Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

1.5.3.Định tính, định lượng họp chất đặc trưng trong dược liệu, các sản phẩm của quá trìnlí chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao HPLC.... Trong p

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI•

-if if—

LÊ THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẩ N ACID CHLOROGENIC TỪ KIM NGÂN HOA

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA

CHẤT LƯỢNG THUố C

LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC• • • •

Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Cao Son và TS Trần Hồng Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Trần Việt Hùng - Khoa Vật lý đo lường, ThS Lục Thị Vân - Khoa Kiểm nghiệm các dạng bào chế, ThS Nguyễn Tuấn Anh - Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, đã nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng quản lý sau Đại học, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà nội, các bạn đồng nghiệp của khoa Kiêm nghiệm các dạng bào chế, khoa Kiểm nghiệm Đông dược, khoa Vật lý đo lường - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương, các cán bộ của Trung tâm Dược điên - Dược thư Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ, san sẻ công việc

và góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn này

Ds LÊ THỊ THU HIỀN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ♦ 7 • VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN • 7 • •

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

CHƯƠNG 1 - TỒNG QUAN 3

1.1 Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn 3

1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học 3

1.1.2 Các thông tin về chuẩn acid chỉorogenic 3

1.2 Tống quan ve acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa 3

1.2.1 Tổng quan về acid chỉorogenic 3

1.2.2 Tồng quan về dược liệu Kim ngân hoa 6

1.3 Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được nghiên cứu 8

1.4 Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột 9

1.4.1 Phương pháp sắc kỷ cột silica gel 9

1.4.2 Sắc ký loại trù' theo kích cỡ và ứng dụng trong tỉnh chế acid chlorogenic 12

1.5 Phưong pháp định tính, định luọng và xác định cấu trúc phân t ủ 15

1.5.1 Định tính và xác định độ tình khiết bằng điểm chảy - M P 15

1.5.2 Định tính bằng phố hồng ngoại - I R 16

1.5.3.Định tính, định lượng họp chất đặc trưng trong dược liệu, các sản phẩm của quá trìnlí chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược liệu

bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) 16

1.5.4 Phương pháp xác định cấu trúc plíân tủ' 21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.2 Phương tiện nghiên cứu 24

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 24

2.2.2 Hoá chất, dung môi 25

2.3 Nội dung nghiên cứu 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Kiếm nghiệm dược liệu Kim ngân hoa dùng đế nghiên cứu 26

2.4.2 Phương pháp chiết xuất acid chỉorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa 27

2.4.3 Phăn lập và tinh chế acid chỉorogenic bằng phương pháp sắc kỷ cột 27

2.4.4 Các phương pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc acid chỉorogenỉc 27

CHƯƠNG 3 - THỤC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 31

3.1 Kiếm nghiệm dưọc liệu Kim ngân hoa 31

3.1.1 Định tỉnh dược liệu Kim ngân hoa 31

3.1.2 Địnlt tính, địnlĩ lượng acid chíorogenic trong dược liệu Kim ngân hoa 33

3.2 Chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa 35

3.2.1 Lựa chọn dung môi chiết và phương pháp chiết 35

3.2.2 Tiến hành chiết xuất 35

3.2.3 Định tính acid chỉorogenic trong cao đặc và cắn C1 bằng phương pháp TLC 36

3.2.4 Định lượng acid chỉorogenic trong cắn C1 38

3.3.Qui trình phân lập acid chlorogenic bằng sắc ký cột silica g e l 40

3.3.1 Kỹ thuật phân lập 40

3.3.2 Kết quả phân lập acid cỉtỉorogenic bằng sắc kỷ cột silica gel 41

3.4 Tinh chế acid chlorogenic bằng sắc ký cột Sephadex 45

3.4.1 Kỹ thuật tinh chế 45

3.4.2 Kết quả tinh chế acid chỉorogenic bằng sắc kỷ cột Sephadex G15 46

3.4.3 Kết quả tỉnh chế acid chỉorogenic bằng sắc kỷ cột Sephadex GIO 49

3.5 Định tính, xác định cấu trúc, định lưọìig và xác định tạp chất liên quan của acid chlorogenic tinh chế được 53

3.5.1 Đặc điểm hình thái 53

3.5.2 Đo nhiêí đô nóng chảy để đinh tính và xác đinh đô tinh khiết 53• • o • • • 3.5.3 Đinh tỉnh acid chỉorogetiic bằng phương pháp sắc kỷ lớp mỏng 54

3.5.4 Định tính acid chlorogenic bằng phương plĩáp đo pho hồng ngoại 55

3.5.5 Định tính acid chlorogenỉc tinh chế được bằng phương pháp H P L C 56

3.5.6 Xác định cẩu trúc của acid chlorogenỉc tinh chế được 58

3.5.7 Định lượng acid chlorogenỉc tinlĩ chế được bằng phương plĩáp HPLC 62

3.5.8 Xác định tạp chất liên quan của acid chỉorogenic tinh chế được 66

3.6 Thẩm định phưoìig pháp HPLC đã sử dụng đế định lượng acid chlorogenic tinh chế được 68

3.6.1 Xác định tính đặc lĩiệu 69

3.6.2 Khoảng tuyến tính 70

3.6.3 Độ lặp lại 71

3.6.4 Độ đúng 71

3.6.5 Xác định LOD 73

3.6.6 Xác định LOQ 74

3.7 Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm 74

3.8 Sử dụng acid chlorogenic tinh chế đưọc làm chất chuẩn PTN để định tính, định lưọng acid chlorogenic trong mẫu dưọc liệu Kim ngân hoa 77

3.8.1 Định tính acid chlorogenỉc trong dược liệu Kim ngân h o a 77

3.8.2 Định lượng acid chỉorogenỉc trong dược liệu Kim ngân hoa 80

3.8.3 Xác định độ ấm dược liệu 82

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN VÈ KÉT QƯẢ 83

KỂT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC

CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

Cacbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

Two - Dimensional NMR

Electron Spray Ionization Mass Spectrometry

Phổ hong ngoại

Sac ký lóp mỏng

Sác ký lỏng hiệu năng cao

T Thử

Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic trong một số loại cây

Bảng 1.2 Hàm lượng acid chlorogenic phân bố trong một số bộ phận

của cây Kim ngân

Bảng 1.3 Khả năng tách lọc của một số loại gel Sephadex

Bảng 3.4 Kết quả định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Kim

ngân hoa đem nghiên cứu

Bảng 3.5 Kết quả chiết xuất các mẻ dược liệu

Bảng 3.6 Giá trị Rj và màu sắc các vết sắc ký của cao đặc và căn C1

Bảng 3.7 Hàm lượng acid chlorogenic trong can C1 thu được sau giai

đoạn chiết xuất

Bảng 3.8 Khối lượng cắn Si thu được sau giai đoạn phân lập cắn C1

qua cột silica gel

Bảng 3.9 Hàm lượng acid chlorogenic trong cắn Si thu được sau giai

đoạn phân lập can Cl qua cột silica gel

Bảng 3.10 Khối lượng cắn Sel thu được sau khi tinh chế can Si qua

cột Sephadex G I5

Bảng 3.11 Ket quả định lượng acid chlorogenic trong cắn Sel thu

được sau giai đoạn tinh chế cắn Si qua cột Sephadex GI 5

Bảng 3.12 Khối lượng cắn Se2 thu được sau khi tinh chế can Sel qua

343637

Bảng 3.14 Kêt quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của sản phâm

tinh chế được

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát tính thích họp của hệ thống sắc ký khi

