XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG cây DIỆP hạ CHÂU ĐẮNG

Cây Diệp hạ châu (Chó đẻ) dần dần trở thành một cái tên dược liệu phổ biến rộng khắp trong nhân dân vì tiếng lành đồn xa rằng cây này trị bệnh gan rất tốt. Trong quá trình tìm hiểu chúng tôi đã được nghe kể nhiều về các trường hợp trị khỏi bệnh gan mãn tính nhờ uống Diệp hạ châu. Có thể mua uống dưới dạng cây tươi, dược liệu khô, các sản phẩm thuốc điều trị hỗ trợ trên thị trường. Ngày càng có nhiều chế phẩm từ dược liệu mà thành phần chính là Diệp hạ châu được sản xuất và bán rộng rãi. Y học hiện đại cũng đã chứng minh các thành phần trong cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn có công dụng hữu ích trong điều trị viêm gan, làm sạch kháng nguyên bề mặt HbsAg, tăng hoạt tính của enzyme gan, ít độc với cơ thể. Chi Phyllanthus còn có nhiều cây có tác dụng làm thuốc như Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus emblica L., Phyllanthus niruri L,… Đặc biệt là thành phần lignan (phyllanthin và hypophyllanthin) có trong cây P. amarus được cho là có tác dụng chính trong việc bảo vệ tế bào gan, có khả năng chống khối u. Tuy nhiên không phải loài Phyllanthus nào cũng chứa các thành phần này. Hiện nay có rất nhiều chế phẩm từ Phyllanthus trên thị trường nhưng chưa có một phương pháp kiểm nghiệm nào đầy đủ để định tính, định lượng hàm lượng các thành phần lignan có trong các sản phẩm trên thị trường nếu đi mua, và hàm lượng trong từng loài dược liệu Diệp hạ châu nếu chúng ta thu hái về. Uống thuốc không đúng lượng, đúng thuốc càng nguy hiểm hơn không uống, có thể gây những tác hại về sau không kiểm soát được. Trong khuôn khổ bài khóa luận tốt nghiệp chúng tôi đặt vấn đề “Xây dựng quy trình định lượng phyllanthin trong cây Diệp hạ châu đắng (P. amarus) bằng phương pháp HPLC”, với các mục tiêu cụ thể : • Xác định độ tinh khiết của mẫu thu hái. • Khảo sát các điều kiện định lượng phyllanthin trong chi Phyllanthus bằng phương pháp HPLC. • Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC. • Ứng dụng quy trình để định lượng phyllanthin trong một số mẫu thu thập được.

NGUYỄN THÙY TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

PHYLLANTHIN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

(Phyllanthus amarus Schum.et Thonn.

Euphorbiaceae)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2009

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2

1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 2

1.1 Vị trí phân loại của chi/loài 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Vị trí phân loại 2

1.2 Giới thiệu về loài 3

1.2.1 Sơ lược về các loài Diệp hạ châu 3

1.2.2 Phân biệt các loài Diệp hạ châu 3

2 TỔNG QUAN VẾ HÓA HỌC 6

2.1 Lignan 6

2.1.1 Định nghĩa 6

2.1.2 Cấu trúc 6

2.1.3 Phân bố trong thực vật 7

2.1.4 Tác dụng dược lý 7

2.1.5 Lignan trong chi Phyllanthus 8

2.2 Alkaloid 9

2.3 Tannin 9

2.4 Flavonoid 10

2.5 Các chất khác 10

3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG 10

3.1 Tác dụng dược lý 10

3.2 Công dụng 12

3.2.1 Công dụng trong y học cổ truyền 12

3.2.2 Các bài thuốc trị bệnh gan 13

3.2.3 Sản phẩm trên thị trường 13

4.1 Định tính 15

4.2 Định lượng 16

5 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) 18

5.1 Định nghĩa 18

5.2 Cấu tạo cơ bản 18

5.3 Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm, nghiên cứu, dược liệu và hợp chất tự nhiên 19

5.3.1 Định tính dược liệu và hợp chất tự nhiên [20] 19

5.3.2 Định lượng dược liệu và hợp chất tự nhiên 19

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

1.1 Nguyên liệu 21

1.2 Dung môi hóa chất 21

1.3 Trang thiết bị và vật liệu nghiên cứu 21

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nghiên cứu thực vật học 22

2.2 Nghiên cứu hóa học 22

2.3 Xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin 22

2.3.1 Khảo sát điều kiện chiết xuất định lượng phyllanthin trong P amarus bằng HPLC 22

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23

2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin trong P amarus bằng HPLC 23

2.3.5 Định lượng các loài Phyllanthus thu thập được 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT HỌC 24

1.1 Đặc điểm hình thái 24

1.1.1 Diệp hạ châu đắng (P amarus) 24

1.1.2 Diệp hạ châu răng cưa (P urinaria) 24

1.1.3 Diệp hạ châu (P sp.) 24

1.2 Đặc điểm giải phẫu 26

1.2.1 Lỗ khí 26

1.2.2 Vi phẫu lá 26

1.2.2.Vi phẫu thân 27

2 THỬ TINH KHIẾT 27

3.1.1 Xây dựng đường cong chuẩn 28

3.1.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống của chuẩn 29

3.2 Khảo sát dung môi chiết 29

3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký 30

3.3.1 Khảo sát tốc độ dòng 30

3.3.2 Khảo sát tỉ lệ dung môi 32

3.4 Khảo sát phương pháp chiết 34

3.5 Khảo sát lần chiết 34

3.6 Quy trình chiết Phyllanthin từ P amarus 35

3.7 Thẩm định quy trình định lượng lignan bằng phương pháp HPLC 37

3.7.1 Khảo sát tính tuyến tính 37

3.7.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống 37

3.7.3 Khảo sát độ lặp lại 37

3.5.4 Khảo sát độ đúng 38

3.8 Quy trình định lượng lignan từ P amarus 42

3.8.1 Chuẩn bị mẫu 42

3.8.2 Điều kiện sắc ký 42

3.8.3 Tiến hành sắc ký 42

3.8.4 Tính toán kết quả 42

3.9 Định lượng các loài thuộc chi Phyllanthus thu thập được 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI 45

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ KẾT LUẬN 45

ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

P amarus : Phyllanthus amarus.

