Nghiên cứu về thực vật , hóa học và một số tác dụng sinh học của hai loài đậu xanh(vicna radiata wilczeck) và đậu đỏ (phaseolus vulgaris l )

Đã có một số tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như một số tác dụng sinh học của hạt đậu xanh, hạt đậu đỏ và ứng dụng trong ngành y dược.. Đậu xanh Vigna r

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

BỘ Y T Ế

D.s H O À N G Q U Ỳ N H H O A

NGHIÊN CỨU V ề THỰC VẬT, HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁ C DỤNG SINH HỌC CỦA HAI

LOÀI ĐẬU XANH ( Vigna radiata Wilczek)

VÀ ĐẬU Đ ỏ (Phaseo/us vulgaris L.)

CHUYÊN NGÀNH : Dược LIỆU, DUỢC HỌC c ổ TRu y ề N

£ Ờ 3 - @ c 4 m Ơ Q I

< V ở i l ò í i ụ l ù ỉ í ờ n ijă u L ẩ u , t ò i dtiJL c l t t ủ t th à n h C í ủ t i ( ì n ^ r V r J Ẵ

rfth(Ịm (ĩ7ltanh 3ỈJp, tiliủ nhiệm (Bà mỗti (Dưđ* liêu, trùổnạ ri)ạ ì họe (UưọC 'ĩũà Q lộ i, tU ịiiổ i íTã tn ióiK Ị d u n o à ạiúfL (to tỏ i r ú t nhiỀ u tvOHỊỊ q u á trìn h nghiên eíiii lùi húủn thành Luận IHUL.

CJfii ti n hừiị tả lòíitị hi í t (fit (Tên QcV ^7fittli (V ăn rJỉájfí, (Jit'i

nhiêm hỏ mòn QJ- sink húe oà (Di tvuụẦLn, trưtìiiạ (Đại hũ* Q/Ị- 'dũà Qlậi, nạt lòi í t ã Illicit tụ tlÁit úỉí (túc hiỀí tao ĩtỉều Uìêíi thuận Lợi ehú tòi Idù tlỀJt

r ĩò i jeitL eíiù n th à n h e á n t fí’n ^ p itạ iti ỵ jliíê u OlxựltL, lúi m ê n 'JC&á lin h , trúcU iíị < ĩ)ại kfífí (ự- J ô à Q lậ i, đ ă glúfL (Trĩ o à (tò a (Ị ũ ìỉtt tồ i r u t n h iè u

t i o i i g th à i g ia n h ũ ù ti th à n h iuậtL o ả n tùuụ,.

'TĨvoiuị q u á tr in h ltú<‘ tíĨỊí o à I iíịh ìê ii cứ u , tô i ĩtã tiỉú u i ĩtư tíe u i ạiúfL

ĩtõ oà nỉỉíùiự ụ hiên (táng (ịỏỊí QẩíẠ lưu í của -ột£ r()ĩi r()ản QluiụítL, c7.c5

rB ù ì JCùu MLỀJI, £/& QlxpxụẪit rO ìêí (Jlu u t (ùuiạ, tiùuL th ê ừáa th ẵ iị C‘ò ạ i/to

ÚỈL c á n íứ% eùa l)ỗ m o n ^ D iitìe ỉ i è n , b ề m ờ ft r~ĩliií'c o ậ t , p l i ò t i ụ rĐ à o t íiú ị it II

^ D a i h ú t' - t r iif U iij ( Đ a i h á íí ^T)ulo'ti HC)Ù QX j ÒL, Ịxâ IILớn QJ- i i n h hớt- t)à ( D i

truụẪiL, hở m ô n Tỉỗtìá s ù tỉi - ivu útiụ , (Đ a i ỉiOí‘ QJ- lỉC ừí Q lô i, Ịìltồ rtq f j) li£ Uliếi - (Z)Lân TỉíiOÚ húí‘ eáe ỉtúỊí ch ấ t tư nhiên, (jiutig, tăm DChoa liỉiíí oà

(ứutụ n ạ lti ÍỊIIÕÍ- (fill, r()ií'H 69 - (Bà tư lên h Jltuuj,

DANH MỤC CHỮ VIÊT t Ắ t

1.3 Những kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học 11

1.3.1 Những kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của đậu xanh 111.3.2 Những kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của đậu đỏ 13

1.4 Kinh nghiệm sử dụng đậu xanh và đậu đỏ trong y học cổ 15 truyền

1.5 Hướng nghiên cứu mới của luận văn về đậu xanh và đậu đỏ 16

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 21

Công trình tốt nghiệp thạc s ĩ dược học

MỞ ĐẦU

Đậu xanh và đậu đỏ là hai loài cây trồng thuộc họ Đậu (Fabaceae) rất

gần gũi với nhân dân ta Cũng như các loài đậu đỗ khác, hạt đậu xanh và đậu

đỏ là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp nhiều protid, lipid, glucid, acid amin cần thiết và nhiều vitamin Từ xa xưa, nhân dân ta đã trồng đậu xanh để lấy hạt như một loại lương thực và biết sử dụng loại hạt này để chữa một số bệnh hay gặp Theo kinh nghiệm dân gian, hạt đậu xanh có thể dùng

để tiêu phù thũng, hạ khí và đặc biệt là có khả năng giải các chất độc (bách độc) [25] Hạt đậu đỏ cũng có mặt trong một số bài thuốc dân gian để điều trị các bệnh đau dạ dày và đau ruột [9]

Hiện nay, việc nghiên cứu về hai loài đậu xanh và đậu đỏ trong lĩnh vực hoá học và y sinh học đang được các nhà khoa học trên thế giới và ở nước ta rất quan tâm Đã có một số tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như một số tác dụng sinh học của hạt đậu xanh, hạt đậu đỏ

và ứng dụng trong ngành y dược Tuy nhiên, việc nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của hạt hai loài đậu này ở Việt Nam vẫn còn chưa đầy đủ

Đậu xanh (Vigna radiata Wilczek) hiện được nhiều nhà khoa học rất

quan tâm về thành phần flavonoid trong vỏ hạt với một số tác dụng sinh học liên quan đến khả năng chống oxy hóa, chống đột biến NST, bảo vệ nhiễm độc phóng xạ v.v Hiện nay ở trong nước đang có chế phẩm viên nang Vitex của Viện Y học cổ truyền Việt Nam có thành phần dược chất là flavonoid chiết xuất từ vỏ hạt đậu xanh Tuy nhiên, ngoài flavonoid ở vỏ hạt, thành phần protein trong nhân hạt đậu xanh có thể cũng có tác dụng điều trị vì đậu xanh được sử dụng trong đông y là toàn hạt Riêng về thành phần protein trong

- 1

-M ở đầu

nhân hạt đậu xanh mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu ứng dụng cho giá trị dinh dưỡng

Khác với đậu xanh, đậu đỏ (Phaseolus vulgaris L.) đã được các nhà khoa

học nghiên cứu tới một thành phần protein trong nhân hạt là phytohemagglutinin (PHA) với ứng dụng sinh học khá phong phú Hiện nay,

trên thị trường thế giới đã có chế phẩm PHA sản xuất từ Phaseolus vulgaris L

đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử Ngoài thành phần protein trong nhân hạt, thành phần hoá học của vỏ hạt đậu đỏ cũng như ứng dụng sinh học của phần này thì chưa thấy tác giả nào đề cập tới Mặt khác, việc sử dụng đậu đỏ ở Việt Nam làm nguyên liệu để sản xuất tại chỗ chế phẩm PHA sử dụng cho các thí nghiệm sinh học cũng chưa thấy tài liệu nào trong nước công bố