định lượng acid chlorogenic tinh chế được

Bảng 3.16 Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo

chuẩn 1

Bảng 3.17 Kết quả định lượng acid chlorogenic tinh chế được theo

chuẩn 2

Bảng 3.18 Kết quả xác định hàm lượng tạp chất liên quan của acid

chlorogenic tinh chế được

Bảng 3.19 Kết quả xác định khoảng tuyến tính

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ lặp lại

Bảng 3.21 Kết quả xác định độ đúng

Bảng 3.22 Kết quả xác định LOD cho phép định lượng

Bảng 3.23 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của dịch chiết dược

liệu Kim ngân hoa

Bảng 3.24 Kết quả định lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu

Kim ngân hoa

78

82

Hình 1.1 Câu trúc hoá học của acid chlorogenic

Hình 1.2 Cây Kim ngân

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Sephadex

Hình 2.4 Dược liệu Kim ngân hoa (Flos Lonicerae japonicae)

Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.6 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic và dịch

chiết dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.7.Sắc ký đồ của các dung dịch chuấn, cao đặc và cắn Cl

Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất acid chlorogenic từ Kim ngân hoa

Hình 3.9 SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn phân lập

cắn Cl qua cột silica gel

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình phân lập acid chlorogenic

Hình 3.1 la, 3.1 lb SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn

tinh chế cắn Si qua cột Sephadex G I5

Hình 3.12a, 3.12b SKĐ định tính acid chlorogenic trong giai đoạn

tinh chế cắn Sel qua cột Sephadex GIO

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình tinh chế acid chlorogenic

Hình 3.14 Sắc ký đồ định tính acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.15 Phổ hồng ngoại của acid chlorogenic tinh chê được

Hình 3.16 Phổ hồnơ ngoại của acid chlorogenic chuấn

Hình 3.17 Sắc ký đồ dunơ dịch chuẩn và thử khi định lưọng acid

chlorogenic tinh chế được

Hình 3.18 Kết quả chồng phổ UV-VIS của acid chlorogenic trong

4

6

132432

343839

4144

47

5052

545555

56

mẫu chuân và mâu thử khi định lượng acid chlorogenic tinh chê

được

Hình 3.19 Kết quả xác định độ tinh khiết của pic acid chlorogenic

khi định lượng acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.20 cấu trúc hoá học (A) và các tương tác COSY, HMBC

chính của sản phâm đem đo

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu trắng - xác định tạp chất liên quan của

acid chlorogenic tinh chế được

Hình 3.22 sắc ký đồ mẫu thử - xác định tạp chất liên quan của acid

chlorogenic tinh chế được

Hình 3.23 sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu chuấn - Khảo sát độ đặc hiệu

Hình 3.24 sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu thử - Khảo sát độ đặc hiệu

Hình 3.25 Đồ thị biếu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng

độ acid chlorogenic

Hình 3.26: Giới hạn phát hiện của phương pháp định lượng acid

chlorogenic

Hình 3.27 sắc ký đồ của dung dịch chuẩn acid chlorogenic và dịch

chiết dược liệu Kim ngân hoa

Hình 3.28 sắc ký đồ mẫu chuan và mẫu thử-định lượng acid

chlorogenic trong mẫu dược liệu Kim ngân hoa

70

73

79

80

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chữa bệnh bằng thuốc y học cổ truyền là một phương pháp có từ lâu đời ở nước ta và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò quan trọng trong nên y học nước nhà Những năm gần đây, các nước trên thế giới có khuynh hướng đây mạnh việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y trong điều trị một sô bệnh mãn tính Ở Việt nam, thị trường thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc trở nên rất đa dạng về chủng loại và phong phú về nguồn gốc Công tác kiêm tra chất lượng thuốc đặc biệt là thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc là một nhiệm vụ cấp thiết và quan trọng góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên, công việc kiếm nghiệm thuốc và dược liệu gặp nhiều khó khăn do thiếu chât chuân

Với mong muốn cung cấp thêm chất chuấn phục vụ kiếm nghiệm dược liệu, đề tài cấp nhà nước KC.10.16/06-10 đã thực hiện mục tiêu chiết 10 hợp chất đặc trưng từ dược liệu làm chất chuấn phục vụ kiếm nghiệm dược liệu

Acid chlorogenic là một trong số các chất chuấn hiện tại trong nước chưa thiết lập được, phải mua của nước ngoài, giá cả đắt và không chủ động Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic, một hoạt chất có trong vị dược liệu dễ tìm ở Việt Nam là Kim ngân hoa

Trong phạm vi của đề tài này, mục đích chúng tôi đặt ra là sản xuất được acid chlorogenic có độ tinh khiết cao từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có đế làm chất chuấn dùng trong kiêm nghiệm thuốc và dược liệu dùng làm thuốc.Muc tiêu nghiên cửu của đẻ tài

- Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa đạt độ tinh khiết > 95,0%

- Điều chế được acid chlorogenic đạt tiêu chuấn làm chất đối chiếu trong kiếm nghiệm thuốc và dược liệu

Nôi dung nghiên cửu cu thế của đề tải:

• Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa

• Định tính, định lượng, xác định cấu trúc acid chlorogenic tinh chế được

• Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic tinh chế được

• Sử dụng acid chlorogenic đã tinh chế được làm chất chuân phòng thí nghiệm để định tính, định lượng acid chlorogenic trong vị dược liệu Kim ngân hoa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Chất chuẩn và sử dụng chất chuẩn

1.1.1 Chất chuẩn đối chiếu hóa học

Theo WHO, chất chuẩn đối chiếu hóa học (chemical reference Standard, viết tắt CRS) là bất kỳ nguyên liệu đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/hoạt lực Một chuẩn đổi chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục chính thức của dược đien Châu Âu (EP), hay dược điên Mỹ (USP) hoặc danh mục của Tổ chức y tế thế giới (WHO) Có thế thiết lập một chuấn đối chiếu cơ

sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/ hoạt lực với một chuan đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuấn đối chiếu tùy theo mục đích sử dụng (dùng đê định tính, dùng đê định lượng) và bản chât phương pháp định lượng [15]