P urinaria : Phyllanthus urinaria

tR : thời gian lưu

As : hệ số kéo đuôi

S : diện tích đỉnh

BĐM : bình định mức

CHCl3 : cloroform

SPE : Solid Phase Extraction

PDA : Photo Diod Array Detector

H2SO4 : acid sulfuric

Bảng 2.1: Phân biệt các loài Diệp hạ châu [1] 5

Bảng 2.2: Điều kiện chạy của phương pháp 16

Bảng 4.3: So sánh kiểu lỗ khí của các loài Diệp hạ châu 26

26

Bảng 4.4: So sánh vi phẫu lá các loài Diệp hạ châu 27

Bảng 4.5: So sánh vi phẫu các loài Diệp hạ châu 27

27

Bảng 4.6: Kết quả thử tinh khiết các loài Diệp hạ châu 28

Bảng 4.7: Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 28

Bảng 4.8: Tính tương thích hệ thống của chuẩn 29

Bảng 4.9: Kết quả so sánh 2 PP chiết 34

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử 37

Bảng 4.11: Kết quả độ lặp lại 38

Bảng 4.12: Kết quả khảo sát cách thêm chuẩn 39

Bảng 4.13: Kết quả khảo sát cách hòa tan và lọc 40

40

Bảng 4.14: Kết quả khảo sát độ đúng 41

Bảng 4.15: Kết quả khảo sát độ phục hồi của hệ thống 41

Hình 2.1: Sắc ký đồ của phương pháp, (2) phyllanthin 17

Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo máy HPLC 18

Hình 4.3.Hình ảnh 3 loài Diệp hạ châu 25

Hình 4.4: Cành mang lá và quả của 3 loài Diệp hạ châu 25

Hình 4.5: Lỗ khí của 3 loài Diệp hạ châu 26

Hình 4.6: Vi phẫu lá P.amarus 26

Hình 4.7: Vi phẫu lá P.urinaria 26

Hình 4.8: Vi phẫu thân các loài Diệp hạ châu 27

Hình 4.9: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 0,7 ml/phút 31

Hình 4.10: Sắc ký đồ với tốc độ dòng 1 ml/phút 31

Hình 4.11: Sắc ký đồ các tốc độ dòng khác nhau: (- ): 1 ml/phút; ( - ): 0,7 ml/phút; 32

( -): 0,8 ml/phút; ( - ): 0,9 ml/phút 32

Hình 4.12: Sắc ký đồ MeOH:H2O (30:70) 33

Hình 4.13: Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (33:67) 33

Hình 4.14: Sắc ký đồ hệ MeOH:H2O (35:65) 33

Hình 4.15: Sắc ký đồ của khảo sát độ lặp lại 38

Hình 4.16: Sắc ký đồ 3D của P amarus 43

Hình 4.17: Sắc ký đồ của mẫu P amarus 44

Hình 4.18: Sắc ký đồ của mẫu P sp 44

Hình 4.19: Sắc ký đồ của mẫu P urinaria 44

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Đồ thị đường cong chuẩn của phyllanthin 28

Biểu đồ 4.2: Sự thay đổi hàm lượng phyllanthin theo dung môi chiết 30

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ

Cây Diệp hạ châu (Chó đẻ) dần dần trở thành một cái tên dược liệu phổ biến rộngkhắp trong nhân dân vì tiếng lành đồn xa rằng cây này trị bệnh gan rất tốt Trongquá trình tìm hiểu chúng tôi đã được nghe kể nhiều về các trường hợp trị khỏi bệnhgan mãn tính nhờ uống Diệp hạ châu Có thể mua uống dưới dạng cây tươi, dượcliệu khô, các sản phẩm thuốc điều trị hỗ trợ trên thị trường Ngày càng có nhiều chếphẩm từ dược liệu mà thành phần chính là Diệp hạ châu được sản xuất và bán rộngrãi

Y học hiện đại cũng đã chứng minh các thành phần trong cây Diệp hạ châu đắng

Phyllanthus amarus Schum et Thonn có công dụng hữu ích trong điều trị viêm gan,

làm sạch kháng nguyên bề mặt HbsAg, tăng hoạt tính của enzyme gan, ít độc với cơ

thể Chi Phyllanthus còn có nhiều cây có tác dụng làm thuốc như Phyllanthus

urinaria L., Phyllanthus emblica L., Phyllanthus niruri L,…

Đặc biệt là thành phần lignan (phyllanthin và hypophyllanthin) có trong cây P.

amarus được cho là có tác dụng chính trong việc bảo vệ tế bào gan, có khả năng

chống khối u Tuy nhiên không phải loài Phyllanthus nào cũng chứa các thành phần

này

Hiện nay có rất nhiều chế phẩm từ Phyllanthus trên thị trường nhưng chưa có một

phương pháp kiểm nghiệm nào đầy đủ để định tính, định lượng hàm lượng cácthành phần lignan có trong các sản phẩm trên thị trường nếu đi mua, và hàm lượngtrong từng loài dược liệu Diệp hạ châu nếu chúng ta thu hái về Uống thuốc khôngđúng lượng, đúng thuốc càng nguy hiểm hơn không uống, có thể gây những tác hạivề sau không kiểm soát được

Trong khuôn khổ bài khóa luận tốt nghiệp chúng tôi đặt vấn đề “Xây dựng quy

trình định lượng phyllanthin trong cây Diệp hạ châu đắng (P amarus) bằng phương

pháp HPLC”, với các mục tiêu cụ thể :

• Xác định độ tinh khiết của mẫu thu hái

• Khảo sát các điều kiện định lượng phyllanthin trong chi Phyllanthus bằng

phương pháp HPLC

• Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC

• Ứng dụng quy trình để định lượng phyllanthin trong một số mẫu thu thậpđược

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN VÊ THỰC VẬT HỌC

1.1 Vị trí phân loại của chi/loài

1.1.1 Tên gọi.

Diệp hạ châu, Chó đẻ , Cam kiềm, Rút đất, Khao ham (Tày), Me đất

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum et Thonn., Phyllanthus urinaria L.,

Họ Thầu dầu thường đặc trưng bởi hoa đơn tính, hoa đực luôn có nhụy tiêu giảm,hoa cái có nhụy thường gồm 3 lá noãn Noãn thường đảo và có nút do vách bầu làmthành, đậy kín lỗ noãn, sau này để lại di tích trên hạt mà người ta gọi là mồng Quảnang mở thành 3 mảnh hay bội số của 3 Hạt của nhiều loài chứa nhiều dầu Láthường đơn nguyên và có hai lá kèm ở hai bên

Vị trí của loài [3]:

Ngành: Ngọc lan – Magnoliophyta

Lớp: Ngọc lan – Magnoliopsida

Phân lớp: Ngọc lan – Magnoliidae

Liên bộ: Thầu dầu – Euphorbiaceae

Họ: Thầu dầu – Euphorbiaceae

Chi: Phyllanthus.

