Góp phần nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain

Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm.. Từ những nguyên nhân trên, ngưòi ta hướng đến tìm kiếm các thuốc chống viêm được chế tạo

BỘ G IÁ O DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T Ế

TRƯỜNG ĐẠI H Ọ C Dược HÀ NỘI

Q c A m ơ q í

T ô i xin bày tỏ lòng biết ơn sầu sắc tới ^?íạtíựềềt (^UÔM người thày đ ã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này.

T ôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, các thày giáo, cô giáo trường

Đ ại học D ược H à N ội, đặc biệt các thày giáo, cô giáo, các cô kỹ thuật viên Bộ m ôn H oá sinh - V i sinh, các anh, chị, bạn bè đồng nghiệp đ ã động viên, giúp đ ỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian học tập và thực hiện

đ ề tài.

H à N ội, ngày 29 tháng 12 năm 1999

( ĩ) ũ 'T õềttg c  n h

M ỤC LỤC

Trang

2.3 Một số dược liệu có tác dụng chống viêm 18

M ỤC LỤC

Trang

2.3 Một số dược liệu có tác dụng chống viêm 18

Viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưcmg xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của ngưòi bệnh,

Vì vậy, việc phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng

Để đáp ứng được yêu cầu đó, ngưòi ta đã nghiên cứu ra nhiều loại thuốc chống viêm như thuốc có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID) Các thuốc này đa phần có nguồn gốc hoá dược, đã được sử dụng từ nhiều năm nay Bên cạnh tác dụng tốt, chúng vẫn chứa đựng những yếu tố bất lọi đối vói cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, kích ứng đưòfng tiêu hoá, ảnh hưởng tód quá trình đông máu, tạo máu

Từ những nguyên nhân trên, ngưòi ta hướng đến tìm kiếm các thuốc chống viêm được chế tạo từ những chất gần gũi với cơ thể con người, và các thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease (papain, a - chymotrypsin ), đã ra đời Tuy nhiên, hiện nay số lượng thuốc chống viêm có nguồn gốc enzym ở Việt Nam còn ít, phần lớn đều do nước ngoài sản xuất, Trong khi đó, nước ta lại có nhiều nguồn nguyên liệu, nhất là dược liệu, có thể tách chiết được các enzym để sử dụng, ví dụ papain có trong nhựa đu đủ Đây

là một điều kiện thuận lọi để chúng ta có thể tự sản xuất các loại thuốc chống viêm có chứa enzym, góp phần làm giảm giá thành của thuốc và không phải nhập của nước ngoài

Trước đây, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về papain nhưng chủ yếu tập trung vào khía cạnh trợ giúp tiêu hoá mà chưa quan tâm

PH Ầ N 1 Đ Ặ T VẤN ĐỂ

tìm hiểu tác dụng chống viêm Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Góp phần nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain”.

Đề tài này nhằm một số mục tiêu sau đây:

© Sơ bộ theo dõi tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain khi dùng trong và bôi ngoài da

® Thử kết hợp tác dụng chống viêm của papain và một vài dược liệu chống viêm khác

® Theo dõi sự biến đổi của một vài chỉ số hoá sinh trong quá trình viêm, dưới tác dụng của chế phẩm chứa papain

Giới hạn phạm vi đề tài:

- Thuật ngữ “chế phẩm” sử dụng trong đề tài này không dùng để chỉ một dạng thuốc hoàn chỉnh mà dùng để chỉ một dạng pha chế đơn giản phục vụ cho quá trình nghiên cứu

- Thuật ngữ “papain” được sử dụng theo nghĩa rộng để chỉ các enzym có trong nhựa đu đủ mà thành phần chính là papain

2.1 Tổng quan lý thuyết về viêm.

Theo Ado (1973), viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu, tổ chức liên kết và hệ thần kinh đối với tác nhân gây bệnh và có liên hệ với tính phản ứng của cơ thể,

Theo Vũ Triệu An, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền tảng

là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần trong quá trình tiến hoá của sinh vật [2, 62]

Trong Từ điển Bách khoa Dược học định nghĩa: Viêm là một phản ứng tại chỗ của cơ thể, do các mô bị kích thích hoặc thương tổn Đó là một phản

ứng phức tạp của các mô liên kết và của tuần hoàn mao mạch ở nơi bị tác

động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức phận [15, 630]

2.1.1 Nguyên nhân gây viêm: [2, 62], [10, 6-8]

Có nhiều nguyên nhân gây viêm, có thể chia thành hai nhóm như sau:2.1.1.1 Nguyên nhân bên ngoài:

- Sinh vật: do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng

- Vật lý: cơ học (đụng dập, chấn thương), nhiệt (bỏng nóng hoặc bỏng lạnh),bức xạ ion

- Hoá học: các chất hòa tan gây hoại tử tế bào như các dung dịch hoá chất (acid, kiềm, muối ) hoặc các chất đặc gây thực bào của bạch cầu

2.1.1.2 Nguyên nhân bên trong:

Các nguyên nhân bên trong có thể gặp như hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch), do phản ứng kháng nguyên — kháng thể

Tuy nhiên, rất khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân gây viêm như trên vì trong thực tế, các nguyên nhân bên ngoài thường kèm theo các biến đổi

PH Ầ N 2 TỔ NG Q UAN

trong cơ thể và từ đó lại tạo ra các nguyên nhân bên trong.

2.1.2 Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm:

Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau

2.1.2.1 Các phản ứng chính tại ổ viêm:

Tại ổ viêm, có hai loại phản ứng chính xảy ra: [2, 62], [10, 49-80], [24,

1-31

a ) Phản ứng tuần hoàn;

Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thưcttig và phát ưiển ở mức độ

khác nhau, phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo một trình

tự sau:

a/ Co mạch chdfp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay sau khi có tác

nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn bị kích thích Tiếp sau đó có hiện tượng giãn mạch Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu tới làm nhiệm vụ bảo vệ Nguyên nhân của hiện tượng giãn mạch là do ba yếu

tố chính:

+ Hưng phấn thần kinh giãn mạch ở vùng động mạch và tiểu động mạch.