1.1.2 Các thông tin về chuấn acid chlorogenic

Cho tới nay, chưa có nơi nào ở Việt Nam sản xuất acid chlorogenic đế làm chất chuẩn Mặt khác, việc tìm mua chất chuẩn acid chlorogenic từ các hãng nước ngoài khó khăn và không chủ động Do đó có nhu cầu cao về chất chuấn acid chlorogenic được sản xuất trong nước

1.2 Tống quan về acid chlorogenic và dược liệu Kim ngân hoa

1.2.1 Tổng quan về acid chỉorogenic

Công thức phân tử : Ci6Hl80 9

Trọng lượng phân tử: 354,31

Tên khoa học theo hệ thống IƯPAC: 3/?-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-OXO-2-

propenyl]oxy]-l£,4/?,5/?-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic acid

Tên khác: 3-0-Caffeoylquinic acid

Acid chlorogenic là một hợp chat phenolic tự nhiên, được phân lập từ lá, hoa và quả của một số loại cây hai lá mầm (như hoa Kim ngân, hạt Cà phê, lá Việt

quất, )- về mặt cấu trúc nó là một ester của acid cafeic với nhóm 3-hydroxyl của acid quinic [13], [16], [30].

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của acid chỉorogenic

Acid chlorogenic có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được trong nước

và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid, Khả năng hòa tan của nó trong các dung môi trên là khoảng 25 mg/ml

ở mức độ thấp [3], [26] Acid chlorogenic được ứng dụng dùng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo đường typ 2, bệnh tim mạch được thương mại hoá dưới tên Sveltol (tại Anh và Na uy) Là một thành phần thêm vào thực phấm (như cà phê, kẹo cao su) đê thúc đây quá trình giảm cân và dùng trong mỹ phâm

đê làm đẹp [17], [26], ơ 'Trung Quốc, sản phâm dược phâm có chứa acid chlorogenic ở mức độ tinh khiết khác nhau từ 20 - 98% và được sử dụng rộng rãi như là một sản phấm bảo vệ sức khoẻ [26]

Acid chlorogenic đã được nhiều Dược đien sử dụng làm chất đối chiếu hoá học

để định tính và định lượng đảm bảo chất lượng các dược liệu có chứa hoạt chất

này Ví dụ: trong Dược điển Anh 2009 có 20 chuyên luận, Dược điển Mỹ 31 có

14 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc 2005 có 18 chuyên luận sử dụng acid chlorogenic làm chất đối chiếu hoá học

Tài liệu [18] đã đưa ra kết quả khảo sát hàm lượng acid chlorogenic trong một

số loại cây trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng acid chlorogenic trong một sổ loại cây

(% theo nguyên liệu khô)

Trong số các loại cây này, hoa Kim ngân là nguồn nguyên liệu dễ tìm ở Việt Nam, có thể được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu chiết xuất acid chlorogenic Do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thêm những tài liệu có liên quan tới cây Kim ngân hoa

1.2.2 Tổng quan về dược liệu Kim ngân hoa

Cây Kim ngân

{Lonicera japonica Thunb.)

Kim ngân hoa

(Flos Lonicerae japonicae)

Họ cơm cháy (Caprifoliaceae)

Cây Kim ngân có nguồn gốc Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam Ớ Việt Nam, Kim ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung du phía bắc, nơi có khí hậu mát, đất trồng thoát nước tốt như

ở Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây Kim ngân thích nghi với nhiêu điều kiện khí hậu và đât đai khác nhau, có thê trồng được ở cả miên núi, trung du và đồng bằng Ớ nơi mát mẻ, cây sinh trưởng nhanh, còn ở những vùng nóng cây phát triên chậm Gân đây, cây được trông ở một sô gia đình, vừa làm cảnh vừa lấy hoa làm thuốc [3],

Cây Kim ngân, đặc biệt là hoa Kim ngân là một dược liệu được dùng làm thuôc từ bao đời nay ở Trung Quôc và Việt Nam [26], Bộ phận dùng của cây Kim ngân là hoa sắp nở (lẫn một sổ hoa đã nở), thân và cành đã phơi khô Mùa hoa nở là tháng 3 đến tháng 5 Thu hái hoa khi hoa sap nở vào mùa hè rồi sây khô Hoa mẫu 5 mọc thành xim 2 hoa ở kẽ lá Hoa thơm khi mới nơ có màu trăng, vê sau chuyên thành màu vàng Vì trên cây cùng có cả hoa trăng và hoa vàng nên mới gọi là Kim ngân Tràng hoa cánh hợp dài 2 - 3 cm chia làm 2 môi dài không đều nhau, một môi rộng lại chia thành 4 thuỳ nhỏ Năm nhị đính ở họng tràng, mọc thò ra ngoài

Hình 1.2 Cây Kim ngân

Tác dụng dược lý của Kim ngân hoa:

- Tác dụng kháng khuân

- Tác dụng trên chuyến hoá chất béo

- Tác dụng trên đường huyết

- Tác dụng chống choáng phản vệ

Kim ngân hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng Nó được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, mày đay, viêm mũi dị ứng, hạ sốt, chữa cảm cúm, chữa sởi, chữa viêm phối, làm dễ tiêu, trị lỵ, hoa phơi khô dùng lợi tiếu Nước sắc hoa Kim ngân còn có tác dụng cải thiện chuyển hóa chất béo trong bệnh nhân tăng lipid máu, sau khi uống thuốc,các esters trong huyết thanh giảm Nước cất nụ hoa Kim ngân (Kim ngân hoalệ) được dùng tiêm đe điều trị bệnh nhiễm khuấn [3], [7]

Thành phần hóa học gồm : các flavonoids, tinh dầu, các saponins và đặc biệt có chứa một hàm lượng acid chlorogenic đáng chú ý được phân bố trong các bộ phận của cây như bảng 1.2 [3] Theo các nghiên cứu từ trước và những nghiên cứu mới nhất gần đây, acid chlorogenic là một hợp chất chính giàu hoạt tính sinh học có trong hoa Kim ngân [26]

Bảng 1.2 Hàm lượng acid chỉorogenic phân bố trong một số bộ phận

của cây Kim ngân.

