Nghiên cứu định lượng selen trong một số chế phẩm thuốc viên nang mềm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Dược điển Mỹ 24 cũng qui định định lượng Selen trong các dạng thuốc bằng phương pháp này với nồng độ của Selen trong dung dịch đo nằm trong khoảng 5 - 25fag/ml.. Xuất phát từ nhu cầu thự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

NGƯYỄN THỊ THANH NHÀI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG SELEN

NANG MỀM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

QUANG P H ổ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

CHUYÊN NGÀNH : K I Ể M NGHIỆM T IIU ố C - ĐỘC C I lẤ l’

MÃ SỐ: 6 0 7 3 1 5

Người hướng dẫn K hoa học:

PGS TS T R Ị NH VĂN L ẨUTHS BÙI T H Ị HÒ

HÀ NÔI - 2004

hướng, íỉẫtt, tị ì úp đô' của eáa thầụ oô (ỊÌátì, các cán f)ộ nhân ữỉèn phòtnị M ỹ

đùn cltáti iíiành cúm tín.:

^JrS ^ ĩr ìt ilt rO ă n M ẩ u — (D iê n t n iỉin ụ (V iê n D d v n i Q íạ íù è n t

'TtíirS (Bùi ^7h i '7f)ồtí — ^ĩriiỉitHỊ pliòniị /lííf rp h u m

(Viên J£iè'm Olạhiệm

ttã h'tt'e íìê p IiiiÓihị d ẫ n tậ n tìn h ũhơ tò i trứng it!(ít q u á trìn h thư a h iên o à

hoàn thành luận oún.

r~Jôì cũng, xin ỉ>ài/ tó lồi cảm tín châu thành tới:

r()4ẬcS Q^S. T/YÍ// CJủ ( ỉn — CfvtiiUuj bộ môn ^ôtìá fj)ỉiâii r~7ú‘h

-'Đãi ítoe rí)iùit‘ 1f)à Qỉôì

rDcỲ ' ìiíỊnụỉit (Dãn 7ỉf)à aà các dán hộ nhăn oiỉti ỊiliàntỊ M ỹ r/)!nún

rĐã ạiúft ĩtữ ơà ĩtónụ íị Ó ịì nhũn (Ị tị Liêu qtiụ hán oỉto tòi trứnạ thòi gian

ỉ ỉn 1C hiên điề tài.

Qlhăti dip nà If tôi t‘ũn(j dùn tràn iron tị cảm on eăa thầy, eê ạìáơ trimạ (Ban (}iúm hiên, pliòttụ ^Đàớ tao sau (Tại hoe trtỉtìtnị rf)ụì ltt)t‘ ^Dtiổi' QlẬi đã tạo mọi điều kiên thuận lời đế tôi hoàn thành luận oán HÌHỊ.

“ 3ôà Qiồi, tìiỊíttậ 20 titíítiạ^ 11 năm 2004.

1.5 PHUƠNG PHÁP QUANG PH ổ HẤP t h ụ n g u y ê n t ử 16

1.6.6 Xử lý mẫu để xác định Selen trong một số đối tượng cụ thể 25

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u t i 27

Chương 3: THỤC NGHIỆM - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 KHẢO SÁT, NGHIÊN c ú u ĐlỀU KIỆN VÔ c ơ HOÁ MAU 333.2 KHẢO SÁT, NGHIÊN c ú u , XÂY DỤNG QUI TRÌNH ĐỊNH

LƯỢNG SELEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP F - AAS, KỸ THUẬT 33HOA HƠI TRỰC TIẾP

3.2.4 Tiến hành 36

3.2.5.1 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp

3.2.5.5 So sánh phương pháp đường chuẩn và phương pháp

3.3 KHẢO SÁT, NGHIÊN c ú u , XÂY DỤNG QUI TRÌNH ĐỊNH

LUỢNG SELEN b ằ n g p h ư ơ n g p h á p F - AAS, KỸ THUẬT

3.3.2 Xây dựng qui trình vô cơ hoá mẫu và chiết Selen 44

3.3.5.1 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp

PHỤ LỤC

AAS: Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.

(Atomic Absorption Spectrophotometry)

F-AAS: Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử trong ngọn lửa

(Flame - Atomic Absorption Spectrophotometry)

ETA -A AS: Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa

(Electro - Themal Atomic Absorption Spectrophotometry)

H C L : Đèn catod rỗng (Hollow catod lamp)

USP: Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea)

Bảng 1.1 Các dạng thuốc chứa Selen Bảng 2.2 Công thức tính hàm lượng

Selen

Bảng 3.3 Sự liên quan giữa nồng độ acid nền và độ hấp thụ

trong phương pháp F - A A S

Bảng 3.4 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ Selen trong

F-AAS kỹ thuật hoá hơi trực tiếp

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát qui trình vô cơ hoá trong F -AAS

kỹ thuật hoá hơi trực tiế p Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu Cigelton Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu

Selenans

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu Prucell Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu Galic - Se Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu Belaf Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu nguyên liệu nấm men Đức Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu nguyên liệu nấm men Việt N am Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng của F - AAS kỹ thuật hoá

hơi trực tiếp trên mẫu M ị Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hoá hơi trực tiếp với phương pháp định lượng thêm đường chuẩn trên mẫuMi Bảng 3.15 Kết quả so sánh phương pháp đường chuẩn và thêm

đường chuẩn trong F - AAS kỹ thuật hoá hơi trực tiếp Bảng 3.16 Kết quả khảo sát các yếu tố tạo H2Se

F- AAS kỹ thuật hydrid hoá 46

18 Bảng 3.18 Kết quả khảo sát qui trình vô cơ hoá trong F - AAS kỹ

thuật hydrid hoá 47

19 Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - A AS kỹ thuật hydrid

hoá trên mẫu C igelton 48

20 Bảng 3.21 Kết quả khảo sát độ lặp lại của F - AAS kỹ thuật hydridhoá trên mẫu nguyên liệu nấm men Việt Nam 48

21 Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ đúng của F - AAS kỹ thuật

hydrid hoá trên mẫu Cigelton 49

22 Bảng 3.22 Qui trình định lượng Selen theo phương pháp

quang phổ hấp thụ u v - VIS 51

23 Bảng 3.23 Kết quả định lượng Selen trong mẫu Cigelton bằng

phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS 52

24 Bảng 3.24 Kết quả định lượng Selen trong nguyên liệu nấm men

Việt Nam bằng phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS 52

25 Bảng 3.25 Kết quả so sánh phương pháp phương pháp F - A AS kỹ

thuạt hoá hơi trực tiếp với phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS 53

26 Bảng 3.26 Kết quả so sánh phương pháp phương pháp F - AAS kỹ

thuật hydrid hoá với phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS 54

1 Hình 1.1 Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch 18

2 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự liên quan giữa nồng độ acid nền và độ

hấp thụ 34

3 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ

Selen trong F - AAS kỹ thuật hoá hơi trực tiếp 36

4 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ

Selen trong F - AAS kỹ thuật hydrid hoá 46

ĐẶT VẤN ĐỂ •

Selen là nguyên tố vi lượng thiết yếu cho cơ thể sống (động vật và thực vật) Nó đóng vai trò quan trọng trong tế bào vì liên quan đến sinh tổng hợp Co-enzym Q(ubiquinon), là thành phần cấu tạo nên Glutathion peroxydase (GSH Px), một enzym chống lại quá trình oxy hoá lipid, bảo vệ tế bào Ngoài

ra, Selen cũng xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá trung gian, giải độc các nguyên tố độc như Asen, Chì, Thuỷ ngân, Cadimi Chính vì vậy, các nhà bào chế đã nghiên cứu và sản xuất ra nhiều chế phẩm chứa Selen để sử dụng cho phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch, viêm khớp, ung thư, suy giảm miễn dịch, suy thoái võng mạc mắt, lão hoá Sự thiếu hụt Selen là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh quan trọng nhưng quá thừa Selen cũng rất nguy hiểm, có thể dẫn tới nhiễm độc Vì vậy, để kiểm soát được lượng Selen đưa vào cơ thể đòi hỏi phải có phương pháp chính xác và tin cậy để kiểm tra hàm lượng Selen trong các dạng thuốc Dược điển Mỹ (USP 24) sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS để xác định hàm lượng Selen Nhưng trên thị trường dược phẩm hiện nay, các thuốc chứa Selen đa số ở dạng hỗn hợp đa thành phần gồm một số vitamin tan trong dầu nên các chế phẩm này thường bào chế dưới dạng viên nang mềm Vì vậy, việc áp dụng phương pháp định lượng như Dược điển Mỹ 24 gặp khó khăn và trở ngại