+ Do tác động của các yếu tố tìiể dịch có mặt tại ổ viêm như histamin, bradykinin, leucotrien gây co tế bào nội mô; hoặc các cytokin (IL-1, TNF, ĨNF-y .) gây nên sự tái tổ chức cấu trúc bộ xưofng tế bào, dẫn đến hình thành những vùng nối gian bào rộng, những lỗ hổng giữa các tế bào

+ Các sợi liên kết ở vùng mao mạch bị tổn thưong do một số enzym nội bào

có thể phá huỷ norepinephrine, là chất cần thiết để duy trì trương lực mao mạch (Norepinephrine thường tìm thấy ở khoảng gian bào),

b/ Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn tới các rối loạn nghiêm ưọng như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành

mạch làm thoát địch ri viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản Do sự chèn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố mạch máu như liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của máu gây ớ máu làm mất tuần hoàn từ đông mạch sang tĩnh mạch, thiếu ôxi gây rối loạn chuyển hoá nghiêm ưọng, tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm sàng là phù và đau).

P) Phản ứng tế bào;

Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể chống viêm và trong phản ứng này, bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất Do tốc độ tuần hoàn chậm lại, các bạch cẩu, chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính dạt vào thành mạch, bám vào nội mô rồi dừng lại tại một điểm, gọi là vách tụ bạch cầu Dưới tác dụng của các chất trung gian hoá học như IL-1, TNF và nội độc tố, bạch cầu và tế bào nội mô bộc lộ hai loại phân tử dính ưên

bề mặt là selectin, integrin Nhờ đó, khả năng dính của bạch cầu với tế bào nội

mô tăng lên rõ rệt

Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mồ, luồn những chân giả vào khe hở giữa các tế bào nội mô Chúng xuyên qua vùng nối đã giãn rộng giữa các tế bào nội mồ để xen vào giữa tế bào nội mô và màng đáy, và từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch Hiện tượng xảy ra dưới tác đụng của một số chất hoá ứng động (nên gọi là hiện tượng hoá ứng động bach cầu): các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có aciđ amin tận cùng là N-formyl-methionin ), các thành phần của hệ thống bổ tíiể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b, 6, 7), các sản phẩm chuyển hoá của acid arachidonic theo đưòfng lipogenase hoá (đặc biệt là leucotrien B4), các cytokin, các mảnh vụn sợi tạo keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào, tơ huyết

và các sản phẩm phân huỷ của tơ huyết [10, 61-67]

Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng thực bào của chúng tăng lên rõ rệt

Trước tiên, các tiểu phần bị thực bào dính vào bề mặt của bạch cầu nhờ

sự nhận biết của bạch cầu Các bạch cầu và đại thực bào có thể dính trực tiếp với tác nhân nhiễm trùng hoặc các mảnh tế bào bị phân hủy nhờ ái lực hoá học giữa hai bề mặt Tuy nhiên, phần ldfn các vi sinh vật không bị nhận biết mà chúng chỉ gắn với các receptor đặc biệt trên bể mặt bạch cầu khi bị bao bọc bỏd các yếu tố gọi là opsonin Có hai opsonin chính: Thứ nhất là đoạn Fc của phân tử IgG (bị bộc lộ khi IgG gắn với kháng nguyên đặc hiệu) sẽ dính với receptor FcyR trên màng bạch cầu Thứ hai là thành phần C3b và thành phần

ổn định của nó là C3bi (được sinh ra do hoạt hoá bổ thể bởi cơ chế miễn dịch

và không miễn dịch) sẽ gắn với các receptor 1, 2, 3 của bổ thể (C R l, 2, 3) [10, 68-691

Sau khi dính với đối tượng thực bào, bào tucfng tạo thành một màn bao vây quanh đối tượng rồi dần đần nuốt đối tượng ứiực bào Khi đó, có thể có các khả năng sau xảy ra: [2, 66], [10, 70-75]

+ Đối tượng thực bào bị tiêu đi bỏfi lysosom: Khi các vi khuẩn bị thực bào, chúng tập trung ở Ichông bào và gắn với màng bào tương tạo thành thể phagosom Màng của ứiể phagosom sát nhập với màng bào tương của các hạt lysosom tạo thành thể phagolysom Thành phần của các hạt lysosom đổ vào phagolysom khiến cho phagolysom chứa nhiều hydrolase của các hạt ưa acid, (trong quá trình này, bạch cầu đa nhân mất hạt dần dẩn) Các hydrolase phân hủy vỉ trùng, đồng thời tiêu hủy cả tế bào thực bào

+ Đối tượng thực bào có thể tồn tại lâu trong tế bào như bụi than trong thực bào ở phổi (gây bệnh bụi than)

+ Đối tượng ứiực bào tồn tại trong thực bào và theo thực bào đi nơi khác gây

ra những ổ viêm mới (như trong bệnh lao mãn tính) Nếu các vi khuẩn tồn tại theo cách này, chúng sẽ được bao bọc để chống lại tác động của các thuốc kháng khuẩn và các cơ chế để kháng khác

+ Đối tượng thực bào có thể bị nhả ra mà thực bào không chết

+ Đối tưọíng thực bào cũng có thể đủ độc để làm chết thực bào (như vi khuẩn lao, liên cầu khuẩn) Khi đó, chúng sẽ làm giải phóng các sản phẩm của bạch cầu ra ngoài tế bào, trong đó có các men lysosom, các chất chuyển hoá hoạt tính dẫn xuất oxy, các sản phẩm chuyển hoá của aciđ arachidonic (như prostaglandin, leucotrien) Các chất này sẽ góp phần gây tổn thương mô, khuếch đại hậu quả của những kích thích viêm ban đẩu và làm kéo dài phản ứng viêm.