Có thể thấy rằng trong hoa có chứa acid chlorogenic cao hơn so với các bộ phận khác trong cây Kim ngân Vì vậy chúng tôi chọn hoa làm nguyên liệu cho việc nghiên cứu qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic

Các thử nghiệm chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu

Kim ngân hoa được mô tả trong phần thực nghiệm và kết quả

1.3 Một số qui trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được nghiên

cứu

Bởi tác dụng đáng chú ý của acid chlorogenic và nhu cầu sử dụng hoạt

chất này ngày càng cao, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhăm

tìm ra phương pháp tối ưu nhất đe phân lập và tinh chế acid chlorogenic Một số

quy trình phân lập và tinh chế acid chlorogenic đã được công bố như dưới đây

Theo K Gorter, Liebig Ann (1908), K Freudenberg (1920), cũng như w

Pluml và w Keiholz, đã mô tả các qui trình sản xuất acid chlorogenic, bước đầu

tiên trong tất cả các qui trình trên, acid chlorogenic trong dịch chiết cây lại được

tách ra bằng cách tạo phức kali-caffein-chlorogenat, rồi được tinh chế bằng

nhiều phương pháp, ví dụ như kết tinh lại trong ethanol/ nước hoặc kết tủa bàng

chì acetat Tách cafein ra khỏi phức đã được tinh chế bằng cách chiết dung dịch

trong nước với chloroform Acid chlorogenic được tủa lại bằng cách thêm acid

sulphuric, và tinh chế bằng cách kết tinh lại trong nước [18]

u Fiedler (1954) đã mô tả một qui trình kết hợp giữa phương pháp của K

Freudenberg và phương pháp của w Pluml và w Keiholz Dịch chiết dược liệu

có chứa acid chlorogenic được cô đặc lại và kết tủa bằng bari acetat Sau đó dịch

lọc được trung hoà bang acid sulphuric, bari thừa sẽ được loại bỏ ở giai đoạn

này Acid chlorogenic được tách ra từ dịch lọc trung tính bằng phương pháp tạo

phức với chì acetat, rửa phức bằng nước nóng và thêm hydrogen sulphid, đế tủ

lạnh 2-3 ns,ày, phức kali-caffein-chloroRenat được tách ra Caffein được loại ra

khỏi phức bang chloroform, và acid chlorogenic thu được băng cách acid hoá

nhẹ [18]

Một qui trình khác (1970) đã tách acid chlorogenic bằng cột acid silicic

với dung môi rửa giải chloroform - butanol theo tỷ lệ gradient [18]

Năm 1978, Dower 44, Amberlite IRA 410 hoặc Amberlite IRA 47 được

sử dụng để tách acid chlorogenic ra từ dịch chiết nước hạt cà phê xanh [18], [19]

Theo tài liệu [28], acid chlorogenic trong dịch chiết cây có thể được hấp phụ bởi HPD-850 resin, sau đó phản hấp phụ bang ethanol 95%, nhưng chỉ tiến hành ở qui mô nhỏ

Rõ ràng là những qui trình đã biết thực hiện rất khó khăn, dẫn đến giá thành của sản phẩm acid chlorogenic thương mại hóa bị đây lên rất cao

Vì vậy mục tiêu đặt ra cho các nhà sản xuất là nghiên cứu và phát trien một qui trình sản xuất đơn giản, ít giai đoạn và ít tốn kém đế phân lập và sản xuất acid chlorogenic dạng tự do hoặc muối, có chất lượng đạt yêu cầu, không lẫn tạp chất có độc tính hóa học không mong muốn, từ nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiểm

Tài liệu [18] đã đưa ra một qui trình tinh chế và sản xuất acid chlorogenic hiệu quả, trong đó acid chlorogenic tự do hoặc dạng muối được tách ra từ dịch chiết nước của các cây phù hợp bằng sắc ký lọc qua gel bởi một rây phân tử có các lỗ xốp được tạo thành nhờ sự biến đôi của polysaccharide cụ thê là dextran Loại gel này được thương mại hóa dưới tên Sephadex [18]

1.4 Phương pháp phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột[13]

Hiện nay phương pháp phân lập một chất từ nhóm chất hoặc từ hỗn hợp, sắc ký cột là phổ biến nhất Có thể dùng một số kiểu sắc ký cột với một sổ cơ chế như: sắc ký pha thuận trên silica gel, pha đảo trên chât nhôi Cg, Cig hoặc săc ký rây

phân tử (Size exclusion chromatoiiraphv, SEC) trên Sephadex.

1.4.1 Phương pháp sắc kỷ cột silica gel

Nguyên tắc:

Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Khi dung môi pha động di chuyên dọc theo cột sẽ rửa giải các thành phần của mẫu thử ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực

tăng dần Các chất có độ phân cực thấp hơn được dung môi pha động rửa giải ra trước, tiếp theo các chất có độ phân cực tăng dần được rửa giải ra Kiêm soát hoạt chất rửa giải ra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích họp.

Xác định các thông sổ của cột

Tùy theo mục đích phải tách sạch hay chỉ phân loại thành nhóm mà chọn các thông số cột khác nhau Với cột đầu chủ yếu đê phân tách thành các nhóm, tỷ lệ giữa khối lượng silica gel và chất cần tách ( m Sj | j ca g C| / m t h ã t ) chỉ cần từ 8-10 là đủ Quan trọng là với lượng silica-gel cho trước, phải chọn được cột có kích thước thích họp, nếu chọn cột dài thì dù đủ khả năng tách tốt nhưng thời gian tách lại ỉâu Thực tế một cột có kích thước h/d (chiều dài/đường kính) từ 10-15 là phù hợp

Nhôi cột

Có hai cách nhồi cột: Nhồi ướt và nhồi khô

Nhồi ưót: Cân silica-gel cho vào một cốc miệng rộng có dung tích thích họp, đố

dung môi vào, khuấy đều tay để đuổi hết bọt khí và làm silica-gel phân tán đều trong dung môi Giai đoạn này ảnh hưởng lớn đến khả năng tách của cột sau này

vì nếu có bọt khí hoặc silica-gel bị vón cục thì sự phân tách sẽ kém nhiêu Cột được kẹp vào giá ở vị trí thăng đứng, đáy cột được lót một lớp bông xôp Đô từ

từ silica gel đã được trộn đều với dung môi vào cột Chú ý bố sung dung môi vào cốc nếu thấy silica-gel khô, khó chảy, khi bố sung phải khuấy đều liên tục Sau khi silica-gel đã được đưa vào cột, phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong dung môi vì nêu đê khô hay nứt cột thì khả năng tách sẽ kém nhiêu

Nhồi khô: Cân silica-gel vào một côc có dung tích thích họp, đô từ từ silicagel,

sau khi đã đô hết silica-gel vào cột thì tiến hành rót dung môi vài lân qua cột đê nén chặt silica-gel, đảm bảo độ đồng đều, tránh hiện tượng vón cục hay tạo thành bọt khí

Đưa chất lên cột sắc kỷ

Thông thường người ta hòa tan một lượng chất thô đem chạy cột trong một lượng tối thiểu dung môi pha động/rửa giải, rồi đưa lên cột bằng pipet pasteur Bơm nhẹ nhàng dung dịch này vòng quanh đường kính cột thủy tinh, sao cho dung dịch chảy xuống thấm đều vào pha tĩnh mà không tạo bọt khí và làm xáo trộn bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh với dung môi pha động Có thê rắc một lóp cát sạch dày 1 -2 cm lên bề mặt phía trên pha tĩnh để bảo vệ bề mặt pha tĩnh khi rót dung môi pha động lên cột.

