XÂY DỰNG mô HÌNH gây GIẢM BẠCH cầu BẰNG PHỐI hợp OXALIPLATIN và 5 FLUOROURACIL

Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng cao. Theo kết quả nghiên cứu mới nhất của Tổ chức y tế thế giới (WHO), số người mắc bệnh ung thư trên thế giới sẽ tăng dần, đến năm 2030 là khoảng hơn 20 triệu (con số này là 12,7 triệu người vào năm 2008) với 90% ca bệnh tập trung ở các nước nghèo. Trước đây, ung thư được xem như bệnh nan y nhưng ngày nay với sự kết hợp tốt của nhiều phương pháp phẫu thuật ngoại khoa, xạ trị và đặc biệt là hóa trị đã góp phần rất lớn trong điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân. Các thuốc hóa trị như 5fluorouracil (5FU), oxaliplatin thường được dùng điều trị ung thư đường tiêu hóa, ung thư vú… Phối hợp 5FUleucovorinoxaliplatin (FOLFOX) được xem như phác đồ đầu tay trong điều trị ung thư trực tràng với tỷ lệ đáp ứng lên đến 5167%, 10 gia tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân, đặc biệt ở những bệnh nhân đã đề kháng. Tuy nhiên, mặt hạn chế của phác đồ FOLFOX nói riêng và hóa trị nói chung là gây độc tính trên nhiều cơ quan như hệ tạo máu, niêm mạc tiêu hóa, tóc. Đặc biệt, độc tính trên tủy xương, gây suy giảm bạch cầu. Bên cạnh đó, nhiều thuốc khác cũng gây suy giảm bạch cầu như ribavirin, lamivudin trong điều trị viêm gan siêu vi B, C. Bạch cầu có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các tác nhân bên ngoài như vi khuẩn, virus, nấm… Giảm số lượng bạch cầu sẽ làm người bệnh có nguy cơ cao bị mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, đây là nguyên nhân cao gây tử vong cho người bệnh. Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu chỉ có thể khắc phục bằng cách giảm liều, trì hoãn hoặc ngưng điều trị. Nhưng hiện nay, khó khăn này đã được khắc phục bằng việc sử dụng các yếu tố kích thích tạo bạch cầu như: GCSF (FilgrastimPegfilgrastim, Lenograstim); GMCSF (Molgramostim, Sargramostim); SCF (Ancestim). Bên cạnh đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu như tam thất, phụ tử, linh chi, trinh nữ hoàng cung…v,v, cũng đang được nghiên cứu như là những chất hỗ trợ điều trị, giúp hạn chế tác dụng phụ trên hệ tạo máu của các thuốc hóa trị. Vì vậy việc xây dựng các mô hình dược lý phù hợp để phục vụ cho các nghiên cứu này là rất cần thiết. Với mục đích trên, chúng tôi đặt mục tiêu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt bằng phối hợp của oxaliplatin, 5fluorouracil, leucovorin với các mục đích cụ thể như sau: Khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của phối hợp oxaliplatin, 5 fluorouracil, leucovorin. Xây dựng mô hình để nghiên cứu sàng lọc thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHÂU NGỌC QUỲNH ANH

XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY GIẢM BẠCH CẦU BẰNG

PHỐI HỢP OXALIPLATIN VÀ 5-FLUOROURACIL

TRÊN CHUỘT NHẮT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Tp Hồ Chí Minh - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHÂU NGỌC QUỲNH ANH

XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY GIẢM BẠCH CẦU BẰNG PHỐI HỢP

OXALIPLATIN VÀ 5-FLUOROURACIL TRÊN CHUỘT NHẮT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS TRẦN MẠNH HÙNG

DS LÊ PHAN XUÂN QUYÊN

Tp Hồ Chí Minh - 2012

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 CÁC DÒNG BẠCH CẦU 3

2.1.1.Bạch cầu hạt 4

2.1.2.Bạch cầu dòng lympho 6

2.1.3.Bạch cầu đơn nhân 6

2.2 SUY GIẢM BẠCH CẦU DO THUỐC 7

2.2.1.Các thuốc hóa trị ung thư 7

2.2.2.Các thuốc kháng giáp tổng hợp 11

2.2.3.Các loại thuốc khác 11

2.3 YẾU TỐ KÍCH THÍCH TẠO BẠCH CẦU 12

2.3.1.Quá trình sản sinh bạch cầu 12

2.3.2.Kích thích sự tạo bạch cầu sau hóa trị liệu 14

2.3.3.Filgrastim 15

CHƯƠNG 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

3.2 HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM 17

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.3.1 Phương pháp đếm tổng lượng bạch cầu trên buồng đếm Neubauer 18

3.3.2 Xây dựng mô hình và xác định các chỉ số huyết học của mô hình trên máy xét nghiệm huyết học 21

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

4.1 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GÂY SUY GIẢM BẠCH CẦU CỦA OXALIPLATIN, 5-FLUOROURACIL TRÊN BUỒNG ĐẾM NEUBAUER 23

4.1.1.Khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của oxaliplatin, 5-fluorouracil 23

4.1.2.Lựa chọn mô hình thích hợp cho nghiên cứu sàng lọc thuốc 37

4.2 ĐÁNH GIÁ MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM BẠCH CẦU CỦA OXALIPLATIN, 5-FLUOROURACIL, LEUCOVORIN VÀ ĐÁP ỨNG CỦA FILGRASTIM 38

4.2.1.Đánh giá trên thể trọng chuột 38

4.2.2.Đánh giá trên bạch cầu của chuột thí nghiệm 40

4.2.3.Đánh giá trên tiểu cầu, hồng cầu và các chỉ số liên quan 43

4.3 BÀN LUẬN 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 48

5.1 KẾT LUẬN 48

5.1 ĐỀ NGHỊ 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các giá trị bình thường của bạch cầu ở người .3

Bảng 2.2 Công thức bạch cầu ở chuột nhắt 4

Bảng 2.3 Nguồn gốc và tế bào mục tiêu của các yếu tố kích thích tạo máu 13

Bảng 4.1 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 23

Bảng 4.2 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 25

Bảng 4.3 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 27

Bảng 4.4 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 29

Bảng 4.5 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 31

Bảng 4.6 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 33

Bảng 4.7 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3 trước và sau khi tiêm thuốc 35

Bảng 4.8 Thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm 38

Bảng 4.9 Bảng theo dõi số lượng các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm 40

Bảng 4.10 Số lượng hồng cầu, tiểu cầu và Hemoglobin 44

Bảng 4.11 Các thông số liên quan khác 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bạch cầu trung tính 5

