Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng clenbuterol trong dịch sinh học động vật

Phân tích miễn dịch Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA là phương pháp được khuyến khích sử dụng để phát hiện nhanh các chất nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol.. Có nhiều phươn

mục lục

Đặt vấn đề

0

Phần I - Tổng quan

1.1 Giới thiệu về Clenbutrol

1.1.1 Cấu tạo, tính chất Clenbuterol

1.1.2 Tác dụng dược lý, độc tính

1.1.3 Thực trạng tình hình sử dụng Clenbuterol hiện nay

trên thế giới và Việt Nam

1.3.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

1.3.3 Phương pháp vi chiết pha rắn (SPME)

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3 Điều kiện dẫn xuất hoá

3.3.1 Nhiệt độ dẫn xuất hoá

3.3.2 Thời gian dẫn xuất hoá

3.4.2 Chuẩn bị cột chiết pha rắn SCX

3.4.3 Khảo sát điều kiện rửa sạch tạp chất

3.4.4 Thể tích dung môi rửa giải

3.4.5 Khảo sát hiệu suất chiết trên cột SCX

3.6 Phân tích Clenbuterol trên mẫu nước tiểu thỏ thực

Danh mục các bảng

Trang

Bảng 3.1: ảnh hưởng của nhiệt độ đến diện tích pic của CLB - TMS 37

Bảng 3.2: ảnh hưởng của nhiệt độ của thời gian thực hiện phản ứng đến diện tích pic của CLB - TMS 39

Bảng 3.3: ảnh hưởng của thể tích MSTFA đến diện tích pic của CLB - TMS 40

Bảng 3.4 Độ ổn định của phản ứng dẫn xuất hoá CLB 41

Bảng 3.5 Sự phụ thuộc giữa lượng dung môi rửa với khả năng rửa trôi CLB 44 Bảng 3.6 Độ thu hồi CLB theo các phân đoạn thể tích dung môi rửa giải 45

Bảng 3.7 Độ thu hồi CLB trên cột chiết pha rắn SCX 46

Bảng 3.8.Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của CLB - TMS 48

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát giới hạn định lượng 52

Bảng 3.10 Kết quả phân tích CLB trong nước tiểu thỏ theo từng ngày với liều uống 0,8 àg/kg 55

Bảng 3.11 Kết quả phân tích CLB trong nước tiểu thỏ theo từng ngày với liều uống 3,2 àg/kg 57

Danh mục hình

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị sắc kí khí 9

Hình 1.2 Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn 26

Hình 3.1 Các ion nhận dạng CLB - TMS 34

Hình 3.2 Sắc kí đồ và khối phổi của CLB - TMS chuẩn 35

Hình 3.3 Sắc kí đồ và khối phổi của CLB - TMS, sản phẩm thu được từ thực nghiệm 36

Hình 3.4 Mối liên hệ giữa nhiệt độ và diện tích pic 38

Hình 3.5 Mối liên hệ giữa thời gian phản ứng và diện tích pic 38

Hình 3.6 Mối quan hệ giữa thể tích MSTFA và diện tích pic 41

Hình 3.7 Phổ khối của CLB - TMS dạng SIM 42

Hình 3.8 Quy trình chiết CLB từ nước tiểu thỏ cho phân tích trên GC - MS 47

Hình 3.9 Mối quan hệ giữa nồng độ CLB và diện tích pic CLB - TMS 49

Hình 3.10 Sắc kí đồ của CLB - TMS ở giới hạn phát hiện 51

Hình 3.11 Sắc kí đồ của CLB - TMS ở giới hạn định lượng 53

SPE ChiÕt pha r¾n

SPME Vi chiÕt pha r¾n

WHO Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi

đặt vấn đề

Thể thao mang tính chất lành mạnh, mục đích của hoạt động thể thao là đem lại sự hiểu biết lẫn nhau, xích lại gần nhau hơn, cao hơn nữa là hợp tác, hoà bình và hữu nghị

Tuy nhiên, trên thực tế có những sự việc đáng tiếc xảy ra, một số vận

động viên chạy theo thành tích bất chấp sức khoẻ bản thân, bất chấp các

điều luật cấm trong thể thao, đã sử dụng các loại chất bị cấm như : chất kích thích, giảm đau, thuốc tăng đồng hoá, thuốc lợi tiểu, các hocmonpeptid và dẫn chất tương tự, gọi chung là chất doping