Trong trường họp chất thô đem chạy cột rất ít tan trong dung môi rửa giải, phương pháp dùng silica gel hấp phụ chất trước khi đưa lên cột được áp dụng Chất thô được hòa tan trong một lượng dung môi pha động vừa đủ đến tan hoàn toàn Thêm một lượng silica gel khoảng gấp ba lần lượng cân chất thô vào dung dịch trên, trộn đều rồi làm bay hơi dung môi bằng cất quay trong chân không tới khô thu được bột silica gel khô tơi đã hấp phụ chất thô sẵn sàng đe đưa lên cột sac ký

Trong cả hai trường hợp, trước khi đưa chất thô dạng dung dịch hay dạng được hấp phụ vào silica gel cần duy trì mức dung môi trên cột chỉ vừa đủ đế không pha loãng thêm dung dịch chất thô (trường hợp 1) và ngấm hết lượng silica gel hấp phụ chất thô đưa lên cột (trường hợp 2)

Chạy cột

Lựa chọn và thay đối dung môi chạy cột hợp lý đe đảm bảo các chất phân tách tốt mà thời gian chạy qua cột không quá dài Đe tách các chất hữu cơ bằng silica-gel, dung môi bắt đầu chạy thường kém phân cực, sau đó thường nâng dần

độ phân cực của dung môi cho phù họp vói từns, phân đoạn hỗn hợp, bởi vì mỗi hỗn họp khi đem chạy cột sẽ bị tách thành các phân đoạn khác nhau đôi với từng chất, những chất di chuyến nhanh hơn là những chất bị hấp phụ kém hơn và ứng với những dung môi ít phân cực

Neu chỉ dùng một dung môi trong suốt quá trình chạy sắc ký, khoảng cách giữa các phân đoạn đầu và cuối càng xa, tuy có the tách sạch nhưng mất nhiều thời

gian do phải chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phân đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyển được hoặc di chuyến chậm Vì vậy, với mỗi đoạn ta tăng dần độ phân cực của dung môi nghĩa là giảm dần độ hấp phụ của silica-gel, các phân đoạn sẽ di chuyển liên tục vẫn đảm bảo phân tách tốt.

1.4.2 Sắc ký loại trù' theo kích cỡ và ứng dụng trong tinh cìĩế acid chỉorogenic

Sắc ký loại trừ theo kích cỡ (size exclusion chromatography - SEC) còn được biết đến với tên là sắc ký rây phân tử (molecular sieve chromatography)

Có 2 loại SEC là sắc ký thẩm thấu qua gel (gel permeation chromatography) và sắc ký lọc qua gel (gel filtration chromatography) SEC dựa trên sự khác nhau

về kích cỡ của các tiểu phân đế tách riêng chúng ra bằng cách sử dụng các chất

có kích thước lỗ xốp xác định làm pha cố định Quá trình tách các chất dựa vào kích thước phân tử, có thê phân thành các nhóm:

- Phân tử có kích thước lớn hơn kích thước cực đại của lỗ xốp trong pha tĩnh, sẽ chỉ nằm ở khe hạt, không xâm nhập vào các lỗ xốp được và nhanh chóng theo pha động thoát ra ngoài trước

- Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lồ xốp có thể xâm nhập vào các lỗ xốp của hạt, bị lưu giữ tạm thời trong các lỗ xốp này, sau đó mới di chuyển dần dần theo pha động và thoát ra sau

Quá trình bị “bẫy vào xoang - bị lun giữ - thoát ra khỏi xoang” này xảy ra liên tục suốt chiều dài của cột, kết quả là các cấu tử nhỏ thoát ra khỏi cột chậm hơn các cấu tử lớn Đoạn đường di chuyến, thời gian lưu của các cấu tử lớn và

bé sẽ càng khác biệt nêu chiêu dài cột càng, lớn [2],

Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhung gân 10 năm sau chất lọc gel làm pha cố định mới ra đời với tên Sephadex Đây là pha rắn dùng

để lọc các họp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước, c ấ u trúc hoá học của Sephadex gồm các chuỗi dextran liên kết với nhau bang glycerin (hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu tạo phân tử Sepỉtadex

Có nhiều loại gel với các cỡ lỗ xốp khác nhau, dùng đe tách các phân tử thuộc các dải cỡ khác nhau, ví dụ như ở bảng 1.3 [2]

Bảng 1.3 Khả năng tách lọc của môt số loai geỉ Sepltadex

về nguyên tắc, sắc ký thẩm thấu qua gel trên Sephadex được dùng đế tách hỗn hợp các chất bởi kích thước lỗ xốp của rây phân tử, các phân tử được phát hiện trong quá trình rửa giải theo thứ tự kích thước phân tử giảm dần Nhiệt độ môi trường bình thường là điều kiện thích họp cho thực hiện quá trình tách Pha động được chọn chủ yếu thoả mãn yêu cầu: hoà tan tốt hoạt chât trong mâu thử,

độ nhót thấp, ít độc hại, không quá đắt, không làm trương nở pha tĩnh quá độ vì

nó có thể làm bít các lỗ xốp Độ nhớt của pha động càng thấp thì nó càng có khả năng xâm nhập vào các lỗ xốp của pha tĩnh đê đưa các phân tử có kích thước nhỏ đi vào và đi ra khỏi các lỗ xốp của hạt Có the dùng môi trường rửa giải là nước hoặc cũng có thế sử dụng hồn hợp cồn - nước và tùy theo các yêu cầu riêng biệt mà lựa chọn hệ thống dung môi có độ phân cực khác nhau cho phù họp Đổi với pha tĩnh Sephadex G, thường dùng pha động là nước Chiều dài cột

và kích thước lỗ xốp của Sephadex là yếu tố quan trọng đế tăng cường hiệu lực tách của cột, chúng có mối quan hệ tỷ lệ thuận với nhau Đê tách tổt nhất một chất, thông thường người ta sử dụng hai loại Sephadex có kích thước lỗ xốp khác nhau từ bé đên lớn

Tài liệu [18] đã sử dụng cột Sephadex đế tinh chế acid chlorogenic từ dịch chiết nước của hạt cà phê xanh với dung môi rửa giải là nước và thu được sản phẩm có hàm lượng acid chlorogenic cao và hiệu suất tinh chế cao Tác giả đã phát hiện ra một điều đặc biệt là trên thực tê, acid chlorogenic được lưu giữ chọn lọc trên Sephadex lâu hơn so với kích thước phân tử của nó Thật bất ngờ là gần như toàn bộ lượng chất có trong dịch chiết nước của dược liệu có trọng lượng phân tử lớn hơn và nhỏ hơn acid chloroeenic đều đưọ'c rửa giải qua cột tronạ những phân đoạn rõ ràng và acid chlorogenic thì được lưu giữ chọn lọc