Hình 2.2 Bạch cầu ưa kiềm 5

Hình 2.3 Bạch cầu ái toan 6

Hình 2.4 Bạch cầu lympho 6

Hình 2.5 Bạch cầu đơn nhân 7

Hình 2.6 Sơ đồ biệt hóa các dòng tế bào từ tế bào gốc 13

Hình 2.7 a) Buồng đếm Neubauer 18

b) Buồng đếm Neubauer khi soi dưới kính hiển vi (vùng đếm là A, B, C, D) 18

Hình 2.8 Buồng đếm nhìn thẳng và nghiêng ……… 18

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Tác động của phối hợp oxaliplatin 10 mg/kg, 5-FU 150 mg/kg, trên thể

trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 24

Biểu đồ 4.2 Tác động của phối hợp oxaliplatin 10 mg/kg, 5-FU 100 mg/kg, trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 26

Biểu đồ 4.3 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5 mg/kg, 5-FU 150 mg/kg, trên thể

trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 28

Biểu đồ 4.4 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5mg/kg, 5-FU 75 mg/kg, trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 30

Biểu đồ 4.5 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5 mg/kg, 5-FU 50 mg/kg trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 32

Biểu đồ 4.6 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5mg/kg, 5-FU/ LV 75 mg/kg trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 34

Biểu đồ 4.7 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5 mg/kg, 5-FU/LV 50 mg/kg trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm 36

Biểu đồ 4.8 Thể trọng chuột ở các lô thử nghiệm 39

Biểu đồ 4.9 Tổng lượng bạch cầu ở các lô thử nghiệm 41

Biểu đồ 4.10 Số lượng bạch cầu trung tính ở các lô thử nghiệm 42

Biểu đồ 4.11 Số lượng bạch cầu lympho ở các lô thử nghiệm 42

Biểu đồ 4.12 Số lượng bạch cầu đơn nhân ở các lô thực nghiệm 43

Biểu đồ 4.13 Số lượng hồng cầu và các chỉ số liên quan ở các lô thực nghiệm 45

Biểu đồ 4.14 Số lượng tiểu cầu ở các lô thực nghiệm 46

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến thầy PGS.TS Trần Mạnh Hùng và

DS Lê Phan Xuân Quyên đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm để em có thể hoàn thành tốt khóa luận

Em cũng xin trân trọng cảm ơn cô TS Huỳnh Ngọc Trinh và quý thầy, cô trong hội đồng đã dành thời gian nhận xét, đóng góp để khóa luận được hoàn chỉnh

Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị trong Khoa xét nghiệm Huyết học bệnh viện

175 TP HCM cũng như các cô và các chị làm việc tại Bộ môn Dược lý đã luôn sẵn lòng giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Và sau cùng em xin cảm ơn gia đình, thầy cô và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong thời gian qua

XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY GIẢM BẠCH CẦU BẰNG PHỐI HỢP OXALIPLATIN VÀ 5-FLUOROURACIL TRÊN CHUỘT NHẮT

Châu Ngọc Quỳnh Anh Thầy hướng dẫn: PGS.TS Trần Mạnh Hùng

DS Lê Phan Xuân Quyên

Đặt vấn đề

Các thuốc hóa trị liệu ung thư gây tác dụng phụ lên nhiều hệ cơ quan, trong đó suy tủy và suy giảm bạch cầu là một trong những nguyên nhân chính buộc phải giảm liều, đổi thuốc, ngưng thuốc gây giảm hiệu quả điều trị Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng phối hợp oxaliplatin, 5-fluorouracil, leucovorin để sàng lọc các thuốc có khả năng phòng ngừa suy giảm bạch cầu

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng chủng Swiss albino 6-8 tuần tuổi,

phái đực

Phương pháp: thử nghiệm được tiến hành trên hai phương pháp: đếm tổng lượng bạch cầu

trên buồng đếm Neubauer và xác định các chỉ số huyết học của mô hình trên máy xét nghiệm huyết học

Kết quả

Oxaliplatin 5 mg/kg, ip (ngày 0) + 5-fluorouracil/leucovorin 50 mg/kg, ip (ngày 0, 1) gây giảm số

lượng các loại bạch cầu và mức giảm bạch cầu mạnh nhất vào ngày thứ 5 Sự suy giảm bạch cầu này đạt ý nghĩa bệnh lý về suy giảm bạch cầu do thuốc hóa trị

Kết luận:

Oxaliplatin 5 mg/kg, ip (ngày 0) + 5-fluorouracil/leucovorin 50 mg/kg, ip (ngày 0, 1) phù hợp để mô phỏng mô hình sàng lọc các thuốc phòng ngừa suy tủy vào ngày 5

Graduation thesis for obtaining the degree of BS Pharm - Academic year: 2011-2012

Mouse model of neutropenia induced by oxaliplatin and 5-fluorouracil

Chau Ngoc Quynh Anh

Supervisor: Assoc Prof Dr Tran Manh Hung

Pharm Le Phan Xuan Quyen

Introduction

Chemotherapeutic agents cause many adverse effects, of those neutropenia is one of the most serious side effects that may delay or postpone chemotherapy In this study, we mimicked a mouse model of neutropenia for screening candidates which could protect bone marrow suppression induced by chemotherapeutic agents

Materials and Methods

Materials: Swiss albino male mice 6-8 weeks old were used in this experiment

Methods: two methods were used: counting white blood celll on Neubauer hemocytometer and

determining hematological indices by hematology analyzer

Results

Oxaliplatin, 5 mg/kg, ip (day 0) + 5-fluorouracil/leucovorin 50 mg/kg (day 0, 1) induced marked decrease in white blood cell count on day 5 after the first dose This neutropenia was pathologically significant in term of neutropenia induced by chemotherapy

Conclusions

Oxaliplatin, 5 mg/kg, ip (day 0) + 5-fluorouracil/leucovorin 50 mg/kg (day 0, 1) could be used to mimick a mouse model of neutropenia

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng cao Theo kết quả nghiên cứu mới nhất của Tổ chức y tế thế giới (WHO), số người mắc bệnh ung thư trên thế giới sẽ tăng dần, đến năm 2030 là khoảng hơn 20 triệu (con số này là 12,7 triệu người vào năm 2008) với 90% ca bệnh tập trung ở các nước nghèo