Kỹ thuật AAS đang được sử dụng khá rộng rãi vì nó đáp ứng được các yêu cầu đối với việc xác định chính xác các nguyên tố vi lượng trong các đối tượng sinh học, y học, môi trường, dược phẩm Dược điển Mỹ 24 cũng qui định định lượng Selen trong các dạng thuốc bằng phương pháp này với nồng

độ của Selen trong dung dịch đo nằm trong khoảng 5 - 25fag/ml Nếu áp dụng theo Dược điển Mỹ để định lượng các chế phẩm thuốc viên nang mềm hiện có trên thị trường nước ta thì cũng gặp khó khăn vì phải vô cơ hoá lượng mẫu thử khá lớn mới có được dung dịch đạt nồng độ yêu cầu

Hiện nay, Việt nam chưa có tài liệu pháp qui nào qui định phương pháp định lượng Selen trong các dạng thuốc Xuất phát từ nhu cầu thực tế kết hợp

với trang thiết bị hiện có tại cơ sở, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu

định lượng Selen có trong các chê phẩm thuốc viên nang mềm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử".

Mục tiêu của đề tài:

• Xây dựng được một phương pháp kiểm tra hàm lượng Selen khả thi,

có độ chính xác và độ đúng cao góp phần vào việc quản lý chất lượng thuốc trên thị trường, giúp các cơ quan kiểm nghiệm, sản xuất áp dụng để kiểm tra, giám sát cũng như xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho các sản phẩm thuốc chứa Selen

• Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Selen trong một số chế phẩm thuốc trên thị trường

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 VÀI NÉT VỀ NGUYÊN T ố SELEN

1.1.1.Đặc điểm [4], [10], [16], [21], [26], [48]

Tên quốc tế: Selenium

Kí hiệu hoá học: Se

Nguyên tử lượng: 78,96

Nguyên tố Selen được Berzelius (1779 - 1848) nhà hoá học người Thuỵ Điển phát hiện năm 1817 ở trong chất thải của quá trình oxy hoá S 02 từ quặng đồng pyrit khi sản xuất H2S 0 4

Selen là nguyên tố hoá học thuộc nhóm VI A trong bảng tuần hoàn các nguyên tố, có số thứ tự 34, cấu hình electron lớp ngoài cùng là: 4s24p4 Các nguyên tố cùng nhóm với Selen là: Oxy, Lưu huỳnh, Telu và Poloni

Selen tồn tại ở một vài dạng thù hình: Selen dạng tinh thể có màu đỏ đậm và màu xám; Selen dạng kim loại có màu xám; Selen dạng vô định hình

là chất bột màu nâu hung Selen không có nhiệt độ nóng chảy xác định, ở nhiệt độ 250°c, các dạng thù hình của Selen đều chuyển sang dạng lỏng có màu nâu đỏ, nhiệt độ sôi Ts = 685 °c và chuyển sang dạng hơi có màu đỏ đậm gồm những phân tử Se2

Vạch phổ hấp thụ đặc trưng và nhạy nhất của Selen là vạch 196, lnm được sử dụng khi dùng kỹ thuật F - AAS và ETA - AAS [17], [37], [38], [39], [49],

Tính chất hoá học của Selen rất giống Lưu huỳnh, chúng đều thể hiện mức oxy hoá -2; +4; + 6 tương ứng với các hợp chất Sulfid - Selenid; Sulfit - Selenit; Sulfat - Selenat Với nhiều hợp chất hữu cơ của Lưu huỳnh , Selen có thể thay thế vị trí của Lưu huỳnh cho những hợp chất tương tự như: Thioure và Selenoure; Cystein và Selenocystein, Methionin và Selenomethionin, các enzym chứa nhóm -SeH tương tự các enzym chứa nhóm -SH

Ở mức oxy hoá -2, Selen tồn tại dưới dạng Selenid (Se‘2) Hydro selenid (H2Se) là một acid yếu, không màu, ở thể khí, có mùi thối giống H2S, có độc tính khá cao Hydro selenid không bền trong không khí, dễ bị phân huỷ thành Selen và nước.

ở mức oxy hoá +4, Selen tồn tại dưới dạng Selen dioxyd (S e0 2), acid Selenơ (H2S e 0 3), Selen tetraclorid (SeCl4) và muối Selenit (S e 0 32') Selen dioxyd có tính oxy hoá mạnh, tính khử yếu Acid selenơ là một acid yếu, tan nhiều trong nước và bị phân huỷ nhanh khi đun nóng tới nhiệt độ nóng chảy

Ở mức oxy hoá +6 , Selen tồn tại dưới dạng acid Selenic (H2S e0 4) hoặc muối Selenat (S e0 4"2) Acid Selenic là một acid mạnh, màu trắng, rất hút ẩm,

có tính oxy hoá mạnh hơn acid Sulfuric

Selen tan trong dung dịch kiềm, KSCN và K ,S 0 3; cháy trong không khí cho ngọn lửa màu xanh sáng và có mùi đặc trưng như mùi rau cải thối rữa do tạo thành dạng dioxyd Selen tác dụng trực tiếp với hydrogen, các halogen Oxy hoá Selen bằng H N 03 sẽ tạo ra H2S e 0 3, bằng H2S 04 sẽ tạo ra H2S e0 4 Selen khử dung dịch muối Vàng và Bạc sẽ tạo ra Bạc selenid và kim loại Vàng, tác dụng được với nhiều kim loại khác

1.1.2 Phân bố [4], [22], [26]

Selen phân bố khắp nơi ở trên vỏ trái đất với những lượng nhỏ, là thành phần chính của 40 chất và thành phần phụ của 37 chất khác Trữ lượng của Selen ở trong vỏ trái đất là 1.10'5% Ta thường gặp Selen trong các loại đất đá, khoáng sản, các vật liệu trên mặt trăng và núi lửa, trong nhiên liệu hoá thạch, động thực vật và nước Trong thiên nhiên, Selen thường ở chung với các kim loại như Cu, Pb, Hg, Ag, Au Những khoáng vật riêng của Selen rất hiếm khi gặp m à thường ở lẫn với những khoáng vật của Lưu huỳnh dưới dạng tạp chất Nước khoáng ở một số vùng có hàm lượng Selen cao [22], [48]

Trong thực vật, Selen thường tập trung ở các cây thuộc họ Đậu, họ Cà phê, các cây Xấu hổ, Nhàu, Keo giậu, lúa mì và một số loài nấm [15], [29]

Trong động vật, Selen tập trung nhiều nhất ở da và gan cá, đặc biệt là cá ngừ Vì thế, mỡ cá và dầu gan cá có hàm lượng Selen lớn Các loài động vật khác thường có lượng Selen nhỏ và không ổn định.

1.1.3 Vại trò của Selen đối vói cơ thể [4], [5], [6], [9], [10], [22], [26],

1958, người ta đã nhận ra lợi ích của Selen đối với sức khoẻ con người và động vật, khi m à Schwars chiết ra từ thận động vật một yếu tố chứa Selen có tác dụng cực mạnh trong điều trị thoái hoá và hoại tử gan [22], [26], Năm

1971, vai trò của nó trong Glutathion peroxydase được phát hiện đánh dấu một giai đoạn quan trọng trong lịch sử y học Ngày nay, Selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng, không thể thiếu được cho hệ thống bảo vệ

cơ thể chống gốc tự do và có nhiều vai trò sinh học khác [22], [23], [27].Gốc tự do luôn tồn tại trong cơ thể, hình thành do chính hoạt động sống của mỗi tế bào và do tác động của môi trường sống Gốc tự do có thể tấn công vào bất cứ cơ quan nào của cơ thể gây ra các nguy cơ sau:

- Tấn công vào các lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) là nguyên nhân hình thành các đám tế bào bọt lắng đọng ở thành mạch máu, tạo ra các mảng xơ vữa gây nên nhiều bệnh tim mạch

- Tấn công vào tổ chức màng, gây tổn thương màng với quá trình peroxyd hoá lipid (POL) gia tăng là bước chuyển dịch đầu tiên của các quá trình viêm

- Tấn công vào ADN gây đột biến gen tế bào là nguyên nhân phát sinh ung thư

- Tấn công dần dần vào các phân tử sinh học quan trọng, vào vật chất di truyền, màng tế bào, các tế bào miễn dịch, sự tích tụ các tổn thương ngày một gia tăng sẽ dẫn đến dấu hiệu tuổi già.