Đe tách riêng acid chlorogenic dạng tự do, người ta nhận thấy răng pH thích hợp nhất của dịch chiết cây phải từ 2-2,8 và cột sử dụng phải có một chiều dài thích họp Trong một số trường họp, dịch chiết nước tự nhiên của cây có pH cao hơn thì ta phải chỉnh pH về khoảng trên bằng một acid vô cơ như HC1, H2S 0 4

Qui trình này cho phép tách riêng acid chlorogenic tự do, dạng muôi và thậm chí

cả các đồng phân của nó với các thao tác đơn giản dễ áp dụng và gân như là tôi

ưu cho chế tạo acid chlorogenic từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên.[18],

Trong thực tế, sắc ký lọc qua gel với độ phân giải cao áp dụng ở các giai đoạn cuối cùng của quá trình tinh chế là lý tưởng với thể tích mẫu vừa phải và dung môi rửa giải thích hợp

1.5 Phưong pháp định tính, định lượng và xác định cấu trúc phân tử

1.5.1.Định tính và xác định độ tinh khiết bằng điếm chảy — M P

Đối với chất rắn kết tinh, điếm chảy là một tiêu chuân lý học rất quan trọng Thông thường phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phấm kết tinh là việc xác định điêm chảy

Điêm chảy là tiêu chuân kiếm tra mức độ tinh khiêt của hợp chât mà chỉ cân lượng mẫu thử rất ít Nêu điêm chảy của hai loại tinh thê thu được qua hai lân kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,5°c thì có thể xem là sản phẩm kết tinh tinh khiết Khi điêm chảy xác định được, đôi chiếu với tài liệu tham khảo có thế đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu

Đo điểm chảy bằng ống mao quản: Phương pháp này dùng mẫu thử từ l-2mg

Quan trọng ở đây là tạo ra môi trường nhiệt độ đồng đều tại vùng tiếp xúc với bầu thủy ngân của nhiệt kế và chất thử trong ống nghiệm mao quản

Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp

Các dụng cụ này có ưu điểm là dùng rất ít chất thử (vài tinh thế) vì có bộ phận phóng đại nên quan sát quá trình nóng chảy của tinh thê được rõ ràng Nhiệt độ được cune, cấp qua một bộ phận điêu nhiệt, nhờ thê nhiệt độ đưọ'c điều chỉnh một cách chủ động và từ từ Khi các góc tinh thê băt đâu biên dạng là lúc băt đầu chảy và khi các tinh thê đã biến thành hạt dầu hình cẩu hoặc hình trứng là quá trình chảy đã kết thúc [8],[9]

1.5.2 Định tính bằng phổ hồng ngoại - IR (infrared spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của bức xạ hồng ngoại Mỗi kiếu liên kết sẽ đặc trimg bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, dựa vào kết quả phổ hồng ngoại, người ta có thế xác định được các nhóm chức đặc trưng Đặc biệt, vùng dưới 700cm'1 được gọi là vùng vân tay được sử dụng đê nhận dạng các họp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp với chất chuân [15]

1.5.3 Định tính, định lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, các sản phẩm của quả trình chiết xuất, phân lập và tinh chế từ dược ỉiệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2],[5],Ị6J

1.5.3.1 Khái niệm cơ bản vê HPLC

Nguyên lý của HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp hóa lý dùng đe tách, định tính, định lượng các thành phần trong hỗn họp dựa trên ái lực khác nhau của các chât với 2 pha luôn tiêp xúc nhưng không trộn lẫn nhau: Pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi bên trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Mau thử và dung môi pha động được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyên theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng với 2 pha và dẫn tới sự tách các chất, sự tách các chất này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thu hoặc trao đối ion Các chất sau khi ra khởi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector (Tử ngoại, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ ) Các tín hiệu được truyền qua bộ phận xử lý kêt quả vả được ơhi hoặc hiên thị trên màn hình Đường cong rửa s,iải sau 1 quá trình gọi là săc ký đô

1.5.3.2 Các thành phân của hệ thông HPLC

Các bộ phận cơ bản của 1 máy HPLC gồm: Bình chứa pha động, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích (có thế được đặt trong bộ phận điều nhiệt), detector (bộ phận phát hiện), bộ phận thu nhận và xử lý số liệu v.v

Pha tĩnh (Stationary phase): Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột, hay

còn gọi là chất mang Trong HPLC, pha tĩnh thông dụng nhất là silica-gel dưới dạng hình cầu Hiện nay, các vi tiểu phân có kích thước 3|im lOị^m, diện tích

bề mặt riêng 50 m2/g ^-500 m2/g là vật liệu được dùng nhiều nhất đê nhồi cột phân tích, Với loại vật liệu này, kỹ thuật nhồi khô không thích họp mà phải nhồi cột ướt với dung môi thích hợp dưới áp suất tương đổi cao

Pha tĩnh được chế tạo trên nền các chất sau: Pha tĩnh trên nền silica-gel, pha tĩnh trên nền oxyd nhôm, pha tĩnh trên nền mạch carbon Trong 3 loại trên, pha tĩnh trên silica-gel có nhiều ưu điếm hơn cả và thường được sử dụng

Pha tĩnh trên nên siỉica-geỉ

- Siỉica-gel trung tính', dùng trong sắc ký pha thuận Ví dụ: Lichrosorb Si 40,

Lichrosorb 60, Hypersil, Micropack-Si

- Silica-gel đã aỉkvỉ hóa: Dùng cho sắc ký pha đảo đế tách các chất không phân

cực, ít phân cực, các chất phân cực ít có khả năng tạo cặp ion Các nhóm OH hoạt động trên bề mặt đã bị alkyl hóa, vì vậy nó không còn phân cực hoặc rất ít phân cực Ví dụ: Hypersil ODS, Lichrosorb RP18, Lichrosorb RP8

Pha động là các chất hữu cơ phân cực: MeOH, ACN, nước hoặc hỗn họp các chất trên Sự tách của các chất nhồi cột loại này có độ lặp lại cao nên được ứng dụng nhiều hơn loại silica-gel trung tính

- Silica-geỉ đã được sulfonic hóa, nitro hóa hoặc amin hóa: dùng cho săc ký trao

đổi ion

Pha động: Pha động trong HPLC là dung môi được cho chảy qua cột, tức là pha

tĩnh, một cách liên tục Pha độne có thê là một hay một hôn hợp các dung môi khác nhau trộn theo tỷ lệ nhất định hoặc có thê là dung dịch muôi có chứa các chất đệm, chất tạo phức

Trong sắc ký phân bổ pha đảo: Pha động là các dung môi phân cực, hay dung là acetonitril, methanol Pha động thường là hồn hợp ACN và nước vì nó có độ nhớt thấp nên có thể sắc ký ở áp suất thấp Có thể thay đổi độ phân cực của pha

