác dụng kháng nấm gây bệnh : Dịch chiết lừ hoàng liên với độ pha

loãng 1: 30 có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh ngoài da

Hoàng liên được sử dụng như một thuốc chữa bệnh ngoài da, nó có tác dụng chống phù nề gây ra bởi 12-0-tetrađecanonylphorrbol-13-acetat, ngay cả khi dùng độc vị hay kết hợp với các chất oxazolon và acid arachiđonic [20,23]

- Tác dụng đối với đơn bào: Quan sát dưới kính hiển vi berberin với

nồng độ 1: 5000 và trên chuột nhắt trắng đã được gây nhiễm amíp, cho uống với lượng 50mg/kg có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của amip gây bệnh

Hoàng liên còn có các tác dụng sau :

- Tác dụng kiện vị, giúp tiêu hoá : Dịch chiết từ hoàng liên có tác dụng

làm tâng nhẹ sự phân tiết dịch nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày [3, 7, 17]

- Tác dụng chống loét đườìig tiêu hoá : Cho chuột cống trắng uống dịch

chiết alcaloid của hoàng liên ,có tác dụng ức chế nhẹ loét dạ dày thực nghiệm

do stress Bằng đường tiêm dưới da trên chuột cống trắng berberin có tác dụng

ức chế sự hình thành vết loét và hiện tượng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [20]

- Tác dụng hạ huyết áp: Tiêm dưới da dịch chiết nước của hoàng liên

hoặc berberin trên súc vật thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột cống trắng [4, 11, 17]

- Tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch: Trên thỏ thí nghiệm được

nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng cholesterol khá cao, dịch chiết nước

Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác dụng làm cho tỷ lộ cholesterol toàn phần/lipid trở về vị trí bình thường [7,20].

- Tác dụng chống viêm: Trên súc vật thí nghiệm, dạng chiết thô từ

hoàng liên có tác dụng ức chế sự hình thành u hạt trên mô hình thực nghiệm gây u hạt bằng viên bông (cotton pellet), có so sánh với tác dụng chống viêm của phenylbutazon

Ngoài ra, hoạt chất berberin với liều nhỏ, có tác dụng kích thích tim, làm giãn động mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung khu hô hấp, trong khi đó tim vẫn đập Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đường huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và sau

đó thì hạ [4,7,11]

Dùng liền Hoàng liên trong 1 tuần bằng đường uống có tác dụng làm giảm chứng quên do scopolamin gây ra (Thực nghiệm lẩn tránh thụ động trên chuột cống) Hoàng liên được xếp vào 1 trong 4 dược liệu có khả năng chống quên tốt đó là nhân sâm, đảng sâm, thiên ma, và Hoàng liên [26]

- Độc tính: Berberin ít độc, trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm phúc

mạc có LD50= 24,3mg/kg; trên thỏ bằng phương pháp tiêm truyền nhỏ giọt tĩnh mạch berberin sulfat với liều 20mg/kg, không thấy xuất hiện phản ứng ngộ độc nào đáng kể, nhưng với liều cao hơn thì gây hạ huyết áp và ức chế hô hấp Trên người uống một lần 2g, chưa phát hiện có triệu chứng ngộ độc Berberin dùng theo đường uống, hấp Ihu châm và không hoàn toàn, sau 8 giờ đạt mức tối đa Sau khi hấp thu vào máu, thuốc được phân phối nhanh chóng vào các tổ chức tim, gan, thận, nên nồng độ thuốc trong máu thấp khó đạt tới nồng độ có tác dụng ức chế vi khuẩn Do đó, berberin chủ yếu được dùng bằng đường uống để điều trị một số bệnh đường ruột [4, 20]

- Sản phẩm hydro hóa của berberin là tetrahydroberberin, chất này có lác dụng an Ihần, ức chế hoạt động tự nhiên của súc vật thí nghiệm, có tác dụng đối kháng với apomorphin, mescalin, còn có tác dụng giãn cơ, hạ huyết

áp nhẹ Thuốc dùng lâu ngày không có hiện tượng tích luỹ Trên chuột nhắt trắng, LD50 được xác định bằng đường uống, tiêm dưới da và tiêm tĩnh mạch

là 940, 790 và 100mg/kg [20]

Berberin có tác dụng lợi mật, dùng cho bệnh viêm túi mật rất tốt, ngoài

ra còn có tác dụng giãn mạch máu và hạ huyết áp, hạ nhiệt độ [4, 20]

1.5 CHẾ BIẾN HOÀNG LIÊN THEO PHƯƠNG PHÁP c ổ TRUYỂN

Từ xa xưa Hải Thượng Lãn Ông đã dùng phương pháp chế biến khác nhau đối với 1 vị thuốc để chữa các chứng bệnh khác nhau Theo Hải Thượng Lãn Ông:

Hoàng liên để sống thì chữa các chứng phát ban, điên cuồng, phiền khát hoặc dùng để tả tâm hoả [13, 14]