Trước đây, ung thư được xem như bệnh nan y nhưng ngày nay với sự kết hợp tốt của nhiều phương pháp phẫu thuật ngoại khoa, xạ trị và đặc biệt là hóa trị đã góp phần rất lớn trong điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân Các thuốc hóa trị như 5-fluorouracil (5-FU), oxaliplatin thường được dùng điều trị ung thư đường tiêu hóa, ung thư vú… Phối hợp 5-FU/leucovorin/oxaliplatin (FOLFOX) được xem như phác đồ đầu tay trong điều trị ung thư trực tràng với tỷ lệ đáp ứng lên đến 51-67%, [10] gia tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân, đặc biệt ở những bệnh nhân

đã đề kháng Tuy nhiên, mặt hạn chế của phác đồ FOLFOX nói riêng và hóa trị nói chung là gây độc tính trên nhiều cơ quan như hệ tạo máu, niêm mạc tiêu hóa, tóc Đặc biệt, độc tính trên tủy xương, gây suy giảm bạch cầu Bên cạnh đó, nhiều thuốc khác cũng gây suy giảm bạch cầu như ribavirin, lamivudin trong điều trị viêm gan siêu vi B, C

Bạch cầu có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các tác nhân bên ngoài như vi khuẩn, virus, nấm… Giảm số lượng bạch cầu sẽ làm người bệnh có nguy cơ cao bị mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, đây là nguyên nhân cao gây tử vong cho người bệnh

Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu chỉ có thể khắc phục bằng cách giảm liều, trì hoãn hoặc ngưng điều trị Nhưng hiện nay, khó khăn này đã được khắc phục bằng

việc sử dụng các yếu tố kích thích tạo bạch cầu như: G-CSF

(Filgrastim/Pegfilgrastim, Lenograstim); GM-CSF (Molgramostim, Sargramostim);

SCF (Ancestim) Bên cạnh đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu như tam

thất, phụ tử, linh chi, trinh nữ hoàng cung…v,v, cũng đang được nghiên cứu như là những chất hỗ trợ điều trị, giúp hạn chế tác dụng phụ trên hệ tạo máu của các thuốc

hóa trị Vì vậy việc xây dựng các mô hình dược lý phù hợp để phục vụ cho các nghiên cứu này là rất cần thiết

Với mục đích trên, chúng tôi đặt mục tiêu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt bằng phối hợp của oxaliplatin, 5-fluorouracil, leucovorin với các mục đích cụ thể như sau:

- Khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của phối hợp oxaliplatin, fluorouracil, leucovorin

5 Xây dựng mô hình để nghiên cứu sàng lọc thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Số lượng bạch cầu trong 1 lít máu ở người trưởng thành bình thường dao động từ 4x109 đến 11x109 Ở trẻ em và phụ nữ có thai, lượng bạch cầu có thể cao hơn Số lượng bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, đặc biệt tăng cao trong các bệnh bạch huyết cấp hoặc mạn tính và giảm trong trường hợp bị nhiễm độc, nhiễm xạ, suy tủy [1], [5]

Có nhiều cách phân loại bạch cầu, thông dụng nhất là chia thành ba nhóm : bạch cầu hạt (bạch cầu trung tính, ưa acid, và ưa kiềm), bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân

Bảng 2.1 Các giá trị bình thường của bạch cầu ở người [1], [5]

Các loại bạch cầu

Giá trị tuyệt đối (trong 1mm 3 )

Tỷ lệ phần trăm

Ở chuột, cũng tìm thấy những loại bạch cầu như ở người Tuy nhiên, tỷ lệ bạch cầu lympho ở chuột cao hơn tỷ lệ này ở người và bạch cầu ưa kiềm ít khi được tìm thấy trong máu chuột trưởng thành [12]

Số lượng bạch cầu rất khác nhau tùy thuộc vào gen, giới tính, môi trường và phương pháp lấy máu Ở chuột cái, bạch cầu hạt cao hơn chuột đực Việc lấy máu đuôi nhiều lần cũng có thể làm tăng bạch cầu từ 50-120% [12] Theo một nghiên cứu của các nhà khoa học, đại học Michigan, số lượng bạch cầu khi lấy máu ở đuôi chuột thường cao hơn khi lấy máu ở tim [18]

Bảng 2.2 Công thức bạch cầu ở chuột nhắt [15]

Tổng lượng

bạch cầu

(trong 1 mm3)

Bạch cầu lympho (%)

Bạch cầu trung tính (%)

Bạch cầu đơn nhân (%)

Bạch cầu

ưa acid (%)

Bạch cầu

ưa kiềm (%)

2.1.1 Bạch cầu hạt

Bạch cầu hạt trước đây được gọi là “bạch cầu đa nhân” do nhân tế bào thắt lại, chia thành nhiều thùy Bạch cầu hạt gồm ba loại, phân biệt nhờ tính bắt phẩm màu khác nhau của các tiểu hạt trong tế bào chất

2.1.1.1 Bạch cầu trung tính [1], [5]

Là những tế bào trưởng thành trong máu tuần hoàn, chức phận cơ bản của bạch cầu trung tính là vận động và thực bào các vật lạ bên ngoài đặc biệt là vi khuẩn, virus ngay sau khi chúng xâm nhập vào cơ thể Vì vậy, bạch cầu trung tính tăng trong các trường hợp nhiễm trùng cấp như viêm ruột thừa, viêm phổi… Số lượng bạch cầu trung tính cũng có thể tăng gấp 3-4 lần so với bình thường sau khi chơi thể thao, vận động nhiều, làm việc nặng Khoảng 60 phút sau, sự tăng bạch cầu sinh lý này sẽ trở lại bình thường

Bạch cầu trung tính giảm trong các trường hợp nhiễm độc kim loại nặng (Pb, As), suy tủy, nhiễm siêu vi, nội độc tố, do thuốc…

Hình 2.1 Bạch cầu trung tính

2.1.1.2 Bạch cầu ưa kiềm [1], [5]

Bạch cầu ưa kiềm không có khả năng vận động và thực bào, nhưng có vai trò quan trọng trong phản ứng quá mẫn do IgE - một globulin miễn dịch gây ra phản ứng dị ứng có khuynh hướng gắn trên màng tế bào bạch cầu ưa baz Khi màng bạch cầu vỡ

ra, histamin, bradykinin, serotonin được phóng thích vào máu gây ra các triệu chứng phù, ngứa, mẫn đỏ, đau… Ngoài ra, bạch cầu ưa baz còn phóng thích heparin vào máu để phòng ngừa đông máu lòng mạch