Loài: amarus, urinaria.

1.2 Giới thiệu về loài.

1.2.1 Sơ lược về các loài Diệp hạ châu.

Sinh thái phân bố.[2]

Chi Phyllanthus L có nhiều loài Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong đó đáng chú ý là 2 loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria có hình dáng gần

giống nhau, mọc rải rác ở khắp nơi, trừ vùng núi cao lạnh Trên thế giới các loài nàycũng có vùng phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới châu Á khác như Ấn Độ,Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Nam Trung Quốc

Diệp hạ châu là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫntrong các bãi cỏ, ở ruộng cao (đất trồng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ởvùng đồi Cây con mọc từ hạt từ cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè vàtàn lụi vào giữa mùa thu Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gầnnên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loài cỏ dại và câytrồng khác

Gần đây, cây Diệp hạ châu mới được nghiên cứu trồng thực nghiệm Cây không kénđất, ưa ẩm, úng ngập ít ngày cây vẫn sống được

Mùa hoa tháng 4-6 và mùa quả tháng 7-9

Bộ phận dùng toàn cây Diệp hạ châu bỏ rễ, rửa sạch, dùng tươi hoặc sấy khô.

1.2.2 Phân biệt các loài Diệp hạ châu.

1.2.2.1 Diệp hạ châu đắng (Diệp hạ châu thân xanh) (Phyllanthus amarus).[1]

Cây thảo, mọc đứng, cao 20-40 cm, phân nhánh đều từ gốc lên ngọn Thân tiết diệntròn màu xanh lục tươi, nhẵn, không có nhựa mủ Cành mang lá dài 6-10 cm, màuxanh lục tươi, hai bên gốc cành có hai vảy nhỏ, rời, hình tam giác, màu nâu

Lá đơn, màu lục nhạt, mọc cách trên cành trông giống lá kép lông chim Phiến láhình bầu dục, mặt trên xanh, mặt dưới mặt dưới mốc hơi trắng Mép lá nguyên, gốc

lá đối xứng, gân lá kiểu lông chim Cuống lá rất ngắn chỉ khoảng 0,5 mm, màuxanh

Cụm hoa mọc thành chụm 2 hoa ở nách lá, gồm 1 hoa đực và 1 hoa cái, hoa cái hơi

to hơn hoa đực và đôi khi mọc riêng lẻ

Quả nang nằm dưới lá , hình cầu nhẵn, hơi dẹp, mang lá đài tồn tại phủ 1/3 quả, chia thành 3 mảnh vỏ, mỗi mảnh có 2 van chứa 2 hạt Hạt màu nâu, có 5-6 rãnh dọc

ở mặt lưng [1]

1.2.2.2 Diệp hạ châu ( Diệp hạ châu răng cưa) (Phyllanthus urinaria).[1]

Cây thảo, mọc đứng, cao 20-50cm, ít phân nhánh và nhánh tập trung trên cao Tiếtdiện tròn, có cạnh lồi, màu xanh tía hoặc hơi tía, nhẵn, không có nhựa mủ Cànhmang lá dài 4-10cm, có cạnh lồi, màu đỏ tía, phần non của cành phủ lông ngắn mịn,hai bên gốc có 2 vẩy nhỏ, rời, hình tam giác màu đỏ tía

Lá đơn, màu xanh đậm, hoặc hơi đỏ, mọc so le trên cành giống như lá kép lôngchim, xếp xít nhau ở phần ngọn, thưa hơn ở phần gốc cành Phiến lá dày, hình bầudục hoặc trái xoan ngược, đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên xanh đậm, mặt dưới mốc,mép lá có lông ngắn giống như răng cưa, gân lông chim Cuống lá rất ngắn

Cụm hoa có hoa đực mọc thành chụm hai hoa ở nách lá, về phía 1/3 ngọn cành Hoacái mọc riêng lẻ ở nách lá phía gốc cành, hơi to hơn hoa đực

Quả nang nằm dưới lá, quả già có màu đỏ nâu, mặt ngoài có nhiều u lồi sần sùi,hình cầu hơi dẹp, mang 6 lá đài tồn tại, phủ 1/3 quả Cuống quả rất ngắn 0,5mm.Hạt màu nâu, có rãnh ngang vuông góc ở mặt lưng

1.2.2.3 Diệp hạ châu (Phyllanthus sp.)

Thân thảo, mọc đứng, cao 30-100 cm, ít phân nhánh, tiết diện thân gần tròn nhưngcó cạnh, màu xanh đậm, nhẵn, không có nhựa mủ Cành mang lá dài 5-15 cm, tiếtdiện tròn hơi có cạnh, phù ở gốc, màu lục đậm, gốc cành đỏ tía, cành con mọc rủxuống, hai bên gốc có hai vẩy nhỏ, rời, màu xanh nhạt [1]

Lá đơn, mọc so le trên cành trông giống như một lá kép lông chim, xếp thưa Phiến

lá dày, hình bầu dục, thon nhọn hai đầu, mặt trên xanh lục đậm, măt dưới hơi mốchơn, mép lá nguyên, gân lá kiểu lông chim Cuống lá rất ngắn, màu xanh

Cụm hoa có hoa đực mọc thành chụm 2-3 hoa ở nách những lá phía gốc cành, hoacái hơi to hơn hoa đực mọc riêng lẻ ở nách những lá từ giữa lên đến đầu ngọn cành.Quả nang nằm dưới lá, màu xanh lục, vỏ quả nhẵn, hình cầu hơi dẹp, mang 6 lá đàiđồng trưởng, phủ 2/3 quả Cuống quả 1,5 mm

Hạt màu nâu, hình tam giác, có 5-6 rãnh dọc ở mặt lưng

Thân Chiều cao 10-40 cm.

