Nghiên cứu ảnh hưởng của aslem trên hệ thống enzim CY p 450 ở gan động vật thí nghiệm

Đặc biệt đối với một chế phẩm thuốc mới thì nghiên cứu về tương tác của thuốc với hệ Cytochrom P450 cũng góp một phần không nhỏ trong việc cung cấp những thông tin cần thiết để có thể sử

Đào Thị Mai Anh

Nghiên cứu ảnh hưởng của a slem trên hệ thống enzym Cyt-P450 ở gan

của động vật thí nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Dược lý ■ Dược lâm sàng

Mã số: 60.73.05

Hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Đào Kim Chi

2 PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Dao

Hà nội -2003

saw đại kọc, cá c pKòng bcm, B ộ môn ~ c r ư ờ n g Đại kọc T ) l ì ợ c H — ỉtN nội líiì fi'n.1 mọi đ iều kiỆK cKo em t^ong quá ừìnk kọ c tập và ỉU,ực kiện luận văn tại

ỉ r ư ờ n g.

xi*^ b à y t ổ lòrvg b i ê t ơ n s â u SQC tc^i P S Ỡ X S Đ à o K i m C k i v à 7\]gwyần ~nkị A)0ỌC Daoy nguời tkầy đ ã lucm tkeo sáf> tận tíiak KucẶng dân và thuyền <ftạ+ k\Kũk\0 Uinh (aghiệm CỊLiý báu t^otac) suô+ r|wn

IrMnk n g ị\ìê Y \ cí<tA v à t l \ ự c K i ệ ^ l u ậ n v ă n n à y

£m cũng xin ckân i K ồk K cám ơn <^\S.XS AJguyen Tkắng, TS A^g^yên (2uôc Bínk CÙKV0 các thầy cô giáo, cô T-^kạm Xkat^h Pk^cMg và các kỹ tkuật viên trcmg Bộ môn •f'loa sink/ ịrường Đại Kọc Duợc flò nội aã giúp đơ, tạo ctìểu kiện thucm lợi đ ê e-tn có ii\ề hoàn iKònK luận văn cua

m m k

T^cmg CỊMQ +I*mk +Kực Kiện luận văn, em đã cíuợc sụ u,ưáng dâK và giúp

đỡ nkiệt fmh của Tks Đổ ~Ckị Tuyên và các cán t>ộ pkò^g Ênzym Kọc- ViẹK cồ n g nghệ sink kọC/ PúÀS ~ cs ]— ê ĐínK "Hoe cùng các cán bộ của

B ộ m ô n < ^ ia i pk<âw bệ^Ky ị ^ ư ờ n g Đ ạ i k ọ c -1-1 à K ọi.

7 \ ) k c m d ị p K\ày, e m xì^v c t a ợ c gt?i lời c á m ơ n c k â n t h à n h t ó i tc\T c Á t ậ p

+kế và cá nkốKv các cíơn vị

£ 3 u ô i c ù n g e m xii^ pi\é-Ọ đ ư ợ c d à n h lời c ả m ơ n c h o g i a c í ỉ n k / b ạ n b è /

người \\\ấv\; nl\ữv\g ngiXỜi đa lucm luÔK đọn g viên UKnyên kkíck và kê+ lổKg

g i ú p đ ỡ c f e e m i k ự c K i ệ n đ ư ợ c , l u ậ n v ă n n à y ,

à laọi/ t k á n a I 1 n ă m 1200"?

D s. Đào Tkị Mnì ;Anl\

TrangTrang phụ bìa

Chương 1 : T ổN G QUAN TÀI LIỆU

1.2 Hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 12

Chương 2 : NỘI DUNG, Đ ố i TUƠNG v à PHUƠNG p h á p

NGHIÊN c ú u

2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống Cyt- 37

P450 và sơ bộ tinh sạch microsome từ gan thỏ

2.1.3 Phương pháp và các bước tiến hành nghiên cứu 38

2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống Cyt- 46

P450 và khả năng tương tác giữa ASLEM và

Cyclophosphamid trên mô hình gây suy giảm miễn dịch

3.1.1 Sự biến đổi trọng lượng cơ thể thỏ dưới ảnh hưởng của 51

ASLEM3.1.2 Ảnh hưởng của ASLEM lên hệ thống Cyt-P450 ở gan 52

thỏ3.1.2.1 Sự biến đổi hàm lượng các Cytochrom 523.1.2.2 Sự biến đổi hoạt tính các Cytochrom 543.1.3 Tách chiết microsom và tinh sạch Cyt-P450 từ gan thỏ 573.2 Các kết quả nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 603.2.1 Số lượng và tỷ lệ sống sót của chuột ở các nhóm 60

nghiên cứu3.2.2 Sự biến đổi trọng lượng cơ thể chuột ở các nhóm 61

nghiên cứu3.2.3 Ảnh hường của ASLEM lên hệ thống Cyt-P450 ở gan 62

chuột3.2.3.1 Sự biến đổi hàm lượng các Cytochrom 623.2.3.2 Sự biến đổi hoạt tính các Cytochrom 673.2.4 Kết quả mô bệnh học của các nhóm chuột nghiên cứu 71

AH Anilin hydroxylase

AIDS Acquired Immuno deficiency syndrome

EDTA Ethylen diamin tetra acetic

Hsp 90 Heat shock protein 90

L D 5 0 Median lethal dose (Liều chết 50%)

NAD+ Nicotinamid adenin dinucleotid

NADH Nicotinamid adenin dinucleotid (dạng khử)

NADP+ Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat

NADPH Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (dạng khử)

Bảng số Tên bảng Trang1.1 Các enzym pha I

3.1 Sự thay đổi trọng lượng thỏ dưới ảnh hưởng của ASLEM

3.2 Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.3 Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.4 Hoạt độ AH ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.5 Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.6 Hàm lượng Cyt-P450 trong dịch nghiền và trong dịch

microsom gan của hai nhóm thỏ

3.7 Hoạt độ AH trong dịch nghiền và trong dịch microsom gan

của hai nhóm thỏ

3.8 Tỷ lệ sống sót của chuột ở các nhóm nghiên cứu

3.9 Sự thay đổi trọng lượng chuột trước và sau thí nghiệm

3.10 Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM

so với nhóm chứng

3.11 Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng

thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.12 Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của nhóm chuột tiêm ASLEM so

với nhóm chứng

3.13 Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm chuột tiêm đồng

thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

Hình số Tên hình Trang Ị1.1 “Đại gia đình của Cyt-P450”

1.2 Mô hình hệ thống Cyt-P450 ở màng lưới nội sinh chất

1.3 Nhân Hem ở dạng Fe proporfirin IX của Cyt-P450

1.4 Cơ chế hoạt động của Cyt-P450

1.5 Sơ đồ vận chuyển điện tử (e) trong phân tử CPR

1.6 Tương tác giữa CPR và Cyt-P450

1.7 Cơ chế cảm ứng CYP 1 AI qua receptor Ah

1.8 Funtumin (3 oc-amino-5 a-pregnan-20on)

2.1 Đường chuẩn Lowry

2.2 Sơ đồ quy trình tinh sạch microsom và Cyt-P450

3.1 Hàm lượng Cyt-P450 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.2 Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.3 Hoạt độ AH ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.4 Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm thỏ nghiên cứu

3.5 Ảnh điện di SDS-PAGE (10% acrylamide) của các mẫu

protein (nhuộm Coomassie Brilliant Blue R 250)

3.6 Sự biến đổi trọng lượng chuột trong quá trình nghiên cứu

3.7 Hàm lượng Cyt-P450 gan chuột ở nhóm tiêm ASLEM và

nhóm chứng

3.8 Hàm lượng Cyt-P450 gan của các nhóm chuột được tiêm

đồng thời cả CY và ASLEM so với nhóm chứng

3.9 Hàm lượng Cyt-b5 ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

3.10 Hoạt độ AH ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

3.11 Hoạt độ CPR ở gan của các nhóm chuột nghiên cứu

ĐẶT VẤN ĐỂ

Vài thập kỷ gần đây, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tới một hệ thống enzym có vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người,

đó là hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 (Cytochrome P450

— dependent monooxygenase system) hay còn được gọi ngắn gọn là hệ thống Cyt-P450 Sở dĩ hệ thống này được chú ý nhiều như vậy là vì đó chính là con đường chuyển hoá chủ yếu của các chất nội sinh có đặc tính thân mỡ như steroid, acid béo, prostaglandin, leucotrien, thromboxan cũng như của nhiều chất ngoại sinh (xenobiotics) có cấu trúc khác nhau, dáng lưu tâm hơn cú là

các chất độc, chất gây ung thư (carcinogen) và thuốc [11] Hệ thống này gồm các thành phần: Cytochrom P450 (Cyt-P450), Cytochrom P450 reductase (CPR), Cytochrom b5 và phospholipid, trong đó Cyt-P450 là thành phần quan trọng nhất Cyt-P450 là tên chung của một “đại gia đình” các enzym màng nội bào chứa nhân Hem, có tính chất đặc biệt là khi kết hợp với c o sẽ tao phức

hợp có đỉnh hấp thụ tại bước sóng X = 450 nm [7|.