Hình 2.2 Bạch cầu ưa kiềm

2.1.1.3 Bạch cầu ưa acid [1], [5]

Bạch cầu ưa acid có vai trò chính là khử độc các protein lạ trước khi chúng xâm nhập vào cơ thể Do đó, thường tăng trong các phản ứng dị ứng, ký sinh trùng Ngoài ra, bạch cầu ưa acid giải phóng plasminogen, chất này hoạt hóa thành plasmin, làm tan cục máu đông Bạch cầu ưa acid có khả năng thực bào kém hơn bạch cầu trung tính, chủ yếu là thực bào và tiêu hóa các phức hợp kháng nguyên-

kháng thể, sau khi quá trình miễn dịch hoàn thành, vì vậy không giữ vai trò quan trọng chống lại sự nhiễm khuẩn

Hình 2.3 Bạch cầu ưa acid

Hình 2.4 Bạch cầu lympho

2.1.3 Bạch cầu đơn nhân [1], [5]

Bạch cầu đơn nhân là bạch cầu có kích thước lớn nhất trong các tế bào máu tuần hoàn Đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của đáp ứng miễn dịch Bạch cầu

đơn nhân trong máu cũng như các bản sao của chúng ở các mô có nhiệm vụ thực bào rồi đưa kháng nguyên của tác nhân gây bệnh tới trình diện cho tế bào T Bạch cầu đơn nhân trưởng thành có thể biệt hóa thành đại thực bào tại các mô khác nhau của cơ thể

Hình 2.5 Bạch cầu đơn nhân

2.2 SUY GIẢM BẠCH CẦU DO THUỐC

2.2.1 Các thuốc hóa trị ung thư [13]

Hóa trị liệu là một trong những nguyên nhân gây suy tủy tạm thời, biểu hiện thường gặp là giảm bạch cầu trung tính Tác động của hóa trị trên tủy xương và tỷ lệ phục hồi, lệ thuộc vào cơ chế dược lý của thuốc hóa trị sử dụng và tốc độ phục hồi của dòng tế bào gốc Về mặt lý thuyết, tất cả thuốc gây độc tế bào có thể tác động lên tế bào gốc đa năng và những tế bào tiền thân khác, những tế bào biệt hóa và cả những

tế bào trong vi mô trường của tủy xương bao gồm tế bào nội mô, mô liên kết, tế bào thân… Khoang dự trữ của tủy xương có nhiệm vụ cung cấp các tế bào máu trưởng thành vào máu ngoại biên trong khoảng 8-10 ngày sau khi phân chia và trưởng thành từ tế bào gốc Hóa trị ức chế các tế bào gốc sản sinh bạch cầu nhưng không làm giảm chức năng hay rút ngắn đời sống của các bạch cầu hạt, thậm chí khi tủy xương đã thâm nhiễm tế bào ung thư

2.2.1.1 5-Fluorouracil (5-FU)

5-Fluorouracil là chất kháng chuyển hóa loại pyrimidin, vào cơ thể được biến thành chất chuyển hóa có hoạt tính là 5-Fd UMP (5-fluoro-2’-deoxyuridin-5’-monophosphat) Tác động kháng u được giải thích qua hai cơ chế:

- Ức chế tổng hợp ADN do ức chế enzym TS (thymidilat synthetase) là enzym xúc tác phản ứng methyl hóa uridilat thành thymidilat

- Ức chế thành lập ARN: thông qua fluorouridin triphosphat (FUTP) Chất này sáp nhập vào ARN làm thay đổi nhiều tính chất của ARN nên gây độc tế bào

Cơ chế chính làm chết tế bào là ức chế TS bằng cách thành lập phức hợp FdUMP-folat là một hợp chất phân ly chậm Khi thiếu folat sẽ ngăn thành lập phức trên, do đó chất bổ sung folat như leucovorin (calcium folinat) có tác dụng làm tăng tác dụng độc tế bào của FU [3], [11]

TS-Sau khi tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải trung bình khỏi huyết tương khoảng 16 phút (từ 8 đến 20 phút và phụ thuộc vào liều dùng) Không còn thấy thuốc ở dạng nguyên vẹn trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch được 3 giờ [2]

5-Fluorouracil có hiệu quả làm thuyên giảm các bệnh ung thư tế bào biểu mô đại tràng, trực tràng, vú và dạ dày Thuốc có chỉ số điều trị rất thấp, độc tính cao với máu, gây xuất huyết tiêu hóa, thậm chí tử vong Đặc biệt là độc tính gây suy tủy nặng

Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng 5-FU để xây dựng mô hình suy giảm bạch cầu

Trong nghiên cứu của Kimball và cộng sự [17] đã sử dụng liều duy nhất 5-FU 150

mg/kg, tiêm tĩnh mạch trên chuột nhắt trắng chủng B6C3F1, kết quả cho thấy bạch

cầu trung tính giảm thấp nhất vào vào ngày 7 sau khi tiêm 5-FU (<100/mm3

)

Bit Mansour và cộng sự đã sử dụng 5-FU liều 150 mg/kg truyền tĩnh mạch 30 giờ

vào chuột nhắt Bạch cầu giảm thấp nhất vào ngày 8 sau tiêm và hồi phục ở ngày

13 Trong thí nghiệm này, CMP/GMP (common myeloid/granulocyte-monocyte progenitors) được tiêm 1 ngày sau khi tiêm 5-FU, kết quả có sự gia tăng đáng kể bạch cầu trung tính so với nhóm chỉ được tiêm 5-FU [16]

Trong một thí nghiệm khác, Gad El-Hak và cộng sự gây suy giảm bạch cầu bằng

5-FU 160 mg/kg tiêm phúc mạc liều duy nhất để gây mô hình suy giảm bạch cầu trên

chuột nhắt Trong thí nghiệm này, các yếu tố kích thích tăng sinh bạch cầu như CSF 250 µg/kg, L-glutathion (GSH) 800 mg/kg được tiêm phúc mạc 7 ngày trước khi tiêm 5-FU (ngày 8), và lấy máu ở ngày 9 Kết quả cho thấy khi dùng đơn lẻ G-CSF (Filgrastim) 250 µg/kg hoặc GSH 800 mg/kg có tác dụng cải thiện bạch cầu so với nhóm chỉ tiêm 5-FU 160 mg/kg, tuy nhiên sự phối hợp cùng lúc cả 2 yếu tố này lại làm giảm tác dụng của nhau [8]

G-Trần Mạnh Hùng và cộng sự cũng đã xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu

bằng 5-FU liều 150 mg/kg tiêm phúc mạc liều duy nhất, trong thí nghiệm này, bạch

cầu giảm thấp nhất vào ngày 7 và hồi phục sau 14 ngày [4]

2.2.1.2 Oxaliplatin

Là một thuốc chống tân sinh thuộc nhóm các hợp chất platin mới, trong đó platin nguyên tử tạo phức hợp với 1,2-diaminocyclohexane ("DACH") và nhóm oxalat