Phân cành đều từ dướigốc

Tròn, xanh lục, nhạt,nhẵn

20-50 cm

Ít phân cành, tậptrung phân cành trêncao

Có cạnh lồi, đỏ tíacó lông

30-90 cm

Phân cành đều

Tròn, xanh lụcđậm, nhẵn

Mặt trên xanh nhạt, mặtdưới hơi mốc

Không rõ

Không có lông

(6-13× 4-6 mm)Bầu dục hay trứngngược, mũi nhọn ởđầu, gốc lá lệch

Mặt trên xanh đậm,mặt dưới mốc

RõCó lông ngắn nhưrăng cưa

10-12× 4-6 mmBầu dục, 2 đầuthuôn nhọn

Mặt trên xanhđậm, mặt dướimốc trắng

Luôn mọc riêng lẻtrong nách lá ở 2/3phía dưới của cành

Không chung vớihoa cái, mọc riêngthành chụm 2 hoatrong nách những lá

ở 1/3 phía ngọn

Luôn mọc riêng lẻtrong nách lá 2/3phía dưới ngọncành

Không chung vớihoa cái, mọc riêngthành chụm 2-3hoa trong náchnhững lá ở 1/3phía gốc cành

Tồn tại, phủ 1/3 quả

Hơi đỏ, có u sần sùi

Tồn tại, phủ 1/3 quả

Xanh lục đậm,nhẵn

Đồng trưởng, phủ2/3 quả

Hạt Rãnh dọc ở mặt lưng Rãnh ngang ở mặt

lưng

Rãnh dọc ở mặtlưng

2 TỔNG QUAN VẾ HÓA HỌC

2.1 Lignan

2.1.1 Định nghĩa

Lignan là một nhóm các hoạt chất tự nhiên gặp trong các loài thực vật Lignan đượchình thành từ acid cinnamic và những chất liên quan sinh hóa học đến sự chuyểnhóa của phenylalanin

Lignan được chia làm 3 nhóm chính: lignan, neolignan, oxyneolignan

2.1.2 Cấu trúc

Cấu tạo cơ bản của lignan.

Lignan là hợp chất tạo thành bởi sự nối giữa β- β’ của carbon trung tâm 2 đơn vị từ1-phenylpropan (cầu nối ở vị trí 8-8’) (1)

O

8'

8

7' 8' 6'

7

8

Từ nhóm này có 3 nhóm phụ được phân biệt bởi vị trí cầu nối sẽ được đọc theo cách

số carbon của cầu nối nào nhỏ hơn sẽ được đọc trước (2)

Oxyneolignan: 2 đơn vị C6C3 được nối bởi 1 nguyên tử oxy của ether và không nốitrực tiếp khung cơ bản.

hợp khi nuôi cấy mô một thời gian dài người ta cũng tìm thấy lignan

2.1.4 Tác dụng dược lý

Tác dụng chống khối u.

Lignan rất được quan tâm do một số chất thuộc nhóm lignan có tác dụng kháng khối

u Điều này thể hiện rất rõ ở nhóm lignans podophyllotoxin, có nhiều trong nhựa

chiết xuất từ các loài thuộc chi Podophyllum, những lignan này cũng được báo cáo

có độc tính tế bào trên các thử nghiệm sàng lọc về độc tính Lignans từ các nhómcấu trúc khác cũng thể hiện rõ tác dụng kháng khối u

Phyllanthin và hypophyllanthin không kháng lại chu trình tế bào ở động vật có vúnhưng cả 2 lại có tác dụng trung gian cùng với vinblastin kháng lại tế bào KB [14]

Tác dụng trên hệ tim mạch.

Một vài chất trong nhóm lignan được báo cáo có tác dụng trên hệ tim mạch.Podophyllotoxin và picropodophyllin có tác dụng làm tăng nhịp tim trên tim cô lập.Đặc biệt là diglucoside của pinoresinol

Hypophyllanthin chiết xuất từ cây P amarus có tác dụng ức chế đăc hiệu trên kênh Ca2+.

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương.

Lignan có cả hai khả năng trên ức chế và thư giãn thần kinh (+)-Nortrachelogeningây căng thẳng trên thỏ và prostalidins A,B và C sản xuất chất làm dịu thần kinhtrên chuột cống và chuột nhắt Chất bisepoxylignan glycoside, simplexoside có tácdụng làm dịu trên hệ thần kinh chuột trong khi aglycon lại kích thích Một số lignan

của chi Schizandra đã được báo cáo có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương Một một ether chiết xuất từ Magnolia obovata được báo cáo có tác dụng làm dịu và giãn cơ.

Tác dụng kháng độc tế bào gan.

Một số lignan trong quả của Schizandra, một dược liệu dùng trong y học cổ truyền

của người Trung Hoa, được biết có tác dụng cải thiện tình trạng hủy hoại do nhiễmđộc của tế bào gan và làm tăng cường hồi phục chức năng gan đã bị nhiễm độc

Mặc dù chưa có chứng minh rõ ràng lắm nhưng nhận thấy các chất có tác dụng thìcùng có ít nhất một nhóm methylenedioxy trong khi những chất không có tác dụngthì không có sự hiện diện của nhóm này

Các lignan trong chi Phyllanthus như phyllanthin, hypophyllanthin và các lignan

khác trong cây thuộc nhóm có tác dụng ức chế men polymerase DNA, một enzymecần thiết cho vi khuẩn viêm gan B tái sản xuất Các lignan này cũng có chứamethylenedioxy trong công thức [17]