Trước tình hình đó, việc tổ chức kiểm tra, kiểm soát và phân tích các chất doping lạm dụng trong thể thao được phát triển mạnh mẽ trên toàn thế giới Tại Việt Nam chưa có một công trình nào công bố các nghiên cứu xây dựng qui trình chiết tách và xác định các chất doping Hiện tại, Việt Nam

đang rất cần thiết có những công trình nghiên cứu để xác định các chất doping phục vụ cho hoạt động thể thao Các chất doping có rất nhiều, nhưng nhóm thuốc tăng đồng hoá là được sử dụng nhiều nhất, trong đó clenbuterol là đại diện điển hình trong nhóm này

Không chỉ trong lĩnh vực thể thao mà trong lĩnh vực chăn nuôi hiện nay Clenbuterol cũng đã được Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hợp Quốc (FAO) và Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Việt Nam cấm đưa clenbuterol vào thức ăn gia súc do clenbuterol có tác hại đến sức khoẻ con người Theo Phó Viện trưởng Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền nam: “Trong 428 mẫu thức ăn gia súc, có đến 47 mẫu dương tính với chất thuộc nhóm β – agonist, phổ biến nhất là Clenbuterol” [5], [8], [13], [29]

Xuất phát từ những thực tế nói trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng clenbuterol trong

dịch sinh học động vật" nhằm bước đầu cung cấp dữ liệu thực nghiệm phục

vụ công tác giám định doping và kiểm nghiệm thực phẩm Để đạt được những mục tiêu trên nội dung bản luận văn thực hiện gồm:

• Xây dựng quy trình chiết pha rắn clenbuterol trong mẫu nước tiểu

• Xây dựng chương trình phân tích clenbuterol bằng sắc kí khí khối phổ

• Định lượng clenbuterol trong nước tiểu thỏ thực nghiệm cho uống clenbuterol

Phần i Tổng quan 1.1 Giới thiệu về Clenbuterol

1.1.1 Cấu tạo, tính chất Clenbuterol

1 - Tính chất hoá học :

Nhìn vào công thức cấu tạo hoá học của clenbuterol chúng ta thấy clenbuterol có 3 phản ứng hoá học đặc trưng đó là : Phản ứng diazo hoá của nhóm amin thơm (-NH2), phản ứng tạo este với axit hữu cơ của nhóm –OH alcol và phản ứng của -Cl gắn vào nhân thơm Nhóm thế clor sau khi vô cơ hoá, tạo tủa AgCl khi tác dụng với AgNO3 trong môi trường HNO3[4], [21]

CH3

Do những tác dụng phụ nên Clenbuterol đã bị cấm sử dụng trong y học

Trong thú y, CLB được sử dụng phổ biến để điều trị rối loạn hô hấp

do dị ứng cho ngựa Thương hiệu Ventifulmin do Ingelheime (Đức) sản xuất có mặt ở khắp nơi

Tuy nhiên CLB bị lạm dụng trong hoạt động thể thao, trong chăn nuôi Clenbuterol làm tăng khả năng chuyển hoá tổng hợp protein, giảm tích mỡ (nạc hoá trong chăn nuôi lợn, bò, gà ) Song clenbuterol lại có tác dụng phụ rất hại cho sức khoẻ con người sau khi sử dụng hoặc ăn phải thực phẩm tồn dư clenbuterol như gây tổn hại chức năng gan, gây rối loạn nhịp tim, tăng huyết áp, phù nề, tuỳ theo thể trạng của từng người [11], [22]

Sau khi vào cơ thể, clenbuterol được hấp thu nhanh và hầu như hoàn toàn sau khi uống, giai đoạn đầu gắn thêm gốc sulfat Nồng độ trong huyết tương đạt cao nhất sau 2 giờ 30 phút và kéo dài trong 6 giờ, thời gian bán thải khoảng 35 giờ Đào thải chủ yếu qua thận theo con đường nước tiểu [18], [21]

Liều sử dụng: 20 àg bằng đường uống, 2 lần trong ngày (có thể sử dụng liều 40àg), clenbuterol hydroclorid có thể sử dụng ở dạng hít, liều 20àg, hít 3 lần trong ngày [11]

1.1.3 Thực trạng tình hình sử dụng clenbuterol hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam

Trong những năm 1960 việc kiểm tra, kiểm soát lạm dụng clenbuterol trong lĩnh vực thể thao còn chưa được chú ý Sau đó đến những năm 1970 do việc lạm dụng khá nhiều các chất doping trong đó có clenbuterol nên tổ chức IOC đã có các quyết định cấm sử dụng clenbuterol cho các vận động viên thể thao, nếu phát hiện vận động viên nào sử dụng clenbuterol thì sẽ bị tước quyền thi đấu hoặc tước giải Trong lĩnh vực thể thao clenbuterol được xếp vào loại các chất doping Do tác dụng phụ có hại