Cơ chế tương tự cisplatin, khi hợp chất platin vào tế bào và được kích hoạt bởi Cl

-sẽ tạo thành 1,2-diaminocyclohexan platin (1,2-DACH platin) Chất này tiếp tục chuyển hóa thành 1,2-DACH monoclorplatin và 1,2-DACH platin dichlorid gắn vào

vị trí N-7 trên purin, ức chế sự sao chép tế bào Oxaliplatin cũng gây giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu, thiếu máu, độc thần kinh [11]

Oxaliplatin có hiệu quả tốt trên những bệnh ung thư trực tràng, đại tràng, sử dụng đơn lẻ cho hiệu quả điều trị 10-24%

Trên mô hình dược lý thực nghiệm, Shi-Rong Cai và cộng sự, tiêm phúc mạc

oxaliplatin liều 10 mg/kg vào chuột nhắt cái, kết quả cho thấy oxaliplatin gây giảm

bạch cầu trung tính 35% so với bình thường, bạch cầu giảm thấp nhất vào ngày 6 và bình thường trở lại vào ngày 11 [7]

2.2.1.3 Phối hợp của oxaliplatin và 5-fluorouracil [9], [10]

Phối hợp FOLOX đã trở thành một trong những phối hợp đầu tay trong điều trị ung thư kết-trực tràng với tỷ lệ đáp ứng lên đến 51–67%, gia tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân, đặc biệt cho kết quả tốt trên những bệnh nhân ung thư kết-trực tràng di căn kháng trị trước đây

Trên lâm sàng, phác đồ FOLFOX4 thường được dùng hóa trị ở giai đoạn 3 Oxaliplatin (85 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ ngày 1, leucovorin (200 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ ngày 1 và 2 Sau đó 5-fluorouracil (400 mg/m2) tiêm bolus tĩnh mạch rồi 5-fluorouracil (600 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong

22 giờ ngày 1 và 2 Liều trên lặp lại mỗi 2 tuần [9]

Phác đồ FOLFOX6 thường được dùng hóa trị ở những bệnh nhân đã chuyển sang giai đoạn 4, oxaliplatin (85-100 mg/m2), truyền tĩnh mạch trong 2 giờ ngày 1, leucovorin (400 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ ngày 1 và 2 Sau đó 5-fluorouracil (400 mg/m2) tiêm bolus tĩnh mạch, tiếp theo là 5-fluorouracil (2400-

3000 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 46 giờ ngày 1 và 2 Liều trên lặp lại mỗi 2 tuần [9]

Một nghiên cứu ngẫu nhiên, đa trung tâm cho thấy phối hợp 5-FU và leucovorin gây ra những độc tính nghiêm trọng: tiêu chảy, viêm cơ, giảm bạch cầu xảy ra ở 15-20% bệnh nhân Tuy khả năng dung nạp khá tốt nhưng tỷ lệ đáp ứng chưa cao 14-33% (chỉ dùng 5-FU tỷ lệ này là 10-15%) Phối hợp oxaliplatin và 5-FU/LV nâng cao tỷ lệ đáp ứng (51-67%) Tuy nhiên gây tiêu chảy nặng ở 43% bệnh nhân, độc tính này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng loperamid Ngoài ra còn gây buồn nôn, nôn mữa Phối hợp cũng gây độc tính nghiêm trọng trên hệ tạo máu, trên thần kinh cảm giác ngoại biên, tăng enzym gan Đây là nguyên nhân phải giảm liều, trì hoãn hoặc ngưng điều trị Do đó việc cải thiện tác dụng phụ, đặc biệt là cải thiện bạch cầu trung tính là rất quan trọng [10]

Hiện chưa tìm thấy mô hình suy giảm bạch cầu bằng phối hợp 2 thuốc oxaliplatin

và 5-fluorouracil/leucovorin

2.2.2 Các thuốc kháng giáp tổng hợp [1]

Các thuốc kháng giáp tổng hợp như methimazol, carbimazol hoặc propylthiouracil được dùng rất phổ biến trong điều trị các bệnh lý có cường giáp như basedow, nhân tuyến giáp Mặc dù có hiệu quả cao trong điều trị nhưng các thuốc này có thể gây khá nhiều phản ứng phụ ở các mức độ khác nhau Một trong những phản ứng phụ gây nguy hiểm cho người bệnh là giảm bạch cầu hạt

Mất bạch cầu hạt của thuốc kháng giáp tổng hợp là một phản ứng miễn dịch, gây ra

do sự thành lập các kháng thể đặc hiệu với thuốc, hoặc với các chất chuyển hóa của chúng Do đó có sự phản ứng chéo giữa các loại thuốc kháng giáp với nhau

2.2.3 Các loại thuốc khác [1]

Các Penicillin: được chiết xuất từ nấm Penicillinum notatum hoặc Penicillinum

chrysogenum Do có chung cấu trúc là beta-lactam, nên các kháng sinh thuộc nhóm

này đều có tác dụng phụ là có thể gây giảm bạch cầu

Ngoài ra, các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin (phân lập từ nấm

Cephalosporium) như: cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cephaloridin, cephalothin,

cephradin, cefazolin, cefotaxim, cefamandol cũng có thể gây giảm bạch cầu

Kháng sinh nhóm Phenicol: các kháng sinh nhóm này thường gây suy giảm bạch

cầu không hồi phục, có thể phụ thuộc hoặc không phụ thuộc liều, có tần xuất khoảng 1/10.000 ca điều trị và thường là tử vong

Kháng sinh nhóm Cyclin: như tetracyclin, oxycyclin, doxycyclin cũng có thể làm

giảm bạch cầu, tuy nhiên ít gặp và cũng ít gây nguy hiểm

Kháng sinh nhóm Sulfamid: có thể gây ức chế tủy, kết hợp trimethoprim và

sulfamethoxazol có nguy cơ cao làm giảm bạch cầu, bạch cầu trung tính nhất là trên tủy nhạy cảm (ghép tủy)

Phenothiazin: thường làm giảm bạch cầu sau 2–8 tuần điều trị, hoặc khi tổng liều

vượt quá 5 gam Có thể thay đổi theo cá nhân và tùy theo khả năng bù trừ sự ức chế của phenothiazin lên tổng lượng ADN