2.1.5 Lignan trong chi Phyllanthus.

Lignan không phải là một hợp chất thường gặp trong các cây thuộc chi Phyllanthus,

nhưng về tác dụng sinh học nó có vai trò khá quan trọng trong cây Chỉ có khoảng1/3 loài trên tổng số 23 loài đã được khảo sát hóa học thấy có sự hiện diện của

lignan[9] Các lignan của chi Phyllanthus cho thấy phần lớn thuộc nhóm lignan đơn

giản dibenzylbutan hoặc nhóm 2,7’cyclolignan, có nối hay không nối vòngcarboxyclic (gọi là cyclolignan) và các dẫn xuất thuộc nhóm này Theo các tài liệunghiên cứu đây chính là khung của những chất có tác dụng trị ung thư, kháng khuẩnvà đặc biệt là tác dụng trên siêu vi gây viêm gan Nhóm methylendioxyphenyl có

trong công thức của 31 lignan trong số 33 lignan của các loài trong chi Phyllanthus

có thể xem như yếu tố bắt buộc trong yếu tố kháng khối u Đặc biệt các lignan trong

P amarus Schum et Thonn có chứa nhóm này trong công thức nên chúng được

xem là các chất chính có hoạt tính kháng khối u trong cây [15]

MeO MeO

Lignan đơn giản dibenzylbutane 2,7’-cyclolignan

Phyllanthin và hypophyllanthin có trong lá P amarus chính là hai lignan đại diện

cho hai nhóm trên Chúng được nhiều tài liệu công bố có tác dụng sinh học đáng

chú ý như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, đặc biệt là trị viêm gan [5].

CH2OCH3

CH2OCH3

OMe OMe

MeO

MeO

CH2OCH3

CH2OCH3O

O

OMe OMe MeO

CH2OCH3MeO

O O MeO

CH2OCH3

CH2OCH3

OMe OMe OMe

O

O

Nirtetralin Phyltetralin Lintetralin Niranthin

Khảo sát thành phần lignan của P urinaria L người ta thấy ngoài các lignan đã biết tương tự như của P amarus Schum et Thonn còn có sự hiện diện của 4 lignan khác trong rễ P urinaria L là 5-demethoxy niranthin, urinatetralin, dextrobursehernin,

urinaligan Các lignan hầu hết được tìm thấy trong phân đoạn chiết với dung môikém phân cực, chủ yếu là từ dịch chiết n-hexan [16]

2.2 Alkaloid

Các alkaloid của chi Phyllanthus phần lớn có khung sercurinan, ngoài ra có một số

alkaloid trong khung có biến đổi nên có khung nor-securinan

Theo tham khảo tài liệu cho thấy thành phần alkaloid của 2 loài P amarus và P.

urinaria có những khác biệt Không thấy có báo cáo nào về thành phần alkaloid

trong P urinaria Tuy nhiên có nghiên cứu gần đây trên BM Dược liệu, ĐH Y Dược TP.HCM cho thấy trong P urinaria có nirurin, iso-bubbialine giống như trong cây

P amarus và có phần alkaloid kém phân cực hơn khác hẳn trong cây P amarus.

Trong lá của P amarus có securinine [4], phyllanthine, 6-isobubbialine, nirurin.

2.3 Tannin

Có một số tannin như acid gallic, acid ellagic, corilagin…

Và có tannin thuộc nhóm cấu trúc ellagitanin.

Từ một chế phẩm trà của P amarus, các tác giả Nhật đã phân lập được geraniin, một tannin thủy phân được và chất này cũng được tìm thấy trong P urinaria.

2.4 Flavonoid

Từ P amarus và P urinaria người ta đã tách được 5 flavonoid bao gồm: quercetin,

astragalin, quercitrin, isoquercitrin và rutin Các flavoloid này được coi là nhữnghợp chất có tác dụng ngăn chặn gốc tự do

2.5 Các chất khác

Các acid hữu cơ như acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanic Ngoài ra còn cón-octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, acid triacontanic,phylanthurinolacton, stigmasterol, methyl brevifolincarboxylat

3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG

3.1 Tác dụng dược lý

Tác dụng trị ung thư

Sử dụng dịch chiết nước P amarus cho chuột bị gây ung thư biểu mô gan bằng

N-nitrosodiethylamine (NDEA) đã tăng đáng kể tỉ lệ sống sót [13] Bên cạnh đó dịchchiết nước này cũng có hoạt tính chống chất gây ung thư 20- methylcholanthrene(20-MC) Hai hoạt tính này có thể liên quan đến việc ức chế hoạt hóa chuyển hóacủa chất sinh ung thư và ức chế chất điều hòa chu kỳ tế bào

Ngoài tác dụng trị ung thư, P amarus còn làm giảm độc tính của một số thuốc trị

ung thư như Cyclophosphamid (CTX) do cải thiện số lượng bạch cầu, số tế bào tủy

xương và số monocyte bị giảm Tác dụng này được giải thích là do P amarus làm

tăng glutathion (GSH) và glutathione-S-transferase (GST)

Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần alkaloid trong Diệp hạ châu có tác dụngđộc tế bào trên thử nghiệm với dòng tế bào ung thư CaCo2 Hai alkaloid thu được từ

P amarus có là nirurine và epibubblialine có tác dụng rõ trong mô hình thử nghiệm

này Tuy nhiên mức độ tác dụng của các alkaloid tinh khiết không bằng phân đoạnalkaloid chứa chúng [1]

Tác dụng chống đột biến là yếu tố chiếm vị trí quan trọng trong báo cáo về hoạt tínhchống ung thư Các báo cáo cho biết khi dùng dịch chiết Diệp hạ châu trên tế bàonuôi cấy nhận thấy chúng làm ngừng hoặc ức chế sự đột biến của tế bào (bao gồmtế bào gan bị đột biến do chất hóa học) Diệp hạ châu ức chế các enzym phụ tráchsản sinh và phát triển tế bào ung thư hơn là khả năng diệt tế bào ung thư (khảo sát

với tế bào sarcoma, carcinoma, và lymphoma) [18].

Tác dụng trên gan.