Cytochrom P450 cùng với hệ thống của nó cũng được chú ý nhiều trong ngành Dược vì nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa của hầu hết các thuốc đang được sử dụng trên lâm sàng hiện nay Những tác động lên

hệ enzym này dù là ức chế hay cảm ứng đều có ảnh hưởng tới tác dụng cũng như độc tính của thuốc Đó chính là nguyên nhân của nhiều tương tác thuốc gây hậu quả nghiêm trọng Vì vậy, những hiểu biết về Cytochrom P450: cấu trúc, chức năng, cơ chế hoạt động là vô cùng quan trọng Đặc biệt đối với một chế phẩm thuốc mới thì nghiên cứu về tương tác của thuốc với hệ Cytochrom P450 cũng góp một phần không nhỏ trong việc cung cấp những thông tin cần thiết để có thể sử dụng thuốc “Hiệu quả - An toàn - Hợp lý”

Hơn 30 năm nay, chế phẩm ASLEM (Glycyl Funtumin Hydroclorid tổng hợp hoàn toàn), một chế phẩm có hoạt tính điều hòa miễn dịch, đã và đang được sử dụng trong điều trị bổ trợ ung thư gan tiên phát, ung thư phổi, ung thư đường tiêu hóa và một số trường hợp nhiễm trùng sau mổ Các kết quả

lâm sàng thu được là rất khả quan Các nghiên cứu về tác dụng sinh học, độc tính của ASLEM đã được tiến hành khá đầy đủ Tuy nhiên, ảnh hưởng của thuốc đối với hệ Cytochrom P450 như thế nào, có tương tác nào xảy ra khi

dùng ASLEM với những thuốc khác không, đó là những vấn đề còn chưa được sáng tỏ Để góp phần sử dụng chế phẩm ASLEM trong điều trị một cách “Hợp

lý — An toàn - Hiệu quả”, chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM trên hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 ở gan của động vật thí nghiệm" với những mục

tiêu sau:

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của ASLEM lên những biến đổi hóa sinh của hệ enzym oxy hoá phụ thuộc Cytochrom P450 trên gan của thỏ và chuột nhai trắng

2 Nghiên cứu khả năng tương tác của ASLEM với Cyclophosphamid, một loại thuốc đang được sử dụng trong điều trị ung thư

3 Phân lập và tinh sạch microsom gan động vật thí nghiệm, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về chuyển hóa ASLEM trong cơ thể

C hương I

TỔNG QUAN

1.1 QUÁ TRÌNH CHUYỂN HOÁ THƯÔC Ở GAN

Hầu hết các thuốc được sử dụng trong điều trị đều có một độ thân mỡ (lipophilic) nhất định để có thể được hấp thu dễ dàng vào các tổ chức của cơ thể Trong hệ tuần hoàn những thuốc này được vận chuyển bàng cách liên hựp với các protein huyết tương như albumin và được tích luỹ tại các mô mỡ với một tỷ lệ nhất định phụ thuộc vào mức độ thân mỡ của chúng Vì vậy, chúng không dễ dàng được đào thải ra khỏi cơ thể Do đó, một quá trình để biến đổi những thuốc này thành những chất chuyển hoá có tính thân nước hơn, dễ dàng đào thải ra ngoài hơn là vô cùng cần thiết Hầu hết các mô và các cơ quan trong cơ thể đều có khả năng tham gia vào quá trình chuyển hoá thuốc Tuy nhiên, gan được đánh giá là cơ quan quan trọng nhất trong quá trình chuyển hoá thuốc của cơ thể vì những lý do sau [51]:

- Thứ nhất: Gan nằm ở cửa ngõ của hệ tuần hoàn, hầu hết các thuốc sau khi hấp thu đều được vận chuyển đến gan trước khi vào vòng tuần hoàn chung

1.1.1 Ảnh hưởng của chuyển hoá đến tác dụng và độc tính của thuốc.

Thông qua chuyển hoá, thuốc bị thay đổi về cấu trúc hoá học dãn đến

sự thay đổi về tác dụng sinh học cũng như độc tính của thuốc

Nói chung, với nhiều thuốc sau khi chuyển hoá sẽ giảm hoặc mất lác dụng và giảm hoặc mất độc tính Mặt khác, như đã đề cập ở trên, thông qua chuyển hoá thuốc trở nên phân cực hơn và dễ đào thải ra ngoài hơn Do vậy

quá trình chuyển hoá thuốc còn được coi là quá trình tự bảo vệ của cơ thể chống lại độc tính của các thuốc.

Tuy nhiên cũng có một số trường hợp đặc biệt:

- Có những thuốc qua chuyển hóa vẫn giữ được tác dụng

+ Vitamin D3 được chuyển hoá thành 1,25 dihydroxy calciferol, chất chuyển hoá này có tác dụng tăng cường hấp thu calci ở ruột, tái hấp thu calci ở ống thận, giúp cho sự tạo xương

+ Cyclophosphamid được chuyển hoá ở gan tạo thành Aldophosphamid

1.1.2 Các phản ứng chuyên hoá thuốc ở gan [12],[13],[19],[79].

Thông thường các thuốc chuyển hoá ở gan qua 2 pha (pha I và pha II) theo sơ đồ sau:

Thuốc -> chuyển hoá - * Chất liên hợp —> Thải trừ

O xyhoá trung gian Acid Acetic

và dễ dàng đào thải ra ngoài hơn

a Phản ứng oxy hoá

• Oxy hoá sử dụng một nguyên tử oxy (Monooxygenation): Là những phan

ứng được thực hiện chủ yếu ở microsom nằm trên lưới nội bào nhẵn (smooth- surface endoplasmic reticulum), bao gồm:

+ Oxy hoá ở nhân thơm

Acetanilid, phenobarbital, diphenylhydantoin (DPH), propanolol được

chuyển hoá theo cách này

+ Hydroxyl hoá nhân steroid

Đa số các thuốc cũng như các chất nội, ngoại sinh có bản chất steroid chuyển

hoá theo con đường này

+ Oxy hoá chuỗi thẳng

RCH 3 -► RCH2OH

Cơ chất thường thấy của phản ứng này là: toluen, hexobarbital, imipramin,

meprobamat, tolbutamid, pentobarbital

+ Epoxy hoá (Epoxidation)