2.1.2.2 Các phản ứng hệ tìiống và sự thay đổi của các chỉ số hoá sinh:

Sau khi hiện tượng viêm xảy ra, toàn thân sẽ có những biến đổi Sớm nhất là các rối loạn thần kinh như mỏi mệt, mất ngủ rồi đến các rối loạn khác

về thân nhiệt, tuần hoàn, tiêu hoá Nhiệt độ cơ thể táng, nhất là khi viêm có kèm theo nhiễm trùng Đặc biệt đáng chú ý là sự thay đổi về các chỉ số của mấu:

- Tăng bạch cầu là hiện tượng phổ biến của phản ứng viêm, đặc biệt là viêm

do nhiễm trùng Bạch cầu thường tàng tới 15000 — 20000 trong Iml máu nhưng cũng có khi còn tăng cao hofii Phần lớn các trường hợp viêm là tăng bạch cầu đa nhân trung tính, tăng các lympho bào [10, 121], [22, 28'

- Tốc độ máu lắng tăng

- Ngoài sự biến đổi về mặt tế bào còn có sự thay đổi các chỉ số hoá sinh của máu Rõ rệt nhất là sự thay đổi các thành phần protein huyết thanh Trong các trường hợp viêm, người ta thấy có sự tăng cua jRbrinogen, tăng protein c phản ứng, giảm albumin, tàng globulin (cả a , p, và y) của huyết thanh, từ đó dẫn đến tỷ số A/G giảm [1, 329-330], [17, 27-401

- Các glucoprotein tăng, (trong đó có cả a 1 và a 2-gỉucoprotein) Trong a j - glucoprotein có seromucoid a j (còn gọi là oromucoid), có trọng lượng phân tử ứiấp (44000), hoà tan trong acid pechloric Seromucoid có chứa 17% galactose

— mannose, 11,5% glucosamin, 10% acid siaiic Điện đi ở pH 3,9, nó tách ra

khỏi toàn bộ glucoprotein Trong quá trình viêm, hàm lượng của seromucoid

táng lên đáng kể [7, 860], [17, 347], [22, 28], [37, 298-300].

- Các mucoprotein tăng [22, 28]

- Đối với các nguyên tố vi lượng trong huyết thanh ứiì có sự tăng của sắt, giảm

đồng [ 22 , 28]

2.J.3 Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm:

Trong phản ứng viêm có sự tham gia của rất nhiều chất trung gian hoá học Các chất này được giải phóng ra ngay khi có tác động ban đầu của viêm

và trong suốt quá ưlnh viêm, duy trì và khuếch đại phản ứng viêm Chúng có nguồn gốc khác nhau như từ huyết tương, tế bào hay tổn thucfng mô Các chất trung gian hoá học gồm có:

2.1.3.1 Các amin hoạt mạch: [10, 82-84]

- Histamin, được giải phóng do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích: tổn thương vật lý (chấn thucfng, bỏng), phản ứng miễn dịch gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các độc tố gây phản

vệ (C3a và C5a), các protein làm giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, các neuropeptid, các cytokin (IL-1, IL-8) Histamin gây giãn các tiểu động mạch và gây tăng tính thấm của các tiểu tĩnh mạch

- Serotonin được giải phóng từ các tiểu cầu bị kích thích khi chúng kết dính sau khi tiếp xúc với sợi tạo keo, ADP, phức hợp kháng nguyên — kháng thể, hoặc do yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF) có nguồn gốc từ các dưỡng bào trong các phản ứng đo tác động trung gian của IgE, Serotonin có tác động tương tự như histamin

2.1.3.2 Các protease của huyết tưoíng; [10, 84-87], [24]

- Hệ thống bổ thể, trong đó đáng chú ý là các thành phần C3a và C5a làm tăng tính t h ^ tíiành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin từ các dưỡng bào C5a cũng hoạt hoá đường chuyển hoá lipoxygenase của acid

arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đcfn nhân, gây giải

phóng tiếp các chất trung gian hoá học của viêm C5a còn là tác nhân hoá ứng

động mạnh đối vói bạch cầu.

- Bradykìnin, một chất gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch, được giải phóng từ a 2'globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá dưới tác dụng của yếu tố Hageman (yếu tố XII của đưcmg đông máu nội sinh) hoạt hoá

- Hệ thống đông và tiêu tơ huyết: Hệ thống đông máu là một loạt những protein huyết tương có thể bị hoạt hoá bởi yếu tố Hageman Bước cuối cùng là

sự chuyển fibrinogen thành fibrin do tác động của tìirombin, Trong quá trình này có sự hình thành các fibrinopeptid, gây tăng tính ứiấm thành mạch và có hoạt tính hoá ứng động đối với bạch cầu

Có thể sơ đồ hoá sự hình thành của các amin hoạt mạch và các protease huyết tưofng trong quá trình viém như sau:

ịKallikrein(XII ^ Xlla)

Hình 1 Sơ đồ quá trình hình thành của một số chất trung gian hoá học trong

quá trình viêm [38, 78]

2.1.3.3 Các chất chuyển hoá của acid arachidonic: [10, 87-89], [20]

Các chất chuyển hoá của acid arachidonic như prostaglandin, prostacyclin, thromboxan (chuyển hoá theo đường cyclooxygenase), leucotrien (chuyển hoá theo đưòmg lipoxygenase) Acid arachidonic là một thành phần bình thưòíng của màng lipid và được giải phóng do tác động của phospholipase A2 Các chất chuyển hoá của nó như prostacyclin và thromboxan đóng vai trò quan trọng trong điều hoà đông máu Trong viêm, prostaglandin E2 làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác làm tăng tính thấm thành mạch và gây đau Chất này có hiệu quả chống viêm

do làm tăng AMP vòng và ức chế chức năng hiệu ứng của tế bào viêm Còn các leucotrien là các chất trung gian tiền viêm mạnh, có tác dụng hoá ứng động bạch cầu

2.13.4 Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF): [10, 89-91], [38, 78-79]

PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng, được sinh ra sau khi hoạt hoấ phospholipase A2 và thưòng được giải phóng đồng thời vói các chất chuyển hoá của acid arachidonic Nhiều loại tế bào có khả nàng tổng họfp PAF như bạch cầu đa nhân, đại thực bào, dưỡng bào, tiểu cẩu, tế bào nội mô, tế bào biểu mô PAF hoạt hoá mạnh bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính

và xuyên mạch của bạch cáu, giải phóng các men của thể tiêu, sinh oxy phản ứng và các eicosanoid; gây hoạt hoá và kết dính tiểu cầu

2.13.5 Các cytokin: [10, 96-102], [38, 79-80]

Các cytokin do nhiều loại tế bào sản xuất ra (chủ yếu là lympho bào và đại thực bào bị hoạt hoá), tham gia vào các phản ứng miễn dịch tế bào và cũng giữ vai trò quan trọng trong phản ứng viêm Các cytokin chính gồm yếu tố hoại tử khối u (TNF a và |3) và các interleukin (IL-1, IL-6, TNF, IL“l,IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống, một số phản ứng có ứiể trở thành mãn tính Tại chỗ, chúng làm hoạt hoá nội mô, tăng tổng hợp các phần tử dính của tế bào nội mô Chúng còn gây sốt, làm tăng lượng

bạch cầu đa nhân trung tính, tăng sinh nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen Còn IL-8 là một tác nhân hoá ứng động và hoạt hoá mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác, chủ yếu là TNF và IL -1.