Trong thử nghiệm về hoạt tính bảo vệ gan của P amarus chống lại tổn thương gan

gây thực nghiệm trên chuột cống trắng, cao cồn của toàn cây (liều uống 100 mg/kg × 7)

đã biểu lộ tác dụng bảo vệ đáng kể thông qua những thông số hóa sinh của huyếtthanh và gan Phân đoạn chiết với Buthanol có hoạt tính bảo vệ gan cao nhất, liềuuống 50 mg/kg × 7 có tác dụng bảo vệ 35-85% Phân đoạn chiết với nước có tácdụng bảo vệ gan nhẹ (20-40%)

Phyllanthin và hypophyllanthin có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống trắngchống tính độc hại tế nào gây bởi carbon tetraclorid và galactosamin

Theo nghiên cứu tác dụng hạ enzyme gan trên tế bào CaCo2 thì P amarus có tác dụng vượt trội hơn so với P urinaria [1].

Các nghiên cứu ban đầu trên 22 bệnh nhân viêm gan siêu vi B cho kết quả chỉ sau

30 ngày dùng dịch chiết P amarus đã sạch hoàn toàn yếu tố bề mặt (HbsAg).

Nhóm nghiên cứu Đan Mạch nhận thấy nếu dùng các dược liệu phối hợp thì cho kếtquả hạ enzyme gan tốt hơn là dùng riêng lẻ [5]

Tác dụng kháng HIV

Các nhà khoa học người Đức nhận thấy dịch chiết nước cũng như dịch chiết cồn của

P amarus có khả năng ức chế sao chép của HIV-1 trong tế bào Hela CD4+ Một

dịch chiết giàu gallotannin cho thấy có hoạt tính mạnh và các gallotannin geraniinvà corilagin là có hoạt tính mạnh nhất

Ngoài ra các thành phần trong P amarus có hoạt tính ngăn chặn sự sao chép sớm

torng chu trình sống của HIV-1, ngăn sự hấp thu virus và ức chế RT (enzym saochép ngược) của virus

Nhóm HIV-1 và 2 đề kháng với chất ức chế RT cũng nhạy cảm với amarus [6].

Tác dụng khác

Dịch chiết methanol của P amarus ức chế sự thương tổn và viêm dạ dày do dùng

ethanol tuyệt đối Tỉ lệ tử vong, chỉ số loét cũng như chảy máu trong bụng giảm khi

được dùng P amarus.

Diệp hạ châu đắng có tác dụng loại sạch các gốc tự do và các superoxid, các gốchydroxyl và các lipid peroxide Các phản ứng viêm là do sự bộc phát các chất oxyhóa từ đại thực bào nên nhiều chất chống oxy hóa có thể hiệu quả trong việc làmgiảm phản ứng viêm, trong đó có viêm dạ dày

Một cơ chế khác có thể trong hoạt tính ức chế thương tổn dạ dày do cồn do sự hình

thành một lớp bảo vệ gồm các polyphenol có trong P amarus với các protein của dạ dày bằng liên kết kị nước Ngoài ra P amarus còn có thể ức chế sự tổng hợp

prostaglandin giống như các thuốc kháng viêm non steroid [7]

3.2 Công dụng

3.2.1 Công dụng trong y học cổ truyền

Trong dân gian thường dùng lẫn lộn giữa 2 loài diệp hạ châu nên việc phân biệttrong việc sử dụng không rõ và không được chính thức

Diệp hạ châu được dùng chữa đau, viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lởngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má Ngoài ra còn dùng chữabệnh gan, sốt, rắn rết cắn, và dùng cây tươi giã đắp, hoặc dịch ép cây tươi bôi ngoài,liều lượng không hạn chế [2]

Ở Đông Nam Á cây Diệp hạ châu đắng được ưa dùng hơn Từ Hải Nam đến

Indonesia, P amarus dưới dạng thuốc sắc hoặc chè được dùng uống để lợi tiểu và

điều trị bệnh về thận và gan, cơn đau bụng và bệnh hoa liễu, làm thuốc long đờm trị

ho, thuốc hạ sốt, điều kinh và trị tiêu chảy [2]

1/ Chữa nhọt độc sưng đau: cây Diệp hạ châu một nắm với 1 ít muối giã nhỏ, chếnước chín vào ,vắt lấy nước cốt uống, bã đắp chỗ đau (Bách gia trân tàng)

2/ Chữa bị thương ứ máu: lá cành cây Diệp hạ châu và Mần tưới mỗi thứ một nắmgiã nhỏ, chế đồng tiện (nước tiểu trẻ em trai) vào, vắt lấy nước uống, bã đắp Hoặchòa thêm bột Đại hoàng 8-12 g thì càng tốt (hoạt nhân toát yếu)

3/ Chữa bị thương đứt, bị chém, chảy máu: cây Diệp hạ châu với vôi giã nhỏ, đắpvào vết thương (Bách gia trân tàng)

4/ Chữa lỡ loét thối thịt không liền miệng: lá cây Diệp hạ châu, lá Thồm lồm, bằngnhau, Đinh hương 1 nụ giã nhỏ đắp

5/ Chữa bệnh chàm (eczema) mãn tính: cây Diệp hạ châu vò, xát nhiều lần, làmliên tục hàng ngày sẽ khỏi

6/ Chữa viêm gan vàng da, viêm thận đái đỏ hoặc viêm ruột tiêu chảy, hoặc mắtđau sưng đỏ: cây Diệp hạ châu 40 g, Mã đề 20 g, Dành dành 12 g, sắc uống

7/ Chữa sốt rét (triệt ngược thang): cây Diệp hạ châu 8 g, Thảo quả, dây Hà thủ ô,

lá Mãng cầu ta tươi, Thường sơn, Dây gắm mỗi vị 10 g, Binh lang, Ô mai, Dây cóc mỗi vị

4 g

Sắc với 600 ml nước, còn 200 ml chia uống 2 lần trước khi lên cơn sốt rét 2 giờ

Nếu không hết cơn thêm Sài hồ 10 g.