Như vậy, việc nghiên cứu về hoá học và ứng dụng y sinh học của hai loài đậu xanh và đậu đỏ ở Việt Nam còn chưa đầy đủ Để góp phần nghiên cứu đầy

đủ hơn về hai loại dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu

về thực vật, hoá học và một số tác dụng sinh học của hai loài đậu xanh fVigna radiata WilczekJ và đậu đỏ (Phaseoỉus vulgaris L.) ở Việt Nam"

với nội dung sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm vi học của bột hai loại hạt đậu xanh và đậu đỏ ở Việt Nam

2 Nghiên cứu về hoá học hai loại hạt đậu xanh và đậu đỏ:

Định tính thành phần hoá học trong toàn hạt

Chiết xuất, phân lập một số thành phần chính trong hạt

Bước đầu nhận dạng các chất phân lập được

3 Nghiên cứu tác dụng sinh học về:

Khả năng chống đột biến NST của đậu xanh đối với nhiễm độc chì ở chuột thực nghiệm, so sánh tác dụng riêng lẻ của flavonoid vỏ hạt và tác dụng hiệp đồng của dịch chiết toàn hạt

2

M ỏ đầu

Tác đụng kích thích phân bào ở tế bào lympho người của dịch chiết protein toàn phần từ hạt đậu đỏ ở Việt Nam, so sánh với chế phẩm PHA sản xuất theo tiêu chuẩn quốc tế

CômỊ trình tốt nghiệp thạc s ĩ dược học

CHƯƠNG 1 - T ổN G QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM VỂ THỰC VẬT

Họ Đậu (Fabaceae = Leguminosae) thuộc Bộ Đậu (Fabales), liên bộ Đậu (Fabanae), phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Theo cách phân loại của một

số tác giả trước đây như Hutchinson (1973), Cronquist (1981), Fabaceae là

inột trong 3 họ thuộc bộ Đậu Tuy nhiên, theo các tác giả khác, kể từ Bentham

và Hooker (1862 - 1883), Takhtajan (1987) đến các tài liệu phân loại gần đây nhất của R.K Brummitt (1992), của W.Greuter và cộng sự (1993) thì bộ Đậu

chỉ có một họ Đậu với 3 phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae), Vang ('Cesalpinioideae) và Dậu (Faboideae = Papilionoideae) Phân họ Đậu có

khoảng 400 - 500 chi với 10.000 - 12.000 loài, phân bố khắp thế giới, ở Việt Nam, phân họ Đậu có khoảng 90 chi với hơn 450 loài [6] Theo H Lecomte,

họ Đậu có 69 chi với 296 loài [51] Tuy nhiên, các cây họ Đậu được trồng phổ biến có khoảng 49 chi với 105 loài trong đó bao gồm các loài đậu đỗ [23],Một số cây thuộc họ Đậu là những cây trồng rất quan trọng về mặt thực phẩm vì hàm lượng protein trong hạt từ 20 đến 45% (tính theo trọng lượng khô) Các cây họ Đậu còn có giá trị rất to lớn trong việc làm màu mỡ cho đất nhờ khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Do đó, việc phát triển trồng cây họ Đậu đang dược đẩy mạnh trên thế giới và ở nước ta nhằm tạo ra một nền nông nghiệp bền vững Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, một số cây họ Đậu còn là nguồn dược liệu quý trong việc sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên

Theo phân loại thực vật trước đây, đậu xanh và đậu đỏ đều thuộc chi

Phaseolus Tuy nhiên, theo hộ thống phân loại hiện nay, đậu xanh được xếp

Tổng quan

vào chi Viqna Theo Nguyễn Đăng Khôi, chi Viọna có khoảng 30 loài Các loài thuộc chi Vigna là những cây họ đậu được trổng nhiều ở các nước nhiệt

đới và cận nhiệt đới để làm thức ăn cho người và gia súc [23] Cây mang tên

"đậu đỏ" được trồng ở nước ta có thể là hai loài khác nhau, đó là đậu đỏ nhỏ

và đậu cô ve hay đậu tây

1.1.1 Cây đậu xanh

Đậu xanh còn có tên là đậu chè; đậu tằm

Tên khoa học là Viqna radiata (L.) Wilczek.

Tên đồng nghĩa: Phaseolus radiatus Lour, non L.; Phaseolus mungo Gagnep non L.; Phaseolus aureus Roxb.; Vigna aureus (Roxb.) Hepper ;

Vi qua aurca Khôi; Vi qua aurea Roxb.

Họ Đậu - Fabaceae [6; 7; 9; 20; 24; 25; 27; 48; 50],

Theo Phạm Hoàng Hộ [201, đậu xanh thuộc loại cây thảo mọc đứng cao khoảng 50 cm, cây sống hằng năm Lá phụ có lông ở cả hai mặt; lá bẹ phụ cómũi chẻ hai; lá bẹ kéo dài dưới nơi gắn Hoa rất dày đặc, xếp thành chùm ởnách lá, dài 10-15 cm Hoa màu vàng lục; đầy lông tơ Quả đậu nằm ngang,hình trụ mảnh, to 8 X 0,6 cm, đen, có lông rồi nhẵn, có đầu nhọn ngắn Quảchứa nhiều hạt nhỏ (10 - 15), phân cách nhau bởi các vách, hình trụ ngắn, gần hình cầu, thường có màu xanh

Cây ra hoa vào tháng 8 - 10, quả vào tháng 3 - 1 1

Cây trồng khắp Đònp Dương lấy hạt ăn

1.1.2 Cây đậu đỏ nhỏ

Đậu đỏ nhỏ còn gọi là xích liểu đậu

Tên khoa học là Viẹna annularis (Willd.) Ohwi et Ohashi.

Tổng quart

Tên đồng nghĩa: Phaseolus anạularis (Willd.) W.F.Wight; Dolichos

annularis Willd.; Phascưlus calcaratus Roxb.

Họ Đậu - Fabaceae [7; 9; 20; 24; 25; 29; 44|.

Theo Võ Văn Chi 19J, đậu dỏ nhỏ thuộc thao, mọc hằng năm, đứng hoặc leo, cao 25-90cm; nhánh có cạnh, có lông dài Lá kép 3 lá chét, cuống 10- 12cm, có lông, lá chét hình trái xoan, đầu tròn, có thuỳ, dài 5-10cm, rộng 2- 5cm, có lông, gân phụ 4-5 cặp; lá kèm thon, hình lọng, cao 8mm Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10cm, có 6-12 hoa; đài 5 răng ngắn; tràng hoa màu vàng sáng, cao 15mm, lườn xoắn 360° Quả hình trụ, dài 6-12,5cm, rộng0,5-0,7cm, chót nhọn; hạt 6-14, to 5-7x4-5mm, hình trụ tới dạng tim tròn 4 cạnh, màu nâu đỏ, rốn nổi rõ

Cây ra hoa vào tháng 6-7, quả tháng 7-8

1.1.3 Cây đậu đỏ

Đậu đỏ còn có tên gọi là đậu tây, đậu côve, đậu thận đỏ

Tên khoa học là Phaseolus vulgaris L.