- Ngoài ra, gốc tự do còn làm suy giảm hệ thống miễn dịch, thoái hoá võng mạc, đục thuỷ tinh th ể

Các chất chống oxy hoá (antioxydant) là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại, loại bỏ và làm giảm tác dụng độc hại của các gốc tự do [2 2 ],[23] Selen là nguyên tố cấu thành của hệ enzym Glutathion peroxydase (GSH Px) có vai trò cực kỳ quan trọng trong hệ thống chống gốc tự do, chống oxy hoá của cơ thể Nó có mặt trong mọi tế bào để cùng các enzym Superoxyd dismustase (SOD), Catalase loại bỏ gốc tự do, đặc biệt là phá huỷ Hydroperoxyd và các peroxyd lipid khác của acid béo (LO O , L O O H ) bảo

vệ màng tế bào và ADN [22], [26], [46] Cơ chế loại bỏ peroxyd có thể biểu diễn theo sơ đổ sau:

H 20 2 + 2GSH GSH - Px (chứa Se^ GSSG + 2H 20

A'

(Glutathion reductase)Ngoài ra, Selen còn tham gia vào thành phần của nhiều chất hoạt động sinh học chứa nhóm -SH, -SeH như Selenomethionin Tính chất antioxydant của Selen không chỉ do bản thân các hợp chất có sẵn của Selen mà còn do Selen xúc tác cho sự tổng hợp Co - enzym Q, một chất chống oxy hoá chủ yếu

vong Người ta đã quan sát và chứng minh được nhiều quá trình bệnh lý liên quan tới Selen.

Selen và bệnh tìm mạch: Selen là chất antioxydant, có thể hạn chế sự

oxy hoá các LDL cholesterol nên ngăn chặn quá trình tạo các mảng xơ vữa động mạch - nguyên nhân của cao huyết áp, thiếu máu cục bộ ở các cơ quan, thiểu năng tuần hoàn não Nhiều tác giả đã chứng minh rõ tác dụng hạ huyết

áp của Co - enzym Q, do đó Selen cũng có tác dụng hạ huyết áp Năm 1965, Godwin và cộng sự đã làm thí nghiệm trên động vật và phát hiện sự thiếu hụt Selen và vitamin E gây nên các tổn thương cơ tim và mạch máu Nếu bổ xung thêm Selen trong khẩu phần ăn thì có thể phòng ngừa được các bệnh này Bệnh Keshan - một chứng bệnh về cơ tim do thiếu Selen gây ra, được phát hiện đầu tiên ở những người Trung Quốc sống trên vùng đất nghèo Selen [26],[30], [41]

Selen và bệnh ung th ư : Khi khẩu phần Selen cao, hàm lượng Selen trong

máu cũng cao sẽ ức chế quá trình sinh ung thư Các nhà nghiên cứu cho rằng chính Selen có tác dụng chống oxy hoá, trung hoà gốc tự do, do đó làm tăng chức năng hoạt động miễn dịch của tế bào Ngoài ra Selen còn ngăn chặn sự tưới máu cho khối u Người dân sống ở những vùng đất trồng có hàm lượng Selen cao thì tỷ lệ tử vong do nhiều loại ung thư thấp, đặc biệt là ung thư phổi, trực tràng, thực quản, bàng quang, tuỵ, tuyến tiền liệt, vú, buồng trứng, cổ tử cung Như vậy, Selen có vai trò quan trọng trong phòng chống ung thư [22], [26], [30], [40], [41], [46]

Selen và quá trình viêm: Selen đã được chứng minh là có tác dụng

chống viêm do nó có thể làm ổn định Lysosom vì màng Lysosom không nguyên vẹn là nguyên nhân của quá trình viêm Tác dụng của Selen tăng nhiều khi phối hợp cùng với vitamin E [22], [26], [30], [41]

Selen và hệ thống miễn dịch của cơ thể' Có rất nhiều thí nghiệm chứng

minh Selen là một yếu tố quan trọng cho khả năng chống đỡ của cơ thể đối với

hiện tượng nhiễm khuẩn, nhiễm virut kể cả HIV/AIDS Sự thiếu hụt Selen liên quan đến tình trạng nhạy cảm của cơ thể đối với các tác nhân này Đó là sự giảm sút khả năng thực bào, giảm lượng và hoạt tính của tế bào lympho T Đặc biệt, Selen có một mối liên hệ chặt chẽ với HIV - nguyên nhân gây ra bệnh AIDS Sự suy giảm lượng Selen trong cơ thể phản ánh tiến triển của bệnh Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng HIV có khả năng đồng hoá Selen của người nhiễm bệnh thành các Selenoprotein của virut Hàm lượng Selen trong dinh dưỡng ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của cơ thể con người và hoạt tính của virut Sự thiếu hụt Selen làm cho nhiều loại virut lành tính trở nên có độc lực (ví dụ như virut Coxsackie B3) [22], [26], [30], [41].

Selen trong nhãn k h o a : Nhiều tác giả đã nghiên cứu và thấy rằng hàm

lượng Selen trong võng mạc cao hơn trong các tổ chức khác của cơ thể Người

ta cho rằng Selen tham gia vào phản ứng quang hoá xảy ra ở võng mạc Tác dụng làm sáng mắt của Selen là do sự điều hoà quá trình sinh các gốc tự do trong võng mạc Ngoài ra, Selen còn đảm bảo sự toàn vẹn của thuỷ tinh thể Chỉ có Selen mới ngăn chặn được bệnh đục thuỷ tinh thể còn vitaminE, vitamin A, vitamin c hay các chất khác như Kalisulfat, Ethoxy quinon đều không ngăn chặn được bệnh này [22], [26], [30], [41]

Selen và sự lão hoá: Các hợp chất của Selen và của Co - enzym Q có khả

năng chống oxy hoá các lipit ở màng tế bào, phân huỷ các peroxyd đã tạo thành trong tế bào nên Selen đảm bảo sự vẹn toàn của tế bào, làm chậm quá trình lão hoá của từng tế bào và kết quả là làm chậm quá trình lão hoá của toàn cơ thể Như vậy, các hợp chất của Selen cũng như Co - enzym Q, vitamin

A, vitamin E, vitamin c là các chất chống oxy hoá, trung hoà các gốc tự do sinh ra hàng ngày, hạn chế tổn thương do gốc tự do gây ra, do đó làm chậm quá trình loã hoá, kéo dài tuổi thọ của con người [22], [26], [30], [41]

Selen cần thiết cho sự chuyển hoá Levothyronin (T4) thành Levothyronin (T3) có hoạt tính sinh học mạnh hơn Sự thiếu hụt Selen làm tăng tích luỹ T4,

làm giảm chất lượng T3 nên làm giảm hoạt tính của hormon tuyến giáp Mặt khác, tuyến giáp sản sinh ra nhiều Hydroperoxyd nên cần nhiều Selen và vitamin E để ngăn chặn stress oxy hoá [30], [41], [45].

Ngoài ra, Selen còn có tác dụng khử độc Nó có khả năng liên kết với các kim loại nặng như Thuỷ ngân và đào thải các kim loại nặng ra nước tiểu Selen cũng bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của Bạc, Đồng, Chì, Cadimi, Arsen, Platin [2 2 ], [41]

1.1.4 Độc tính của Selen.

1.1.4.1 Đôi với động vật [10], [26].

Độc tính của Selen trên động vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu Độc tính phụ thuộc vào liều lượng, thời gian dùng và loại súc vật Có ba loại ngộ độc là ngộ độc cấp tính, bán trường diễn và trường diễn

Ngộ độc cấp tính được phát hiện ở động vật ăn cỏ có hàm lượng Selen cao hơn 1 0 0 mg/kg với các biểu hiện như: khó thở, cử động bất thường, ỉa chảy

và chết Khi mổ ra thấy xuất huyết đường tiêu hoá, gan, thận, bàng quang.Nếu xúc vật ăn cỏ có hàm lượng Selen từ vài chục đến 100mg/kg trong thời gian từ vài tuần đến vài tháng sẽ xảy ra hiện tượng ngộ độc bán trường diễn với các biểu hiện như: giảm thị giác, suy hô hấp và chết

Còn nếu súc vật thường xuyên ăn cỏ có hàm lượng Selen từ 5 đến

1 0mg/kg thì bị ngộ độc trường diễn với các triệu chứng như dị dạng, sút cân, rụng lông Cách duy nhất làm mất tác dụng độc của Selen là di chuyển động vật ra khỏi vùng có hàm lượng Selen cao

1.1.4.2 Đôi với con người [10], [26].