8/ Chữa ăn không ngon miệng, đau bụng, sốt, nước tiểu màu sẫm: cây Diệp hạ châu

1 g, Nhọ nồi 2 g, Xuyên tâm liên 1 g

Tất cả những vị thuốc trên phải phơi trong râm và tán bột Sắc bột thuốc này vàuống hết ngay một lúc Uống mỗi ngày 3 lần (Y học dân gian Ấn Độ)

3.2.2 Các bài thuốc trị bệnh gan.

Bài 1: 20-40 g Diệp hạ châu tươi sao khô, sắc nước uống Có thể cho thêm chútnước chanh vào nước sắc, chia uống 4 lần trong ngày

Bài 2: Diệp hạ châu, Rau má, mỗi thứ một nắm nhỏ sắc uống hàng ngày

Bài 3: Diệp hạ châu 80 g, Cỏ mần trầu 10 g, Tinh tre 20 g, Lá chanh 20 g, phèn chua

16 g , Nhân trần 60 g, Chi tử 40 g, Hà thủ ô 60 g, dùng 3 l nước sắc đặc lấy nửa lít,chia đều uống trong 6 ngày

Bài 4: 30-50 g Diệp hạ châu tươi rửa sạch, ¼ trái thơm tươi sắc lát mỏng, 50-100 ggan heo tươi xắt lát mỏng ướp chút muối Xếp từng lớp xen kẽ, chưng cách thủytrong khoảng 45 phút Mỗi ngày hoặc cách ngày ăn một lần, liên tục trong 2 tháng.Bài 5: Diệp hạ châu, cây Lưỡi rắn, Bán chi liên, đồng lượng (10-20 g), sắc nướcuống mỗi ngày

3.2.3 Sản phẩm trên thị trường

Viên thuốc VG-5 (Cty cổ phần Dược Danapha)

Thành phần mỗi viên: Cao diệp hạ châu 100 mg

Cao cỏ nhọ nồi 50 mg Cao nhân trần 130 mg Cao râu bắp 50 mgCông dụng: hạ men gan, tăng cường chức năng gan, phục hồi tế bào gan, hỗ trợđiều trị viêm gan cấp và mãn tính

Diệp hạ châu (Cty cổ phần Dược phẩm 2/9 – Nadyphar).

Dạng bào chế: viên nang

Công dụng: bảo vệ tế bào gan

Trà Diệp hạ châu: do trung tâm nghiên cứu và chế biến cây thuốc thuộc Viện Dược

liệu (Bộ Y Tế) nghiên cứu và đưa vào sản xuất

Công dụng: là trà thảo mộc, tốt trong việc làm giảm men gan dùng trong các trường

hợp mụn nhọt, mẫn ngứa, viêm gan siêu vi B.

Viên giải độc Gan HAMEGA: được bào chế từ cao khô Diệp hạ châu đắng với

hàm lương cao (3g), nguồn dược liệu sạchvà chuẩn hóa theo mô hình G.A.P manglại tác dụng ưu việt: Giúp giải độc gan do bia rượu, bảo vệ và phục hồi tế bào gan,góp phần loại trừ dấu hiệu nhức đầu, chóng mặt, buồn nôn, mệt mỏi, thiếu tập trungsau khi uống Hamega giúp hạ men gan, hỗ trợ điều trị bệnh gan nhiễm mỡ, viêmgan, xơ gan

Livsin-94 (Công ty cổ phần dược phẩm Hà Tây)

Dạng bào chế và quy cách đóng gói: viên bao phim, hộp 5 vỉ × 10 viên

Thành phần: Diệp hạ châu 1500 mg, chua ngút 250 mg, nhọ nồi 250 mg

Chỉ định: viêm gan do siêu vi B, viêm gan virus và viêm gan mãn Suy giảm chứcnăng gan Phòng và điều trị xơ gan

Chống chỉ định: người mẫn cảm với thuốc, phụ nữ có thai, người tỳ vị hư hàn, ỉachảy

Phyllanthus Complex

Đóng gói: một chai chứa 120 viên nang

Công thức: 1 viên chứa

- Cao chiết (lá) Phyllanthus amarus: 200 mg.

- Cao chiết (hạt) Silybum marianum (chứa 80% silymarin): 200 mg.

- Cao chiết (rễ) Taraxacum officinale: 200 mg

Lợi ích: cung cấp tác dụng bảo vệ gan hiệp lực của 3 loại thảo dược trong một côngthức, hỗ trợ cơ chế giải độc pha II của gan và tăng cường hiệu quả của glutathione,nâng đỡ chức năng của hệ tiêu hóa, túi mật, thận và gan

Cách dùng: 1 viên hay 2 viên 3 lần/ngày trong bữa ăn hoặc theo hướng dẫn của bácsỹ

Diệp hạ châu- BVP (BV pharma).

Thành phần: chất chiết được từ 1660 mg dược liệu khô diệp hạ châu tương đương

250 mg cao khô

Chỉ định: viêm gan, đau yết hầu, đinh râu, mụn nhọt, viêm thần kinh da, lở ngứa,sản hậu ứ huyết, trẻ em cam tích, người lớn viêm thận, phù thũng, viêm nhiễm, sỏiđường tiết niệu

Liều dùng: ngày uống 3 lần, mỗi lần 3-4 viên, trẻ em uống 2 lần, mỗi lần 1-2 viên.

4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

4.1 Định tính

DĐVN III có chuyên luận về Diệp hạ châu răng cưa (P urinaria) với các tiêu chuẩn

điển hình của dược liệu: mô tả vi học, độ tro, định tính [10]

Dự thảo DĐVN IV thì có thêm chuyên luận về Diệp hạ châu đắng (P amarus).

Một số tiêu chuẩn phân tích P amarus theo WHO [8]:

Vật lạ: < 1,0%

Đất cát: không được có

Sự xâm nhập của côn trùng: (-)

Sự nhiễm bẩn do loài ngậm nhấm: (-)

Độ ẩm:: <8,0% kl/kl

Tro: 7,0% kl/kl

Tro không tan trong acid: tối đa 4,5%

Hàm lượng chất chiết được trong cồn: 12-20% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong ether dầu hỏa: 1,5-3,2% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong chloroform: 0,3-1,0% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong methanol: 10,0 – 18,0% kl/kl

Hàm lượng chất chiết được trong cồn: 12-20% kl/kl

Phân tích thành phần hóa học: phyllanthin > 0,3% và hypophyllanthin >0,3%kl/kl bằng HPLC

4.2 Định lượng

Trong nước và trên thế giới có những bài nghiên cứu về định lượng alkaloid, lignan

trong cây P amarus ứng dụng những kỹ thuật sắc ký hiện đại.