R—C H = C H 2 - ► HRC— CH2 - ► HRC— CH2

Carbamazepin, protriplin là cơ chất của phản ứng này

+ Oxy hóa khử alkyl (Dealkylation)

r _ x _ CH3 -► R —X —CH 2 O H - ► R - X H + RCHO

Clopromazin, imipramin, erythromycin, diazepam, morphin, griseofulvin,

papaverin, codein được chuyển hoá theo cách này

Ngoài các phản ứng kể trên các thuốc còn có thể được chuyển hóa

• Các phản ứng oxy hoá khác: Là các phản ứng không xảy ra ở microsom,

Cloramphenicol, nitrofuran là cơ chất của phản ứng này

+ Khử các aldehyd: ví dụ khử cloral hydrat bị khử thành tricloethanol

+ Khử loại halogen (Reductive dehalogenation)

c Phản ứng thuỷ phân

Dưới tác dụng của các enzym esterase và amidase các ester hoặc amid

sẽ bị thuỷ phân Các esterase có hoạt tính mạnh hơn amidase Trường hợp

acetylcholin bị thuỷ phân bởi acetylcholinesterase thành cholin và acid acetic

là ví dụ điển hình của loại phản ứng này

1.1.2.2 Các phản ứng pha II

Pha II còn được gọi là pha liên hợp Sau khi chuyển hoá qua pha I các chất chuyển hoá vừa tạo thành có một số nhóm chức phân cực hơn như — OH, -NH2 có thể liên hợp được với một số chất như acid glucuronic, acid acetic, acid sulfuric, acid mercaptopuric, glutathion, a aminoacid, glutamin, sulfocyanicL.trong cơ thể để cuối cùng tạo thành chất liên hợp có phân tử lượng lớn hơn, thân nước hơn, do đó dễ thải ra ngoài qua thận hay mật Tuy nhiên cũng có chất sau khi acetyl hoá lại khó tan trong nước hơn chất mẹ nên khó thải trừ hơn, sulfonamid là một ví dụ điển hình

Các phản ứng pha II gồm:

a Phản ứng liên hợp với acid acetic (acetyl hoá)

R—NH2 + Acetyl coenzym A - ► R— N + Coezym A

C OCH 3

Các chất có chứa amin bậc nhất (như Histamin), các aminoacid không phải là những aminoacid sinh lý, các hydrazin, hydrazid (như isoniazid), sulfamid đều có thể bị acetyl hoá

b Phản ứng liên hợp với acid sulfuric (sulfur hoá)

R — O H + PAPS - ► R— SO4 + PAP

HCác chất có nhóm chức phenol hoặc alcol cua carbua hydro mạch thẳng, mạch nhánh (như: cloramphenicol, oestron, butanol ) sẽ liên hợp với PASP (3’-phosphoadenosin-5-phosphosulfat), dạng hữu cơ của acid sulfuric trong bào tương của tế bào

c Phản ứng liên hợp với hợp chất mang nhóm thiol

Các hợp chất hữu cơ chứa halogen có thể liên hợp với những chất mang nhóm thiol (-SH) như cystein, N-acetyl cystein, glutathion

R, — CH2- X + r 2 s h R,— C H 2- S R 2 + HX

Bromsulfonphtalein (BSP), clorotoluen chuyển hoá như vậy ở gan

d Phản ứng liên hợp với glycocol (glycin)

Một số acid có nhân thơm tạo liên kết amid với nhóm am in của glycocol, cho những amid tương ứng:

Acid salicyluric

e Phản ứng methyl hoá

Đây là quá trình phổ biến trong cơ thể động vật Cơ chất sẽ kết hợp với S-Adenosylmethionin, là chất mang nhóm methyl Tuỳ theo nhóm chức trong cấu trúc của cơ chất mà có thể N-methyl hoá (gắn nhóm methyl (CH3) vào phân tử một chất qua nguyên tử nitơ) hoặc o - methyl hoá, s - methyl hoá Ví

dụ methyl hóa histamin cho 4- methyl histamin, methyl hóa nicotinamid cho N- methyl nicotinamid, methyl hóa noradrenalin cho adrenalin

Nor- adrenalin hợp với acid glucuronic Adrenalin

Nhiều chất có thể liên hợp với UDP-GA (Uridin 5 ’-diphospho-a-D- glucuronic acid), hay còn gọi là “acid glucuronic hoạt hoá” để tạo thành glucuronid Có rất nhiều chất có thể liên hợp với acid glucuronic như:

+ Các rượu và phenol (morphin, phenol, steroid ), tạo thành dẫn xuấteste

4- Các acid mạch thẳng hoặc acid có nhân thơm (acid salicylic, acid nicotinic), tạo thành ete.

+ Các amin mạch thẳng, amin thơm (sulfamid ), tạo dẫn xuất N- glucuronid

+ Các chất có chứa lưu huỳnh, tạo dẫn xuất S-glucuronid

Trong thực tế người ta thấy phản ứng liên hợp glucuronic thường đi cùng với liên hợp sulfuric, và đây là con đường chủ yếu của chuyển hoá cơ chất

1.1.3 Các enzym tham gia chuyên hoá thuốc ở gan.

1.1.3.1 Các enzym pha I [51], [79].

Tên, vị trí khư trú trong tế bào, loại phản ứng xúc tác của các enzym chủ yếu tham gia xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá thuốc ở pha I được tóm tắt trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Các enzym pha 1

Enzym Loại phản ứng xúc tác Vị trí khư trú trong tế bàoCytochrome P450 (CYP) Oxy hoá sử dụng một

nguyên tử oxy (Monooxygenation)

amine Oxidase (SSAO)

Oxy hoá khử amin

Aldehyd dehydrogenase Oxy hoá aldehyd Bào tương

thể

Trong số đó, Cytochrome P450 được đánh giá là hệ enzym quan trọng nhất trong chuyển hoá thuốc vì theo thống kê 80% dược phẩm có mặt trên thị trường hiện nay là cơ chất của hệ thống enzym này [33J, [71 ], [73J.

1.1.3 2 Các enzym pha II [79].

Các enzym tham gia chuyển hoá thuốc ở pha II chủ yếu là các enzym vận chuyển (transferase) xúc tác cho các phản ứng liên hợp Các enzym chính được tóm tắt trong bảng 1.2:

Bảng 1.2 Các enzym pha II

Glutathione S-transferase (GST) Liên hợp với các chất mang

nhóm thiol (- SH)Sulfotransferase (ST) Liên hợp với acid sulfuricN-Acetyl transferase (NAT) Liên hợp với acid aceticUPD-glycosyltransferase (UDPGT) Liên hợp với acid glucuronicNhiều loại Methyltransferase Methyl hóa

1.2 HỆ THỐNG ENZYM OXY HOÁ PHỤ THUỘC CYTOCHROM P450.

1.2.1 Tóm lược lịch sử nghiên cứu

1.2.1.1 Trên thê giới.

Từ những năm 1940, Cytochrom P450 đã được phát hiện ra trong quá

trình nghiên cứu một hệ enzym xúc tác cho những phản ứng oxy hoá đặc biệt (monooxygenation), xảy ra theo cơ chế chung sau: NAD(P)H + 0 2 + R(cơ chất) -» NADP+ +HoO + RO Cơ chất của phản ứng này gồm hàng ngàn chất hóa học có cấu trúc khác nhau như : thuốc, steroid, thuốc trừ sâu Khi đó người ta cũng đã biết rằng những phản ứng trên chỉ xảy ra trong microsom (những túi nhỏ có nguồn gốc từ lưới nội sinh chất (endoplasmic reticulum) thu được khi các tế bào bị nghiền đồng thể) của tế bào gan và tế bào của một số

mô nhất định.Tuy nhiên, thành phần nào trong microsom chịu trách nhiệm xúc tác cho phản ứng thì vẫn chưa được biết rõ [41]

Mãi đến năm 1958, Garfinkel và Klingenberg khi nghiên cứu microsom tế bào gan lợn và chuột đã tìm ra một loại enzym mà khi kết hợp với oxyd carbon (CO) có đỉnh phổ hấp thụ ở bước sóng À, = 450 11111 Sau đỏ Omura và Sato (1964) phát hiện ra enzym này có bản chất hemoprotein và là thành phần quan trọng nhất của hệ thống enzym chuyên xúc tác cho các phản ứng monoxygenation nói trên Sato đặt tên cho nó là Cyt-P450 để chỉ sự hấp thụ không bình thường của hợp chất Enzym-CO tại bước sóng Ằ=450 nm và tên gọi đó được dùng cho đến ngày nay [41]

Năm 1968, các thành phần khác của hệ thống Cyt-P450 đã được đồng thời hai nhóm nghiên cứu độc lập tìm ra Nhà nghiên cứu Gunsalus từ trường đại học tổng hợp bang Illinois (Mỹ) chuyên nghiên cứu về loại vi khuẩn sống trong môi trường có camphor, thấy rằng hệ thống Cyt-P450 ở vi khuẩn gồm ba thành phần: NADH, một protein chứa sắt và lưu huỳnh gọi là putidaredoxin và

một loại Cyt-P450 mà Gunsalus đặt tên là Cyt-P450cam Cùng thời gian đó hai nhà nghiên cứu là Lu và Coon thuộc trường tổng hợp bang Michigan (Mỹ) đã tiến hành nghiên cứu trên microsom gan thỏ và công bố ba cấu tử cần thiết của hệ thống Cyt-P450 là: Cyt-P450, Cyt-P450-reductase (CPR) và phospholipid Các nghiên cứu sâu hơn sau đó đã chỉ ra rằng mô hình hệ thống Cyt-P450 do Lu và Coon công bố là phổ biến đối với hầu hết các loài động vật [33].