M i

động bằng cách cho thêm vào những tỷ lệ nước nhất định Ngoài ra, trong một

số trường hợp còn có thêm chất tạo cặp ion, hệ đệm ôn định pH cho quá trình sắc ký

1.5.3.3 Một so đặc trung trong HPLC

Thời gian lưu tR (retention time):

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần thiết để chất đó di chuyên từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ khi tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic trên sac ký đô)

tR = to + t R hoặc tR - to (1+k )

k : hệ sô dung lượng

t0: thời gian lưu của 1 chất tan không bị lưu giữ (thời gian cần thiết để pha động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu)

- Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: bản chất chất tan; bản chất, tốc độ pha động; bản chất pha tĩnh và trong một sô trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động

- Trong phân tích, nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém Còn nếu tR quá lớn (tR > 20 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài

H ệ so dung lượng k (Capacity factor):

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bô của chât đó trong 2 pha

k = % - = = K — hoặc k = t- ^ - = ^ 1

Qs, Qm : lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động

Vs, Qm : the tích của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Neu k quá nhỏ thì quá trình rửa 2,iải diễn ra quá nhanh, chât cân tách bị rửa giải

ở thời điếm gần với thời điếm bơm mầu Do vậy khả năng tách không tốt Neu k quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài (tR lớn), đỉnh giãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp Trị số tối ưu: 1 < k <5

Độ chọn lọc a (Selectivity factor)

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, thê hiện mức độ tách

A = ^ = ^ ( k : , > k „ )

1 R h f 0

lớn thì thời gian phân tích dài

Hiệu lực cột (Coỉum efficiency)

Hiệu lực của cột là thông số về hiệu suất phân tích của cột, được biêu thị bởi đại lượng quan trọng nhất là sổ đĩa lý thuyết N sổ đĩa lý thuyết là đại lượng biếu thị hiệu năng của cột trong 1 điều kiện sắc ký nhất định Thực tế N nằm trong khoảng 2500 - 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

Số đĩa lý thuyết được tính toán dựa theo công thức:

1.5.3.4 Các phương pháp định lượng trong phân tích HPLC

Nguyên tắc: Có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất phân tích với

diện tích hoặc chiều cao pic của nó Vì vậy có thể định lượng các chất dựa vào

sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic của chất cần xác định với mẫu chuân đã biết trước nông độ

Dựa vào diện tích pic: Phương pháp này hay được sử dụng nhất vì luôn có sự

tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất với diện tích pic của chât đó Không áp dụng phương pháp này trong trường họp pic quá cao, đường nên nhiễu hoặc pic

bị doãng, không đối xứ ng

Dựa vào chiều cao pic: Áp dụng khi pic có dạng không đối, thì nồng độ chất

tuyến tính với chiều cao pic, vì vậy nếu không tính theo diện tích pic thì có thế tính theo chiều cao pic

M ột số phương pháp định lượng cơ bản

- Phương pháp chuân ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản.

Nguyên tắc: So sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích pic của mẫu thử với chiều cao hoặc diện tích pic của mẫu chuân sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Yêu cầu: mẫu thử và mẫu chuấn được sắc ký trong cùng một điều kiện, thời gian thực hiện 2 mẫu không cách nhau xa

Có thê sử dụng phương pháp chuân hóa 1 điêm hoặc nhiêu điêm

- Phương pháp chuân nội

Nhằm giảm sai số và đạt được độ lặp lại cao, dùng 1 chất chuấn thứ 2 thêm những lu'O'nc giống nhau vào cả chất chuẩn ngoại và mẫu thử Chất thêm vào này gọi là chât chuân nội

- Phương pháp thêm cìmân

Phương pháp này được sử dụng khi định lượng bằng HPLC có ảnh hưởng của các chất phụ (như tá dược) hoặc chất chuấn có nồng độ quá nhỏ Dung dịch thử

được thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn rồi tiến hành sắc ký trong cùng điêu kiện dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuân.

1.5.4 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử

Cấu trúc các chất tinh chế ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau, c ấ u trúc càng phức tạp thì yêu cầu phôi họp các phương pháp càng cao Dưới đây là một số phương pháp chúng tôi dùng đê xác định cấu trúc của chất tinh chế được

1.5.4.1 Phô cộng hưởng từ hạt nhân - NMR (nuclear magnetic resonance spectroscopy) [ 15]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phô hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng đế xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ nói chung

và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kêt hợp các kỹ thuật phô NMR một chiều và hai chiều, người ta có the xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kê cả cấu trúc lập thế của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phô NMR (phô proton và phô cacbon) là sự cộng hưởng của các tân sô khác nhau của các hạt nhân từ ('H , l3C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biếu diễn bằng độ dịch chuyến hóa học Ngoài

ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

Phổ 'H -N M R: Trong phổ 'H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (õ) của các proton được xác định trong thang từ 0-14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trung riêng của từnỉỉ phân tử Môi loại proton cộno hưởng ỏ' một trường khác nhau vì vậy chúng được biêu diên băng một độ dịch chuyên khác nhau Dựa vào những đặc trung của độ dịch chuyên hóa học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thế xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

Phổ 13C-NM R: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phô khác nhau Thang đo phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm).

Phổ D EPT - distortinonless enhanccement by polarization transfer: Phô này cho nhũng tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phô DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất Tín hiệu phô của CH và CH3 năm vê một phía

và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT 135° Còn trên phổ DEPT 90° thì chỉ xuất hiện tín hiệu phô của các CH

Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật thường được dùng chủ yêu như sau:

Phô HMQC - heteronuclear multiple quantum coherence: Các tương tác trực

tiếp C-H được xác định nhờ vào các peak giao nhau trên phổ HMQC Trên phổ này, một trục là phổ 'H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

Phổ ltì- H COSY - 1H -1 H chemical shift correlation spectroscopy: Phổ này biểu

diễn các tương tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề nhau Chính nhờ phô này mà các phần của phân tử được nôi ghép lại với nhau

Phô HMBC - heteronucìear multiple bond connectivity : Đây là phô biêu diên

các tương tác xa của c và H trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phô này

mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

Phô NOSEY - nuclei' overhauser effect spectroscopy: Phố này biêu diễn các

tươnơ tác gần trona; không gian của các proton khôna kê đên các liên kêt mà chỉ tính đến khoảng cách nhât định tro na; không gian Dựa vào kêt quả phô này, có thế xác định được cấu trúc không gian của phân tử

1.5.4.2 Phô khôi lư ợ n g - MS (mass spectroscopy) [15]

Phố khối lượng được dùng khá phố biến đế xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phố này là dựa vào sự

phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn có các peak ion mảnh khác, dựa vào đó người ta có thê xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hóa học các hợp chât Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Các phương pháp chủ yếu là:

Phổ EI-MS (electron impact ionization mass spectroscopy): Phổ va chạm điện

tử (Electron Impact, EI), dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm điện tử hoặc ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phố biến là 70eV

Phổ ESI-MS (electron spray ionization mass spectroscopy): Phô tạo ra bởi ion

hóa bằng phun điện tử (Electron Spray Ionisation), Phố này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phố EI-MS, do đó phố thu được chủ yếu là peak ion phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ

Phố FAB-MS (fast atom bombardment spectroscopy): Phô tạo ra bởi kỹ thuật bẳn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment, FAB) ở mức năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được peak ion phân tử

Ngoài ra còn có phương pháp phố khối khác như phố khối lượng phân giải cao (HRMS) cho phép xác định peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Hay là phương pháp kết hợp sắc ký với phố khối như sắc ký khí khối phố (GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích thành phần của hỗn hợp chất

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u

2.1 Nguyên liệu

Dược liệu: Kim ngân hoa

• Tên khoa học: Flos Lonicerae ịaponicae.