Qui trình định tính và định lượng alkaloid (nirurine, epibubbialine) bằng sắc kýmicel điện động [1]

Trường ĐH Quốc Gia Đài Loan đã phân tích và định tính thành phần lignan trong

cây P urinaria bằng phương pháp HPLC [20] Cân 110 g dược liệu, được chiết xuất

với MeOH, lắc phân bố với CHCl3, và qua một giai đoạn loại tạp bằng cột SPE.HPLC được triển khai trên máy Agilent (Waldbronn, Germany), cột C8 (150 × 4.6

mm i.d.; 5 μm), sử dụng đầu dò PDA Bruker (Rheinstetten, Germany), phát hiện ởbước sóng 225 nm Điều kiện sắc ký ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Điều kiện chạy của phương pháp.

Kết quả là đã xác định được các lignan có trong cây P urinaria, trong đó có

phyllanthin Kết quả sắc ký đồ ở hình 2.1

Hình 2.1: Sắc ký đồ của phương pháp, (2) phyllanthin.

Phương pháp định tính trên có khá nhiều bất tiện, thời gian chuẩn bị mẫu lâu vàphức tạp, khối lượng dược liệu đem phân tích nhiều Sắc ký đồ chưa rõ, đường nềnkhông ổn định, thời gian lưu dài

Các nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu định lượng phyllanthin trong các loài thuộc

chi Phyllanthus bằng HP-TLC Với hệ dung môi hexane:acetone:ethyl acetate

(74:12:8), phát hiện bằng H2SO4 5%/cồn 960, quét ở bước sóng 530nm

Kết quả [11]:

Bên cạnh đó, các tác giả cũng khảo sát phyllanthin bằng phương pháp HPLC Sửdụng máy HPLC Shimadzu (Tokyo, Japan) model LC-10, đầu dò PDA ShimadzuSPD-M10 AVP, cột C18 Spherisorb S10 ODS2 (250 ×4.6 mm i.d.; 10 μm) Với cácđiều kiện sắc ký là pha động MeOH:H2O (30:70); tốc độ dòng (0,7 ml/phút); bướcsóng phát hiện 220 nm; tR 20,13

Trong tập hướng dẫn kiểm nghiệm cây P amarus của trung tâm nghiên cứu

(Research centre) ở Bangalore có kết quả định lượng phyllanthin bằng HPLC

>0,3% Chuẩn bị mẫu, cân 7g dược liệu, ngâm 50 ml CHCl3 trong 1 ngày, lọc lấy

Loài phyllanthin

dịch chiết, thực hiện 3 lần, gộp dịch chiết, cô đến cắn, hòa với MeOH trong bìnhđịnh mức 50 ml Với các điều kiện sắc ký: hệ dung môi, đệm (pH 2,8):Acetnonitril(83:17); bước sóng phát hiện 230 nm; tốc độ dòng 1,9 ml/phút; thể tích bơm: 20µl/phút [8]

Thành phần lignan trong các loài thuộc chi Phyllanthus còn chưa được thống nhất

giữa các bài nghiên cứu, hàm lượng của hoạt chất quan tâm còn chưa thực sự đượcđịnh lượng chính xác

5 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

5.1 Định nghĩa

Dựa trên những kỹ thuật và ứng dụng của sắc ký cột cổ điển, đồng thời đó cuốinhững năm 1960 đã sản xuất được những chất nhồi cột cỡ hạt khoảng 10µm có hiệusuất tách rất cao Cỡ hạt bé đòi hỏi dùng bơm để nén dung môi qua cột, với loại chấtnhồi này và hệ thống máy vi tính, kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp ra đời.[12]

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa cáchạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúnggiữa các pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh vàpha động

5.2 Cấu tạo cơ bản

Nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau có cùng 1 số bộ phậnkết nối với nhau:

Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo máy HPLC

1/ Hệ thống cung cấp pha động

5.3 Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm, nghiên cứu, dược liệu và hợp

Khi tiến hành HPLC phân tích, nếu một chất chỉ cho 1 đỉnh đối xứng, tách riêngbiệt không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì nó có khả năng là chất tinhkhiết.Việc xác định sẽ chắc chắn hơn nếu hệ thống có trang bị detector cung cácthông tin về cấu trúc như detector dãy diod quang detector MS, IR…

5.3.1.2 Định tính

Phương pháp “dấu vân tay” thường được áp dụng cho các dược liệu có thành

phần hóa học chưa được biết rõ Phương pháp này dựa trên cơ sở tiến hành phântích bằng HPLC một dịch chiết dược liệu, hay một phân đoạn chiết xuất từ dượcliệu trong điều kiện sắc ký phù hợp đã được xác định sao cho các thành phần cấutạo thể hiện tối đa trên sắc ký đồ

Phương pháp này còn được ứng dụng có hiệu quả vào việc theo dõi sự ổn định thểhiện qua sự già hóa của dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu trong quá trình tồntrữ và bảo quản từ đó xác định tuổi thọ của chúng Có thể áp dụng phương pháp

“dấu vân tay” để tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, kiểm nghiệm bán thành phẩm, thànhphẩm từ dược liệu

Phương pháp định tính với chất đánh dấu và chất chuẩn.

Khi có chất chuẩn việc định tính sẽ dễ dàng hơn, so sánh tR và dựa vào dữ liệu củacác phổ MS, IR… để xác định chất

Do dược liệu chứa nhiều thành phần khác nhau, việc định tính chúng bằng HPLC cóthể thực hiện dựa vào các hoạt chất chính hay dựa vào các chất đánh dấu

5.3.2 Định lượng dược liệu và hợp chất tự nhiên

5.3.2.1 Không có chất chuẩn

Có thể xác định hàm lượng của một hợp chất tự nhiên bằng HPLC dựa vào nguyêntắc định lượng dựa vào phân tích quy về 100% diện tích

5.3.2.2 Có chất chuẩn

Phương pháp chuẩn nội được thực hiện bằng cách cho chất chuẩn vào trong mẫu