Hoàng liên ngâm với nước sắc ngô thù, rồi đem sao thì điều hoà trường

vị và tả hoả nhiệt ở gan, mật và trị thấp nhiệt hoả ở khí phận [8, 13, 24]

Sao với hoàng thổ chữa tích thực và chữa được bệnh cam trẻ con ăn đất vách [13, 14]

Sao với muối hoặc phác tiêu thì chữa chứng ở hạ tiêu

Sao với gừng chữa bệnh ở trung tiêu

Tẩm rượu sao để dẫn lên đầu, mắt, miệng, lưỡi và hoả ở thượng tiêu [13,14,24].Sao với nước gừng thì vị cay có công năng tán chứng nhiệt xông bốc lên chế bớt tính hàn, trị can đởm [4, 13,14]

Tẩm giấm để trị can hư hỏa [14]

Sao với mật lợn để trị can đởm thực hỏa [14]

- Hoàng liên dùng sống thanh nhiệt, chữa các bệnh đi ngoài phân lỏng,

cảm giác no bụng kèm theo nôn mửa, các chứng thấp nhiệt kết hợp với hàn vào trung tiêu.

- Hoàng liên chế với nước sắc ngô thù: Điều hoà chức năng dạ dầy và làm bớt nóng ở gan [31]

- H oàng liên có th ể chê theo llp h ư ơ n g pháp khác nhau [15,21]

* H oàng liên phiến

Làm sạch các rễ con bằng cách cho vào bao tải chà sát, rồi sàng sảy Rửa sạch, ủ cho mềm, rồi thái phiến, phơi âm can tới khô

* H oàng liên ủ rượu

Hoàng liên 10kg

Rượu 35-40° 4 kg Lấy hoàng liên, thêm rượu, ủ kỹ; thái phiến 3 - 5 mm Phơi âm can (đề tránh biến thành màu đen)

* H oàng liên trích rượu

*ỈIoàng liên sao vàng

Cho hoàng liên phiến vào nồi, sao nhỏ lửa đêh khi có mầu vàng đậm

* H oàng liên sao đất

Đun nóng hoàng thổ đến tơi, cho hoàng liên phiến vào sao đến lúc hơi biến mầu, đổ ra rây bỏ đất

Nước vừa đủ để ngâm

Ngâm hoàng liên vào giấm, trộn đều Sau khi mềm, lấy ra thái phiến Phơi khô, sao vàng

* H oàng liên trích muối

Nước vừa đủ Đem nước muối trộn đều vào hoàng liên, ủ cho ngấm đều, sao nhỏ lửa tới khô Cũng có thể đem hoàng liên sao đến khi ngả mầu thì phun nước muối vào, sao khô

1.6 CÔNG NĂNG, CHỦ TRỊ LlỂU DÙNG CỦA HOÀNG LIÊN.

Hoàng liên có vị đắng tính hàn, quy vào các kinh tâm, can, vị và đại tràng, có tác dụng thanh nhiệt, thanh táo thấp, tả hoả, giải độc Hoàng liên còn được dùng như một vị thuốc bổ đắng có tác dụng kiện vị dùng điều trị tiêu hoá kém [2,13,14]

- Hoàng liên được dùng để chữa lỵ trực trùng, lỵ amíp - ngày dùng từ 3-ốg chia 3 lần uống 7-15 ngày dưới dạng thuốc sắc ơ iữ a viêm dạ dày và ruột ngày 3-4g dưới dạng nước sắc hoặc cao lỏng, chữa đau mắt đỏ ( viêm kết mạc ) dùng dung dịch hoàng liên 5- 30% nhỏ vào mắt [7]

- Chữa bệnh lăng huyết áp, phòng ngừa xơ vữa động mạch [1, 7,20]

- Chữa viêm tai giữa có mủ : dùng dung dịch borat hoàng liên :

Nước sắc Hoàng liên dùng điều trị bệnh bạch hầu, có kết quả và không thấy tác dụng không mong muốn

Ở Hàn Quốc, dịch chiết Hoàng liên là 1 trong 9 dược liệu được sử dụng dưới dạng dịch chiết toàn phần để điều trị các chứng viêm nhiễm nói chung

Nó cũng là 1 trong 59 dược liệu hay dùng để kê đơn thuốc ở Hàn Quốc [30].