Tên đồng nghĩa: Phaseolus esculentus Salisb.

Họ Đậu - Fabaceae [6; 9; 20; 23; 24; 25; 27; 52]

Theo Phạm Hoàng Hộ [20], đậu đỏ là cây thuộc thảo, leo Lá kép 3 lá chél hình trụ trái xoan, có đầu nhọn, lá giữa hình thoi; gốc tù, nhẵn; mặt trên

thường có lông và ráp Chùm hoa ở nách lá mang hoa ở nửa trên, mỗi mẫu có

ít hoa, 1-2 hoa màu trắng, vàng hoặc hồng; cao 1-2 cm Đài hình chuông, nhẩn, có 4 răng Cánh hoa không đều Nhị 2 bó, nhị trên rời và có chỉ nhị phồng thành vảy ở gốc Bầu có lông mềm Quả loại đậu, mập lúc non, to 10-

15 X lem Hạt 6-12, hình thận, có màu khác nhau, dài 1-2 cm

Tổng quan

Theo tài liệu [91, nguồn gốc của đậu đỏ từ Nam Mỹ, được nhập vào nhiều nước, trong đó vào Việt Nam từ trên 80 năm nay Tại Việt Nam, đậu đỏ được trồng khá rộng rãi ở nhiều nơi, thậm chí ở cả những nơi có độ cao 1500 m.Loài đậu đỏ khá phong phú về chủng loại và được làm phân thành hai nhóm:

- Nhóm đậu lùn: Cây cao 40 - 50 cm, thời gian sinh trưởng 80 - 100 ngày Cây thuộc nhóm này gồm có :

+ Chủng dạu án quá: đậu vàng; đậu đỏ

+ Chủng đậu ăn hạt: đậu tây trắng; đậu ấn nguyên; đậu cô ve hạt đen và đậu cô ve hạt đỏ

- Nhóm đậu leo: Thuộc nhóm này có hai chủng như sau:

+ Chủng đậu ăn quả: đậu chạnh; đậu quả xanh dài

+ Đậu ăn hạt: đậu bở; đậu lơ

1.2 NHŨNG KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VỂ HOÁ HỌC

1.2.1 Thành phần hoá học của hạt đậu xanh

Hạt đậu xanh là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Trong hạt đậu xanh có protid, lipid, glucid, cellulose, các chất khoáng, vitamin, các acid amin cần thiết và tinh bột [9; 10; 2 5 1

Theo tài liệu ị 10; 18], hàm lượng acid amin cần thiết trong hạt đậu xanh được trình bày trong bảng 1; thành phần hoá học của hạt đậu xanh bao gồm nước (14%), protein (23,4%), lipid (2,4%), glucid (53,1%), cellulose (4,7%) tro (2,4%) và các thành phần muối khoáng như Ca (64,8 mg%), p (377,0 mg%), Fe (4,8 mg%), các vitamin như caroten (0,06 mg%), B,(0,72 mg%), B2

(0,15 mg%), pp (2,4 mg%), c (4 mg%).

Tổng quail

Hảng 1 Thành phần các acid amin cần thiết trong hạt đậu xanh

Acid amin

Hàm luựng (g) Trong lOOg protein Trong lOOg hạt

1.3.2 Thành phẩn hoá học hạt đậu đỏ

Hạt đậu đỏ {Phaseolus vulgaris L.) có thành phần nước (13%), protein

(19,98%), lipid (1,52%), dẫn xuất không phải protein (59,15%) [9]

Tống quan

Nhũng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước hầu hết đểu tập Irung vào thành phain protein, đó là lectin và chất ức chế protease - những thành phần có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ nhân hạt đậu đỏ

(Pliaseolus vulíỊơris L.) Theo lài liệu [371, hàm lượng lectin trong hạt đậu đỏ

cao hơn hàm lượng chất ức chế prolease

Về chất ức chế protase có mật trong hạt đậu đỏ, trong cấu trúc của chất này có nhiéu cầu nối rlisulíìđ, góp phần tạo độ ổn định với nhiệt [43] Trọng lượng phân tử của chất ức chế protease trong khoáng 8000 - 23000 (tuỳ theo chủng loại và phương pháp đánh giá trọng lượng phân tử), v ề số lượng, người

ta tìm thấy 2 đến 6 loại chất ức chế protease

Thành phần lectin trong hạl đậu đỏ đã được nghiên cứu và phát hiện từ lâu Năm 1960, Nowell và cộng sự đã quan sát thấy hiện tượng bạch cầu của người phân chia sau khi đã tách hồng cầu do tác động của một loại protein

trong Pliaseolus vulạaris L., loại protein này được gọi tên là phytohemagglutinin (PHA) và dược xác định chính là thành phần lectin [42] Theo công bố của Hoffman và cộng sự ( 1982) [39], thành phần acid amin của lectin đậu đỏ bao gồm 17 loại (bảng 2)

Trình tự 15 acid amin tận cùng đầu N của lectin từ hạt Phaseolus

vulạaris L như sau:

A; D; T; I; V; A; V; E; L; D; T; Y; P; N; I

Theo tài liệu của Strosberg (1986), lectin của Phaseolus vulẹaris L gồm

hai chuỗi khác nhau là PHAE và PHA1' Sự khác nhau của hai chuỗi polypeptid này là ở 6 gốc acid amin tận cùng đầu N nhưng trọng lượng phân tử của chúng xấp xí 34kDa Sự kết hợp không cộng hoá trị của hai chuỗi PHAE và PHAL theo tỷ lệ khác nhau sẽ cho 5 izo lectin mà mỗi izo lectin là một tetramer: 4L, 3L1E; 2LIE; 3E1L và 4E [471 Kết quả này cũng giống với kết quả nghiên cứu của Fleischmann và cộng sự (1985) khi các tác giả này sử dụng cột ái lực

Tổng quan

Sephrose-4B-ovomucoid để tinh chế lectin từ Pliaseolus vulgaris L Với kỹ

thuật điện di trên gel polyacrylamid có mercaptoethanol, nhóm nghiên cứu đã tìm thấy lectin này có 2 tiểu đơn vị 31kDa và 34 kDa [35]

Bảng 2 Thành phần acid amin của lectin đậu đỏ

Theo nghiên cứu của Trương Văn Châu [8], đặc tính sinh hoá của lectin

trong loài Phaseolus vulqaris L có một số khác biệt so với các loài đậu khác

Chẳng hạn, tính đặc hiệu với đường không hề có ở lectin của đậu đỏ, hầu hết các loại dường thí nghiệm đều kìm hãm hoạt dộng của chúng, v ề tính chịu

nhiệt, leclin của Phaseolus vulạơris L cũng khá bền với nhiệt, vẫn còn hoạt

Tổng qua II

tính ở 70°c sau 15 phút Độ pH thích hợp của lectin đậu đỏ khá lộng, dao động từ 6 , 0 - 8,0

Ngoài thành phần protein đã được nghiên cứu từ lâu, các thành phần khác

như flavonoid trong vỏ hạt Phaseolus vulgaris L cũng đã được nghiên cứu

Clifford w Beninger và cộng sự đã nghiên cứu ở 3 giống khác nhau của loài

Pỉiaseolus vulgaris L (khác nhau ở màu vỏ hạt) và nhận thấy ò các giống này

đều có chung một thành phần flavonoid là chất astragalin (kaempferol 3-0-fì- D-glucosid) [32], Theo công bố của một số tác giả, trong vỏ hạt đậu đỏ có 3 loại anthocyan là pelargonidin 3-O-beta-D-glucosid (P3G); cyandin 3-O-beta- D-glucosid (C3G) và delphinidin 3-O-bela-D-glucosid (D3G) [49]