2.Ỉ.4 Vai trò của viêm, và một s ố cơ c h ế tác dụng của các thuốc chống viêm:

Từ các thông tin trên cho thấy, nhìn chung, viêm là một phản ứ ig bảo

vệ của cơ thể vì viêm làm tăng tuần hoàn tại chỗ, tăng chuyển hoá, tạo nhiều năng lưcmg cho phản ứ ig bảo vệ, tăng thực bào, ẩm bào, tăng sinh kháng thể, tâng nội tiết, tăng hoạt động của hệ liên võng nhằm loại trừ tác nhân gây viêm, kích thích quá trình hình thành sẹo Do đó, về nguyên tắc cần tôn trọng phản ứng viêm [2, 70]

Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ gây ảnh hưởng xấu cho cơ thể Các chất mới sinh có thể gây rối loạn chuyển hoá, tổn thưcíng tổ chức lan rộng, rối loạn nhiều chức phận của cơ tíiể, có khi nguy hiểm đến tính mạng của ngưòd bệnh Vì thế, trong những trường hợp viêm quá mức cần phải có tác động của thuốc chống viêm

Trên thế giới, các thuốc chống viêm đã được sử dụng từ lâu, kinh điển

là hai nhóm thuốc chống viêm steroid và phi steroid (ví dụ Aspirin, Paracetamol, Inđomethacin ) với cơ chế ức chế quá trình giải phóng aciđ arachidonic từ màng phospholipid do ức chế phospholipase A2 [15, 6321, [21 ];

ức chế cyclO'Oxygenase nên ngăn cản quá trình chuyển acid arachidonic thành

prostaglandin (các NSAID) hay ức chế 5-lipoxygenase nên ngăn cản quá trình chuyển acid aiachidonic thành các leucotrien [15, 631-632], [201

Hiên nay, trên cơ sở những hiểu bết mới về cơ sở phân tử của phản ứng viêm, người ta đang tập trung nghiên cứu các thuốc chống viêm mới nhằm vào một số cơ chế mới như sau: [20]

- Úc chế các protease kim loại ở khoảng gian bào

- ức chế các chất hoá ứng động và các cytokin

- úc chế các protein tyrosin kinase và các kinase nội bào khác.

- Úc chế phosphodiesterase

- Điều hoà các receptor của nhân tế bào

2 . 2 Tổng quan về enzym chống viêm.

2.2.ỉ Sơ ỉược vê các enzym chống viêm:

Các thuốc chống viêm hoá dược, bên cạnh khả năng chống viêm, còn chứa đựng nhiều tác dụng phụ như gây loét dạ dày, dễ làm chảy máu Vì vậy, trên thế giới, người ta đang hưóíng đến sử đụng các enzym có tác dụng chống viêm như trypsin, a - chymotrypsin, serratiopeptidase, amylase, papain Các enzym này có ưu điểm là tương đối gần gũi với cơ thể con người nên đã phần nào giúp tránh được những tác dụng không mong muốn Các enzym này giúp tiêu hủy các mảnh vụn tế bào, fibrin và các protein huyết tưcfng kết tập tại vùng bị tổn ửiương, đồng ửiời với việc kích ửiích hiện tượng thực bào Từ đó, chúng giúp giảm nhanh phù viêm và cải thiện sự lưu thông máu Tuần hoàn mao mạch được phục hồi sẽ đảm bảo cung cấp đủ oxy và dinh dưõíig cho vùng mô bị tổn thương Bên cạnh đó, các enzym này còn giúp điều hoà các chất trung gian hoá học của viêm như protein pha cấp, các cytokin, các receptor kết dính giảm khả nãng hoạt hoá hệ thông bổ ứiể của các phức hợp miễn dịch màng tế bào, làm giảm sự nguy hiểm của các phản ứng quá mức Sự phục hồi nhanh chóng các điều kiện chuyển hóa sinh lý đó đã giúp cho việc cải thiện hàng rào bảo vệ miễn dịch và phục hồi nhanh chóng mô tổn thưoíng Trong quá trình này, khác với các chất chông viêm có nguồn gốc hoá dược, các enzym tác động một cách sinh lý và không cho thấy bất cứ tác dụng bất lợi nào đối với hệ miẻn dịch [25, 121-123J

Nhờ những đặc tính trên, các enzym ngày càng được sử dụng nhiều trong điều trị chấn thương hoặc phòng chấn thưcíng trong thể thao, hoặc dùng điều trị hỗ trợ trong các trường hợp viêm Hiện nay, nhiều hãng dược phẩm đã

đưa ra thị trường những loại thuốc chống viêm có chứa các enzym Ví dụ, chế phẩm Danzen của hãng Takeda có hoạt chất là serratiopeptidase, có tác dụng chống viêm và phù nề Seưatiopeptidase có khả nâng thuỷ phân bradykinin, phân huỷ fibrin và fibrinogen, làm tiêu mủ và đờm [28, 230] Hãng Sanofi pharma đưa ra chế phẩm Alphachymotrypsine choay có chứa a - chymotrypsin a - chymotrypsin là một enzym tách từ tuyến tụy, có tác dụng phân giải protein, dùng trong chỉ định chống viêm và phù nề do chấn tíiưcíng hoặc sau phẫu thuật [15, 1381, [27, 16901, [28, 32] Biệt dược Alphintem của hãng Leurquin Mediolanum có trong thành phần hai enzym là trypsin và chymotrypsin, có tác dụng ức chế giai đoạn tiết địch ri viêm của quá trình viêm [28, 33] Một enzym khác cũng có khả năng chống viêm và phù nể là a - amylase cũng được hãng Sanofi pharma sử dụng làm dược chất chính trong hai sản phẩm Maxilase và Maxilase — Bacitracine [16, 299-300]