Năm 1979, Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tá chi tiết cư chế hoạt động của hệ thống Cyt-P450 [20]

Những năm sau đó những hiểu biết về Cyt-P450 được mở rộng, người ta phát hiện ra rằng Cyt-P450 không phải là một phân tử protein duy nhất mà gồm nhiều dạng isozym có cấu trúc khác nhau Chính vì thế người ta coi Cyt- P450 là một đại gia đình những protein chứa Hem xúc tác sự chuyển hóa nhiều chất nội sinh có đặc tính thân mỡ như steroid, acid béo, vitamin tan trong mỡ, prostaglandin, leucotrien, thromboxan và các chất ngoại sinh (xenobiotics) [51], [73], [82J

Năm 1987 một hệ thống danh pháp thống nhất của Cyt-P45(J đã ra đời trong đó các Cyt-P450 được phân loại và gọi tên dựa trên trình tự acid amin trong phân tử mà trình tự này lại do trình tự của các cặp base nitơ trong gen quy định Để thống nhất và đơn giản về mặt thuật ngữ, người ta quy ước dùng chữ CYP thay cho Cyt — P450 Ký hiệu tiếp theo gốc CYP bằng số Ả rập để chỉ họ (family) Trình tự acid amin của các isozym trong cùng một họ khác hơn 70% trình tự acid amin của các isozym thuộc họ khác Trong một họ lại chia thành các nhóm dưới họ (subfamily), ký hiệu bằng một chữ cái, biểu thị nhóm gen có quan hệ huyết thống cao (hơn 70% thứ tự acid amin tương tự nhau) Trong một nhóm dưới họ lại chia ra các Cyt-P450 riêng biệt, đánh số tiếp theo Ví dụ CYP 3A3, CYP 3A4 [22], [72J

2A6 2B6 2<

2A7

7 11 17 19 21 27

3A3 3A4 3A5 3A7

21A2

4A9 4B1 4F2 11A1 11B1

8 2D6 2É1 2 2C9

2C10

2C17 2C18 2C19

//m /ỉ 7.7 “Đa/ gia CMA Cyt-P450 [ 51 ]

N ăm 1991, Nerbert đã xác định được một gen Cyt-P450 do tổ tiên truyền lại đã tồn tại cách đây hơn 3,5 tỉ năm Cho đến nay, người ta đã phát hiện được 221 gen và 12 gen được coi là pseudogen cua Cyt-P450 trong 31 loại sinh vật có nhân thật (eukaryote) và 11 loại sinh vật tiền nhân (prokaryote) Ở người, đã phát hiện được 32 gen và có 5 gen được coi là pseudogen của Cyt-P450 Theo chức năng, các gen này được chia làm 2 loại:

- Những gen tổng hợp ra các enzym chuyển hoá steroid ở các tổ chức đặc hiệu như tuyến thượng thận, tuyến sinh dục và nhau thai

- Những gen tổng hợp ra các enzym tham gia vào chuyển hoá các xenobiotic (thuốc, chất trừ sâu, hoá chất môi trường) [58], [51]

Năm 1993, một hội nghị về Cyt-P450 đã được tổ chức tại Bồ Đào Nha, thu hút nhiều nhà nghiên cứu Cyt-P450 trên thế giới Hơn 300 báo cáo về Cyt- P450 đã được công bố xoay quanh nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu cơ bản đến những nghiên cứu ứng dụng như: cấu trúc- chức năng của Cyt-P450; sự tương tác của các thành phần trong hệ thống Cyt-P450, cơ chế vận chuyển điện tử và hoạt tính oxy hoá; các tính chất sinh hoá, sinh lý và sinh học phân tử của hệ Cyt-P450; sự tiến hoá, sự đa dạng loài của gen Cyt-P450; cơ chế kiểm soát quá trình sinh tổng hợp Cyt-P450; Cyt-P450 trong ung thư và độc học miễn

dịch (immunotoxycology); công nghệ sinh học, các chức năng mới của Cyt- P450 và khả năng ứng dụng trong thiết kế thuốc [28] , [32], [34], [76].

Đến nay, các nghiên cứu về Cyt-P450 càng được mở rộng với sự trợ giúp của nhiều phương tiện hiện đại Hướng nghiên cứu ứng dụng đang dược các nhà khoa học chú ý đặc biệt là các nhà Y và Dược học nhằm hiểu rõ cơ chế tác dụng của thuốc để tìm ra những phương pháp và những loại thuốc chữa bệnh mới có khả năng điều trị những căn bệnh nguy hiểm như ung thư hay AIDS [47], [48], [28]

1.2.1.2 Ở Việt Nam.

Những kiến thức, thông tin về Cyt-P450 mặc dù mới được du nhập vào Việt Nam cách đây chưa lâu (đầu những năm 80) nhưng thực sự đã gây chú ý cho nhiều nhà khoa học

Tiếp thu và kế thừa những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, những nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt nam chu yếu là những nghiên cứu ứng dụng đặc biệt là trong lĩnh vực Y và Dược

Năm 1985, TS Nguyễn Thị Ngọc Dao, phòng Enzym học Viện công nghệ sinh học, đã nghiên cứu tách chiết và làm sạch một phần Cyt-P450 Kể

từ đó đến nay, TS Dao đã phối hợp với nhiều nhà khoa học ở nhiều nơi khác nhau (Học viện quân Y, Trung tâm nhiệt đới Việt Nga ) để tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất độc khác nhau (nhiên liệu lỏng tên lửa, yperit, CC14 và gần đây nhất là dioxin) lên hệ thống enzym Cyt- P450 để từ đó tìm ra các loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Việt nam có tác dụng phòng và chống các chất độc đó [5], [6], [7], [20]

Trịnh Thị Hồng Duyên (Khoa Dược, đại học Y, Dược thành phô Hồ Chí Minh), Nguyễn Thái Biềng (Bộ môn Dược lý, Học viện quân y) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số dược liệu (thuốc phiện, tam thất, rotundin từ củ bình vôi) lên hệ thống Cyt-P450 để có những nhận định trong bào chế dạng thuốc mới cũng như đưa ra những tư vấn về sử dụng thuốc trong lâm sàng [ 1 ], [8]

Gần đây, Phòng Hoá sinh protein- Viện Công nghệ Sinh học đã tách dòng và biểu hiện đoạn gen exon 7- CYP1A1 từ máu nguyên của người Việt Nam ở E Coli Đây là một bước tiến mới trong việc ứng dụng những thiết bị

và phương pháp hiện đại trong nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt Nam [20]

Tuy những công trình nghiên cứu về Cyt-P450 ở Việt Nam hiện còn khiêm tốn nhưng trong tương lai không xa lĩnh vực nghiên cứu về Cyt-P450 chắc chắn sẽ phát triển được do các nhà khoa học ngày càng nhận thức được vai trò và khả năng ứng dụng to lớn của những nghiên cứu về Cyt-P450 trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực Y và Dược học