- Thanh tâm trừ phiền, dùng khi tâm hỏa cường thịnh dẫn đến chứng tâm phiền, người buồn bực mất ngủ, lở miệng thường phối hợp với chu sa, toan táo nhân [14,17]

- Giải độc: Thuốc có khả năng giải độc mạnh dùng với các chứng độc như nhọt độc ở bên trong, tà nhiêt thiêu đốt tân dịch, sốt cao, phiền táo chóng mặt, nói nhảm, mê cuồng, lưỡi đỏ, mạch sác,có thể phối hợp vói Hoàng bá, Hoàng cầm, chi tử (Hoàng liên giải độc thang )[3]

Thanh can sáng mắt dùng để điều trị các bệnh do can hỏa gây đau mắt

đỏ, sưng phù Nước mắt chảy dòng do can đởm, thấp nhiệt thì phối hợp với hạ khô thảo[3,13]

Berberin được sử dụng để điều trị các bệnh viêm nói chung và bệnh gan nói riêng, ở Trung Quốc,Hoàng liên được dùng làm thuốc dự phòng đối vối các chứng rối loạn tiêu hóa Berberin có khả năng làm giảm sự sinh sản của tế bào và giảm a -fetoprotein ở tế bào gan người (Hep G2)

- Berberin điều chỉnh mức độ của pgp-170 (yếu tố vận chuyển đa kháng thuốc) ở tế bào gan người Hoạt động của pgp-170 bị ức chế bởi các chất tamoxyfen và verapamil (các thuốc trị liệu ) Nhưng khi có mặt của berberin thì

sự ức chế đó giảm đi nhiều dẫn đến làm giảm sự lưu giữ của các thuốc trị liệu

Như vậy, berberin có khả năng điều tiết được chức năng của pgpl70 ở

sơ sinh bị vàng da và phụ nữ có thai [24]

Hoàng liên là vị thuốc có phổ sử dụng rất rộng có thể dùng đường uống, bột rắc, thuốc rửa để dùng ngoài, có thể dùng cho thượng tiêu, trung tiêu và hạ tiêu VI vậy cần khai thác thế mạnh này của Hoàng liên

+ Hoàng liên là vị thuốc rất đắng, do đó khi sử dụng cần chú ý về liều lượng và thời gian sử dụng Không nên dùng liều cao với thời gian kéo dài, sẽ làm tê liệt các thần kinh vị giác, gây ra cảm giác ăn không biết ngon hoặc có cảm giác buồn nôn [8]

Đối với thực trạng người bệnh, Hải Thượng Lãn Ông có dạy rằng: Với người trường vị có hàn, bệnh thương hàn mà cho hạ quá sớm, sẽ làm cho âm

hư mà đi ngoài ra máu cũng như tổn hại tỳ mà huyết chẳng về nguồn, cho đến chứng huyết ít khí hư, phiền nóng tiêu khát, tì vị hư yếu, đàn bà huyết hư phát sốt, đau bụng ỉa chảy, hết thảy các chứng tương tự như lỵ mà không phải là lỵ đều cấm dùng [13,14]

Khi phối hợp Hoàng liên với các vị cúc hoa, huyền sâm, nguyên hoa, cần thận trọng[14]

1.7 MỘT SỐ PHƯƠNG THUỐC ĐlỂN h ì n h c ó h o à n g l i ê n

Hoàng liên là một vị thuốc được sử dụng rộng rãi Có thể dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác để điều trị các chứng bệnh về phổi, gan, đường tiêu hoá v v.[3,13]

Sau đây là 1 số phương thuốc điển hình:

Bài V Tam Hoàng thang

Hoàng liên 12g

Hoàng bá 12g

Hoàng cầm 12g

Công năng: Thanh nhiệt giáng hỏa, thanh nhiệt táo thấp.

Công dụng: Dùng trong các trường hợp sốt cao, phát cuồng mê sảng do

nhiệt độc nhập vào phần dinh phần huyết, phân tâm bào lạc

Bài 2 : Hoàng Liên giải độc thang

Hoàng liên 12 - 16g Hoàng cầm 8 - 12g

Hoàng bá 8 - 12g Chi tử 10 - 12g

Công năng : Tả hoả giải độc.

Công dụng: Chữa các hội chứng nhiễm trùng toàn thân, nhiễm trùng

huyết, mụn nhọt, viêm phổi Chữa lỵ nhiễm trùng, ỉa chảy, nhiễm trùng, chữa viêm não, viêm gan

Bài 3 : Tê giác tán

Sừng tê giác hay sừng trâu 16g Nhân trần 12g

Công năng : Thanh nhiệt lương huyết, thanh nhiệt giải độc

Công dụng: Chữa sốt cao hoặc viêm gan siêu vi trùng thể nặng.

Bài 4 : Thanh dinh thang

Công năng : Thanh dinh, giải độc, dưỡng âm thấu nhiệt.

Công dụng: Chữa chứng nhiệt ở phần dinh, sốt cao, đêm sốt cao hơn,

mê sảng, phiền táo mất ngủ, phát ban, lưỡi đỏ mà khô, mạch tế sác

Bài 5: Bạch đầu ông thang

Bạch đầu ông 12- 20g Hoàng liên 4-8g

Công năng : Thanh nhiệt giải độc, lương huyết.

Cổng dụng : Chữa lỵ trực trùng ,lỵ amíp.

B ài 6: Đương quy lục hoàng thang.