2.2.2 Giới thiệu về papain:

2.2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo và tính chất;

Papain được lấy từ nhựa cây đu đủ Carica papaya L Papayaceae [8, 360], [15,472-473] Người ta thưòíng dùng danh từ papain để chỉ một hỗn hợp enzym, trong đó, ngoài thành phần chính là papain còn có một số thành phần khác với hàm lượng ít hcfn nhiều như chymopapain, lysozym, peptidase A, lipase [26,402], [34, 1154]

Papain CÓ ký hiệu là E c 3.4.22.2 trong hệ thống phân loại enzym [25, 11] Papain ỏ dạng kết tinh hay bột có màu trắng hơi vàng, dễ tan trong nước

và glycerin, khồng tan trong phần lổfn các dung môi hữu cơ Papain có phồn tử lượng 23400 [15, 473] (còn nếu coi papain là một hỗn hợp enzym thì phân tử lượng của nó vào khoảng 21000 - 23700 [26, 402]) Cấu trúc bậc 1 của nó

gồm 212 acid amin với trung tâm hoạt động là cystein ở vị trí 25 có mang

nhóm -SH Điểm đẳng điện của papain Ịà pHj = 8,75 Papain là một protease tương đối bền Nó ổn định và hoạt động ưong khoảng pH tưcfng đối rộng (3-

11), bền vững trong dung dịch trung tính Nó có thể chịu được nhiệt độ 7 0 °c ở

pH 7 trong 30 phút mà không mất hoạt tính, ở dạng bột, papain có thể chịu được nhiệt độ sấy khô tới 100°c trong 3 giờ Tuy nhiên, pH và nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của papain là ở pH 5 - 7, và nhiệt độ 60 - 70°c, íuỳ theo

từng loại cơ chất [26, 402], [34, 1154] (Cũng có tài liệu cho rằng à nhiệt độ

cao hcfn 90°c, papain sẽ mất tác dụng [8, 361])

Papain được hoạt hoá bởi các chất khử (ví dụ, thioglycolat, glutathion, cystein, sulfid, bisulfid, thiosulfat, cyanid), là nh&ig chất làm cho trung tâm hoạt động của papain ở dạng nhóm -SH Papain bị bất hoạt khi nhóm -SH bị oxy hóa, chuyển thành liên kết disulfua Các chất ức chế papain là các chất oxy hóa, các thuốc thử phản ứng với nhóm -SH (ví dụ như iodoacetat, iodoacetamid, meửiyl bromid, N-ethylmaleimid), các ion kim loại nặng (ví dụ,

và các muối thủy ngân hữu cơ Sự bất hoạt papain dưới tác đông của các kim loại nặng có tính thuận nghịch, nó được phục hồi khi có mặt EDTA và các chất khử (ví dụ như cystein) [26, 402-403^2.2.2.2 Tác dụng sinh học và dược lý của papain:

Papain làm mềm thịt ăn, làm trong đồ uống và làm mềm da Papain phân huỷ protein, đồng thời cũng được dùng làm xúc tác trong tổng hợp các chất angiotensin, dynorphin, enkaphalin, peptid [15,473

Papain có tác dụng chống viêm, chống phù Nó có khả năng tiêu huỷ

các mô chết mà không làm ảiih hưởng tới các mô xung quanh Tuy nhiên, ò

một số cá tìiể, papain có thể gây phản ứng dị ứng như làm ngứa, rộp khi dùng ngoài da hoặc gây viêm dạ dày khi dùng trong [26,403]

Papain có tác dụng trị giun đũa, giun kim, sán lợn, làm một số vi trùng Gram (-) và Gram (+) n g tag phát triển Papain còn có tác đụng làm đông sữa, tác dụng giảm độc đối với toxin và toxalbumin, alcaloid [8, 362], [26,403 J

Nhờ các tác dụng trên, trong y dược, người ta sử dụng papain làm thuốc

tẩy giun, trợ giúp tiêu hoá trong những trường hợp đầy bụng khó tiêu, viêm dạ dày — ruột Papain còn được sử dụng hỗ trợ trong các trường hợp viêm, phù sau phẫu thuật, sau chấn thương, nhiễm trùng và dị ứng Nó còn được sử dụng trong các loại kem dưỡng đa, kem đánh răng, trong chế phẩm làm sạch kính tiếp xúc mềm [26, 403J

2.2.2.3 Một số chế phẩm chống viêm chứa papain có ở Việt Nam;

- Liều đùng: Ngày đầu, dùng 4 lần/ ngày X 2 viên

Ngày sau, dùng 4 lần/ ngày X 1 viên

Dùng ít nhất 5 ngày liền

- CCĐ; Bệnh máu chậm đông, dùng phối hợp với thuốc chống đông

® Papaynol: [4, 1181]

- Dạng thuốc; Siro 80mg papain/ 20g

Viên nén, viên nhện 0 ,lg papain

- Tác dụng: Phân huỷ protein

- Chỉ định: Chậm tiêu, viêm dạ dày, ruột

- Liều dùng; Ngày 0,2 - 1,0g chia 2 - 3 lần vào ngay sau bữa ăn

CD Lysopaine (Boehringer Ingelheim); f ỉ 6, 347], [28, 548]

- Dạng thuốc: Viên ngậm, ống 24 viên

- Thành phần (cho 1 viên):

Lysozym chlorhydrat (26000 uFIP/ mg) 5mg

Tinh dầu bạc hà

- Tác dụng: Chống viêm, kháng khuẩn và kháng virus

- Q iỉ định: Các trường hợp viêm, nhiễm trùng ồ vùng miệng, hầu, thanh

quản, tưa lưỡi, viêm amidan; điều trị ưước và sau phẫu thuật thanh quản, rạch ap-xe, cắt amiđan, nhổ răng

- Liều dùng: 4-6 viên/ ngày, ngậm cho tan từ từ (không nhai hoặc nuốt)

- Chống chỉ định; Trẻ còn bú (đo có tinh dầu bạc hà)

2.3, Một sô được liệu có tác dụng chòng viêm:

Trong dân gian, từ lâu người ta đã biết đến và sử dụng nhiều dược liệu

có tác dụng chống viêm như ngưu tất, bồ công anh, Hên kiều, hoàng cầm Các dược liệu này cũng đã được nghiên cứu về thành phần hoá học, tác dụng dược lý, tác dụng sinh học