Rị = R 2 = OH; R 3 = H Cyanidin

Rj = R 3 =H ; R2 = OH Pelargonidin

1.3 NHCNG k ế t q u ả n g h i ê n C ứ u v ể t á c d ụ n g s i n h h ọ c

1.3.1 Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của hạt đậu xanh

Nghiên cứu về tác dụng sinh học của flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh , Mai Văn Điển và cộng sự đã có một số kết quả nhất định về tác dụng bảo vệ

cơ thể chống phóng xạ Các tác giả đã công bố flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế khá mạnh phản ứng peroxyd hoá lipid trong gan, lách, ruột non chuột nhắt trắng bị chiếu xạ liều 7Gy và giảm tổn thương rõ rệt

Tổng quan

ở các cơ quan này cả về đại thể lẫn vi thể [13; 14; 15; 16] Flavonoid vỏ hạt đậu xanh còn có tác dụng bảo vệ được tế bào nội mạc động vật bò bị tổn thương do xanthin oxydase Đối với nguyên bào sợi, flavonoid cũng có tác dụng bảo vệ tế bào này đối với stress oxy hoá bằng xanthin oxydase và có khả năng bảo vệ tế bào tương đương với stress oxy hoá bằng Ho02 [12] Trên lâm sàng, viên nang Vitex lOOmg với thành phần dược chất là flavonoid chiết từ

vỏ hạt đậu xanh đã được dùng thử nghiệm trong điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân

K điều trị bằng tia xạ sau phẫu thuật và đã cho kết quả bước đầu là với liều

400 mg/ ngày, Vitex có khả năng hỗ trợ và làm hạn chế các tổn thương của tia

xạ, cải thiện tình trạng sức khoẻ chung, giảm nhẹ các triệu chứng nhiệt và phần nào giảm các tác hại của tia xạ lên hệ miễn dịch [19]

Hướng nghiên cứu về tác dụng chống đột biến của đậu xanh đã được nhiều tác giả quan tâm Từ những năm 1980, Cung Bỉnh Trung và Huỳnh Thu Lương đã nghiên cứu khả năng chống đột biến của dịch nghiền đậu xanh và nhận thấy: dịch nghiền đậu xanh có tác dụng chống đột biến do 2,4,5 - T gây

ra [30] Trong thời gian nghiên cứu từ năm 1980, 1981, 1985, nhóm nghiên cứu của Trịnh Văn Bảo đã có các báo cáo bước đầu về tác dụng chống độc và chống đột biến của đậu xanh cả vỏ, các chỉ số rối loạn NST ở nhóm chuột được dùng đậu xanh cả vỏ có thấp hơn các chỉ số này ở nhóm chứng đơn thuần bị nhiễm độc không được dùng đậu xanh, tuy nhiên sự thay đổi này phần lớn chưa có ý nghĩa thống kê Có thể nói, ngoài flavonoid trong vỏ, các tác giả đã bắt đầu quan tâm tới tác dụng sinh học của toàn hạt (kể cả nhân hạt) mặc dù chưa có nghiên cứu sâu về hoá học ở phần này Trong nghiên cứu về tính chất sinh học của một số chất chống oxy hoá thử nghiệm với lympho bào người nuôi cấy, Trịnh Văn Bảo và cộng sự đã có nhận xét: đậu xanh có tác dụng rõ rệt trong việc bảo vệ làm giảm tỷ lệ nhân nhỏ do Cyclophosphamid gây ra [2] Cho tới năm 1998, Trần Đức Phấn đã hoàn thành công trình nghiên cứu về tác dụng chống đột biến của flavonoid vỏ hạt đậu xanh và dịch chiết

Tổng quan

đậu xanh loàn phần trên chuột thực nghiệm bị nhiễm monitor là một loại hoá chất bảo vệ thực vật Kết quả cho thấy flavonoid vỏ có tác dụng hạn chế việc xuất hiện các đột biến cấu trúc NST ở chuột nhiễm độc thí nghiệm, đặc biệt là nhiễm độc cấp Bên cạnh đó, dịch chiết toàn hạt cũng có tác dụng hạn chế các độl biến cấu trúc NST, đặc biệt là ở chuột bị nhiễm monitor liều nhỏ dài ngày Ị261 Như vậy, bên cạnh lác dụr|<Ị của flavonoid trong vỏ, thành phần nhân hạt đậu xanh cũng có vai trò nhất định trong việc hình thành tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng trên một số mô hình thí nghiệm hoặc thử nghiệm lâm sàng

1.3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của hạt đậu đỏ

Đậu đỏ (Phaseolus vulgaris L.) đã được một số nhà khoa học trên thế

giới quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học và sinh hoá, về thành phầnprotein trong nhân hạt Lectin là một dạng protein và chủ yếu là glycoprotein,

có một số đặc tính sinh học đặc biệt như: có khả năng gây ngưng kết hồngcầu; kích thích và kìm hãm sự phân chia tế bào Lectin của đậu đỏ có tácdụng kích thích phân bào mạnh Khác với nhiều chất kích thích phân bào(mitogen) khác như kháng nguyên, các chất oxy hoá, kháng thể kháng cácthành phần màng bạch cầu vốn chỉ kích hoạt một số dòng bạch cầu đặc hiệu,lectin kích thích sự phân chia của nhiều dòng bạch cầu Do đó, tỷ lệ tế bào đápứng rất cao (70-80%) [36; 45] Chính nhờ khả năng kích thích phân bào màlectin được coi là một mitogen điển hình, đã được tinh chế và thương mại hoá,dùng trong nghiên cứu tế bào học và miễn dịch (chế phẩm PHA -Phytohemagglutinin) PHA ở dạng chiết xuất thô được hãng Difco (Mỹ) đưa

ra thị trường vào năm 1961 Sau đó, các hãng dược phẩm khác cũng sản xuấtPHA như hãng Burroughs Wellcome, Serva Hiện nay, trên thị trường đang cónhiều loại PHA, trong đó có chế phẩm PHA do hãng Difco (Mỹ) sản xuất và

được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm sinh học PHA từ Phaseolus

vulgaris L bao gồm 4 loại: (1) PHAE (Erythroaglutinin) là loại PHA có tính

kích thích phân bào thấp nhưng lác dụng ngưng kết hồng cầu cao; (2) PHAL

Tổng quan

(Leucoagglutinin) là loại PHA có tính chất kích thích phân bào cao (nồng độ trên 5 Ịig/ml) nhưng tác dụng ngưng kết hồng cầu kém; (3) PHAp (ở dạng protein) có tính chất kích thích phân bào ở nồng độ trên 1 0 |J.g/ml và có tác dụng ngưng kết hổng cầu mạnh (trên 16 |_ig/ml); (4) PHAM (ở dạng mucoprotein) có tính chất kích thích phân bào ỏ' nồng độ trên 1 0 ỊJ.g/ml nhưng khả năng gây ngưng kết hổng cầu kém hơn so với PHAp, ngưng kết hồng cầu