Không thấy có báo cáo về tác hại nghiêm trọng do ngộ độc Selen gây ra Chỉ thấy có những thông báo về những dấu hiệu mơ hồ như chán ăn, suy dinh dưỡng, hỏng răng, mất màu da, mất móng chân, móng tay, phù dưới da Việc sử dụng lâu dài Selen hữu cơ với liều 3000ịj.g/ngày có thể gây ra những triệu chứng của ngộ độc trường diễn Để phòng xa, ở Mỹ, người ta coi liều

500fig/ngày dùng trong thời gian dài là có nguy cơ ngộ độc cho người nhưngchưa có bằng chứng cụ thể.

1.1.5 Nhu cầu Selen của con người.

Nhu Cầu Selen ở người được xác định dựa vào chế độ ăn có hàm lượng Selen cần thiết để tăng tối đa hoạt tính của hệ enzym GSH-Px Năm 1980, các nhà khoa học Mỹ làm thí nghiệm trên động vật và đã xác định hàm lượng Selen cần thiết trong chế độ ăn dinh dưỡng của người lớn là 50 - 200|ig/ngày.Hiện nay, một số quốc gia đã đưa ra những con số khác nhau về nhu cầu Selen ở con người Ví dụ ở Australia được khuyên dùng với liều 85)^g/ngày đối với nam trưởng thành và 70|ig/ngày đối với nữ trưởng thành; Hội đồng liên bang Hoa Kỳ đã chấp nhận lượng Selen đưa vào cơ thể hàng ngày là 100|ig đối với nam giới và 70|ug đối với nữ giới, 10 - 15|ig/ngày đối với trẻ em tuỳ theo độ tuổi Phụ nữ có thai và cho con bú nên tăng hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn từ 10-20|j.g/ngày [10], [22], [26], [36], [41]

1.2 CÁC DẠNG THUỐC CHỨA SELEN [10], [22], [23], [26], [28], [34].Với vai trò quan trọng trong quá trình chống lại gốc tự do, Selen trở thành một trong những ngôi sao mới của nhu cầu bổ xung muối khoáng Hiện nay, có năm hoạt chất đã được nghiên cứu cơ bản và thừa nhận là có hoạt tính chống oxy hoá điển hình dùng cho bào chế các dạng thuốc Đó là vitamin c , vitamin E, Ị3 caroten, proanthocyanidin và Selen [6 ]

Vận dụng những thành quả nghiên cứu về chất chống gốc tự do đã được thử nghiệm trên người, các nhà bào chế và công nghệ dược ngày nay đã chế tạo thành công những viên thuốc chứa bốn loại hoạt chất quan trọng nhất: vitamin c , vitamin E, (3 caroten (hoặc vitamin A) và Selen [22], [27], [41],Trên thị trường Việt nam hiện nay có rất nhiều chế phẩm chống oxy hoá chứa Selen, chủ yếu ở dạng viên nang mềm Trong các chế phẩm này, Selen thường dưới dạng hữu cơ trong nấm men (Dried yeats containing Selenium)

với hàm lượng phổ biến khoảng 50fj.g Selen trong một viên Một số chế phẩm chứa Selen ở dạng vô cơ.

Bảng 1.1: Các dạng thuốc chứa Selen

TT THUỐC &

1 Prucell Viên nang mềm Men khô có Se hữu cơ tương đương

với 50|ig Selen

Crom đông khô: lOOmg

2 Belaf Viên nang mềm Men khô có Se hữu cơ tương đương

với 50|ig Selen

Vitamin C: 500mg Vitamin E: 400UI

p caroten: 15mg

3 Youngton Viên nang mềm Men khô có Se hữu cơ tương đương

với 50|ng SelenVitamin C: 500mgVitamin E: 400ƯIVitamin A: 5000UI

8 Geriton Viên nang mềm Selen hữu cơ tương đương 70|ug Se

Dịch chiết nhân sâm Hỗn hợp các vitamin

9 Ginsomin Viên nang mềm Selen hữu cơ tương đương 35|ug Se

Dịch chiết nhân sâmHỗn hợp các vitaminCác khoáng chất: Ca, Fe, Cu, Mg,

Mn, K

1 0 Pre Astig Viên nang mềm Men khô chứa Selen hữu cơ

Các khoáng chất và các vitamin

TT T H U Ố C &

1 1 High potency Viên nang mềm Men khô chứa Selen hữu cơ

Các khoáng chất và Vitamin

1 2 Super energy Viên nang mềm Men khô chứa Selen hữu cơ và các

khoáng chất: Ca, Cu, Cr, p, Mn,

Mo, Zn

Vitamin: A, c , D, E, Bị, Bt, B6, Bj2

13 Selenans Viên nang mềm Men khô có Se hữu cơ tương đương

với 50|ag Selen

15 Celium -50|ig Viên nang mềm Selen: 50|Lig trong men bia

Fe, Mn , Mo, Zn, I, F

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ú ư VỀ SELEN TRONG NƯỚC.

Năm 1992, Đặng Hồng Thuý - Đỗ Thu Huyền - Từ Minh Koóng nghiên cứu nuôi cấy được nấm men chứa 126 - 171|dg Selen trong lgam sinh khối khô [15]

Năm 1997, Lê Thị Hương Giang (Trường Đại học Tổng hợp) nghiên cứu xác định Selen bằng phương pháp cực phổ xung vi phân và Volt - ampe hoà tan [1 1 ]

Năm 2000, trung tâm phân tích khoáng sản - địa chất đã nghiên cứu và ban hành qui trình phân tích: Xác định hàm lượng Selen trong các loại mẫu đất đá, quặng từ 1 0"4% đến 0 ,1% bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - kỹ thuật hydrid hoá

Năm 2001, Lê Thị Uyển Chi (Trường Đại học Dược Hà nội) nghiên cứu tính chất chống oxy hóa của một số chế phẩm chứa nấm men giàu Selen [9].Năm 2002, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường công bố công trình nghiên cứu sản xuất nấm men giàu Selen ở qui mô phòng thí nghiệm và xây dựng phương pháp định lượng Selen trong nấm men bằng phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS theo USP 24; Nhóm nghiên cứu của Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang sử dụng N i(N 03 ) 2 để nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa trong phân tích Selen [19]

Theo hồ sơ tiêu chuẩn chất lượng của một số chế phẩm thuốc do Hàn Quốc sản xuất đang lưu hành trên thị trường nước ta, Selen được định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS (áp dụng theo Dược điển Mỹ

Đến nay, ở Việt Nam chưa có tài liệu pháp qui nào nêu phương pháp định lượng Selen trong các dạng thuốc chế phẩm đa thành phần ở dạng vi lượng.1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP Đ ỊN H LƯỢNG SELEN

1.4.1 Phương pháp phân tích khối lượng.

N guyên tắc; chuyển những hợp chất Selenat (S e04 2 ), Selenit (SeO^2-) trong các mẫu thử về Selen nguyên tố kết tủa đỏ bằng các chất khử như: S 0 2, Fe++, Cu+, Thioure; thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô rồi đem cân khối lượng và tính kết quả Có thể cho Selen tác dụng với thuốc thử O-diamino thơm tạo phức Piazoselenol kết tủa, thu lấy tủa, rửa tủa, sấy khô, cân và tính kết quả[4],

[7], [26]

(Phương pháp này chỉ áp dụng cho các mẫu có nồng độ Selen lớn và nên mẫu đơn giản).

1.4.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ ƯV - VIS.