2.3.ỉ Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume Amaranthaceae) [3, 219-220],

- Công dụng: Nguxi tất được dùng để chữa thấp khófp, đau lưng, bế kinh, cao huyết áp, tăng cholesterol máu, vữa xơ động mạch, chẫh thưoíng tụ máu, viêm họng

2.3.2 Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georg Lamiaceae): 15, 560], [8,

- Bộ phận dùng là rễ phơi hay sấy khồ của cây hoàng cầm

- Thành phần hoá học: Trong rễ hoàng cầm có tinh dầu, các dẫn xuất củaílavon như baicalin Q iH igO ii, scutelarin (hay woogonin) C16H 12O 11 tanin

_ _ _ _ _ _ A _V _ , ^ _ A _ _ _ ^ ■

PHAN 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

3.1 Nguyên liệu

3.1.Ỉ Papain thô (nhựa đu đủ sấy khô tán bột), lấy từ quả cây đu đủ (Carica

papaya L Papayaceae) thu tại vườn Viện Rau quả, Gia Lâm, Hà Nội

Quả đu đủ xanh, còn ở ưên cây (chọn loại vừa, không già quá cũng không non quá), dùng gạc mềm lau sạch vỏ quả Dùng dao inox hoặc cật tre, nứa rạch nhẹ nhàng dọc theo quả (không rạch sâu quá) Các đưòmg rạch cách nhau khoảng 3 cm Nhựa đu đủ chảy ra được hứng vào cốc sạch, bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển Dàn mỏng nhựa ứiu được trên các khay tráng men, sấy ở nhiệt độ 50 - 6 0 °c cho khô, tiếp tục sấy ở 80®c đến khô hoàn toàn Nghiền nhỏ được bột papain thô Bảo quản trong lọ sạch, nút kín, đặt trong

lạnh tới khoảng 0 - 4 °c, tiếp tục đồng thể lần thứ 2 và thu lấy dịch trong như ồ

trên Các dịch trong được đem ly tâm lanh 1 hoặc 2 lần với tốc độ 10000 vòng/ phút, trong 30 phút ở nhiệt độ 4"C Dịch ly tâm thu được đem rót vào các bình nón thuỷ tinh sạch, dung tích 250 nil (các bình nón này đã được làm lạnh từ trước bằng cách để vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 30 phút) Lượng dịch trong mỗi bình chỉ dày khoảng 4 mm Để các bình nón qua đêm trong ngân đá

tủ lạnh ờ nhiệt độ khoảng -15°c Khỏd động máy đông khô để hệ thống làm lạnh và bcfm chân không hoạt động Khi đạt tới nhiệt độ và áp suất cần thiết,

lắp các bình nón vào máy và tiến hành đông khô liên tục trong 8 giờ, thu được các tinh thể xốp nhẹ, màu vàng nhạt Bảo quản papain đồng khô trong lọ sạch, nút kín, đặt trong bình hút ẩm Sơ đồ quá trình đó diễn ra như sau:

- Ngưu tất: Đạt tiêu chuẩn DĐVN [3, 219-220], [8,48-49] được sắc bằng nước

3 lần Các dịch sắc được gộp lại và cô bớt nước, còn lại dịch sắc tưcfng ứng vód 5g ngưu tất/ 50 ml

- Hoàng cầm: Đạt tiêu chuẩn làm thuốc [8, 311-314J, được sắc bằng nước 3 lần Các dịch sắc được gộp lại và cô bớt nước, còn lại dịch sắc tương ứng với 5g hoàng cầm/ 50 ml.

- Máy điện di Biometra

- Máy ly tâm thường Hettich zentrifugen EBA 12

- Máy ly tâm lạnh Biofuge 15R

- Máy đông khồ Jouan LP3

- Máy đo quang Trung Quốc 752

- Tủ lạnh

- Tủ sấy

“ Thiết bị điều nhiệt

- Dụng cụ thuỷ ngân có chia độ dùng đo thể

tích chân chuột (Hìiứi 3)

Nơi nhúng chân chuộtI Thang chia dộ

Cân chính xác 1,20 g casein cho vào cốc có mỏ đã đánh dấu s ả i vạch

100 ml Thêm dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5) vừa đủ 100 ml Đun cách thuỷ đến tan hoàn toàn, vừa đun vừa khuấy đều Bổ sung dung dịch đệm

cho vừa đủ 100 ml rồi lọc qua gạc thu lấy dung dịch (pH cuối cùng của dung dịch là 7,2) Dung dịch casein chỉ pha đủ dùng 1-2 ngày, bảo quản trong tủ lạnh Trước khi dùng phải lắc đều Tốt nhất sau khi pha xong dùng ngay.

3.4.3 Dung dịch acid tricloracetỉc 1,8%:

Acid tricloracetic 9,0gAcid acetic băng 19,5gNước cất vừa đủ 500,0ml

3.4.4 Dung dịch đệm phosphat 0,03M ịpH = 7,5)

Na2HPƠ4.12 H2O 10,7451 g

Nước cất vừa đủ 1000,0ml

3.4.5 Dung dịch acidpercỉoric (HCỈO 4 ) Ỉ , 8 M [18, 303J

3.4.6 Dung dịch acidphosphoĩungstic 5% trong acid clohydric 2N [18, 303] 3.4.7 Các hoá chất dùng tron^ điện £Íi.[18, 234-235]

3.5 Phương pháp nghiên cứu:

3.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng enzym:

3.5.1.L Phưcfng pháp định lưọng protein bằng phản ứng Biuret [18, 222-223]3.5.1.2 Phưcmg pháp xác định hoạt tính enzym: [14]

a) Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của papain, casein bị thuỷ phân, giải phóng ra các peptid ngắn và các acid amin Xác đinh lượng casein còn lại bằng cách cho tủa với aciđ tricloracetic Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo thành dung dịch

có màu, đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng X = 530 nm.

hcfp vứi yêu cầu thí nghiệm (thường lấy các dung dịch 0,1% và 0,5%).