1.2.2 Cytochrom P450 (EC.1.14.14.1)

I.2.2.I Phân bô

Cyt-P450 là một enzym gắn màng nằm chủ yếu ở microsom trên lưới nội sinh chất và màng phía trong ty thể Ở đây Cyt-P450 nằm cùng với hai thành phần khác trong hệ thống của mình là CPR và phospholipid theo tỷ lệ: 1CPR / 20-40 Cyt-P450 / 3.500 phospholipid [1], [41]

NADPH

Hình 1.2 Mô hình hệ thống Cyt-P450 ở màng lưới nội sinh chất [41 ]

Ớ người, Cyt-P450 tập trung nhiều nhất và được nghiên cứu nhiều nhất

là ở tế bào gan Tuy nhiên người ta cũng tìm thấy sự có mặt của chúng ở nhiều loại tế bào khác như : tế bào phổi, thận, vỏ thượng thận, niêm mạc ruột, tinh hoàn, buồng trứng

Trong tự nhiên, Cyt- P450 phân bố rất rộng rãi Nó được tìm thấy ớ trong tế bào của người và nhiều loài động vật có vú khác, trong tế bào của chim, rắn, ếch nhái, cá, trong nhiều loài thực vật, vi sinh vật, côn trùng và cả ở nấm men, nấm mốc Vì thế, cũng có lý khi nói rằng: “Cyt-P450 có mặt trong tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất” [13], [22], [32], [34], [57], [67]

Hình 1.3 Nhân Hem ở dạng Fe protoporfirin IX của Cyt-P450 [79]

Cấu trúc của các Cyt-P450 được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Các nghiên cứu về cấu trúc bậc một của Cyt-P450 đã chỉ ra ràng trình tự acid amin trong phân tử của mỗi isozym thường có thể khác nhau rất nhiều (có trường hợp khác đến 70%), hơn nữa đoạn acid amin ở đầu N tận thường là không giống nhau giữa các Cyt-P450 So sánh về trình

isozym trong cùng một loài, người ta thấy rằng sự khái

đến hơn 95% Những nghiên cứu sau này đã khẳng định: mồi isozym được mà hoá bằng một gen riêng biệt và sự khác biệt về trình tự acid amin trong phân

tử là do trình tự của các cặp base nitơ trong gen tổng hợp protein quy định Đến nay người ta đã biết được hơn 1200 cấu trúc bậc một của Cyt- P450 Các thông tin về trình tự acid amin của các Cyt-P450 cũng như trình tự của các nucleotid mã hoá chúng hiện đều được lưu trữ trong ngân hàng gen (GenBank) của thế giới

Trung tâm hoạt động của Cyt- P450 chứa Fe protoporfirin IX, liên kết bởi lực hydro kỵ nước Vị trí thứ 5 của vòng porfirin liên kết với aminothiol thường là của gốc Cystein Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nước có khả năng trao đổi Dựa trên sự khử của Fe mà Ot (CO) có thể liên kết trong vị trí thứ 6 Mặc dù có sự khác biệt về trình tự acid am in nhưng một số cấu trúc được bảo toàn ở tất cả các isozym ví dụ như gốc Cystein gắn với Hem bao giờ cũng ở gần đầu tận cùng carboxyl

Cấu trúc bậc hai của Cyt- P450 cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy cả a-helix và ị3-sheet đều tồn tại trong phân tử enzym này Cho đốn nay cấu trúc bậc 3 của các Cyt- P450 ở tế bào nhân thật (eukaryote) vẫn chưa được tìm ra [20] Tuy nhiên người ta biết được rằng sự khác biệt trong cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của Cyt- P450 là nguyên nhân gây ra sự đặc hiệu cơ chất giữa các isozym

1.2.2.3 Cơ chế hoạt động [1], [20J

Cyt- P450 xúc tác sự thủy phân những cơ chất thích hợp bằng cách hoạt hóa một phân tử 0 7 và đưa nguyên tử o đã hoạt hóa đến cơ chất cần được chuyển hóa Cơ chế của phản ứng này được Coon và cộng sự đã tìm ra và mô

tả chi tiết vào năm 1979 Có thể hình dung tổng quát cơ chế này theo sơ đồ

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của Cyt-P450 [1 ]

Như vậy, ta có thể thấy cơ chế phản ứng của Cyt-P450 được đặc trưne bằng một chuỗi các phản ứng riêng lẻ, gồm:

- Phản ứng 1: Cơ chất (RH) gắn vào Cyt- P450 ở dạng oxy hóa (Fe3+) tạo

thành phức hợp enzym - cơ chất: Cyt-P450(Fe3+)-RH

- Phản ứng 2: Phân tử CPR (Cyt- P450 — reductase) chuyển một điện tử (e) từ

NADPH đến phức hợp enzym - cơ chất vừa được tạo thành ở trên và phức hợp này chuyển từ dạng oxy hóa sang dạng khử: Cyt-P450(Fe2+)-RH

- Phản ứng 3: Trong điều kiện có oxy, một phân tử oxy (Oo) sẽ liên kết với

nguyên tử Fe2+ trong phức hợp enzym - cơ chất dạng khử tạo thành một phức hợp mới: RH-Cyt-P450(Fe2+- 0 2)

- Phản ứng 4\ Phân tử Cyt-b5 chuyển điện tử (e) thứ hai từ NADH đến phức

hợp RH-Cyt-P450(Fe2+- 0 2) làm cho phân tử oxy chuyển sang dạng hoạt động

là anion superoxyd (Oo ) Phức hợp chuyển thành: RH-Cyt-P450(Fe2+0 7 )

- Phản ứng 5: Trong phức hợp RH-Cyt-P450(Fe2+- Oo ) có sự chuyển điện tử

(e) nội phân tử (điện tử (e) từ Fe2+ được chuyển sang 0 2’ ) Sau đó một nguyên

tử oxy (dạng o 2') sẽ kết hợp với hai nguyên tử hydro (dạng H+), tạo thành một phân tử nước và tách ra Nguyên tử oxy (O) thứ hai sẽ oxy hoá cơ chất tạo nhóm OH (R-OH) và giải phóng Cyt- P450 dạng oxy hóa (Fe3+)

I.2.2.4 Vai trò của Cyt-P450 trong cơ thể, [38], [41], [57]

Nhiệm vụ chính của nhiều Cyt-P450 là tham gia chuyển hoá thuốc Theo kết quả của những nghiên cứu gần đây thì sự khác nhau về số lượng Cyt- P450 trong cơ thể mỗi cá nhân là nguyên nhân khiến cho mỗi người có những đáp ứng khác nhau đối với cùng một loại thuốc nhất định Người ta cho rằng chính sự khác biệt này đã gây ra hiện tượng khi sử dụng thuốc cho một số đối tượng các tác dụng không mong muốn xảy ra ngay ở liều thông thường Với một số ít người (khoảng 10%), thậm chí một vài loại Cyt-P450 còn tồn tại ở dạng không hoạt động làm cho họ không có khả năng đào thải một số loại thuốc ra khỏi cơ thể, hậu quả là các thuốc này bị tích lại gây ra một số tai biến nghiêm trọng Ví dụ: Khoảng 7% người dân Cap-ca bị thiếu CYP 2D6, enzym tham gia chuyển hoá debrisoquine (thuốc hạ huyết áp) và phenformin (thuốc điều trị tiểu đường), những người này thường gặp phải nhiều tác dụng phụ khi

sử dụng những loại thuốc trên

Cyt-P450 cũng đóng vai trò quan trọng trong chuyển hoá nhiều chất gây ung thư (carcinogen) Hầu hết các chất gây ung thư sau khi bị chuyển hoá bởi Cyt-P450 đều trở nên ít độc hơn và bị thải ra ngoài Tuy nhiên trong một

số trường hợp khả năng gây ung thư của một sô chất lại tăng lên sau khi những chất này được chuyển hoá bởi Cyt-P450 thành những chất chuyển hóa thân nước, dễ dàng liên kết đổng hoá trị với phân tử ADN để gây ra đột biến