Sinh địa 1 6 g Hoàng kỳ 1 2 g

Công năng: Thanh nhiệt táo thấp, dưỡng âm.

Công dụng : Chữa chứng âm hư hỏa vượng, khí huyết hư gây ra mồ hôi

Công năng : Kiện tỳ, hoà khí, lý khí tiêu đạo.

Công dụng : Dùng khi ăn kém, chậm tiêu, ỉa chảy mãn tính, viêm đại

tràng mãn

Bài 8: Chỉ thực đạo trệ hoàn

Công năng: Tiêu đạo tích trệ, thanh lợi thấp nhiệt.

Công dụng : Chữa nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn gây bụng đầy

trướng, lỵ hay ỉa chảy, đầy bụng, mót rặn táo bón, nước tiểu vàng, ít

Bài 9: Cát căn cầm liên thang gia giảm

Công năng : Thanh nhiệt lợi thấp (hoá thấp).

Công dụng : Chữa ỉa chảy nhiễm trùng.

Bài 10: Thanh ôn bạch độc đơĩi gia giảm

Công năng : Thanh nhiệt giải độc, tả hỏa.

Công dụng: Trị sốt cao, hôn mê, co giật.

1.8 PHỤ LIỆU CHẾ HOÀNG LIÊN

1.8.1 Vai trò của phụ liệu trong chê biến thuốc cổ truyền [3]

- Trong chế biến thuốc cổ truyền phụ liệu có ý nghĩa rất quan trọng vì

nó góp phần có thể loại độc tính của vị thuốc (sinh khương đối với bán hạ);

hoặc góp phần vừa làm giảm độc tính vừa làm biến đổi về mặt hoá học (phác

tiêu , muối ăn trong chế sinh phụ tử), tăng tác dụng của vị thuốc( Ihần sa trong

chế đan sâm) Theo y học cổ truyền, mỗi phụ liệu đều tạo ra những tác dụng

mới cho vị thuốc hoặc tăng sự quy kinh can khi chế với giấm ,tăng quy kinh

thận đối với chế muối, hoặc tăng quy kinh phế đối với chế gừng

Trong luận văn tập hợp 11 cách chế Hoàng liên với 7 loại phụ liệu khác

nhau như: rượu, muối, hoàng thổ, mật lợn, gừng, giấm, ngô thù du trong

phần chế biến này chỉ tiến hành với 2 loại phụ liệu là gừng và giấm

1.8.2 Vài nét vê phụ liệu chê Iỉoàng liên.

ỉ 8.2.1 Gừỉig (sinh khương)[3].

Tên khoa học : Zingiber officinale Rose

Họ Gừng : Zingiberaceae

Thành phần hóa học :Trong gừng có 2-3% tinh dầu Ngoài ra còn có

chất nhựa dầu (5%), chất béo (3,7%), tinh bột và các chất cay như

zingeron,zingerola, và sogaola

Tính v ị : vị cay, tính ấm

Qui kinh: vào 2 kinh phế, tỳ

Công năng chủ trị :phát tán phong hàn , dùng chữa cảm mạo do phong

hàn gây ra Làm ấm tỳ vị (ấm dạ dầy) hết nôn lợm giọng dùng khi bị lạnh,

bụng đầy trướng, đau bụng không tiêu Hóa đờm chỉ ho , lợi niệu tiêu phù

thũng giải độc khử trùng

1.8.2.2 Giấm (thố).

Giấm dùng để chế thuốc là loại giấm thanh, chua,được chế từ rượu nhẹ hoặc chế bằng cách lên men từ ch u ố i,đường Phương pháp chế thuốc với giấm gọi là thố chế

- Thành phần hóa học chứa 4 - 5 % acid acetic, vị chua pH=2-3 Tính v ị : vị chua, tính lương, không độc

- Công năng :lý khí huyết, tiêu thũng, giảm đau

- ứng dụng trong chế biến thuốc

+ Tăng dẫn thuốc vào kinh can, đởm

+ Tăng tác dụng hành khí, hoạt huyết, giảm đau

+ Acid hoá môi trường, có thể tăng khả năng hòa tan của một số thành phần trong vị thuốc : alcaloid

Thường được dùng chế các vị thuốc hương phụ, diên hồ sách (huyền hồ) nga truật

Ví dụ: Nga truật chế giấm tăng tác dụng hoạt huyết, diên hồ sách chế giấm tăng tác dụng giảm đau đặc biệt với gan

CHƯƠNG 2NGUYÊN PHỤ LIỆU, Đ ố i TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN PHỤ LIỆU VÀ Đ ố i TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

* Nguyên liệu: Cây tươi, thân rễ của hoàng liên (Coptis chinensisFranch), lấy trên dẫy Hoàng Liên Sơn thuộc thôn Séo mý tỷ, xã Tả Van, huyện

Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 10/2000 và tháng 4/2001

Họ Hoàng liên, Ranunculaceae

- Berberin chuẩn do Trung tâm Kiểm nghiệm sở y tế Hà Nội cung cấp

- Palmatin chuẩn do Phòng Hoá thực vật viện Dược liệu cung cấp

* Phụ liệu : Giấm thanh có 5% acid acetic, sinh khương loại già

* Đối tượng nghiên cứu :

+ Chuột nhắt trắng cả hai giống đực, cái khoẻ mạnh, chủng Swiss có trọng lượng 20g ±1, do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp

+ Thỏ cả hai giống đực, cái khoẻ mạnh có trọng lượng > 2kg do Bệnh viện quân y 103 cung cấp

+ Vi sinh vật kiểm định do Phòng thí nghiệm vi sinh - kháng sinh Bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược cung cấp

lệ 1:1

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

- Soi, cắt vi phẫu thân rễ Hoàng liên theo phương pháp nhuộm kép:

Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang, xử lý bằng cách ngâm

tẩy với các dung dịch Javen hoặc cloramin, acid acetic, nước Sau đó nhuộm

kép bằng dung dịch xanh methylen và son phèn

Soi trên kính hiển vi Nikon Độ phóng đại 40

- Soi bột Hoàng liên trên kính hiển vi Nikon Độ phóng đại 40

2.2.2 Chê biến hoàng liên theo phương pháp cổ truyền

2.2.2.1 Hoàng liên trích gừìig:

Hoàng liên 200g

Gừng tươi 20g

Hoàng liên cho vào bao tải chà xát cho rụng hết các rễ con, rửa sạch

Thái phiến vát l-3cm, dầy 2-3mm Gừng tươi rửa sạch, giã lấy nước (khoảng

300ml), rồi trộn đều vào Hoàng liên, ủ 1 giờ, sao vàng

2.22.2 Hoàng liên ch ế giấm

Hoàng liên 200g

Nước vừa đủ để ngâm

Hoàng liên cho vào túi chà xát cho rụng hết các rễ con Ngâm Hoàng liên

vào giấm trộn đều (chú ỷ đủ lượng nước để ngâm) Ngâm trong 30 phút, vớt ra để

ráo nước, thái phiến l-3cm, dầy 2-3mm Sao vàng

2.2.3 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của H oàng liên trước

và sau kh i chế.

2.2.3.1 Định tính

- Định tính bằng các phản ứng hoá học trong ống nghiệm

Thấm ẩm 5g bột dược liệu mỗi loại bằng dung dịch amoniac 25%, sau

đó chiết hồi lưu bằng cloroform trên bếp cách thuỷ Cho dịch chiết vào bình

gạn, thêm 5ml acid sulfuric 10% Lắc, lấy phần dịch acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid.

+ Phản ứng với thuốc thử Mayer

+ Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

+ Phản ứng với thuốc thử Dragendorff [3],

+ Lắc mạnh 0 ,lg bột Hoàng liên với 3ml nước Lọc Thêm vào dung dịch lm l acid sulfuric đậm đặc (TT), rồi thêm từng giọt nước Brom (TT).Giữa

2 lớp dung dịch sẽ có 1 vòng màu đỏ [6]

+ Ngâm 0,2g bột dược liệu trong 2ml cồn Nhỏ 2 giọt dịch chiết cồn lên phiến kính, nhỏ 1 giọt H N 0 3 (TT) 30% Sau 1 lúc soi kính hiển vi thấy những tinh thể hình kim màu vàng [6]

- Đinh tính bằng SKLM với bản tráng sắn Silicagel Merck GF 254 [4,9,32]

a Dung môi khai triển.

* Hệ 1: Toluen - aceton - elhylacetat - acid formic ( 5:2:2:1)

* Hệ 2: n- butanol - acid acetic-nước (7: 1: 2)

* Hệ 3: Erther dầu hoả - erther (6:4) bão hoà amoniac

b Thuốc thử hiện mầu.

* Dung dịch Iod 1% trong cloroform

* Thuốc thử Dragendorff

* Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng x= 366nm.

c Cách tiến hành

* Chuẩn bị dung dịch phân tích :

Cân 0,5g bột Hoàng liên thêm 10ml ethanol 80° ,đun hồi lưu trên bếp cách thuỷ 15 phút Để nguội, lọc, bốc hơi dịch lọc đến khô Hòa cắn bằng 0,5ml ethanol, được dung dịch phân tích

* Chuẩn bị dung dịch đối chiếu berberin HC1:

Cân 0,005g berberin chuẩn hoà vào 5ml methanol, thêm 2giọt amoniac đậm đặc được dung dịch đối chiếu