Tiến hành định lượng enzym theo bảng sau:

Bảng 1: Tliể tích các thuốc thử đem dùng để xác định hoạt tính enzym:

Lắc đều các ống, ủ ấm ở nhiệt độ 37°c, cứ 5 phút lắc lại một lần Sau

đó, thêm vào ống thử 2,5 ml dung dịch acid tricloracetic 1,8%, lắc đều, để ỏ nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm các ống lấy tủa Thêm vào mỗi ống 4 ml thuốc tíiử Gomall, khuấy đều cho tan hết tủa Tiếp tục thêm vào mỗi ống Iml

dung dịch NaCl 0,9% Để yên ờ nhiệt độ phòng 30 phút- Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng X = 530 nm, cuvet 1 cm.

Đơn vị hoạt động của enzym được ưnh là Katal hoặc nanoKatal (1 nKatal = 10 Katal) Katal là lượng enzym (papain) xúc tác thuỷ phân 1 mol

cơ chất (casein) trong thời gian 1 giây

Công thức tính kết quả như sau:

A 1 0 \ 209 -BnKatal

23600 1 0 \ t m A: Lượng casein bị thuỷ phân, tính bằng mg

B: Hệ số pha loãng của dịch enzym

23600 X 10^: Trọng lượng phân tử cùa casein, tính bằng mg.

209: Số dây nối của 1 phân tử casein.

t; Thời gian thực hiện phản ứng, tính bằng giây

m: Số lượng enzym đem thử, tính bằng mg

3.5.2 Phương pháp xác định một vài chỉ sô'hoá sinh:

3.5.2.1 Phưcfng pháp điện di protein huyết thanh trên giấy thạch [18, 233­237], [37, 329-411 Ị

3.5.2.2 Định lưọfng seromucoid trong huyết thanh: [18, 303], [37, 298-299]

a ) Nguyên tắc:

Dùng acid percloric loại protein của huyết thanh, sau đó tủa seromucoid bằng acid phosphotungstic 5% Độ đục của dung dịch tỷ lệ với hàm lưọíig seromucoid và được đo ở bước sóng Ằ, = 400nm

P) Tiến hành:

Trong 1 ống nghiệm ly tâm, cho vào:

Dung dịch NaCl 0,9% 4,9mlAcid percloric 1,8M (từ từ) 2,5ml Trộn đều, để yên 15 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 15 phút, tốc độ 3500

vòng/ phút, thu lấy phần dịch trong.

Cho vào 1 ống nghiêm khác:

Acid phosphotungstic 5% ImlTrộn đều, đé yên 40 phút ở nhiệt độ phòng Đo độ đục ở A, = 400 nm, cuvet 1 cm, so với ống chứng là nước cất Kết quả được biểu thị bằng mức độ tăng (tính theo phần trăm) của mật độ quang học thu được ở các lô chuột thử

so với mật độ quang học thu được ở lô chuột bình thường.

5.5 J Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm của c h ế phẩm

3.5.3.1 Phưomg pháp gây viêm:

- Phưcfng pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [36], [31, 155-156]:

Tiêm 0,05 ml đung dịch đextran 6 % vào dưới bề mặt gan bàn chân sau của

chuột có trọng lượng khoảng lOOg

- Phưoíng pháp gây viêm ngoài da do bỏng: Chọn chuột nặng khoảng 20-22g, cạo sạch lồng trên da vùng lưng chuột Dùng dùi sắt đường kính 0,8 mm đã được vùi ưong cát nóng 350°c cho tiếp xúc với vùng da đã cạo lồng trên lưng chuột trong khoảng 20 - 30 giây Sau vài ngày, khi biểu bì vùng da bị bỏng biến thành lớp vảy cứng, biến màu và khồng còn dính với các lớp mô bên dưới, bóc bỏ lớp vảy để bộc lộ vết thương đã viêm

3.5.3.2 Phương pháp thử tác dụng chống viêm:

a ) Sử dụng phưoíng pháp đo độ phù chân chuột theo mô hình của Winter [36]:

Đo thể tích bàn chân sau của chuột tới khớp cổ chân vào thời điểm trước khi tiêm ứĩuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc

- ở những lô chứng, chuột không được uống thuốc gì

- ở những lổ thử thuốc, chuột được uống thuốc bằng một kim tiêm cong

đầu tù, đưa thẳng thuốc vào dạ dày, vào các thời điểm 90 phút trước, 30 phút trước và 30 phút sau khi gây viêm bằng tiêm dung dịch dextran 6 % để đảm

bảo phát hiện được tác dụng của tìiuốc, dù tác dụng xuất hiện chậm, dù tác dụng có trước hay có sau khi gây viêm

- ở những lô so sánh, chuột được uống Aspirin vào thời điểm 30 phút

trước khi gây viêm bằng tiêm dung dịch dextran 6%.

So sánh mức độ phù trung bình của chân chuột ở những lồ thử thuốc và

ở các lô chuột đối chứng Tỷ lệ phần ưàm độ tăng thể tích chân của mỗi chuột

so với lúc ban đầu chưa gây viêm được tính theo công thức:

V2 -V ,

% AV = -X 100%

V

Trong đó: V I : thể tích chân chuột trước khi gây viêm

V2: thể tích chân chuột sau khi gây viêm

Từ đó tính ra số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột trong cùng một lô và sai số chuẩn của nó: AV% ± SE.

Tính tỷ lệ phần trăm ức chế chế phù để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của thuốc, theo công ửiức:

A V , % - A V j %

1% = -X 100%

AV.%

Trong đó; AV(,% : Số trung bình (%) độ tang thể tích chân chuột à lô chứng.

AVj% : SỐ trung bình (%) độ tãng thể tích chân chuột ở lô thuốc 3) Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm ngoài da:

- Theo dõi và so sánh thời gian lành vết thưoíng trên các lô chuột:

Lô chứng: Không bồi thuốc gì

Lô thử: Bôi chế phẩm thử 1 lần/ ngày

Lô so sánh: Bôi hydrocortison acetat 1 lần/ ngày

- Theo dõi sự biến đổi của một vài chỉ số hoá sinh:

So sánh sự biến đổi các giá trị trung bình của tỷ lệ các thành phần protein huyết thanh, của tỷ lệ Albumin/Globulin, của giá trị seromucoid giữa

lô chứng và lô thử, giữa các lô thử với nhau để xác định tác dụng chống viêm của chế phẩm thử

3.5.4 Phương pháp xử lý s ố liệu:

Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê với sự trợ giúp của chưoíng trình Excel

PHẦN 4 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QƯẢ

4.1 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzym của nguyên liệu:

Trong quá trình thí nghiệm, sử dụng hai dạng nguyên liệu là papain thô

và papain đã sơ bộ được tinh chế bằng phương pháp đông khô (gọi tắt là papain đông khồ) Kếí quả xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzym của

2 dạng nguyên liệu được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2: Hàm lượng protein và hoạt tính enzym của nguyên liệu:

Papain thô Papain đông khô

Ghi chú: Giá trị trong bảng ỉà kết quả trung hĩnh của 3 lần thí nghiệm trong cùng điều kiện.