ở nồng độ trên 40 ịig/ml [46] Từ những năm 1960, Nowell và cộng sự là

những người đầu tiên quan tâm đến tác dụng của PHAM điều chế từ Phaseolus

vulạaris L ảnh hưởng đến sự phân chia của lympho bào ở máu ngoại vi vốn

không có khả năng phân chia Sau đó, PHAp cũng được phát hiện có tác dụng này [381 úhg dụng của kỹ thuật này đã trở nên rất quan trọng trong việc mô tả đặc điểm của NST, đặc biệt là những loại tồn tại trong điều kiện bệnh lý [33]

Ở Việt Nam, năm 1967, Bạch Quốc Tuyên và cộng sự đã điều chế PHA

từ hạt Phaseolus vulẹans để nuôi cấy lympho bào [31] Trong nghiên cứu gần

đây về tính chất sinh học của một số chất chống oxy hoá thử nghiệm với lympho bào người nuôi cấy, Trịnh Văn Bảo và Nguyễn Thị Hà đã có nhận xét

về khả năng gây chuyển dạng lympho bào mạnh của đậu đỏ Việt Nam Đậu xanh cũng có thể gây chuyển dạng nhưng kém đậu đỏ [2] Bên cạnh đó, các tác giả còn tìm thấy khả năng chống đột biến của PHA điều chế từ toàn hạt

Phaseolus vuỉqaris L thông qua tính chất chống oxy hoá của chế phẩm Các

chất chống oxy hoá thể hiện khả năng hạn chế tác động gây đột biến, gây quái thai hoặc gây ung thư của một số chất dị sinh [1]

Cũng với ý tưởng báo vệ cơ thể khỏi quá trình oxy hoá, bên cạnh những ứng dụng của thành phần protein, đã có những nghiên cứu về khả năng ức chế quá trình peroxyd hoá lipid và tác dụng thu dọn gốc tự do của anthocyan chiết

từ Phascolus vulgaris L Trong nghiên cứu của mình, Tsuda T và cộng sự

(Nhật Bán) [49] đã nhận thấy 3 loại anthocyan của vỏ đậu đỏ là pelargonidin

Tổng quan

3-0-beta-D-glucosid (P3G); cyandin 3-0-beta-D-glucosid (C3G) và delphinidin 3-O-beta-D-glucosid (D3G) và các aglycol của chúng là pelargonidin, cyanidin và delphinidin đều có tác dụng chống oxy hoá mạnh ở

hệ liposom, giảm sự tạo thành malodialdehyd do chiếu tia tử ngoại Đặc biệt, các chất này còn có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ microsom ở gan chuột và

có khả năng loại bỏ gốc tự do sinh ra trong cơ thể

1.4 KINH NGHIỆM s ử DỤNG ĐẬU XANH VÀ ĐẬU Đ ỏ TRONG Y HỌC CỔ TRƯYỂN

Đậu xanh được ghi làm thuốc trong sách "Nam dược thần hiệu" của Tuệ Tĩnh và "Bản thảo cương mục" của Lý Thời Trân Theo Lý Thời Trân, vỏ hạt đậu xanh (hay còn gọi là lục đậu bì, lục đậu ỵ, lục đậu xác) có vị ngọt, tính

mát, không độc, có tác dụng giải nhiệt độc, làm cho mắt khỏi mờ Toàn hạt có

vị ngọt, tính hàn, không độc, có tác dụng tiêu tích nhiệt, giải bách độc (các chất độc), dùng nấu ăn để tiêu thũng phù, hạ khí, giải nhiệt độc, giải các chất độc của thuốc và kim loại [7; 25 ] Đậu xanh cũng có thể nhai sống nuốt nước hoặc nếu dùng ngoài thì nhai đậu xanh lấy bã, đắp chữa giời leo, ngứa ngáy khó chịu Vỏ hạt đậu xanh được Chu Văn An phối hợp với các vị thuốc khác trong thang "Thần tiên cứu khổ" chữa bệnh ôn nhiệt, sốt cao, hôn mê, co giật

Y học cổ truyền còn dùng vỏ hạt đậu xanh phối hợp với kim ngân hoa, liên kiều, cam thảo sắc uống để chữa ngộ độc cà độc dược [17; 29]

Đậu xanh có mặt trong một số phương thuốc trị tiêu khát; chữa phát

nóng, sưng quai hàm nhức nhối {Nam dược thần hiệu) hoặc phương thuốc giải

độc [22; 25 ị

Đậu dỏ (Phaseolus angularis Wight.) được sử dụng trong Đông y như

một vị thuốc có vị ngọl chua, lính bình, quy kinh tâm và tiểu trường; có tác dụng lợi Ihuỷ, hành huyết tiêu thũng, bài nùng (tiêu mủ) Đậu đỏ có thể dùng

để trị thuỷ thũng (phù), tả lỵ, ung nhọt sưng tấy Hiện nay, nhân dân ta thường

Tổng quan

dùng để chữa phù thũng, dùng ngoài giã nát đắp lên nơi mụn nhọt, sưng tấy [7; 9; 25; 29]

Loài Phaseolus vulgaris L.) du nhập vào nước ta muộn hơn nên kinh

nghiệm sử dụng còn chưa phong phú Trong tài liệu của Đỗ Tất Lợi [25], chưa

thấy tác giả đề cập tới loài Phaseulus vulgaris L như là một vị thuốc Tuy

nhiên, theo các tác giả Võ Vãn Chi, Lê Khả Kế, Vũ Văn Chuyên, loại đậu này được trồng lấy vỏ quả và quả non còn tươi, hạt được dùng làm thuốc giảm đau

và làm dịu Đậu còn non do chứa nhiều inositol nên là chất hồi sức cho tim[91.

Trong Đông y, cũng có khi phối hợp hai loại đậu xanh và đậu đỏ cùng với đậu đen (lượng bằng nhau) làm thành phương thuốc phòng bệnh ôn nhiệt mùa hè Ị 17]

1.5 HƯỚNG NGHIÊN c ứ u MÓI CỦA LUẬN VĂN VỂ ĐẬU XANH

VÀ ĐẬU ĐỞ

1.5.1 N ghiên cứu về đậu xanh

Hiện nay, vấn đề nhiễm độc, đặc biệt là những nhiễm độc trường diễn với liều nhỏ dài ngày các chất gây độc với cơ thể đang là vấn đề được xã hội quan tâm Có rất nhiều tác nhân gây độc với cơ thể là những chất hay gặp trong môi trường sống hoặc môi trường làm việc của một số ngành nghề nhất định Nhiễm độc chì là một trong những vấn đề hiện đang được các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực quan tâm và tìm hướng giải quyết

Các sản phẩm có chì đang được sử dụng nhiều trong sản xuất và đời sống, từ bình ắc quy, dường ống dãn nước đến cái bát ăn đều có chứa ít nhiều hàm lượng chì Nước ta hiện đang sử dụng xăng pha chì cho các loại động cơ của phương tiện giao thông Chính vì vậy, trong không khí có một lượng bụi chì lớn được thải ra từ xăng động cơ Theo ước tính của các nhà khoa học, với