+ Hydro hoá berberin, palmatin trong đưực liệu thành

tetrahydroberberin, tetrahydropalmatin

Dịch phân tích: lấy 0,5g bột thân rễ Hoàng liên, thêm 10ml ethanol 50°

và 2ml acid chlohydric 6N, thêm lgam bột kẽm Đun hồi lưu hỗn hợp phản

ứng trên nồi cách thuỷ sôi trong 30phút Để nguội, lọc, thêm 5ml amoniac 6N

vào dịch lọc tới phản ứng kiềm Bốc hơi dịch đến hết ethanol, thêm nước để có

10ml dung dịch, chuyển dung dịch vào bình gạn Thêm 15ml ether ethylic

Lắc, để yên cho tách lớp Gạn lấy lớp ether.Lọc qua natri sulfat khan Bốc hơi

ether Hoà tan cắn trong 0,5ml methanol được dung dịch phân tích

+ Tạo tetrahydroberberin, tetrahydropalmatin chuẩn bằng cách sau:

Cân 0,005g berberin, 0,005g palmatin bazơ hoặc muối clohydrat vào 2

bình khác nhau.Lần lượt thêm vào mỗi bình 5ml ethanol 50°, 1 ml acid

clohydric 6N và 0,5g bột kẽm Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trên nồi cách

thuỷ 30 phút Để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc 3ml amoniac 6N Bốc hơi dung

dịch trên nồi cách thủy còn 5ml Chuyển vào bình gạn Thêm 10ml ether

ethylic.Lọc lớp ether qua Na2S 0 4 khan Bốc hơi ether Hoà cắn trong 0,5 ml

methanol được các dung dịch tetrahydroberberin,tetrahydropalmatin làm chất

đối chứng [9]

Tiến hành sắc ký lớp mỏng

* Chấm các dịch chiết và chất đối chứng lên bản mỏng

* Tiến hành sắc ký với các hệ dung môi

* Hiện mầu bằng cách phun thuốc thử Dragendorff, hoặc đặt trong hơi

iod bão hoà Soi dưới đèn UV-VIS bước sóng Ằ= 366nm

2.23.2 Định lượng berberin trong rễ hoàng liên trước và sau khi ch ế biêh theo phương pháp ghi íroiìg D Đ VN 2 /ố /.

Cân chính xác khoảng 2,5g bột Hoàng liên Cho vào bình Zaitchenko

và lấy kiệt hoạt chất bằng 50ml cồn Đặt trên nồi cách thủy để loại hết cồn

Thêm 30ml nước và 2 - 3g MgO, tiếp tục đun trên nồi cách thủy ở 60-70°C

trong 15 phút Thỉnh thoảng lắc bình Lọc, rửa cắn bằng 30-40ml nước nóng,

rửa làm nhiều lần, cho đến khi nước rửa không còn màu nữa Hợp nước rửa với

dịch lọc, thêm 5ml dung dịch KI 50% để kết tủa berberin Lọc, rửa tủa bằng

dung dịch KI 2% Dùng nước kéo tủa vào một bình chịu nhiệt 250ml có nút

mài, lượng nước dùng không được quá 50ml Đun trên nồi cách thủy, lắc bình

cho berberin iodid phân tán đều trong nước, khi nhiệt độ trong bình lên 70°c,

thêm 50ml aceton (lượng aceton có thể rút xuống 10ml tuỳ theo lượng

berberin) Đậy nút bình, tiếp tục đun để hòa tan berberin iodid Sau khi thêm

thật nhanh 3ml dung dịch amoniac, lắc bình cho đến khi kết tủa Để chỗ mát

một đêm Gạn, lọc tủa phức berberin aceton vào một chén nung đã cân trước,

hứng dịch lọc vào một bình khác, đo thể tích Rửa tủa bằng ether etylic, sấy

khô ở 105°c trong 3 giờ, cân

lg tủa tương ứng với 898,2mg berberin

lm l dịch lọc tương ứng với 0,0272mg berberin

Dược điển Việt Nam quy định dược liệu phải có ít nhất 4% berberin [6]

2.23.3 Chiết xiiất berberin từ thân rễ hoàng liên bằng phương pháp chiết lạnh [2],

Tiến hành: Ngâm bột dược liệu với dung dịch acid sulfuric 0,5% Từ 4-

6 giờ thỉnh thoảng lắc, rồi rút dịch chiết, làm như thế 3 lần Gộp dịch chiết,

lọc Sau đó thêm NaCl với tỉ lệ 3-4% so với dịch chiết, khuấy mạnh cho tan

hết, để yên trong 24 giờ cho berberin kết tủa hết rửa tủa bằng HC1 0,5% để

loại tạp.Rửa tủa bằng nước cho hết phản ứng acid Hoà tan nóng tủa trong cồn

96° tỉ lệ 1:5 Thêm than hoạt đun hồi lưu 10 phút.Lọc, bỏ than hoạt ,dich cồn

để kết tinh trong 24 giờ Rửa tủa bằng cồn 90° Sấy khô ở 60 - 70° trong 8 giờ

Berberin đã chiết xuất được đem xác định điểm nóng chảy,

trên máy Kallen - Kamp

Đo phổ tử ngoại trên máy u v - VIS Varian 1 - Cary 1E

Đo phổ hồng ngoại trên máy PT - IR Nexute Spectrophotometry 470

2.2.4 Nghiên cứu LDĨ0 và m ột số tác dụng sinh học.

2.2.4.1 Xác định LD50 của Hoàng liên trước và sau khi ch ế

Theo phương pháp Behrens - Karber [12]

Được tiến hành tại Bộ môn Dược lực Trường đại học Dược Hà Nội

C h ế phẩm thử {như phần 2.1) Súc vật thí nghiệm : ( như phần 2.1).