N guyên tắc: Selen(IV) phản ứng nhạy và chọn lọc với O- diamino thơm,

tạo phức Piazoselenol tan trong các dung môi hữu cơ Phức này có cực đại hấp thụ rất đặc trưng, có thể đo quang để xác định hàm lượng Selen Thuốc thử 3,3' diaminobenzidin và 2 ,3 -diaminonaphtalen là phổ biến nhất [18], [26],

[32], [49],

- Với 2 ,3 -diaminonaphtalen: Mẫu thử được vô cơ hoá bằng hỗn hợp HNO^ và HCIO4, pha loãng dung dịch vô cơ hoá bằng nước cất, thêm vào đó dung dịch chứa Dinatri edetat và Hydroxylamin hydroclorid, điều chỉnh pH đến 1,1 ± 0 ,1 bằng dung dịch NH4OH Sau đó, thêm dung dịch 2 ,3 -diamino naphtalen rồi đun cách thuỷ hỗn hợp trên ở 50°c trong 30 phút Chiết bằng Cyclohexan, đo quang ở bước sóng 380nm để định lượng Selen [48]

Ưu điểm của phương pháp này là phản ứng tạo phức nhạy, chọn lọc, áp dụng được với các mẫu có hàm lượng Seỉen thấp nhưng hạn c h ế lớn nhất là phức piazoselenol d ễ bị phân hư ỷ ngoài ánh sáng, các chất oxy hoá mạnh ngăn cản phản ứng tạo phức, các chất màu ảnh hưởng đến mật độ quang, do

đó dẫn đến kết quả định lượng thiếu chính xác N hư vậy, nếu áp dụng phương pháp này đ ể định lượn ạ các dạng viên nang mềm, viên nén, viên sủi bọt có thành phần nền phức tạp thì gặp nhiều khó khăn.

1.4.3 Phương pháp huỳnh quang.

N guyên tắc: Phức Piazoselenol tạo thành giữa Selen (IV) và các O-

diamino thơm phát huỳnh quang ở bước sóng nhất định Do đó, có thể đo cường độ huỳnh quang để định lượng Selen [26], [48]

- Với 3-3' diaminobezidin: Se(IV) sẽ tạo phức Monopiazoselenol Trong dung môi hữu cơ, phức này phát huỳnh quang ở bước sóng 580nm với bước sóng kích thích là 436nm [26]

- Với 2 ,3 - d ia m in o n a p h t a le n : Se(IV) sẽ tạo phức Piazoselenol phát huỳnh quang ở bước sóng 520nm, với bước sóng kích thích là 380nm trong dung môi

là n-hexan hoặc Cyclohexan [26], [48]

(Phương pháp này nhạy nhưng nếu trong c h ế phẩm chứa nhiều nguyên tố

vi lượng thì kết quả có th ể bị ảnh hưởng).

1.4.4 Phương pháp cực phổ.

N guyên tắc: Đưa Selen trong mẫu về Se(IV) rồi đem đo trên thiết bị giọt

thuỷ ngân với dung dịch điện ly nền là acid Dưới thế 0 - lOOOmV, Selen bị khử ở catod cho hai thế bán sóng Đo cường độ dòng khuyếch tán giới hạn tại thế bán sóng thứ hai sẽ xác định được nồng độ Selen trong dung dịch đo [11], [12], [26], [30], [47],

ịTrong phương pháp này, sự có mặt của một sô' nguyên tố và các thành phần có trong c h ế phẩm ảnh hưởng đến việc lựa chọn dung dịch nền).

1.4.5 Phương pháp kích hoạt phóng xạ.

N guyên tắc: Selen được chuyển về các đồng vị do bắn phá mẫu bằng chùm

nơtron, sau đó đo các cường độ bức xạ của đồng vị mới tạo thành [2 0 ], [26],

[41]

(Độ nhạy của phương pháp này đạt được 0,01 jug, phương pháp có ưu th ế trong việc kiểm tra hàm lượng Selen trong các c h ế phẩm thuốc Tuy nhiên,

phương pháp này đòi hỏi phải có thiết bị phức tạp và phương tiện chống nhiễm xạ).

1.4.6 Phương pháp quang phổ phái xạ nguyên tử.

N guyên tắc: Selen được nguyên tử hoá chuyển thành các nguyên tử tự

do ở dạng hơi Các nguyên tử tự do ở trạng thái cơ bản được kích thích bằng năng lượng của ánh sáng, ngọn lửa, lò, tia lửa điện, hồ quang sẽ chuyển sang trạng thái kích thích Ở trạng thái kích thích, các nguyên tử sẽ phát ra các bức

xạ có bước sóng X = 196,lnm Hàm lượng Selen trong mẫu tỷ lệ với cường độ

bức xạ và tuân theo định luật Lambert - Beer - Buger [42]

1.4.7 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.

N guyên tắc: Selen được nguyên tử hoá chuyển thành các nguyên tử tự do

ở dạng hơi sẽ hấp thụ chùm tia sáng có bước sóng X = 196, lnm Hàm lượng

Selen trong mẫu tỷ lệ với cường độ hấp thụ và tuân theo định luật Lambert - Beer - Buger [19], [26], [31], [33], [35], [43], [44], [49], [50], [51]

(Phương pháp này có th ể định lượng Selen đến khoảng nồng độ 10'6jug/ml

và có ưu th ế đối với những mẫu có nền phức tạp như các dạng viên nang mềm

có chứa hỗn hợp cấc chất chống oxy hoá).

1.5 PHƯƠNG PHÁP QUANG P H ổ HAP t h ụ n g u y ê n T Ử [2], [13], [17],[24], [25], [37], [38], [39],

Sự phát hiện hiệu ứng hấp thụ nguyên tử được công bố lần đầu tiên vào năm

1802 khi W ollaston nhận thấy những vạch tối trong phố ánh sáng mặt trời Năm 1961, người ta bắt đầu sản xuất hàng loạt phổ kế hấp thụ nguyên tử có ứng dụng phân tích Trong những năm gần đây, phương pháp AAS đã được ứng dụng khá rộng rãi để xác định kim loại trong các mẫu quặng, đất, đá, nước, các mẫu của y học, sinh học, các sản phẩm công nghiệp, rau quả, thực phẩm; các nguyên tố vi lượng trong phân bón, thức ăn gia s ú c [19], [26],[31], [33], [35], [43], [44], [49], [50], [51] Trong ngành Dược cũng đã có một

trong dược chất, tá dược, dược liệu.

Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử có độ chính xác và độ nhạy cao nên chúng tôi sẽ ứng dụng phương pháp này để xác định hàm lượng Selen trong chế phẩm thuốc viên nang mềm và nguyên liệu nấm men

1.5.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp AAS.

Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không thu và cũng không phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ Ở trạng thái này, nguyên tử bền vững và nghèo năng lượng nhất được gọi là trạng thái cơ bản của nguyên tử Nhưng khi nguyên tử đang tồn tại ở trạng thái hơi tự do, nếu kích thích nó bằng một chùm tia bức xạ đơn sắc có năng lượng phù hợp, có độ dài sóng trùng với các vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố đó thì các nguyên tử sẽ hấp thụ năng lượng của bức xạ chiếu vào nó và chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản, sinh ra một loại phổ của nguyên tử Quá trình này gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nguyên tố đó

Sự giảm cường độ ánh sáng do nguyên tử hấp thụ cũng tuân theo định luật theo định luật Lambert - Beer - Buger:

Trong đó:

I0: Cường độ chùm sáng tới

I: Cường độ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ

N„ và nồng độ c của nguyên tố phân tích trong mẫu có mối quan hệ rất phức tạp, một cách tổng quát mối quan hệ giữa N() và c được xác định theo

Trong đó: Ki là hằng số thực nghiệm được xác định bởi các điều kiện hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu phân tích Trong những điều kiện nhất định, Ki là hằng số, b là hằng số bản chất, được quyết định bởi mỗi loại nguyên tử và nồng độ của nó trong mẫu Trong mọi điều kiện ta đều có: 0<b< l

Kết hợp biểu thức (1.1) và (1.2) có: D = k cb (1.3)Trong một điều kiện thực nghiệm thì k = const, nên biểu thức (3) sẽ là:

Đây là phương trình cơ sở của phép định lượng các nguyên tô theo AAS

Đường biểu diễn phương trình này có hai đoạn (hình 1.1):

Hình 1.1 Môi quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch

- Với mọi nồng độ Cx < C(), quan hệ giữa D và c là tuyến tính, b = 1 (đoạn AB)

- Với mọi nồng độ Cx > C0, quan hệ giữa D và c là không tuyến tính,

b < 1 (đoạn BC)

C() được gọi là nồng độ giới hạn trên của vùng tuyến tính AB Trong phân tích, người ta thường chỉ sử dụng đoạn thẳng AB, vì trong đoạn này (vùng

nồng độ này) đường chuẩn là một đường thẳng và việc tính toán sẽ được kết quả chính xác hơn Nếu nồng độ chất cần nghiên cứu Cx > C() thì cần phải tiến hành pha loãng dung dịch về nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính AB.