Tổng quan

tốc độ phát triển này thì đến năm 2 0 1 0 , hàm lượng chì trong không khí ở nước

ta sẽ tăng gấp 2 -2,5 lần Chì có ảnh hưởng đến hệ thần kinh gây các bệnh lý

về não do chì (nếu nhiễm lượng chì lớn) hoặc nhiễm độc mãn (nếu nhiễm lượng chì nhỏ và dài ngày) Đặc biệt, đối với írẻ em, nhiễm độc chì trường diễn là một trong các nguyên nhân làm giảm chỉ số IQ (chỉ số thông minh) Ngộ độc chì là một bệnh nghề nghiệp đã được xác định Các biểu hiện ngộ độc chì đã được quy (linh với các triệu chúng cấp tính và những hậu quả lâu dài; nhưng khả năng gây đột biến của chì còn ít dược đề cập tới Tác giả Nông Thanh Sơn trong luận án PTS của mình đã bước đầu có đề cập tới những rối loạn NST khi tiếp xúc với chì [28]

Đậu xanh đã được sử dụng trong dân gian với tác dụng giải độc rất có hiệu quả Xuất phát từ kinh nghiệm này, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu tác dụng phòng và giải độc của đậu xanh đối với nhiễm độc chì - một loại nhiễm độc đang dược quan tâm Để tiếp tục với hướng nghiên cứu về tác dụng chống đột biến của đậu xanh, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tác dụng phòng chống đột biến của đậu xanh trên chuột nhiễm độc chì Theo kinh nghiệm sử dụng của dân gian, đậu xanh có thể dùng toàn hạt để giải độc Như vậy, ngoài thành phần flavonoid của vỏ hạt đậu xanh , các thành phần khác trong nhân hạt cũng có thể đóng vai trò nhất định trong tác dụng sinh học của toàn hạt Chính vì vậy, trong nội dung nghiên cứu về hoá học, chúng tôi nghiên cứu về thành phần hoá học của nhân hạt làm cơ sở cho thử nghiệm tác dụng sinh học của hạt đậu xanh toàn phần

1.5.2 N ghiên cứu về đậu đỏ

Trong giai đoạn hiện nay, ycu cầu xét nghiệm về NST để phát hiện bệnh

di truyền do đột biến NST cũng như để phát hiện các đột biến NST do tác động của các tác nhân trong môi trường càng ngày càng nhiều Do vậy, yêu

Tổng quan

Hiện nay, loại PHA được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm sinh học là loại do hãng Difco cung cấp với giá thành tuỳ theo từng loại: với lọ 5mg PHA1 giá 6 8 USD; PHAL giá 74,4 USD; PHAp giá 11 USD và PHA M giá

19 USD (số liệu năm 1998 do Sigma cung cấp) [46] Giá thành chế phẩm PHA trên thị trường quốc tế là khá cao, trong khi đó, với nguồn dược liệu sẵn có ở trong nước, đậu đỏ có thể là nguyên liệu để sản xuất PHA ngay trong nước đạt các tiêu chuẩn về chất lượng và giá trị sử dụng, có thể đánh giá theo các chế phẩm có tiêu chuẩn quốc tế

Với mục tiêu đưa nguồn dược liệu trong nước vào sử dụng, đề tài này nhằm nghiên cứu sâu hơn về thực vật, thành phần hoá học của toàn hạt cũng như nghiên cứu khả mine kích thích phân bào của dịch chiết protein trong hạt đậu đỏ của Việt Nam, so sánh với chế phẩm PHA của hãng Difco

C ôiiíị trình tốt nghiệp thục s ĩ dược học

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ

Các mẫu hạt đảm bảo yêu cẩu: hạt đậu mẩy đều, vỏ láng bóng, tương đối đều nhau; đậu không bị mốc, không bị mối mọt; đậu không qua các chất bảo quản

Ký hiệu m ẫu nghiên cúu

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.2 N ghiên cứu về hoá học

2.2 2 I Đ ịnh tính các nhóm chất trong dược liệu

♦ Định tính một số chất vô cơ bằng quang p h ổ ph át xạ tia X

Thí nghiệm dựa trên nguyên tắc: mọi nguyên tố vô cơ khi được đốt cháy bằng hồ quang sẽ phát ra bức xạ có bước sóng xác định Đo bước sóng này sẽ xác định được thành phần vô cơ có mặt trong mẫu chất và cường độ bức xạ sẽ phụ thuộc vào hàm lượng chất Phương pháp này cho phép xác định các nguyên tố có mặt trong cây nghiên cứu

Tiến hành trên máy phát huỳnh quang ,H,T-2 và đo trên máy quang phổ l/ICn-30 (Nga) tại Trung tâm phân tích thí nghiệm địa chất - Cục địa chất và khoáng sản Việt Nam

♦ Định tính các nhóm chất hữu cơ

Tiến hành theo phương pháp định tính các nhóm chất chính được mô tả trong tài liệu [3; 4; 5; 11] để định tính các nhóm chất flavonoid, alcaloid, glycosid tim, coumarin, saponin, antraglycosid, tanin, acid hữu cơ, chất béo, sterol, tinh bột và protein

2 2 2 2 Phân tích thành phần flavonoid

♦ Chiết xuất flavonoict toan phán theo phương pháp mô tả ở tài liệu [11].

♦ Phân lập thành phần chính theo phương pháp sắc ký giấy chế hoá và sắc ký cột [1 1]

Sắc ký cột: chất hấp phụ Silicagel G (MERCK) Kích thước cột 1,5 X 35 cm

Sắc ký giấy chế hoá: Giấy Whatman N° 4

♦ Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy u v - 3101 PC (SHIMADZU) tại Phòng thí nghiêm Hoá - Viện Kỹ thuật hình sự Bộ Công An

♦ Phổ hồng ngoại (IR) FTIR - 8101M (SHIMADZU) đo ở dạng viên nén KBr tại Phòng thí nghiệm Hoá - Viện Kỹ thuật hình sự Bộ Công An

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

♦ Phổ khối đo trên máy 5989 B - MS (HEWLETT PACKARD) tại Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên, Trung tâm khoa học và công nghệ quốc gia

2.2.2.3 Phân tích thành phần protein

♦ Chiết xuất protein toàn phần được tiến hành theo phương pháp của Muray

p Deutscher [41]

♦ Điện di dịch chiết thô protein hạt trên gel polyacrylamid, so sánh với chất

chuẩn là lectin ( Phaseolus vulgaris L.) type p (SERVA) Gel sau khi điện dị,

các vạch protein được nhuộm bằng Comassie Blue [38]

♦ Xác định và phân tấch sơ bộ các thành phần protein hạt bằng các phương pháp sắc ký khác nhau:

Bước 1: Sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G200 Đây là phương pháp sàng lọc phân tử Kích thước cột 1,5 X 120cm

Bước 2: sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE-Sephadex A50 Đây là quá trình sắc ký dựa trên nguyên tắc trao đổi ion Kích thước cột 3,0 X 60 cm

♦ Hàm lượng protein trong các dịch nghiên cứu được tính bằng phương pháp

đo quang ở bước sóng X = 280 nm theo tỷ lệ: lm g protein/ml tương ứng vói

MĐQH bằng 1 [41]

2.2.3 N ghiên cứu tác dụng sinh học

2 2 3 I T hăm dò khả năng chống đột biến NST của Đậu xanh

Phương tiên

♦ Chế phẩm thử:

- Dịch chiết đậu xanh toàn phần (X1+2)

- Flavonoid toàn phần vỏ hạt đậu xanh (FXj)

♦ Yếu tố khí hậu phòng thí nghiệm: độ ẩm, nhiệt độ và độ chiếu sáng theo quy định

♦ Súc vật thí nghiêm: chuột nhắt trắng (Mus musculus) thuần chủng dòng Swiss (Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội cung cấp)