Vàng: các thuốc có dẫn xuất từ vàng làm giảm bạch cầu hạt do ức chế tủy hay do

miễn dịch

Thuốc loạn nhịp tim: quinidin và procainamid cũng làm giảm bạch cầu trong vòng

12 tuần sau khi sử dụng

2.3 YẾU TỐ KÍCH THÍCH TẠO BẠCH CẦU

2.3.1 Quá trình sản sinh bạch cầu [6], [13]

Các tế bào bạch cầu cũng như hồng cầu đều xuất phát từ một nguồn là tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell) Khởi đầu trong bào thai, các tế bào này có mặt ở túi noãn hoàng nguyên thủy, rồi ở gan và cuối cùng là ở tủy xương cho đến suốt đời Các tế bào gốc ban đầu được gọi là các tế bào vạn năng vì chúng có thể phát triển và biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau Từ tế bào gốc vạn năng, qua biệt hóa sẽ cho ra hai dòng tế bào chính: tế bào dòng lympho và tế bào dòng tủy Sơ đồ

về quá trình biệt hóa có thể tóm tắt như hình 2.6

Các tế bào dòng tủy khởi đầu là những tế bào tiền thân chung cho cả dòng hồng cầu

và tế bào tủy sau đó mới tách ra Các tế bào tiền thân của dòng tủy tiếp tục biệt hóa

để trở thành một bên là dòng tế bào tiền thân của bạch cầu trung tính và các tế bào đơn nhân, một bên khác sẽ biệt hóa để cho tiểu cầu nguyên thủy và các bạch cầu ưa acid, ưa kiềm và tế bào mast

Quá trình biệt hóa của các tế bào dòng tủy chịu ảnh hưởng của nhiều cytokin được

mô tả trong bảng 2.3 và hình 2.6

Bảng 2.3 Nguồn gốc và tế bào mục tiêu của các yếu tố kích thích tạo máu [13]

bạch cầu đơn nhân

GFU-G, bạch cầu hạt

bạch cầu đơn nhân, lympho T

CFU-blast, CFU-GEMM, CFU-GM, BFU-E, bạch cầu hạt, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa kiềm

CFU-GM,CFU-E,

BFU-E, bạch cầu hạt, bạch cầu

ưa acid, bạch cầu ưa kiềm

bạch cầu đơn nhân

CFU-M, bạch cầu đơn nhân

M-CSF = macrophage colony-stimulating factor (yếu tố k ích thích dòng đại thực bào)

G-CSF = Granulocyte colony-stimulating factor (yếu tố k ích thích dòng bạch cầu hạt)

GM-CSF = Granulocyte – macrophage colony-stimulating factor (yếu tố k ích thích cả dòng bạch cầu hạt

và đại thực bào)

Hình 2.6 Sơ đồ biệt hóa các dòng tế bào từ tế bào gốc

2.3.2 Kích thích sự tạo bạch cầu sau hóa trị liệu [13]

Suy tủy thật sự là một trở ngại lớn trong việc duy trì liều hóa trị Do bạch cầu bị suy giảm dẫn đến những biến chứng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm… gia tăng tỷ lệ tử vong Bệnh nhân buộc phải đến bệnh viện điều trị hoặc dùng kháng sinh Những nỗ lực nghiên cứu trong thập kỉ vừa qua đã đem lại những tiến bộ vượt bậc trong việc hỗ trợ tình trạng suy tủy bệnh nhân sau hóa trị

Việc sử dụng các yếu tố kích thích sự tạo bạch cầu như G-CSF và GM-CSF đã cải thiện được tỷ lệ suy giảm bạch cầu sau hóa trị liệu và ghép tủy

G-CSF

Những nghiên cứu tiền lâm sàng của G-CSF, một yếu tố kích thích đơn dòng giúp cải thiện sự sản xuất và hoàn thiện chức năng của bạch cầu trung tính, chứng minh rằng sự kích thích này phụ thuộc vào liều và thời gian giảm bạch cầu sau hóa trị, suy tủy nặng hoặc xạ trị Những thử nghiệm pha I/II ở người cho thấy việc tiêm truyền hoặc tiêm dưới da G-CSF làm tăng bạch cầu hạt một cách tương đối và phục hồi tình trạng giảm bạch cầu sau hóa trị Độc tính đáng chú ý của G-CSF là đau xương, đau lưng và xương chậu

Trong một thử nghiệm mù đôi, ngẫu nhiên, đa trung tâm của Mỹ, bệnh nhân điều trị với cyclophosphamid, doxorubicin và etoposid nhận G-CSF hoặc giả dược và một thử nghiệm khác tương tự ở Châu Âu Cả hai thử nghiệm, tuy khác nhau về cách thiết kế nghiên cứu nhưng đều cho những kết luận tương tự Thời gian giảm bạch cầu trung tính là 6 ngày ở nhóm dùng giả dược và giảm còn 3 ngày ở nhóm được tiêm G-CSF Quan trọng hơn những biến chứng nhiễm khuẩn cần chăm sóc ở bệnh viện được giảm tới 50% ở những bệnh nhân dùng G-CSF Do đó, G-CSF được Mỹ chấp nhận sử dụng ở những bệnh nhân bị suy tủy do hóa trị

GM-CSF

GM-CSF kích thích những tế bào tiền thân dòng bạch cầu hạt và dòng mono, đồng thời hoàn thiện chức năng của các tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa acid, ưa

kiềm trưởng thành và đại thực bào GM-CSF ở người cũng được sản xuất ở động vật có vú, nấm men và một số loại vi khuẩn Sargramostim là GM-CSF chiết xuất từ nấm men

Trong khi filgrastim và sargramostim giống nhau ở chỗ chúng đều làm phát triển bạch cầu trung tính, thì sargramostim cũng kích thích sự trưởng thành của đại thực bào, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa kiềm và hồng cầu Tác dụng rộng hơn của sargramostim tạo điều kiện cho các dòng tế bào khác hợp sức với bạch cầu trung tính chống lại vi khuẩn và các tác nhân xâm nhập khác Một hiện tượng lâm sàng quan trọng khác là sargramostim kích thích đại thực bào dẫn đến sản sinh interleukin-1 hay yếu tố hoại tử u Các chất này là yếu tố gây sốt nội sinh vì thế bệnh nhân có thể bị sốt khi được điều trị bằng sargramostim Filgrastim không gây sốt do thuốc như sargramostim

2.3.3 Filgrastim [2], [14]

Filgrastim là một yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt của người, được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN và có hoạt tính giống hệt yếu tố nội sinh kích thích dòng bạch cầu hạt ở người G-CSF Filgrastim là một protein không gắn đường, có