1.5.2 Các quá trình thực hiện trong phép đo AAS.

Muốn thực hiện được phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố, cần phải thực hiện các quá trình sau:

1 Quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu: chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử

tự do Đám hơi này chính là môi trường hấp thụ bức xạ Số nguyên tử tự do trong trạng thái hơi quyết định cường độ vạch phổ hấp thụ Do đó, quá trình nguyên tử hoá mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phân tích một nguyên tố Mục đích của nguyên tử hoá mẫu là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do

từ m ẫu phân tích với hiệu suất cao và ổn định để phép đo đạt kết quả chính xác và độ lặp lại cao

Hiện nay, người ta thường dùng hai kỹ thuật để nguyên tử hoá mẫu phân tích Đó là:

- Kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu bằng ngọn lửa tương ứng có phép đo phổ hấp thụ nguyên tử trong ngọn lửa (F - A AS)

- Kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa tương úng có phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (ETA - AAS)

2 Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ một phần năng lượng của tia bức xạ Phần năng lượng của bức xạ bị hấp thụ phụ thuộc vào nồng độ của các nguyên

tử tự do trong môi trường hấp thụ

3 Thu toàn bộ chùm sáng bằng một hệ thống máy quang phổ, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của

nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử

Trong một giới hạn nhất định của nồng độ c , giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ c của nguyên tố trong mẫu phân tích theo phương trình (1.4).

1.5.3 Kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu bằng ngọn lửa

Trong phép đo F - AAS, mọi quá trình xảy ra trong khi nguyên tử hoá mẫu phụ thuộc vào các tính chất và đặc trưng của ngọn lửa đèn khí, chủ yếu là nhiệt độ của ngọn lửa Nhiệt độ của ngọn lửa lại phụ thuộc rất nhiều vào bản chất, thành phần của chất khí được đốt cháy và tốc độ dẫn khí vào để tạo ra ngọn lửa Điều đó có nghĩa là ứng với mỗi hỗn hợp khí cháy sẽ cho ngọn lửa

có nhiệt độ khác nhau Thành phần của hỗn hợp khí cháy thay đổi thì nhiệt độ của ngọn lửa cũng bị thay đổi Nói chung, nhiệt độ của các loại đèn khí đều không cao, nó chỉ trong vùng từ 1900- 3300()c Hai loại hỗn hợp khí đã và đang được sử dụng phổ biến trong phép đo F - AAS là hỗn hợp của không khí nén và acetylen hoặc nitơoxit và acetylen

1.5.3.3 Các quá trình xảy ra trong ngọn lửa:

Đây là một quá trình động gồm nhiều quá trình xảy ra liên tiếp đồng thời với nhau Mẫu phân tích đã chuẩn bị ở trạng thái dung dịch (ví dụ dạng dung dịch muối MenXm), được trộn đều với khí mang và khí cháy tạo thành các hạt sol khí (thể aerosol) Sau đó, dẫn hỗn hợp aerosol cùng hỗn hợp khí đốt vào đầu đốt Dưới tác dụng của nhiệt độ ngọn lửa, dung môi trong các hạt sol khí bay hơi làm cho M enXm trong dung dịch chuyển thành các hạt rắn nhỏ mịn

Các hạt MenXm bị nóng chảy ở nhiệt độ cao chuyển sang dạng MenXm lỏng Tiếp theo là quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá với hai cơ chế chính sau xảy

Cơ chế I: Nếu Eh < Ea, tức là năng lượng hoá hơi Eh nhỏ hơn năng lượng nguyên tử hoá Ea thì các phân tử M enXm sẽ hoá hơi Sau đó các phân tử khí này sẽ bị phân ly (nguyên tử hoá) thành các nguyên tử tự do Các nguyên tử này sẽ hấp thụ bức xạ tạo ra phổ AAS của nó

MenXm(lỏng) -» MenXm(khí) -» nMe°(khí) + mX(khí)

nMe°(khí) + n(hv) —» phổ AAS

Các muối halogenid, acetat và một số muối nitrat của các kim loại thường xảy ra theo cơ chế này Cơ chế này cho phép đo có độ nhạy và độ ổn định cao

Cơ chế II: nếu Eh > Ea, các phân tử MenXm sẽ bị phân ly thành nguyên tử Sau đó, các nguyên tử mới hoá hơi và hấp thụ tia bức xạ để tạo ra phổ AAS của nó

M enXm(lỏng) -» nMe(rắn, lỏng) + mX(rắn, lỏng) -» nMe° (khí)nMe°(khí) + n(hv) -» phổ AAS

Muối sulfat, phosphat và silicat của các kim loại thường xảy ra theo cơ chế này Cơ chế này cho phép đo có độ nhạy và độ ổn định kém cơ chế I.Bên cạnh quá trình chính như trên, trong ngọn lửa còn có các quá trình phụ làm ảnh hưởng đến kết quả của phép đo như:

- Quá trình ion hoá của nguyên tố phân tích, làm giảm số nguyên tử tự do trong ngọn lửa, do đó làm giảm cường độ của vạch hấp thụ

- Quá trình hấp thụ của các phân tử ở trạng thái hơi hoặc của các hạt mẫu rắn chưa bị hoá hơi trong ngọn lửa gây nên sự hấp thụ giả

- Sự tạo thành các hợp chất bền nhiệt: một số kim loại có thể hình thành các hợp chất bền nhiệt kiểu monoxit Các hợp chất này sẽ khó phân ly thành các nguyên tử tự do trong ngọn lửa đèn khí

- Sự phát xạ của m ột số nguyên tử có vạch phát xạ gần với vạch phát xạ của nguyên tố phân tích sẽ sinh ra phổ nền và sự hấp thụ giả.

1.5.4 Các yếu tô ảnh hưởng.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích trong phép đo AAS rất đa dạng và phức tạp, có khi xuất hiện, cũng có khi không xuất hiện, có ảnh hưởng hay không là tuỳ thuộc vào thành phần của mẫu và nền của nó Xét một cách toàn diện, có thể chia thành sáu nhóm yếu tố

Nhóm 1: là các thông số của hệ máy đo phổ Các thông số này cần được khảo sát và lựa chọn cho từng trường hợp cụ thể Thực hiện công việc này chính là tối ưu hoá các thông số của máy cho một đối tượng phân tích

Nhóm 2: là các điều kiện nguyên tử hoá mẫu Các yếu tố này thể hiện rất khác nhau tuỳ thuộc vào kỹ thuật được lựa chọn để nguyên tử hoá mẫu

Nhóm 3: là các ảnh hưởng về phổ như sự hấp thụ nền, sự chen lấn của vạch phổ và sự hấp thụ của các hạt rắn

Nhóm 4: là các kỹ thuật và phương pháp xử lý mẫu Đây là một công việc quan trọng có thể làm mất hay nhiễm bẩn thêm nguyên tố phân tích vào mẫu gây cho kết quả phân tích không đúng với thực tế của mẫu

Nhóm 5: là các yếu tố vật lý như độ nhớt và sức căng bề mặt dung dịch mẫu thường thể hiện nhiều trong phép đo F - AAS, nhất là khi mẫu phân tích

có nồng độ lớn Các yếu tố khác như sự ion hoá và kích thích phổ phát xạ chỉ

có ý nghĩa khi phân tích phổ hấp thụ của kim loại kiềm và kiềm thổ

Nhóm 6 : là các yếu tố hoá học như nồng độ acid và loại acid trong dung dịch mẫu, ảnh hưởng của các cation và anion khác nhau trong dung dịch, ảnh hưởng của thành phần nền và ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Trong nhiều trường hợp, một trong những ảnh hưởng này lại được lợi dụng để làm tăng độ nhạy của vạch phổ

Vì vậy, để kết quả chính xác và tin cậy đòi hỏi người phân tích phải biết

xử lý hóa học, tách loại, làm giàu, che tránh các yếu tố ảnh hưởng về mặt hoá học cũng như về phổ hấp thụ trong mỗi trường hợp

1.6 PHƯƠNG PHÁP VÔ C ơ HOÁ MAU [1], [3], [8],

Các nguyên tố trong mẫu phân tích thường ở dạng hợp chất hữu cơ hoặc hợp chất vô cơ nhưng có lẫn các tạp chất hữu cơ Việc xác định chúng đòi hỏi phải phá huỷ hoàn toàn phần hữu cơ trong mẫu Các chất hữu cơ rất phong phú và đa dạng Trước khi phân tích, mẫu thường được xử lý bằng một trong các phương pháp sau: Vô cơ hoá khô, vô cơ hoá ướt, vô cơ hoá trong lò vi sóng và lên men