Cách tiến hành

Chuột mua về cho ăn uống bình Ihường trong 2 ngày bằng thức ăn tổng hợp do Viện Vệ sinh dịch tễ sản xuất Sáng ngày thứ 3 chia chuột thành các nhóm ngẫu nhiên, mỗi nhóm 6 con Sau đó cho chuột uống thuốc theo liều tăng dần từ liều cao nhất không gây chết chuột nào, đến liều thấp nhất gây chết chuột 100% Theo dõi và quan sát các biểu hiện của chuột, tính số chuột

Chuột chết trong các nhóm được mổ để đánh giá tổn thương thực thể

- Liều LD50 được tính theo công thức sau:

LD = LD 50 ^ -^ ÌO O ^ ( ^ 0

n

Trong đó LD 100 : Liều làm cho chuột chết 100% (g)

z : Số chuột chết trung bình giữa 2 liều kế tiếp (con)

d : Khoảng cách liều giữa 2 liều kế tiếp (g)

n : số chuột trong mỗi nhóm (con)

- Sai số chuẩn được tính theo công thức sau:

ỊZsd

50 ~ V n

s : Là phân bố chuẩn, tính theo công thức 7 ^16

K: Hệ số Karber = 0,564

d : Khoảng cách liều giữa 2 liều kế tiếp, (trong trường hợp khoảng cách giữa 2 liều kế tiếp của các nhóm không giống nhau thì lấy

k - ỉ

k: Số nhóm chuột thí nghiệm, n: Số chuột trong mỗi nhóm (con)

2.2A.2 Thử tác dụng lợi mật của Hoàng liên theo phương pháp

Ngày thứ 3 sau khi uống lgiờ chuột được gây mê rồi mổ bụng để thắt ống dẫn mật, đoạn đổ vào tá tràng rồi khâu thành bụng lại

Sau 30 phút giết chuột bằng cỉoroform.MỔ chuột bóc tách túi mật đem cân trên cân phân tích

Thống kê kết quả, tính xác suất thí nghiệm, so sánh kết quả giữa nhóm chứng với nhóm thử, giữa các nhóm thử với nhau

Trong đó : L%= Độ lợi mật (%)

mT = Khối lượng mật của nhóm thử (mg)

mc = Khối lượng mật của nhóm chứng (mg)

2.2.4.3 Thử tác dụng hạ nhiệt của Hoàng liên trước và sau khi ch ế bằng phương pháp Smith -Hanbouger[36J.

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Dược lý -Sinh hoá Viện Dược liệu

Nhóm 1: Nhóm chứng uống dung dịch N aG 9°/oo với liều lml/kg thể

Các nhóm thử thỏ được uống vói thể tích như nhóm chứng

Cho thỏ uống thuốc 2 lần :30 phút trước và sau khi gây sốt 30 phút

Sau đó tiếp tục đo nhiệt độ thỏ 30 phút 1 lần, cho đến 3 giờ 30 phút sau khi gây sốt.Thống kê số liệu, tính xác suất, so sánh chênh lệch nhiệt độ của thỏ trước và sau khi gây sốt

2.2.4A Thử tác dụng kháng khuẩn của Hoàng liên trước và sau khi ch ế theo phương pháp : sử dụng khoanh giấy lọc khuếch tán trên môi trườìĩg thạch [18].

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh- kháng sinh,

Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường đại học Dược Hà Nội

- Chủng vi khuẩn.

Sử dụng 10 chủng vi khuẩn gồm 5 chủng Gram (+):

Bacillus subtilis ATCC 6633 viết tắt là B.s.

Bacillus cereus ATCC 9946 viết tắt là B.C

Sarcina lutea ATCC 9341 viết tắt là S.L

Staphylococcus aureus ATCC 12228 viết tắt là Sta

Bacillus pumilus ATCC 10241viết tắt là B.p

và 5 chủng Gram (-)

Shigella flexneri DTI 12 viết tắt là Shi

Salmonella typhii DT220 viết tắt là Typh

Escherichia coli ATCC 259222 viết tắt là EC

Proteus mirabilis BV108 viết tắt là Pro

Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt là Pseu

- Môi trường nuôi cấy

Sử dụng các môi trường dưói đây để nuôi cấy các vi khuẩn kiểm định.