độ tinh khiết cao, chứa 175 acid amin

Filgrastim được sản xuất trong phòng thí nghiệm từ chủng vi khuẩn Escherichia coli mà hệ gen của chúng đã được biến đổi do gắn thêm vào một gen sản xuất ra

yếu tố kích thích tạo bạch cầu hạt Thuốc điều hoà việc sản xuất và huy động các tế bào hạt trung tính từ tuỷ xương Thuốc kích thích sự hoạt hoá, tăng sinh và biệt hoá các tế bào tiền thân bạch cầu trung tính Trong một số trường hợp giảm bạch cầu trung tính mạn tính, điều trị cũng làm tăng sản xuất bạch cầu hạt ưa acid và ưa kiềm Tăng bạch cầu hạt trung tính phụ thuộc trực tiếp vào liều

Khi ngừng điều trị, bạch cầu trung tính lưu hành giảm 50% trong vòng 1-2 ngày và trở lại mức bình thường trong vòng 1-7 ngày

Liều filgrastim đầu tiên phải được tiêm cách ít nhất 24 giờ sau khi kết thúc hóa trị

Filgrastim, được cấp phép nǎm 1991, ban đầu được chỉ định để ngǎn ngừa các biến chứng nhiễm khuẩn sau dùng hóa trị liệu chuẩn Nǎm 1994, filgrastim được cấp phép sử dụng sau ghép tủy xương để thúc đẩy sự phục hồi số lượng bạch cầu trung tính Filgrastim chủ yếu dùng để ngǎn ngừa giảm bạch cầu trung tính nặng, tuy nhiên, cũng có thể dùng chất này để điều trị giảm bạch cầu trung tính sau khi đã phát bệnh Điều trị filgrastim được áp dụng cho bệnh nhân giảm bạch cầu trung tính khi bắt đầu có sốt

Theo một nghiên cứu của Kuderer cùng các đồng nghiệp thuộc Đại Học Y Khoa Duke trên 3000 bệnh nhân ung thư đang được hóa trị, kết quả cho thấy bệnh nhân ung thư được truyền bạch cầu trễ thường có biểu hiện triệu chứng sốt do giảm bạch cầu và có nguy cơ tử vong là 44% Trong khi nhóm bệnh nhân ung thư vừa được hóa trị, vừa được chỉ định dùng filgrastim, giảm nguy cơ tử vong xuống thấp hơn (22%) Filgrastim có tác dụng phục hồi lượng bạch cầu trong máu Vì thế, nhiều tác giả khuyến cáo nên dùng filgrastim trước hay ngay sau khi hóa trị cho bệnh nhân vì

sẽ giảm nguy cơ tử vong cho bệnh nhân hơn là để quá trễ

CHƯƠNG 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là chuột nhắt trắng, giống đực, chủng Swiss albino, 6- 8 tuần tuổi, do viện Vắc-xin và Sinh phẩm Nha Trang cung cấp, có trọng lượng trung bình 28-35 g Chuột thử nghiệm là chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường Hằng ngày, chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống Sau khi nhập về, chuột được nuôi trong môi trường thực nghiệm từ 3-5 ngày để chúng thích nghi với môi trường Chuột được phân bố ngẫu nhiên thành nhiều lô khác nhau, mỗi lô từ 8-

15 con

3.2 HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM

 5-Fluorouracil “Ebewe” 250mg, do công ty Ebewe Pharma Ges.m.b.H – Austria sản xuất Số lô 12754204, hạn sử dụng 4-2013, dạng bào chế: dung dịch tiêm

 Neupogen (filgrastim) 30MU sc/iv infusion, sản xuất tại Thụy Sĩ bởi F.Hoffmann-La Roche Ltd., số lô B2036B03, hạn sử dụng 30-8-2013, dạng bào chế: dung dịch tiêm

 DBL Oxaliplatin (oxaliplatin), do công ty Hospira Australia Pty Ltd sản xuất,

số lô X025350AB, hạn sử dụng 06-2013, dạng bào chế: bột pha tiêm

 Calcium folinat “ Ebewe” 50mg, do công ty Ebewe Pharma Ges.m.b.H – Austria sản xuất, số lô 96549006 hạn sử dụng 10-2013, dạng bào chế: dung dịch tiêm

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp đếm tổng lượng bạch cầu trên buồng đếm Neubauer

3.3.1.2 Phương pháp tiến hành

Lấy máu: lau sạch đuôi chuột bằng bông thấm nước, tránh chà xát mạnh, cắt cách

đầu đuôi một đoạn 0,5 cm, hơi xéo Cố gắng để máu chảy tự nhiên, bỏ giọt máu đầu, lấy từ giọt máu thứ 2 Đặt ống hút bạch cầu nghiêng 30o

hoặc 45o so với giọt máu Hút máu tới vạch 0,5, lưu ý là cột máu liên tục, không lẫn bọt khí, dùng bông tẩm cồn lau nhẹ đầu ống Những lần lấy máu sau, cắt sát vết thương cũ

Pha loãng: cho ống hút vào dung dịch Lazarus, hút tiếp đến vạch 11, để có độ pha

loãng là 20 lần

Lưu ý: thao tác phải nhanh để tránh đông máu

Trộn máu: dùng hai ngón tay bịt kín 2 đầu ống hút, lắc tối thiểu 1 phút

Chuẩn bị buồng đếm: rửa sạch buồng đếm, sấy khô Đặt lamelle lên hai khu vực có

kẻ ô đếm Nhỏ bỏ khoảng 3-4 giọt đầu, sau đó nhỏ giọt tiếp theo lên buồng đếm, ngay mép lamelle, dung dịch sẽ mao dẫn lan khắp ô đếm Đặt buồng đếm lên mặt phẳng nằm ngang, để yên trong thời gian 2 phút để bạch cầu phân tán đều

Đếm bạch cầu: đếm số lượng bạch cầu ở vật kính x10 (là những tế bào nhuộm xanh,

thấy rõ viền và nhân) ở tất cả 16 ô vuông nhỏ nằm trong mỗi ô vuông lớn ở 4 góc (A,B,C,D), không tính những tế bào nằm ngay trên đường phân chia

Trong đó : A: là số bạch cầu đếm được

1/10: chiều cao từ buồng đếm đến lamelle

20: độ pha loãng

4: vì 1 ô vuông lớn (16 ô vuông nhỏ) có diện tích 1 mm2

Nguyên nhân sai số:

- Máu xét nghiệm không đúng qui cách: đông dây, máu mao mạch bị pha loãng bởi dịch gian bào do nặn bóp đầu ngón tay nhiều khi chích máu, ống máu để lâu không đậy nút,