1.6.1 Phương pháp vô cơ hoá khô.

N guyên tắc: Đốt cháy các chất hữu cơ có trong mẫu phân tích để giải

phóng kim loại ra dưới dạng oxit hoặc muối của chúng bằng nhiệt Sau đó, hoà tan cắn trong acid để tạo dung dịch

Phương pháp này thực hiện đơn giản, vô cơ hoá được triệt để nhưng có nhược điểm chính là nhiệt độ tro hoá cao (khoảng 500 - 600°C) nên làm mất các nguyên tố dễ bị bay hơi như: Pb, Zn, Ag, Se, As , thời gian xử lý mẫu kéo dài Người ta khắc phục bằng cách cho thêm chất bảo vệ như M g (N 03 ) 2

hoặc KNO3 và chọn nhiệt độ thích hợp

1.6.2 Phương pháp vô cơ hoá ướt.

N guyên tấc: Oxi hoá chất hĩru cơ bằng một acid hoặc một hỗn hợp acid

có tính oxy hoá mạnh thích hợp

Phương pháp này rút ngắn được thời gian phân tích so với phương pháp

vô cơ hoá khô, bảo toàn được chất phân tích (vì nhiệt độ vô cơ hoá không cao) nhưng phải dùng một lượng acid lớn (thường gấp 3 đến 5 lần mẫu) Vì vậy, phương pháp này đòi hỏi các acid sử dụng phải có độ tinh khiết cao và chỉ thích hợp với những mẫu có khối lượng nhỏ

1.6.3 Phương pháp vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng.

N guyên tắc: Dùng năng lượng vi sóng đốt nóng thuốc thử và mẫu đựng

trong bình kín Trong điều kiện kín, áp suất cao có thể dễ dàng đạt được nhiệt

độ cao làm tăng tốc độ vô cơ hoá (Thực chất đây là quá trình vô cơ hoá ướt thực hiện trong lò vi sóng).

Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hoá triệt để, có thể vô cơ hoá nhiều mẫu cùng một đối tượng Có thể điều khiển quá trình vô cơ hoá từ xa bằng một máy vi tính do đó làm tăng độ an toàn cho người sử dụng và độ tin cậy của hệ thống Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không đủ điều kiện trang bị

1.6.4 Phương pháp lên men.

Nguyên tắc: Hoà tan mẫu thành dung dịch huyền phù, thêm men xúc tác

và lên men ở nhiệt độ 37 - 40°c trong thời gian 7 - 1 0 ngày Trong thời gian lên men, các chất hữu cơ bị phân huỷ thành khí C 0 2, acid, nước và giải phóng kim loại trong hợp chất hữu cơ dưới dạng cation trong dung dịch nước

Phương pháp lên men là phương pháp vô cơ hoá mẫu êm dịu, không cần hoá chất, không làm mất nguyên tố cần phân tích, rất thích hợp cho việc phân huỷ các mẫu đường, nước ngọt, nước giải khát, tinh bột nhưng thời gian xử lý mẫu lâu và phải chọn được loại men thích hợp

1.6.5 Tác nhân vô cơ hoá [1], [38]

Khi xử lý mẫu bằng phương pháp vô cơ hoá ướt và trong lò vi sóng thì việc lựa chọn các tác nhân oxi hoá phải căn cứ vào khả năng, đặc tính oxy hoá của thuốc thử và đối tượng mẫu

A cid N itric (H N Ỡ 3) : là tác nhân oxy hoá mạnh dùng để oxy hoá các chất

hữu cơ, được sử dụng rộng rãi để giải phóng các nguyên tố từ các cốt sinh học

và thực vật Nhiệt độ sôi Ts= 120°c

A cid sulfuric (H 2S 0 4) : có tính oxy hoá mạnh, Ts=339°c, có khả năng phá huỷ hoàn toàn hầu hết các chất hữu cơ, có thể phối hợp với H N 0 3

A cid percloric (H CIO J: có tính oxy hoá mạnh, có thể ăn mòn các kim

loại, không phản ứng với các acid khác, phá huỷ được các hợp chất hữu cơ

HC104 gây nổ mạnh khi tiếp xúc với nguyên liệu hữu cơ và chất vô cơ dễ bị oxy hoá nên phải oxy hoá bằng HNO3 trước khi sử dụng HCIO4 Ts=200°c.Ngoài ra, acid hydrocloric, acid hydrofluoric, hydroperoxyd cũng được dùng làm tác nhân oxy hoá.

Trong nhiều trường hợp, phải sử dụng hỗn hợp các acid để đạt được mục đích vô cơ hoá Các hỗn hợp acid hay được sử dụng: acid sulfuric - hydro peroxyd; acid nitric - hydroperoxyd; acid sulfuric - acid nitric; acid sulfuric - acid nitric - acid percloric; acid nitric - acid percloric; acid sulfuric - acid nitric - acid hydrocloric; acid sulfuric - acid nitric - acid hydrofluoric

1.6.6 Xử lý mẫu đê xác định Selen trong một sô đối tượng cụ thể

Khi định lượng Selen, ngoài nhiệm vụ vô cơ hoá Selen dạng hữu cơ thành dạng vô cơ, một số kỹ thuật định lượng đòi hỏi Selen phải ở mức oxy hoá nhất định (Se+ 4 hoặc Se+6) Do đó, khi xử lý mẫu, ta phải lựa chọn được phương pháp và tác nhân vô cơ hoá thích hợp để thu được dạng Selen có mức oxy hoá đáp ứng được yêu cầu của kỹ thuật định lượng Ví dụ định lượng bằng phương pháp quang phổ thụ u v - VIS, phương pháp cực phổ và phương pháp F - AAS với kỹ thuật hydrid hoá thì ở giai đoạn cuối cùng Selen nhất thiết phải ở dạng

Se+ 4 [30],

M au đất, đá, trầm tích: Định lượng bằng phương pháp F - AAS với kỹ

thuật liỹđrid hoá, sử dụng phương pháp vô cơ hoá ướt theo quy trình sau:0,15g mẫu + 9ml HNO3 65% + 0,25ml HC1 10%, để yên 3 giờ Thêm 2ml HCỈO4, 2ml H2S 0 4, 10ml HF, duy trì nhiệt độ 125° trong 1 2 giờ Sau đó, làm lạnh, thêm tiếp 25ml HC1 6 N, để 6 giờ [36]

Có thể chiết Selen lẫn trong đất bằng các dung dịch sau (xắp xếp theo thứ

tự giảm dần của khả năng chiết): HNO, 2M > KH2P 04 IM > KH2P 04 +

K2H P 04 0,1M > KH2P 04 0,1M > EDTA (pH 7) > CH3COOH 0,43M [31], Hỗn hợp KH2P 0 4- K2H P 04 0,1M (pH 7) thích hợp nhất với các loại mẫu

M ẫu than và thực vật: Định lượng bằng phương pháp F - AAS với kỹ

thuật hoá hơi trực tiếp, sử dụng phương pháp vô cơ hoá ướt theo qui trình sau:

0 ,lg mẫu + 20ml HNO3, 2ml H2S 0 4, để yên trong 12 giờ Thêm tiếp 3ml HCIO4, duy trì nhiệt độ 175°c trong 30 phút Sau đó, tiếp tục tăng nhiệt độ đến khi xuất hiện khói trắng [36].