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

- 40 chuột đực (trọng lượng trung bình 21 g ± 3 g)

- 30 chuột cái có chửa (trọng lượng trung bình 26 g ± 2 g)

Phương pháp nghiên cứu

♦ Đánh giá đột biến ở tế bào tủy xương

- Tiêu bản NST từ tế bào tuỷ xương được làm theo phương pháp của Ford [36]

- Tiêu bản NST được đánh giá theo các quy định quốc tế với-các dạng đột biến: đột biến về số lượng bao gồm lệch bội (trên hoặc dưới 40 NST); đa bội (3n hoặc 4n); đột biến cấu trúc bao gồm các dạng đứt gẫy NST và các dạng cấu trúc lại NST như chuyển đoạn, NST hai tâm, NST hình vòng

- Đánh giá 50-100 tế bào / chuột ở kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần

♦ Đánh giá đột biến từ tế bào tinh hoàn

- Tiêu bản NST từ tế bào tinh hoàn được làm theo phương pháp của Evans

có cải tiến [34]

- Tiêu bản NST được đánh giá theo các quy định quốc tế với các dạng đột biến: đột biến số lượng bao gồm lệch bội (trên hoặc dưóti 2 0 thể lưỡng tribivalent), đa bội; đột biến cấu trúc bao gồm thể đơn trị, univalent NST thường hoặc cặp NST giới tính, các dạng chuyển đoạn tạo NST hình chuỗi hoặc hình vòng; NST bị đứt

- Đánh giá 50-100 metaphase-Diakinesis cho mỗi chuột ở kính hiển vi với

độ phóng đại 1 0 0 0 lần

♦ Đánh giá tác động của acetat chì đến sự phát triển phôi thai

Đánh giá các chỉ số: số trứng làm tổ; số thai sống (số chuột con còn sống); số thai chết sớm (biểu hiện bằng những điểm tụ máu trong tử cung); số thai chết muộn, số chuột con bị dị dạng

♦ Các số liệu thu được của nhóm nhận acetat chì và nhóm chứng, nhóm nhận acetat chì có bảo vệ bằng dịch chiết đậu xanh toàn phần và ílavonoid từ vỏ hạt

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

đậu xanh được so sánh và xử lý thống kê bằng test X2 trên phần mềm MS- Excel 97

2 2 3 2 N ghiên cứu khả năng kích thích phân bào của đậu đỏ đối với

tê bào lym pho người

Phương tiên

♦ Chế phẩm thử:

Dịch chiết protein toàn phần của đậu đỏ (Phaseolus vulgaris L.) được

chiết xuất theo hai quy trình khác nhau ở khâu diệt khuẩn (ký hiệu là PDọ.I và PDọ.II)

- PHA dạng p (của hãng Difco) để so sánh

♦ Đối tượng thí nghiệm: Lympho bào nuôi cấy của 10 người (5 nam, 5 nữ) không mắc các bệnh tật di truyền, không tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến

Phương pháp nghiên cứu

♦ Đánh giá chuyển dạng lympho bào (lymphocyte transformation) và đánh giá tần suất phân bào (mitotic rate):

Lympho bào của người được nuôi cấy theo phương pháp của Moorhead

có cải tiến [40]: Cho 5 giọt chế phẩm thử (tương đương 0,25 ml) vào 3 - 4 ml máu Dưới tác dụng của PHA hồng cầu bị ngưng kết lắng xuống dưới, bạch cầu nổi ở lớp huyết tương ở trên Dùng pipet hút lấy phần huyết tương có bạch cầu cho vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn bao gồm 6ml môi trường F10

(Difco) có bổ sung 2 ml huyết thanh bê (Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội cung cấp) Nuôi cấy 72 giờ trong tủ ấm 37°c Thu hoạch tế bào vào giờ thứ 72: sau khi ly tâm 1 0 0 0 v/ph, phần cặn của tế bào được cố định bằng dung dịch Camoy, sau đó lại ly tâm 1000 v/ph,lấy phần cặn tế bào ở dưới đáy ống ly tâm dàn lên phiến kính sạch để đánh giá lympho bào chuyển dạng và lympho bào

ở các kỳ phân chia (từ kỳ đầu đến kỳ cuối)

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Các chỉ số được đánh giá: - Chỉ số chuyển dạng lympho bào

- Tần suất phân bào

♦ Đánh giá tê bào (lympho bào) phân chia ở kỳ giữa:

Để đánh giá đột biến NST chủ yếu người ta dựa vào tình trạng của các tế bào ở kỳ giữa Lympho bào được cấy trong 72 giò; vào giờ thứ 70, quá trình phân bào được ức chế bằng Colcemid (hãng Fluka)

Đột biến NST được đánh giá dựa trên việc xác định tỷ lệ đột biến số lượng NST: tế bào lệch bội (tế bào có 44 hoặc 45 NST), tế bào đa bội (tế bào

có 3n = 69 NST hoặc 4n = 92NST), xác định các tế bào có đột biến cấu trúc kiểu NST (đột biến xảy ra trên cả hai NStử của NST) hoặc đột biến kiểu NStử (đột biến chỉ xảy ra trên một trong hai NStử của NST)

♦ Để đánh giá khả năng kích thích phân bào của PHA từ đậu đỏ Việt Nam, trong mô hình nghiên cứu của mình, chúng tôi nuôi cấy song song 3 lọ cấy:

- 1 lọ có PDt.I

- 1 lọ có PDt.II

- 1 lọ có PHA dạng p của Difco (Mỹ)

Các số liệu chuyển dạng lympho bào, tần suấl phân bào và tỷ lệ tế bào có

đột biến NST ở kỳ giữa được so sánh và xử lý thống kê bằng test ỵ 2 trên phần

mềm MS-Excel 97

Côny trình tốt nghiệp thạc s ĩ dược học

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

3.1 NGHIÊN CỨU VỂ THựC VẬT

3.1.1 M ỏ tả đặc điểm thực vật

3.1.1.1 Đ ặc điểm thực vật cây đậu xanh

Lấy mẫu cây trồng tại Đan Phượng (Hà Tây) quan sát thấy các đặc điểmsau:

Cây thảo, mọc thẳng đứng, cao khoảng 60 - 80 cm Lá có 3 lá chét hình trái xoan, màu lục sẫm, có lông ở cả hai mặt Hoa mọc thành chùm rất dày đặc

ở nách lá, chùm hoa dài khoảng 1 5 - 2 0 cm Hoa màu vàng lục Quả đậu hình trụ mảnh, hơi có lông khi còn non, sau thì nhẵn, kích thước 2 x 7 - 1 0 cm Quả chứa nhiều hạt nhỏ phân cách nhau bởi vách ngăn Hạt hình trụ ngắn, gần hình cầu, kích thước 0,4 - 0,5 X 0,3 cm, vỏ hạt có màu xanh, bên trong lớp vỏ hạt có màu vàng (Hình 1)

G.s Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa học là Vigna radiata (L.) Wilczek

Fabaceae (Phụ lục 1).