Kết quả trong bảng 2 cho thấy, sau quá trình tinh chế sơ bộ bằng phucfng pháp đông khô, hàm lượng protein trong papain đông khô đã tăng lên khoảng 1,3 lần so với dạng papain thô Như vậy, quá trình đông khồ đã giúp loại bớt các thành phần không phải là protein, ví dụ như các thành phần nhựa Tuy nhiên, sau quá trình đông khô, hoạt tính enzym/ Img protein hầu như không thay đổi, chứng tỏ lượng enzym đã được giữ nguyên, khồng mất đi ừong quá trình tinh chế

Từ kết quả như trên, để thuận tiện cho quá trình nghiên cứu, hàm lượng

protein (%) được lấy là đcfn vị để sơ bộ tạo một số chế phẩm chứa papain.

4.2 Thử tác dụng chông viêm cấp của papain trén chuột bị gây phù chân:

4 2 J Theo dõi sự biến đổi th ể tích chân chuột hị gây phù theo thời Ịĩian (động học của phẩn ứng viêm):

28

Trong thí nghiệm này, sử dụng một lô gồm 6 chuột nặng khoảng lOOg Các chuột được đánh số và đo thể tích chân phải sau lúc bình thường Tiêm dưới da gan bàn chân phải sau của mỗi chuột 0,05ml dung dịch dextran 6%

Cứ cách 1 giờ sau khi tiêm lại đo thể tích chân phải sau của từng chuột Kết quả được tổng hợp trong bảng 3 và hình 4:

Bảng 3: Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian

Số liệu trong bảng cho thấy mức độ phù chân chuột tăng dần, sau khi tiêm dextran 1 giờ, phù tăng so với lúc chưa tiêm là 44,0% (P < 0,01), sau 2 giờ tăng 60,0% (P < 0,05), sau 3 giờ tăng 81,7% (P < 0,01), sau đó giảm xuống, đến 4 giờ chỉ còn 61,6% (P < 0,05) Như vậy, khi gây phù chân chuột bằng cách tiêm dung dịch dextran 6 %, thời điểm mà độ sưng phù đạt giá tậ cao nhất là vào khoảng 3 giờ sau khi tiêm Vì vậy, khi thử tác dụng của các thuốc, chúng tôi tiến hành đo thể tích chân chuột vào thời điểm 3 giờ sau khi tiêm dextran để so sánh với thể tích chân chuột lúc bình thưcmg, chưa tiêm thuốc (thời điém 0 giờ).

4.2.2 Tác dụng chống viêm cấp của papain trên chuột bị gây phù chán:

Sử dụng nguyên liệu papain đông khô do có tính chất dễ tan trong nước, thuận tiện khi cho chuột uống thuốc

Tiến hành trên 3 lô chuột, mỗi lô 6 chuột:

- Lô 1: Lô chứng, không cho chuột uống thuốc gì

- Lô 2: Lô thử, chuột uống papain đông khồ với liều 500mg/ kg/ lần X 3 lần vào các thời điểm 90 phút trước, 30 phút trước và 30 phút sau khi gây viêm

- Lô 3: Lô so sánh, chuột uống Aspirin với liều (ị^.gỉ kg, uống 1 lần vào ửiời

điểm 30 phút trước khi gây viêm

Kết quả thu được trình bày trong bảng 4:

Bảng 4: Tác dụng của papain đông khô và Aspirin trên chuột bị phù do tiêm dextran 6 %

trong lô

Mức độ phù tăng (%)

% ức chế phù

p

Kết quả trên cho thấy, papain đông khô với liều 500mg/ kg/ lần X 3 lần (90 phút trước, 30 phút trước và 30 phút sau khi gây viêm) có tác dụng giảm phù nhẹ, phần trăm ức chế phù là 22,3% (P < 0,01) Tác dụng này tưcmg đưoíng với tác dụng ức chế phù của Aspirin với liều 0,5g/ kg uống 1 lần 30 phút trước khi gây viêm, là 18,2% (p < 0,01) Sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).

4 2 3 Tác dụng chống viêm cấp trên chuột bị gây phù chân khỉ kết hợp papain với một s ố dược liệu:

Trong thí nghiệm này, papain được kết hợp với một số dược liệu có tác dụng chống viêm để theo dõi tác dụng phối hợp giữa papain với các được liệu

đó trong việc giảm độ phù chân chuột Bước đầu, sử dụng hai dược liệu ngưu

tất và hoàng cầm, là hai dược liệu có tác đụng chống viêm tốt, đã được sử

dụng trong dân gian từ lâu và đã có một số đề tài nghiên cứu trước đây về chúng

I4.2.3.1 Tác dụng chống viêm cấp trên chuột bị gây phù chân khi kết hợp papain với ngưu tất:

Tiến hành trên 4 lô chuột, mỗi lô 6 chuột:

- Lô 1: Lô chứng, khồng cho chuột uống thuốc gì

- Lô 2: Lô cho chuột uống papaỉn đông khô với liều 500mg/ kg/ lần X 3 lần vào các thời điểm 90 phút trước, 30 phút trước và 30 phút sau khi gây viêm

- Lô 3: Lô cho chuột uống nước sắc ngưu tất với liều tưcmg ứng 500mg ngưu

tấự kg/ lần X 3 lần vào các thời điểm giống như lô 2.

- Lô 4: Lô cho chuột uống papain đông khô và nước sắc ngưu tất với liều tưcíng ứng 500mg papain + 500mg ngưu tất/ kg/ lần X 3 lần vào các thời điểm

giống như lô 2

Kết quả thu được trình bày trong bảng 5