- Dụng cụ không đủ tiêu chuẩn: bẩn, ướt,

- Đếm hoặc tính kết quả sai

3.3.1.3 Lựa chọn liều lượng thử nghiệm

Đường tiêm: tiêm phúc mạc, thể tích tiêm: 0,1ml/10g Hằng ngày chuột được lấy máu từ đuôi và xác định số lượng bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer vào thời điểm trước khi tiêm và liên tục 14 ngày sau khi tiêm Chuột được thử nghệm với các liều như sau:

- Oxaliplatin 10 mg/kg ngày 0 + 5-FU 150 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 10 mg/kg ngày 0 + 5-FU 100 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 5 mg/kg ngày 0 + 5-FU 150 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 5 mg/kg ngày 0 + 5-FU 75 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 5 mg/kg ngày 0 + 5-FU 50 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 5 mg/kg ngày 0 + 5-FU 50 mg/kg ngày 0, 1 + leucovorin 50 mg/kg ngày 0, 1

- Oxaliplatin 5 mg/kg ngày 0 + 5-FU 75 mg/kg ngày 0, 1+ leucovorin 50 mg/kg ngày 0, 1

3.3.2 Xây dựng mô hình và xác định các chỉ số huyết học của mô hình

trên máy xét nghiệm huyết học

3.3.2.1 Xây dựng mô hình

Chuột được nuôi thành 4 lô như sau:

- 2 lô chứng ngày 0 và ngày 5

- Lô tiêm phúc mạc oxaliplatin 5mg/kg (ngày 0) + 5-FU 50 mg/kg (ngày 0, 1) + leucovorin 50 mg/kg (ngày 0, 1), xét nghiệm ngày 5

- Lô tiêm phúc mạc oxaliplatin 5 mg/kg (ngày 0) + 5-FU 50 mg/kg (ngày 0, 1) + leucovorin 50 mg/kg (ngày 0, 1) + neupogen 50 µg/kg (ngày 2, 3, 4, 5) xét nghiệm ngày 5

Oxaliplatin, 5-FU, leucovorin, filgrastim (Neupogen) được pha trong dung dịch glucose 5% thành liều phù hợp Điều kiện tiêm: 0,1ml/10g, đường tiêm: tiêm phúc mạc

Oxaliplatin được tiêm vào buổi sáng, sau 2-3 giờ tiêm leucovorin, 5-FU được tiêm cách leucovorin khoảng 1-2 giờ

Neupogen được tiêm hằng ngày, liều đầu tiên cách 24 giờ sau khi ngừng tiêm thuốc hóa trị

3.3.2.2 Phương pháp lấy máu xét nghiệm

Chuột được gây mê bằng đá CO2 Mổ bộc lộ khoang bụng để lấy máu từ tim, thao tác này phải nhanh, trong khi tim chuột còn đập để tránh đông máu từ bên ngoài Thể tích máu cần lấy phải đạt ít nhất là 0,4 ml Ngay sau khi có đủ lượng máu cần lấy (từ 0,4 – 0,9 ml), cho ngay mẫu máu vào ống chứa mẫu có chất chống đông EDTA Máu được xét nghiệm trên máy CELL-DYN 3700

3.3.2.3 Các thông số đánh giá

- Trọng lượng của chuột trong quá trình thí nghiệm

- Tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân

- Tổng lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit

- Số lượng tiểu cầu

3.3.2.4 Phương pháp phân tích thống kê

Các số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± Sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM)

SEM : Standard Error of Mean

Việc thống kê các số liệu được áp dụng dựa trên phần mềm thống kê Minitab Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p<0,05 (độ tin cậy 95%) hay p<0,01 (độ tin cậy 99%)

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GÂY SUY GIẢM BẠCH CẦU CỦA OXALIPLATIN, 5-FLUOROURACIL TRÊN BUỒNG ĐẾM NEUBAUER

4.1.1 Khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của oxaliplatin,

5-fluorouracil

4.1.1.1 Oxaliplatin 10 mg/kg (ngày 0) + 5-Fluorouracil 150 mg/kg ngày (0, 1)

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 8 chuột Sau khi tiêm thuốc, chuột được cân và lấy máu theo dõi mỗi ngày Sau khi tiêm thuốc, thể trạng chuột nhanh chóng suy sụp, trọng lượng chuột giảm rõ rệt Từ ngày 2 chuột bắt đầu bị tiêu chảy, rụng lông Ngày 4 có 1 chuột chết, tất cả chuột đều rất yếu ớt, chuột chết dần (đến ngày 6 thì toàn bộ chuột trong lô đều chết) Như vậy liều này quá độc, không thích hợp để khảo sát

Bảng 4.1 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3

trước và sau khi tiêm thuốc

Trước khi tiêm

Biểu đồ 4.1 Tác động của phối hợp oxaliplatin 10 mg/kg, 5-FU 150 mg/kg,

trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu

4.1.1.2 Oxaliplatin 10 mg/kg (ngày 0) + 5-Fluorouracil 100 mg/kg (ngày 0, 1)

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 5 chuột với liều 5-FU giảm xuống còn 100 mg/kg Sau khi tiêm thuốc, chuột được cân và lấy máu theo dõi mỗi ngày Trong thí nghiệm này, thể trạng chuột cũng nhanh chóng suy sụp, trọng lượng chuột giảm nhanh Chuột bị tiêu chảy, rụng lông Ngày 4 có 2 chuột chết, ngày 6 tất cả chuột đều chết Như vậy liều này cũng quá độc, không thích hợp để khảo sát

Bảng 4.2 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3

trước và sau khi tiêm thuốc

Trước khi tiêm

Biểu đồ 4.2 Tác động của phối hợp oxaliplatin 10 mg/kg, 5-FU 100 mg/kg,

trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm

4.1.1.3 Oxaliplatin 5 mg/kg (ngày 0) + 5-Fluorouracil 150 mg/kg (ngày 0, 1)

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 5 chuột với liều oxaliplatin giảm xuống còn 5 mg/kg Sau khi tiêm thuốc, chuột được cân và lấy máu theo dõi mỗi ngày Thể trạng chuột nhanh chóng suy sụp, trọng lượng chuột giảm nhanh Chuột bị tiêu chảy, rụng lông Ngày 4 có 1 chuột chết, ngày 6 chỉ còn 1 chuột sống nhưng thể trạng rất yếu Như vậy liều này cũng quá độc, không thích hợp để khảo sát

Bảng 4.3 Thể trọng và tổng lượng bạch cầu/mm3

trước và sau khi tiêm thuốc

Trước khi tiêm

Biểu đồ 4.3 Tác động của phối hợp oxaliplatin 5 mg/kg, 5-FU 150 mg/kg,

trên thể trọng và tổng lượng bạch cầu ở lô thử nghiệm