+ Môi trường 1 (MT1) môi trường canh thang

Natri clorid 5g Nước vừa đủ 1000 ml

+ Môi trường 2 (MT2) môi trường canh thang đặc

Nước vđ 1000ml

- Chuẩn bị c h ế phẩm thử;và mẫu chuẩn.

+ Chuẩn bị các chế phẩm thử (như phần 2.1)

Dung dịch penicillin G 30 UI=18ị_i g/ml

Dung dịch gentamicin 20ƯI=20 Ịig/ml

+ Chuẩn bị khoanh giấy thử

* Đục các khoanh giấy lọc có đường kính D = 6mm, khối lượng từ

33,5 - 34mg

* Hấp tiệt trùng các khoanh giấy ở 117°c -118°c trong 30 phút

Tẩm các dịch thử vào khoanh giấy lọc đã tiệt trùng , sau đó sấy khô khoanh giấy ở 50°c Làm như vậy 3 lần Tính lượng cao lỏng mà mỗi khoanh giấy đã thấm được Mỗi khoanh giấy tẩm cao lỏng chứa khoảng 0,8mg dược liệu

+ Chuẩn bị mẫu chuẩn: khoanh giấy tẩm penicillin và gentamicin, mỗi khoanh giấy tẩm penicillin chứa khoảng 1 Ưỉ kháng sinh, mỗi khoanh giấy tẩm gentamicin chứa khoảng0,7 UI kháng sinh

- Tiến hành :Pha môi trường canh thang lỏng.

Cho vào 10 ống nghiệm, mỗi ống 10ml môi trường 1, nút ống bằng bông mỡ Hấp tiệt trùng các ống môi trường ở 117-118°c trong 30 phút Để nguội và cấy các chủng vi khuẩn kiểm định vào đó, mỗi chủng cấy vào 1 ống môi trường (tiến hành trong tủ cấy vô trùng) Sau đó cho vào tủ ấm ở 37°c cho phát triển trong 18 - 24 giờ

Mặt khác, ta tiến hành chuẩn bị môi trường kiểm định như sau: cho vào

10 bình nón có dung tích 250ml mỗi bình 180ml môi trường 2 Nút bình bằng bông mỡ ,sau đó khử trùng ở 117-118°c trong 30 phút Để nguội các bình đến khoảng 45 - 50°c rồi lần lượt cho mỗi vi khuẩn kiểm định đã nuôi cấy vào mỗi

bình nói trên; lắc đều rồi phân ra 10 hộp petri sao cho mỗi hộp chứa khoảng 20ml môi trường (lớp thạch dầy 3 - 4 m m ) Để nguội xuống nhiệt độ phòng.

Khi môi trường 2 đã nguội và đông lại, tiến hành đặt các khoanh giấy

đã tẩm chất cần thử lên mặt môi trường Ihạch Irong các hộp petri theo sơ đồ

đã định sẵn Cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 10°c trong 2giờ cho hoạt chất khuếch tán vào môi trường thạch Rồi để các hộp petri vào tủ ấm ở nhiệt độ

37°c trong 1 8 - 2 4 giờ cho vi khuẩn phát triển Khi đủ thời gian đưa ra đọc kết quả và đo các vòng vô khuẩn (nếu có)

CHƯƠNG 3THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QƯẢ

3.1.NGHIÊN CỨU VỂ NGUYÊN LIỆU HOÀNG LIÊN

3.1.1 M ô tả đặc điểm cây H oàng liên.

Mẫu cây Hoàng liên chúng tôi lấy ỏ Sapa vào tháng 10/2000, và tháng 4/2001 (Hình 3.1 a) là cây thuộc thảo, cao khoảng từ 27cm, thẳng Lá có cuống dài 20cm, mọc so le từ thân rễ lên, phiến lá mỏng chia 3 thuỳ chính, mép khía răng cưa không đều, thuỳ giữa gần giống tam giác cân, xẻ thuỳ Ihứ cấp hình lông chim Hai thuỳ bên giống nhau, có cuống ngắn hơn thuỳ giữa

Lá có mầu lục, bóng Cụm hoa gồm 5 tán mọc trên một cuống chung dài 30

cm Hoa mầu vàng nhỏ Bao hoa mầu vàng lục, 5 lá đài hình mác, 5 cánh hoa thuôn dài, nhiều nhị.(Hình 3.1b)

3.1.2 Đặc điểm vị thuốc H oàng liên

Đồng thời với việc thu mẫu cây tươi chúng tôi đã mua thân rễ Hoàng liên tại Sapa (Hình 3.1c) để làm nguyên liệu nghiên cứu về chế biến, hoá học

và tác dụng sinh học

Thân rễ Hoàng liên cong queo dài 5-7cm, đường kính 0,3-0,ốcm, có nhiều rễ phụ, nhỏ, cứng; thể chất của thân rễ Hoàng liên cứng ,khi bẻ ,vết bẻ không phẳng Bên ngoài vỏ rễ có mầu vàng nâu, bên trong vàng Vị rất đắng