3.1.1.2 M ô tả đặc điểm thực vật cây đậu đỏ

Lấy mẫu cây trồng tại Thanh Trì (Hà Nội), quan sát thấy các đặc điểmsau:

Cây thảo thấp, cao khoảng 30 - 40 cm, hơi có lông Thân có gờ cạnh Lá mọc so le, lá kép có 3 lá chét hình trái xoan, nhọn; lá giữa hình thoi, mặt trên thường có lông và ráp; cuống thường dài 1 0 - 15 cm, bên trên có rãnh; có 3 lá kèm nhỏ Hoa mọc thành chùm ở nách lá, mỗi chùm có 1 - 2 hoa màu trắng Đài hoa hình chuông Tràng hoa không đều Quả loại đậu, dài khoảng 1 0 - 3 0

cm, đầu hình mỏ Hạt hình thận, có vỏ màu đỏ thẫm, bên trong lớp vỏ hạt có màu trắng đục, kích thước 1,5 - 2 X 0,7 - 0,8cm (Hình 2)

Thực nghiệm vù kết quả

GS Vũ Văn Chuyên đã xác định tên khoa học là Phaseolus vulgaris (L.)

Fabaceae (Phụ lục 1).

3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu

3.1.2.1 Đ ặc điểm bột hạt đậu xanh

Bột đậu xanh có màu vàng nhạt Khi soi dưới kính hiển, quan sát thấy những đặc điểm sau: hạt tinh bột, mảnh mô mềm, mảnh vỏ hạt (Hình 3)

3.1.2.2 Đ ặc điểm bột hạt đậu đỏ

Bột đậu đỏ có màu trắng hồng Khi soi dưới kính hiển vi, quan sát thấy một số đặc điểm: hạt tinh bột, mảnh mô mềm, mảnh vỏ hạt và mạch xoắn (Hình 4)

4M áè,

Hình 1 Cây đậu xanh (Vigna radiata Wilczek)

a Cây mang quả; b.Hạt

Hình 2 Cây đậu đỏ (Phaseolus vulgaris L.)

a Cây mang hoa; b Cây mang quả; c Hạt

0,05 mm

Hình 3 Một số đặc điểm bột hạt đậu xanh

Vigna radiata Wilczek

1 Hạt tinh bột; 2 Mảnh mô mềm; 3 Mảnh vỏ hạt

0,05 mm 0,1 mm

Hình 4 Một số đặc điểm bột hạt đậu đỏ

Phaseolus vulgaris L.

1 Hạt tinh bột; 2 Mảnh vỏ hạt; 3 Mảnh mô mềm;

4 Mảnh mạch

Thực nghiệm và kết quả

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHAN HOÁ HỌC

3.2.1 Đ ịnh tính các nhóm chất trong dược liệu

3.2.1.1 Định tính thành phần vỏ cư

Tiến hành do quang phổ phát xạ các mẫu dược liệu Xj, X2, Dj, D2

Dược liệu được đốt cháy thành than, cho vào cốc nung ở nhiệt độ khoảng

400 - 500°c cho đến khi than trắng hoàn toàn Nhồi than vào điện cực của máy huỳnh quang và đo trên máy quang phổ

*: Hàm lượng % của các nguyên tô' tính theo trọng lượng tro của mẫu nhồi vào điện cực.

Từ kết quả phân tích, chúng tôi sơ bộ kết luận:

Vỏ hạt và nhân hạt đậu xanh có 14 nguyên tố, trong đó có 12 nguyên tố giống nhau và có 2 nguyên tố khác nhau (Sr và Ti có trong vỏ hạt còn Mo và

Pb có trong nhân hạt) Nguyên tố K chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong hạt đậu xanh (5% trong vỏ hạt và 1 0% trong nhân hạt)

Trong vỏ hạt đậu đỏ có 13 nguyên tố, còn nhân hạt đậu đỏ chỉ có 12 nguyên tố Các nguyên tố có mặt ở nhân hạt đều có ở vỏ hạt, riêng Ti chỉ có trong vỏ hạt, không có ở nhân hạt đậu đỏ K cũng là nguyên tố có tỷ lệ lớnnhất ở cả vỏ hạt và nhân hạt đậu đỏ (> 1 0%)

3.2 I.2 Đ ịnh tính các nhóm chất hữu cơ

Định tính bằng phản ứng hoá học trong ống nghiệm đổ phát hiện các nhóm chất: Flavonoid, alcaloid, glycosid tim, coumarin, saponin,antraglycosid, tanin, acid hữu cơ, chất béo, sterol, tinh bột, protein

Quá trình chiết để định tính sơ bộ được tóm tắt trong sơ đồ 1

Kết quả định tính được trình bày trong bảng 4

Thực nghiệm và kết quả

So đồ 1 - Tóm tắt quá trình chiết đê định tính một sỏ nhóm chất hoá học

trong dược liệu.

Thực nghiệm và kết quả

Qua kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ, chúng tôi rút ra kết luận như sau:

♦ Hạt đậu xanh

- Vỏ hạt có thành phần chính là flavonoid Ngoài ra còn có tanin với tỷ lệ thấp

- Nhân hạt có thành phán chính là protein và tinh bột

♦ Hạt đậu đỏ

- Vỏ hạt cũng có thành phần chính là flavonoid Bên cạnh đó, đậu đỏ cũng có tanin với tỷ lệ thấp

- Nhân hạt có thành phần chính là protein, tinh bột

Từ kết quả định tính sơ bộ các thành phần hữu cơ trong dược liệu, chúng tôi nhận thấy flavonoid và protein đều là những thành phần hoá học chính có trong hai dược liệu này Căn cứ vào kết quả này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hai thành phần chính là flavonoid trong vỏ hạt và protein trong hai loại hạt

Để tiện cho việc nghiên cứu, chúng tôi ký hiệu các mẫu flavonoid toàn phần và protein toàn phần như sau:

- 3 3

-Thực nghiệm và kết quả

3.2.2 N ghiên cứu thành phần flavonoid trong vỏ hạt

3.2 2 I C hiết xuất flavonoid toàn phần (FX! và FDj)

Quá trình chiết xuất flavonoid được tiến hành theo sơ đồ 2

So đồ 2 Sơ đồ chiết xuất flavonoid toàn phần FXj (từ Xj) và FDj (từ D ị )

Nguyên liệu

Nguyên liệu đã loại tạp

Ether dầu hoả Soxhlet, t° (loại tạp)

Thực nghiệm và kết quà

3.2.2.2 Phân tích FXi từ vỏ đậu xanh bằng sắc ký lóp m ỏng

FXj thu được sau quá trình chiết xuất là bột vô định hình có màu vàng tươi Tiến hành phân tích FX, bằng SKLM để kiểm định với kết quả đã công bố về flavonoid của vỏ đậu xanh

♦ Hệ dung môi khai triển

Hỗn họp flavonoid toàn phần FX1 được tiến hành phân tích bằng sắc ký lớpmỏng với một số hệ dung môi sau:

♦ Thuốc thử hiện màu

1 Vanilin trong acid sulfuric đặc

2 dd AICI3 trong methanol 2%

3 Hơi amoniac

♦ Kết quả phân tích

Qua kết quả phân tích bằng SKLM với một số hệ dung môi trên, nhận thấyFX] tách tốt nhất ở hệ 1 và 3, trong đó số vết tách được nhiều nhất là ở hệ 3 ( 6

vết) Sau đây là kết quả phân tích ở hệ 3 (bảng 5 và hình 5)

Bảng 5 Kết quả phán tích SKLM FXj ỏ hệ dung môi AcOEt - HCOOH - H20 (80:10:10) STT R fx l0 0

vàngđâm

vàngđâm