Ví dụ: CYP1A2 hoạt hoá các amin dị vòng (vốn không có khả năng gây ung thư) trong khói thuốc lá hoặc thực phẩm cháy thành những carcinogen thực sự

Bên cạnh khả năng chuyển hoá thuốc và các chất gây ung thư, Cyt-P450 còn tham gia chuyển hoá nhiều chất sinh học quan trọng trong cơ thể như:

- Các steroid nội sinh (cholesterol, acid mật, hormon ) và một số vitamin tan trong dầu (A,D ) bị tồng hợp và chuyển hoá bởi một số loại Cyt-P450 Ví dụ: quá trình tổng hợp các hormon steroid có sự tham gia của các Cyt-P450 ỏ' nhóm CYP11, CYP17, CYP19 và CYP21 Trên thế giới, người ta đã phát hiện

ra rằng một số căn bệnh di truyền có liên quan đến các enzym chuyển hoá này Ví dụ: Sự thiếu hụt CYP 21B, loại enzym xúc tác phản ứng hydroxy hoá carbon thứ 21 trong phân tử các steroid như pregnenolon và progesterone, ở trẻ sơ sinh (tỷ lệ khoảng 1/100.000) gây ra hội chứng thiếu muối (salt-wasting syndrome), thậm chí còn có thể gây tử vong

- Một số alkaloid nội sinh được tổng hợp nhờ Cyt-P450 Ví dụ như quá trình tổng hợp codein và morphin ở não cũng như phản ứng để chuyển codein thành morphin đều có sự tham gia xúc tác của Cyt-P450 Tuy nhiên, loại Cyt-P450 nào thực hiện nhiệm vụ này vẫn chưa được xác định

- Các 20-carbon eicosanoid như prostaglandin, thromboxan, leukotrien cũng được tổng hợp từ acid arachidonic bởi Cyt-P450 Đến nay, người ta đã biết được khoảng 14 Cyt-P450 thuộc các nhóm CYP1, CYP2, CYP3 và CYP4 tham gia vào quá trình này Ví dụ: CYP 5A1 tham gia tổng hợp Thromboxan

At, CYP 8A1 tham gia tổng hợp Prostaglandin I2 Phản ứng oxy hoá các acid arachidonic không giống như các phản ứng oxy hoá thông thường mà hệ Cyt-P450 xúc tác vì nó không cần đến oxy cũng như điện tử (e), các sản phẩm được tạo ra do sự tự sắp xếp lại trong phân tử tiền chất Một số đột biến trong gen của các Cyt-P450 xúc tác phản ứng này, hiện đã được xác định là có liên quan đến các rối loạn về viêm nhiễm và sự hình thành huyết khối, trong đó đáng lưu ý là các bệnh mạch vành hay tăng áp lực phổi

- Cyt-P450 cũng liên quan đến quá trình tổng họp khí nitơ oxyd (NO) nội sinh, một chất có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể như: dẫn truyền thần kinh, điều hoà huyết áp, tiêu diệt tác nhân gây bệnh Các Cyt-P450 tham gia phản ứng tổng hợp này được tìm thấy trong não và trong các đại thực bào của

hệ thống miễn dịch

Bên cạnh những chức năng kể trên, người ta cũng dự đoán rằng Cyt- P450 còn có thể có một số chức năng khác vì một số loại Cyt-P450 được tìm

thấy trong cơ thể như: CYP20A1, CYP27C1, CYP4A20, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4V2, CYP4X1, CYP26B1 và CYP26C1, mà chức năng của các Cyt-P450 này, cho đến nay, này vẫn chưa xác định được.

I.2.2.5 Các Cyt-P450 tham gia vào quá trình chuyển hoá thuốc ở người

Có khoảng 20 loại isozym thuộc các nhóm (families) CYP: 1, 2, 3, 4 tham gia vào quá trình chuyển hoá thuốc trong cơ thể Các isozym chính chịu trách nhiệm xúc tác phản ứng oxy hoá thuốc ở gan được tóm tắt trong bảng 1.3 [30], [71], [79]:

Bảng 1.3 Các enzym Cyt-P450 tham gia chuyển hoá thuốc ở gan người

Các C yt-P 450 V ị trí của gen

m ã hoá trên NST

H àm lượng (pm ol/m gP rotein)

Tỷ trọng (% C yt-P450 toàn phần)

Tỷ lệ (% ) tham gia chuyển hóa thuốc

CYP3A7) có vai trò rất mờ nhạt hoặc hầu như không tham gia chuyên hoá thuốc [39], [71].

Một isozym của Cyt-P450 có thể đơn độc xúc tác phản ứng oxy hoá của nhiều thuốc Ví dụ: Phản ứng chuyển hoá acetaminophen, cafein, phenacetin, ofloxacin do một mình CYP1A2 xúc tác hay amprenavir, astemisol, cortisol, digitoxin, enalapril, felodopine, lovastatin, ketoconazol bị chuyển hoá bởi CYP3A4 Nhưng trong một số trường hợp, phản ứng chuyển hoá của một thuốc lại đòi hỏi sự tham gia với những mức độ khác nhau của nhiều loại CYP Ví dụ: Carbamazepin bị chuyển hoá bởi các Cyt-P450 sau: CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 3A4; phenobarbital bị chuyển hoá bởi: CYP 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 3A4; hay các CYP tham gia chuyển hoá rifampicin là: 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 3A4 [71] (Xem thêm phụ lục)

1.2.3 Các thành phần khác của hệ thông enzym oxy hoá phụ thuộc Cyt- P450

1.2.3.1 NADPH - Cyt-P450 - reductase và Cytochrom b5

Thành phần thứ hai của hệ thống Cyt-P450 là những protein đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử (e) từ những chất cho (NADPH, NADH) đến Cyt-P450, để enzym này thực hiện nhiệm vụ oxy hóa cơ chất Đó chính là NADPH - Cyt-P450 - reductase và Cytochrom b5

a NADPH - Cyt-P450 - reductase (EC.1.6.1.4)

NADPH - Cyt- P450 - reductase (CPR) được Horceker phân lập lần đầu tiên vào năm 1950, có chức năng chuyển điện tử (e) từ NADPH đến Cyt-P450 chuyển Cyt-P450 từ dạng oxy hóa sang dạng khử (hình 1.3) [ ỉ I, [20]

Trong cơ thể, hàm lượng CPR được tìm thấy cao nhất ở gan Trong tế bào, CPR tập trung chủ yếu ở lưới nội sinh chất và gắn vào màng bằng một vùng “mỏ neo” rất kỵ nước ở đầu N- tận của chuỗi polypeptid [43]

CPR là một flavoprotein, phân tử gồm 1 chuỗi polypeptid liên kết với hai flavin cofactor là FAD và FMN, trọng lượng xấp xỉ 77 kDa Phân tích thành phần acidamin của CPR người thấy chuỗi polypeptid của nó được tạo thành từ 711 acidamin, trong đó có: 41 Lys, 20 His, 36 Arg, 73 Asn, 45 Thr,

39 Ser, 91 Glu, 36 Pro, 52 Gly, 49 Ala, 6 Cys, 46 Val, 24 Met, 26 lie, 27 Tyr,

33 Phe, 1 Trp Các Cys cùng với Tip (Trp 677) tham gia cấu tạo và đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của trung tâm gắn NADPH trong phân tử CPR [20], [43] Phân tích vùng quang phổ tử ngoại cho thấy chuỗi polypeptid của enzym có 34% ở dạng xoắn kép và 16% ở dạng xoắn p [1J Khác với Cyt- P450, CPR không tồn tại ở trạng thái đa dạng (polymorphism) Trình tự acidamin của CPR được bảo toàn khá chặt chẽ giữa các loài động vật có vú Đặc biệt sự thống nhất trong cấu trúc của các vùng “mỏ neo” gắn màng, vùng gắn FAD, FMN, vùng gắn NADPH và vùng gắn Cyt-P450 đã được quan sát thấy khi tiến hành các nghiên cứu phân tích cấu trúc- chức năng của những phân tử CPR ở các loài khác nhau [43]