250mg mẫu hoà tan trong hỗn hợp HNO3-HF đặc (tỷ lệ 1:2 V/V), bốc

hơi đến khô ở 50 - 60°c Hoà tan cắn trong 15ml dung dịch HC1 5M, đun

nóng ở 100°c trong 15 phút để khử Se+ 6 thành Se+4, làm lạnh và thêm 15ml nước Cho dung dịch chạy qua cột polyethylen (35mm X 8mm id), chất nhồi cột là thiolcotton, dung dịch rửa giải là dung dịch HC1 2,5M Dung dịch thu được đem phân tích bằng phương pháp ETA - AAS Phương pháp này áp dụng với hầu hết các mẫu địa chất [43]

M ẫu nước và dịch chiết: Định lượng bằng phương pháp F - AAS với kỹ

thuật hoá hơi trực tiếp, sử dụng phương pháp vô cơ hoá ướt theo qui trình sau: lOg dung dịch + lm l K9S2Ox, để yên lgiờ Thêm lm l HC1 đặc, đậy kín, đun đến 110°c và duy trì trong 1 giờ Sau đó, mở nắp và đun đến khi dung dịch còn 3 - 5ml [36]

N ấm m en chứa Selen: Định lượng bằng phương pháp quang phổ u v -

VIS, sử dụng phương pháp vô cơ hoá khô bằng cách đốt mẫu trong bình oxygen [49]

M ẫu dược ph ẩ m (dạng viên nang, viên nén, dung dịch chứa hỗn hợp

các vitamin tan trong nước - dầu và muối khoáng):

Định lượng bằng phương pháp F - AAS kỹ thuật hoá hơi trực tiếp, sử dụng phương pháp vô cơ hoá ướt: mẫu + HNO3, đun sôi nhẹ khoảng 15 phút, làm lạnh, cho tiếp HCIO4, tiếp tục đun đến khi xuất hiện khói trắng [49].Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ u v - VIS, sử dụng phương pháp vô cơ hoá ướt: mẫu + HNO3, đun sôi nhẹ khoảng 15 phút, làm lạnh, cho tiếp HCIO4, tiếp tục đun đến khi xuất hiện khói trắng, thêm tiếp HNO3 rồi đun đến mất màu Thêm dung dịch HC1 10% và đun sôi trong 3 phút [49]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đ ố i TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

Mẫu 1 (Mj): Viên nang mềm Cigelton

Công thức: (xem bảng 1.1.)

Số kiểm soát: 00003

Nơi sản xuất: Công ty Dược phẩm Chon Kun Dang-Korea

Mẩu 2 (M 2): Viên nang mềm Selenans.

Công thức: (xem bảng 1.1.)

Số kiểm soát: 020403

Nơi sản xuất: Công ty Dược phẩm Chung Gei - Korea

Mẫu 3 (M3): Viên nang mềm Prucell.

Công thức: (xem bảng 1.1.)

Số kiểm soát: 330502

Nơi sản xuất: Công ty Dược phẩm Green-Korea

Mẫu 4 (M4): Viên nang mềm Galic - Se.

Công thức: (xem bảng 1.1.)

Số kiểm soát: 001

Nơi sản xuất: Công ty cổ phần Dược phẩm Hà tây-Việt nam

Mẫu 5 (M s): Viên nang mềm Belaf.

Công thức: (xem bảng 1.1.)

Số kiểm soát: 040903

Nơi sản xuất: Công ty Dược phẩm SuDo - Korea

Mẫu 6 (M6): Nguyên liệu nấm men Đức (hàm lượng 2000|ig/g)

Mẫu do công ty TNHH SPM - Việt nam cung cấp

Mẫu 7: Nguyên liệu nấm men Việt nam (hàm lượng 1800|Lig/g)

Mãu do TS Nguyễn Quang Thường - Trường Đại học Dược Hà nội cung cấp

2.2 THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT.

2.2.1 Hoá chất và thuốc thử.

Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất và hoá chất sử dụng phải có độ tinh khiết rất cao, loại superpure hay tinh khiết phân tích, đã được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phương pháp A AS trước khi dùng.Các hoá chất và dung môi sử dụng để nghiên cứu đều của hãng Merck gồm: - Dung dịch HNO3 65%

- Dung dịch HC104 70%

- Dung dịch HC1 37%

- Dung dịch amoniac 25%

- Cyclohexan

Nước cất được làm sạch bằng phương pháp trao đổi ion

Các thuốc thử của BDH-Laboratory- England gồm:

- Natri ethylendiamino tetraacetat (Natri edetat - Na EDTA) không có Se

Máy quang phổ UV-VIS - HP 8453

Máy đo pH Metrohm - Swiss

Cân phân tích AA-200 có độ chính xác 0 ,lm g của Denver Instrument Company

Hệ thống lọc nước trao đổi ion

Các dụng cụ thuỷ tinh, nồi cách thuỷ, bếp điện

Tất cả các máy móc và dụng cụ đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, GLP

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u .

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu: phương pháp vô cơ hoá ướt.

2.3.2 Phương pháp định lượng.

2.3.2.1.Đ ịnh lượng Selen trong m ẫu bằng phương phá p F - A A S.

Nguyên tử hoá bằng ngọn lửa đèn khí với hai kỹ thuật hoá hơi: hoá hơitrực tiếp và hydrid hoá

Nguyên tắc của kỹ thuật hoá hơi trực tiếp: Dùng năng lượng nhiệt của

ngọn lửa đèn khí khi đốt cháy một hỗn hợp khí để hoá hơi mẫu phân tích (mục 1.5.3.3) Đối với kỹ thuật này, chỉ cần đưa Selen về dạng vô cơ hoà tan trong dung dịch mà không cần quan tâm Selen ở mức oxy hoá nào

Nguyên tắc của kỹ thuật hydrid hoá: Các nguyên tố như Asen, Selen và

Antimon trong mẫu dạng dung dịch được chuyển sang dạng hợp chất hydrid thể khí nhờ phản ứng với Hydrogen mới sinh do Natriborohydrid (NaBH4) hoặc Thiếc clorid (SnCl2) tác dụng với Acid hydrocloric Hợp chất hydrid này được thổi liên tục bằng khí Argon vào trong buồng nguyên tử hoá Dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn khí khi đốt cháy một hỗn hợp khí để nguyên tử hoá hợp chất hydrid đó, tạo ra các nguyên tử tự do của nguyên tố phân tích cho phép đo phổ AAS

Phép đo phổ F - AAS với kỹ thuật hydrid hoá chỉ xác định được một số nguyên tố như Se, As, Sb nhưng có độ nhạy cao hơn (cỡ ng/ml) phép đo F - AAS với kỹ thuật hoá hơi trực tiếp Trong phép đo này, máy hấp thụ nguyên tử đòi hỏi phải có thêm một bộ phận tạo hydrid Các điều kiện để tạo ra hợp chất hydrid là vấn đề quan trọng nhất và chỉ khi có được các điều kiện này thích hợp nhất thì ta mới thu được kết quả tốt và chính xác Đối với Selen, sau khi

vô cơ hoá phải ở dạng có mức oxy hoá +4 (H2S e 0 3), sau đó mới bị khử thành H2Se và nhiệt độ của ngọn lửa để nguyên tử hoá là 2000°c

2.3.2.2 Đ ịnh lượng Selen trong m ẫu bằng phương pháp quang p h ổ hấp thụ

u v - VIS.

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả.

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng toán thống kê theo chỉ dẫn của các tài liệu [2], [14]

• Công thức tính khối lượng dầu thuốc trung bình trong viên ( m ):

m = ^ J— — (2.5) n: số lượng viên thuốc

n

Mt : tổng khối lượng của n viên thuốc (g)

M ,,: tổng khối lượng vỏ của n viên thuốc (g)

• Công thức tính hàm lượng Selen:

Bảng 2.2 Công thức tính hàm lượng Selen

PHƯƠNG PHÁP F - AAS KỸ THUẬT HOÁ HƠI TRựC TlẾP

Trong đó M: hàm lượng Se trong một viên(|Lig/viên)

hay trong một gam sinh khối nấm men (ng/g)

C: nồng độ Selen trong dung dịch đo (|ig/ml)

c*: nồng độ Selen trong dung dịch đo (ng/ml)Cc: nồng độ dung dịch Selen chuẩn (|ag/ml)

m : khối lượng dầu thuốc trung bình trong viên (g)

mt: khối lượng mẫu phân tích (g)

L: độ pha loãng của mẫu thử

Ach: độ hấp thụ của dung dịch Selen chuẩn

Ath: độ hấp thụ của dung dịch Selen thử

Flt tra bảng với bậc tự do KA = nA- 1 và KB = nB - 1 ở mức tin cậy 95%

Ftn < Flt : sự khác nhau về độ chính xác của hai phương pháp là không có ý nghĩa thống kê

Ftn > Fl t : Hai phương pháp có độ chính xác khác nhau có ý nghĩa thống kê

• So sánh hai giá trị trung bình:

• Giá tri trung bình: x - ~-2*i x i

• So sánh độ chính xác của hai phương pháp:

B

(2.17)

Nếu ta.k > t0 05; k thì hai giá trị trung bình khác nhau có ý nghĩa thống kê với độ