• Nơi mua: Công ty dược phâm và thiêt bị y tê Hà nội

Hình 2.4 Dược liệu Kim ngăn hoa (Flos Lonicerae japonicae)

Nguyên liệu Kim ngân hoa được mua về ở dạng tươi đã được sấy qua, có màu vàng nâu sánạ Sau đó đem xay thô băns côi xay d u 'Ọ 'c liệu, thu đ u 'Ọ 'c bột dược liệu đã xay thô

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR- BRƯKER- 500MHz

- Máy đo điểm chảy BUCHI 535

- Máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR

- Máy khối phổ 5989B.HP-MS

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT-PACKARD Series 1100

- Buồng soi tử ngoại DESAGA HP-ƯVIS

- Máy cất quay chân không Buchi 461 có cách thuỷ điều nhiệt

- Cột sắc ký lỏng PHENOMENEX luna C18 ( 5|im, 250 X 4,6 mm )

- Cân phân tích METTLER AG 245 có độ chính xác 0,0 lm g

- Máy lắc siêu âm

- Nồi cách thuỷ MEMMERT

- Tủ sấy MEMMERT

- Bình chạy sac ký lớp mỏng 15x15cm

- Cột thủy tinh đường kính 6 cm, có khóa điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi rửa giải

- Cốc thủy tinh 25 ml (đe thu các dung dịch qua cột)

- Dụng cụ thuỷ tinh chính xác: bình định mức, pipet, ông đong, và các dụng cụ thuỷ tinh khác cần cho quá trình thực nghiệm

2.2.2 Hoá chất, dung môi

Các hoá chât dung môi dùng trong nghiên cứu đê tài đạt tiêu chuân tinh khiết phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC

- Bản mỏng Silica gel GF 254

- Chất chuẩn làm việc acid chlorogenic

Nguồn gốc: Trung Quốc, lot: 110753-200413 Hàm lượn2;: 99,0% (tính theo nguyên trạne,)

- Acid hydrocloric đậm đặc PA

- Bột kẽm PA

- Dung dịch natri hydroxyd 10%

- Ethanol tuyệt đổi PA

- Butyl acetat PA

- Acid formic PA

- Acetonitril (HPLC)

- Acid phosphoric

- Methanol PA

- Các chất nhồi cột: Silica gel (cỡ hạt 40 - 63 Ịim, Merck)

Sephadex G I5 và Sephadex GIO (Sigma)

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân hoa

- Định tính acid chlorogenic tinh chế được

- Xác định cấu trúc của acid chlorogenic tinh chê được

- Thẩm định phương pháp HPLC sử dụng để định lượng acid chlorogenic tinh chế được

- Định lượng acid chlorogenic và xác định hàm lượng tạp chất liên quan của acid chlorogenic tinh chê được

- Sử dụng acid chlorogenic đã tinh chế được làm chất chuân phòng thí nghiệm đế định tính, định lượng acid chlorogenic trong vị dược liệu Kim ngân hoa

2.4 Phưong pháp nghiên cứu

2.4.1 Kiếm nghiệm dược liệu Kim ngăn hoa dùng đê nghiên cứu

2.4.1.1 Định tỉnh dược liệu Kim ngân hoa:

Theo Dược điển Trung Quốc 2005.

Định tính:

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định lượng:

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.4.2 Phương pháp chiết xuất acid chlorogenic từ dược liệu Kim ngân ho

- Acid chlorogenic là một acid phenol, tan được trong nước và trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, với tỉ lệ 25 mg/ml Dựa vào khả năng hoà tan của acid chlorogenic trong các dung môi trên, chúng tôi đã khảo sát các qui trình chiết xuất acid chlorogenic trong các dung môi khác nhau: nước, ethanol (ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, tuyệt đối), methanol (ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 100%) với 2 phương pháp chiết nóng và chiết nguội Dịch chiết thu được, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc

- Loại tạp tan trong nước bang ethanol tuyệt đối

2.4.3 Phân lập và tinh chế acid chỉorogenỉc bằng phương pháp sắc kỷ cột

- Phân lập acid chlorogenic bằng sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 40-63um,

2.4.4.1 Phươnọ;pháp sâc ký' ỉớp mong đê định tính acid chlorogenic

Thử theo Dược điển Trung Quốc 2005 [21]

Điều kiên sắc ký:

- Bản mỏng Silica gel GF254

- Pha động: butyl acetat - acid formic - nước ( 70 : 25 : 25, lớp trên)

- Phát hiện: 2 cách:

+ Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm: vết acid chlorogenic phát huỳnh quang màu xanh.

+ Bằng ánh sáng thường: vet acid chlorogenic có màu nâu vàng

Chuẩn bi dung dich chuẩn vả dung dich thử:

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử có nồng độ acid chlorogenic trong methanol là lm g/ ml

Tiến hành:

- Chấm riêng biệt 1 Oịil mỗi dung dịch chuấn và dung dịch thử

- Tiến hành SKLM theo qui định của DĐVN III

- Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, đế khô ngoài không khí

- Quan sát các vết trên bản mỏng, so sánh vết trên sac ký đô của dung dịch

thử và dung dịch chuấn đế đưa ra kết luận

2.4.4.2 Phương pháp đo đi êm chảy đê định tính và đánh giá mức độ tinh khiêt của acid chỉorogenic tinh chê được

- Đo điểm chảy mẫu chất tinh chế được trên máy đo điếm chảy Buchi 535

- Đánh giá kết quả bằng cách so sánh với thông sổ nhiệt độ nóng chảy của acid chlorogenic trong các tài liệu tham khảo

2.4.4.3 Phương pháp đo phô hông ngoại đê định tính acid cìĩlorogenic tinh chê được

- Chuấn bị mẫu viên nén KBr

- Đo phổ IR

- Đánh giá kết quả bằng cách so sánh với phố chuấn

2.4.4.4 Phươnọ; pháp sac kỷ ỉong hiệu nănơ cao đê đinh tính, định lượn % acid chlorogenic

Thử theo Dược điển Trung Quốc 2005 [21],