Hai cofactor FAD và FMN của CPR liên kết với phân tử protein không phải bằng những liên kết đồng hoá trị do đó có thể bị tách khỏi protein trong điều kiện pH thấp hoặc lực ion cao Cả FAD và FMN đều tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử (e) từ NAPDH đến Cyt-P450 Quá trình này được mô

tả qua sơ đồ sau:

Dòng điện tử (e) -^

NADPH - ► FAD -► FMN - ► Cytochrome P450

Hình 1.5 Sơ đồ vận chuyên điện tửịe) trong phân tửCPR [Internet ]

Theo Iyanagi và cộng sự thì FAD nhận điện tử từ NADPH còn FMN chuyến điện tử đến sắt Hem của P450 [20]

Để có thể chuyển được điện tử đến Cyt-P450 và khử Cyt-P450, CPR phải gắn với Cyt-P450 tạo thành một phức hợp theo tỷ lệ 1:1 Phức hợp này

được duy trì bởi hai loại lực liên kết: Lực tĩnh điện và lực kỵ nước (lực Vandervan) Lực tĩnh điện được hình thành giữa các nhóm carboxyl tích điện

âm của các acidamin (aspartat, glutamat) trong phân tử CPR và các nhóm amin mang điện dương của các acidamin (lysine, arginin) trong phân tử Cyt- P450 Lực tĩnh điện có vai trò định hướng và duy trì liên kết Lực kỵ nước do các acidamin không phân cực (leucin, tryptophan, valin ) tạo thành, vai trò của nó là hút hai protein lại gần nhau đến một khoảng cách thích hợp đủ để thực hiện quá trình trao đổi điện tử (e) Mỗi một isozym cua Cyt-P450 có ái lực khác nhau đối với CPR

Hình 1.6 Tương tác giữa CPR và Cyt-P450 (Internet)

Sự khử Cyt-P450 phụ thuộc vào sự hình thành phức hợp giữa hai enzym (CPR-Cyt-P450) và quá trình này lại phụ thuộc vào hai yếu tố: phospholipid

có trong môi trường (xem thêm phần sau) và cơ chất của Cyt-P450 Cơ chất có tác dụng làm tăng ái lực của CPR đối với Cyt-P450, điều đó có nghĩa là CPR

sẽ có ái lực mạnh với phức hợp Cyt-P450 - cơ chất hơn là với phân tử Cyt- P450 không mang cơ chất [43J, [70J, [74J, [78J

b Cytochrom b5

Cytochrom b5 được tìm ra bởi Chance và Williams vào năm 1954 Đó là một hemoprotein có mặt trong hầu hết các tế bào sinh vật, tham gia vào quá trình oxy hoá của cơ thể Trong tế bào Cytochrom b5 được gắn vào màng microsom và có chức năng vận chuyển điện tử giữa NADH và phân tử 0 2 trong microsom Người ta cho rằng, protein của Cytochrom b5 được cài sâu

vào bề mặt của lưới nội sinh chất nhẵn, không tập hợp lại thành từng cục mà phân bố ngẫu nhiên ở trong màng.

Trong hệ thống enzym Cyt-P450 Cytochrom b5 đảm nhận việc chuyển điện tử (e) thứ 2 từ NADH đến đến phức hợp RH-Cyt-P450(Fe2+- 0 2) làm cho phân tử oxy chuyển sang dạng hoạt động là anion superoxyd (Oo ) (hình 1.3)[1], [20], [43]

I.2.3.2 Phospholipid

Phospholipid là cấu tử thứ 3 cần thiết của hệ thống enzym oxy hoá phụ thuộc Cyt- P450 Trong lưới nội sinh chất của tế bào gan, hàm lượng phospholipid chiếm khoảng 30-35% trọng lượng khô

Đối với hệ thống Cyt-P450, phospholipid có vai trò sau:

- Thứ nhất: Sự có mặt của phospholipid có tác dụng tập trung, thu hút các cơ chất tan trong lipid làm cho nồng độ cơ chất xung quanh Cyt-P450 tăng cao tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành phức hợp enzym-cơ chất, khởi đầu quá trình hoạt động của Cyt-P450

- Thứ hai: Phospholipid rất cần thiết cho sự vận chuyển điện tử (e) từ NAPDH đến nhân Hem của Cyt-P450 (Strobel và cộng sự 1970) do nó làm Lãng ái lực của CPR (chất vận chuyển điện tử) với Cyt-P450 (Coon et al, 1976) [1], [20], [43]

1.2.4 Hiện tượng cảm ứng và ức chê Cyt- P450 - ý nghĩa lâm sàng.

I.2.4.I Cảm ứng Cyt- P450

a Khái niệm.

Hiện tượng cảm ứng enzym được Gelhrter (1979) định nghĩa là hiện tượng tăng số lượng các phân tử của một loại enzym nhất định hoặc do tăng tốc độ tổng hợp hay giảm tốc độ phân hủy của enzym đó [30]

Đối với hệ enzym Cyt- P450, khi gây cảm ứng bằng phenobarbilal hay các thuốc khác, người ta thấy có sự tăng tổng hợp protein enzym màng nội bào, phospholipid, hem, RNA phụ thuộc DNA và mRNA đặc hiệu [30], [68]

Quá trình cảm ứng là quá trình đòi hỏi phải có thời gian Khoảng thời gian xuất hiện cảm ứng thay đổi tuỳ theo loại chất gây ra cảm ứng đó Ví dụ rifampicin gây cảm ứng đối với CYP 3A4, 1A2 và 2C trong vòng 24 giờ trong khi đó phenobarbital phải mất đến một tuần mới có thể gây ra các dấu hiệu cảm ứng rõ ràng [79].

b Cơ chê

Rất nhiều các nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ cơ chế phân

tử của hiện tượng cảm ứng Phần lớn các kết quả đã chỉ ra rằng: các chất gây cảm ứng enzym bằng cách tác động dến quá trình tổng hợp protein ở giai đoạn sao mã (transcription) thực hiện trong nhân của tế bào [46], [66], [79] Tác động này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ của các receptor nhân (nuclear receptor) Cơ chế cảm ứng CYP 1A1 với sự tham gia của Aryl hydrocarbon receptor (AhR) có thể là một ví dụ điển hình

Sau khi xâm nhập vào tế bào, chất cảm ứng gắn vào phức AhR-Hsp 90 làm cho Hsp 90 tách ra tạo thành phức hợp mới: chất cảm ứng- AliR Phức hợp này kết hợp với một enzym có tên là aryl hydrocarbon receptor nuclear transferase (ARNT) nhờ tác dụng của Proteinkinase c và được enzym này vận

chuyển vào trong nhân của tế bào Ớ đó, phức hợp hoạt động vừa được tạo thành tương tác với ADN, tạo điều kiện cho enzym ARN- polymerase gan vào, khởi phát quá trình sao chép để tạo ra mRNA của CYP1A1 [41] Ngày nay, ngoài receptor Ah người ta còn biết đến các receptor khác tham gia quá trình cảm ứng Cyt-P450 như: constitutive androstane receptor (CAR), pregnane X receptor (PXR), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) [66], [71].

Bảng 1.4 Một sô chất gây cảm ứng Cyt-P450 thường gặp trên lâm sàng

Chất gây cảm ứng Loại Cyt-P450 bị

I.2.4.2 ứ c chế Cyt- P450

a Khái niệm

ức chế là hiện tượng enzym bị giảm hoặc mất hoạt tính xúc tác dưới tác dụng của một số chất Khác với hiện tượng cảm ứng, hiện tượng ức chế thường xảy ra ngay sau khi chất gây ức chế tiếp xúc với enzym [ 19], [79],

b Cơ chê

Các chất ức chế hệ Cyt- P450 theo nhiều cách khác nhau nhưng nhìn chung được xếp vào hai loại chính là: ức chế thuận nghịch và ức chế không thuận nghịch [3], [19], [30], [71], [79]

ức chế thuận nghịch là loại ức chế xảy ra khi có sự cạnh tranh giữa chất

ức chế và cơ chất để gắn được vào trung tâm hoạt động của Cyt-P450 Nhân Hem là một trong những “đích” để các chất ức chế tác động vì đó là "trung tâm oxy hoá” của Cyt-P450 Các chất có cặp điện tử tự do như những hợp chất

dị vòng do có thể liên kết với nhân Hem bằng liên kết tĩnh điện, được xem là

“những ứng cử viên” để trở thành chất ức chế Cyt-P450 Ví dụ, cimetidin có khả năng ức chế hoạt động của CYP 3A4 và 2D6 do trong phân tử chứa nhóm imidazol (dị vòng chứa nitơ) có khả năng tạo liên kết chặt chẽ với nhân Hcm của hai loại CYP này Một điểm đáng chú ý là cấu trúc dị vòng lại xuất hiện trong phân tử của đa số các thuốc được sử dụng hiện nay với vai trò là yếu tố quyết định hoạt tính sinh học của chúng, ức chế thuận nghịch hệ Cyt-P450 vì thế là loại ức chế thường gặp trên lâm sàng Bên cạnh tương tác tại nhân Hem, các tương tác không gian giữa phân tử chất ức chế và Cyt-P450 cũng liên quan đến khả năng ức chế của một chất Ví dụ: Ketoconazol có khả năng ức chế CYP3A4 mạnh hơn cimetidin (mặc dù chúng đều là những hợp chất có chứa nhân imidazol) do ketoconazol có tính thân mỡ hơn nên bằng lực kỵ nước lớn hơn nó liên kết chặt chẽ hơn với Cyt-P450 Mặt khác, cấu trúc không gian cũng quyết định tính đặc hiệu với Cyt-P450 của một chất ức chế Ví dụ, cùng chứa nhóm imidazol trong phân tử nhưng cimetidin có ái lực mạnh vỏ'i CYP3A4 còn omeprazol thì lại có khả năng ức chế CYP 2C19

Khác với ức chế thuận nghịch trong đó có sự cạnh tranh giữa cơ chất và chất ức chế, ức chế không thuận nghịch xảy ra do chính các sản phẩm có hoạt tính của phản ứng mà Cyt-P450 xúc tác Có hai loại ức chế không thuận nghịch Loại thứ nhất, sản phẩm của phản ứng có khả năng liên kết khá bền vững với Cyt- P450 tạo thành phức hợp trung gian không còn hoạt tính xúc tác Ví dụ: Erythromycin có khả năng ức chế không thuận nghịch CYP 3A4

do bị chuyển hóa thành một hợp chất có nhóm nitroso có khả năng gắn chặt vào nhân Hem của enzym này tạo phức hợp không còn hoạt tính Loại thứ hai, sản phẩm của phản ứng có khả năng thay đổi cấu trúc ở phần Hem hoặc phần protein hoặc cả phần phần Hem và phần protein của Cyt-P450 làm mất khả năng xúc tác của enzym này Ví dụ: ethinylestradiol làm biến đổi cấu trúc nhân Hem của CYP3A4; chloramphenicol làm biến đổi gốc lysine trong trung tâm hoạt động của CYP2C9 còn spironolacton thì tạo thành chất chuyến hoá

có khả năng liên kết đồng hoá trị với cả nhân Hem lẫn phần protein của Cyt- P450

Ngoài hai kiểu ức chế trên, một số thuốc còn có khả năng ức chế Cyt- P450 do chúng phá hủy phân tử (Carbontetraclorid, cyclophosphamid) hay tác động đến quá trình tổng hợp của enzym này (Cobalt chlorid ảnh hưởng đến quá trình tạo phần Hem của Cyt-P450)

c Các chất gây ức chê

Các thuốc gây ức chế enzym thường gặp trong lâm sàng là: Allopurinol, amiodarone (3A4, 2D6), cimetiđin (1A2, 2C9, 2D6, 3A4) ciprofloxacin (1A2), clarithromycin (1A2, 3A4), chloramphenicol (2C9), dicumarol, erythromycin (1A2, 3A4), fluvastatin (2C9), furaphyllin (1A2), haloperidol (2D6), IMAO, isoniazid (1A2, 2C9), josamycin, ketoconazol (1A2, 2C9, 3A4), metronidazol (3A4), nofloxacin (1A2, 3A4), omeprazol (1A2, 2C19, 3A4), perfloxacin (1A2), quinin (3A4), quinidin (2D6), ritonavir (2D6, 3A4), troleandomycin (3A4) .[11], [30), [51], [54]

I.2.4.3 Ý nghĩa trong lâm sàng.

Cyt-P450 đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá của hầu hết các thuốc do đó mọi tác động lên hệ thống enzym này đù là ức chê hay cảm ứng đều có ảnh hưởng đến tác dụng cũng như độc tính của thuốc Các chất cảm ứng hay ức chế hệ Cyt-P450 có thể làm thay đổi lượng thuốc qua gan, như vậy, thay đổi sinh khả dụng của các thuốc dùng kèm nếu những thuốc này là cơ chất của hệ Cyt-P450: hoặc làm giảm nồng độ dẫn đến giảm hay mất tác dụng hoặc ngược lại làm tăng nồng độ dẫn đến tăng độc tính, tăng các tác dụng phụ Đây chính là nguyên nhân của nhiều tương tác ở giai đoạn chuyển hoá khi phối hợp hai hay nhiều thuốc trong điều trị Theo những thống

kê gần đây, số lượng tương tác thuốc có liên quan đến Cyt-P450 được phát hiện trên lâm sàng đã lên tới con số hàng trăm, trong đó có nhiều tương tác gây hậu quả nghiêm trọng [54]

Trong lâm sàng, các thuốc có hệ số chiết xuất qua gan nhỏ (E<0,3) rất nhạy cảm với hiện tượng ức chế hoặc cảm ứng men gan Đặc biệt nếu những thuốc này lại có phạm vi điều trị hẹp (Ví dụ: hormon (thyroid, corticoid, estrogen ), thuốc chống động kinh, thuốc chống đông máu dạng uống, thuốc

hạ đường huyết, thuốc tim mạch, thuốc chống ung thư ) thì rất cần phải lưu ý khi phối hợp với các chất có khả năng cảm ứng hay ức chế Cyt-P450 Il l ], [54]

Bảng 1.5 Một sô ví dụ điển hình về tương tác thuốc liên quan đến Cyt-P450

ứ c c h ế các Cyt- P450 chuyển hoá thuốc

N guy cơ quá liều theophylin, đặc biệt nguy hiểm với trẻ

N ước bưởi N ifedipin,

V erapam il

Úc c h ế C Y P 3A 4 chuyển hoá thuốc

Tăng tác dụ n g phụ của thuốc: tụt huyết

áp, tăng nhịp tim Phenobarbital,

carb am azep in , phenytoin,

rifam p icin ,

E strogen (trong thuốc tránh thai)

C ảm ứng CY P 3A 4 chuyển hoá estrogen

M ất tác dụng tránh thai - » có thai ngoài

ý m uốn

cisapride

ứ c c h ế C Y P 3A 4 chuyển hoá

T efenadin, cisapride

1A2 chuyển hoá theophylin

G iảm nồng độ

th eo p h y lin trong

m áu —» giảm tác dụng

chuyển hoá phenytoin

K éo dài thời gian bán thải của

d iaz e p a m -> tăng tác dụng phụ của diazepam

2C chuyển hoá phenytoin

M ất tác dụng chông trầm cảm

chuyển hoá phenytoin

TC A

T ăng cao nồng độ thuốc trong m áu —» ngộ độc

2D 6 chuyển hoá

M ethadone

M ất tác dụng của

m eth ad o n e —» xuất hiện các triệu chứng

“cai n g h iện ”