đến sức khoẻ con người cho nên tổ chức FAO cũng đã cấm không được sử dụng clenbuterol trong chăn nuôi Hiện nay ở Việt Nam chưa có phòng thí nghiệm nào chuyên xét nghiệm chất doping nói chung, clenbuterol nói riêng trong thể thao cho nên chưa có bằng chứng là các vận động viên Việt Nam có sử dụng clenbuterol trong thi đấu hay không Do vậy đề tài đặt ra là hoàn toàn thiết thực Riêng trong lĩnh vực phân tích thức ăn chăn nuôi và thực phẩm ở Việt Nam cũng đã có 5 đơn vị đủ năng lực phân tích clenbuterol trong đó có Phòng giám định Hoá pháp lý – Viện Khoa học Hình sự – Bộ Công an Ngày 20/6/2002 Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn Việt Nam đã quy định cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thức ăn chăn nuôi, trong đó có chất clenbuterol Theo kết quả phân tích của Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam ngày 5/12/2006, trong 86 mẫu máu lợn khi giết mổ tại Thành phố Hồ Chí Minh, phát hiện gần 20% chứa β-agonist, phổ biến nhất

là clenbuterol - chất có thể gây tai biến tim Các nhà khoa học cũng khẳng

định: "nếu có trong máu, chất này chắc chắn có trong thịt lợn" Như vậy hiện nay ở Việt Nam có sử dụng clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi [5], [10], [13], [18]

1.2 Một số phương pháp định tính và định lượng Clenbuterol

Có 4 phương pháp thường được sử dụng để xác định clenbuterol:

1.2.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký bản phẳng được phát triển vào

đầu những năm 1950 và ứng dụng rộng rãi cho đến nay Phương pháp này

đòi hỏi ít thiết bị, rẻ tiền Tuy vậy khả năng phát hiện và độ nhạy còn hạn chế nếu so với một số phương pháp phân tích hiện đại như sắc kí khí hay sắc kí lỏng Sắc kí lớp mỏng được sử dụng cho phân tích định tính và bán

Rf (clenbuterol) 0,4 (hệ dung môi 1) và Rf (clenbuterol) 0,51 (hệ dung môi 2) [7], [17], [21]

1.2.2 Phân tích miễn dịch (ELISA)

Phân tích miễn dịch (Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA

là phương pháp được khuyến khích sử dụng để phát hiện nhanh các chất nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol Có nhiều phương pháp đã được sử dụng để phân tích, thậm chí có thể định lượng được các chất nhóm này từ trong mẫu nước tiểu hoặc trong thực phẩm

Phân tích miễn dịch có thể tiến hành theo nhiều kiểu (mode) khác nhau:

- Miễn dịch phóng xạ (Radio immunoassay - RIA)

- Miễn dịch enzym (Enzyme Multiplied Immunoassay Technicque - EMIT)

- Miễn dịch kích thích huỳnh quang (Fluorescence Excitation Transfert Immunoassay - FETIA)

- Miễn dịch phân cực huỳnh quang (Fluorescence polarisation Immunoassay - FPIA)

ứng dụng chủ yếu của phân tích miễn dịch là phát hiện sơ bộ Giới hạn ứng dụng của nó là tính kháng chéo của các kháng thể sử dụng trong phân tích miễn dịch Một số kết quả nghiên cứu chỉ ra, trong một số trường hợp cụ thể, các kháng thể sử dụng không chỉ tương tác với đối tượng chất phân tích mà còn có thể có hoạt tính với chất khác tương tự có mặt trong mẫu phân tích Điều này có thể dẫn đến những kết quả dương tính giả Vì vậy khi áp dụng phân tích CLB, để đi đến kết luận khẳng định cần kết hợp thêm với phương pháp khác như sắc ký khí khối phổ hay sắc ký lỏng hiệu năng cao khối phổ [25], [33]

1.2.3 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nguyên lý:

HPCL dựa trên nguyên lý sắc kí lỏng, là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha: pha tĩnh rắn và

pha động lỏng Qúa trình tách theo cơ chế phân bố, hấp phụ hay trao đổi ion tuỳ thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha tĩnh sử dụng Đặc trưng của kỹ thuật là cột được nhồi với các tiểu phân có kích thước nhỏ (thường từ 3 – 10 àm), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất cao và đạt được hiệu quả tách tốt hơn nhiều so với sắc ký lỏng thông thường Vì vậy kỹ thuật này được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao [7], [19], [23], [28]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng phân tích rất tốt các chất doping nhóm tăng đồng hoá trong đó có clenbuterol Giới hạn phát hiện CLB bằng phương pháp này rất cao nhất là khi ghép nối khối phổ Daniel Zalko và các cộng sự đã đưa ra điều kiện phân tích cho clenbuterol trong đối tượng mẫu dịch chiết sinh học:

- Cột: Utra base C18 ( 250 x 4,6 mm, 5àm), cột bảo vệ: Hypersi BDS C18 pre-guard column (18 x 4,6 mm, 5 àm)

- Dung môi: Amoni acetat 10 mM pH 3,2 /Acetonitril (95/5)- (Dung môi A)

- Amoni acetat 10 mM pH 3,2/Axetonitril (30/70) – Dung môi B

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Gradient nồng độ: 0 – 4 phút, 100% A; 4 – 10 phút từ 100% A

đến 95% A (5% B); 10 – 30 phút, giữ 95%A (5% B); 30 – 35 phút từ 5%

B (96%A) đến 40 %B; 35 – 45 phút, 60% A và 40%B; 45 – 47 phút 100%B

Detector: Khối phổ (MS – Sim, Scan), giới hạn phát hiện là 0,3 àg/l nước tiểu [22], [26]

Lehnert khi tiến hành phân tích clenbuterol từ huyết thanh ngựa cho

sử dụng CLB liên tiếp trong 10 ngày với lượng 0,8àg/kg (ngày) Sử dụng

cột sắc ký nền Silica C8 bằng phân tích HPLC-MS-MS Phổ khối lượng lựa

chọn ion mẹ m/z 278 bắn phá các mảnh ion con phân tích chọn lọc SIM đối

với MS lần 2 Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện đạt được đặc

biệt cao: 10 pg/mL huyết thanh [27]

1.2.4 Sắc ký khí khối phổ (GC – MS)

1.2.4.1 Giới thiệu máy sắc ký khí

Sắc ký khí là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất,

được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau như: hoá sinh, sinh

học, y học, dược học, hoá học lâm sàng, nghiên cứu xúc tác, hoá học môi

trường Phương pháp sắc ký khí dùng để tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu

các thông số hoá lý như hệ số hoạt độ, entanpi, nhiệt hoá hơi, hệ số khuếch

tán phân tử, động học xúc tác v.v [12]

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

Sơ đồ khối về máy sắc ký khí được minh họa trong hình 1.1 Hai bộ

phận quan trọng nhất là cột tách và detector Nhờ có khí mang, mẫu từ

buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký khí xảy ra tại đây, sau khi các cấu tử rời khỏi cột tách tại các thời

điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào dectector tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện, tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang

bộ phận xử lý kết quả

Nguyên lý hoạt động của detector khối phổ

Hiện nay có nhiều loại detector ghép nối với sắc ký khí như detector dẫn nhiệt (TCD), ion hoá ngọn lửa (FID), cộng kết điện tử (ECD), nhưng detector khối phổ có giá trị như một cuộc cách mạng trong phân tích lượng vết do khả năng chứng minh trong định tính và giới hạn định lượng của nó

Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng lượng va chạm, dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau Sau đó tách và đo khối lượng của tất cả các ion này và ghi chúng trên một bản đồ phổ

• Thiết bị phân tích khối phổ bao gồm các bộ phận:

- Bộ nạp mẫu: Mẫu được dẫn vào một bình chứa ở đó áp suất có thể giảm đến 10-6 mmHg sau đó dòng khí này được dẫn vào buồng ion hoá để tạo ra các ion Lượng mẫu có thể ghi nhận được rất nhỏ 10-13g/giây

- Bộ nguồn ion: sử dụng các kỹ thuật sau để tạo ion:

+ Va chạm electron (Electron impact - EI)

+ Ion hoá hoá học (Chemical ionization - CI)

+ Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ianization - APCI)

+ Ion hoá bằng nhiệt (Thermo spray ionization - ISI)

+ Ion hóa bằng giải hấp:

Giải hấp laser

Tốc độ này ở trong máy phân tích đạt 100 km/giây Sau khi tăng tốc các ion được bay qua 1 từ trường do hai nam châm hình móng ngựa gây ra,

đường bay của chúng sẽ bị lệch khác nhau do tác dụng của từ trường với bán kính lệch R, công thức tính:

R2 = .2 2

H

U e m

Trong đó: R :Bán kính lệch

m: Khối lương ion e: Điện tích ion H: Cường độ từ trường

Còn m/e ghi trên bản đồ phổ là số khối của các ion Với thiết bị GC/MS thì hỗn hợp khí mang và ion hoá của máy khối phổ để ion hoá mẫu chất Tuy nhiên tốc độ dòng khí ở cột sắc ký ra vào khoảng 0,2 – 2mL/phút (sắc ký mao quản), nên người ta phải giảm tốc độ dòng khí khi

đưa vào buồng ion là nhỏ hơn 0,2mL/phút, thế ion hoá của máy khoảng 20

eV nhỏ hơn thế ion hoá của He (24,582eV) do đó đảm bảo các phân tử khí

He không bị ion hoá, thế ion hoá 20 eV ít hơn 70 eV dẫn đến độ nhậy của máy bị hạn chế, do vậy người ta phải tách khí He trước khi vào buồng ion hoá [7], [12]

1.2.4.2 Phân tích định lượng

Điều kiện phân tích Để kết quả phân tích đúng đắn, điều cần thiết

trước hết là các cấu tử nghiên cứu phải được tách hoàn chỉnh mà không có píc chồng lên nhau Trước khi phân tích định lượng cần kiểm tra các điều kiện sau đây:

- Độ lặp lại ( giữ nguyên các thông số)

- Mối tương quan giữa các các kết quả thu được trong trường hợp thay đổi các thông số làm việc của thiết bị như cột tách, lượng mẫu bơm, nhiệt độ

- Độ đúng của kết quả

- Độ nhạy và độ tuyến tính của detector

Phân tích định lượng chia làm 4 giai đoạn

- Tách sắc ký (thu tín hiệu detector)

- Chuyển tín hiệu detector thành số liệu (đo điện tích)

- Chuyển các số liệu để so sánh tính toán

- Giải thích các số liệu (thống kê)

Phương pháp ngoại chuẩn Kết quả sẽ chính xác khi các thông số

làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng v.v… phải rất ổn định và lượng mẫu bơm phải có độ lặp lại cao Người ta lập đường chuẩn giữa các lượng mẫu khác nhau và diện tích tương ứng của các cấu tử cần phải xác định

Phương pháp nội chuẩn Người ta thêm vào mẫu (có khối lượng cố

định là E) một lượng xác định Mr của chất được chọn làm chất nội chuẩn Chất nội chuẩn có thể là một chất lạ và cũng có thể là một cấu tử nào đó sẵn

có trên sắc đồ Nếu là chất lạ thì thời gian của nó phải gắn với thời gian lưu của cấu tử cần phân tích Hàm lượng của cấu tử cần xác định đó được tính như sau:

fi: Hệ số hiệu chỉnh cấu tử i E: khối lượng của mẫu

Mr: Khối lượng của chất nội chuẩn

Ai: Diện tích của cấu tử i

Ar: Diện tích của cấu tử r

Phương pháp tự nội chuẩn Khi sắc đồ không còn chỗ hở cho việc

đưa thêm chất nội chuẩn vào, áp dụng phương pháp tự nội chuẩn tức là bằng chính cấu tử cần xác định Thêm vào hỗn hợp mẫu có khối lượng ban đầu là

E, một lượng mẫu cấu tử i đã biết là MIZ Sau đó, so sánh píc của cấu tử i đó

giữa hai sắc đồ trước và sau khi cho thêm chất nội chuẩn (Ai1 và Ai2) Mặt khác cũng so sánh sự thay đổi của một diện tích píc của cấu tử x khác (Ax1

và Ax2)

Hàm lượng phần trăm khối lượng cấu tử i cần xác định sẽ là:

Khối lượng % =

E A

A A A M

i i x x iz

.

100

1 2 2

1.2.4.3 Dẫn xuất hoá các hợp chất trong phân tích lượng vết

* Nguyên lý chung: Phương pháp sắc ký khí làm việc dựa vào việc

chuyển mẫu thành dạng hơi trong điều kiện thực nghiệm Một số chất nhiều khi không phân tích được bằng sắc ký khí như: đường, axit amin, các axit béo bậc cao và các vitamin v.v Tuy nhiên, các hợp chất này có thể được phân tích bằng sắc ký khí nếu như chúng được chuyển hoá thành các dẫn xuất tương ứng dễ bay hơi Do đó người ta có thể đạt được hiệu quả tách tốt

và độ nhạy phát hiện cao hơn nhiều Dẫn xuất hoá bên cạnh làm tăng khả năng bay hơi của các cấu tử cần phân tích, còn cho phép chuyển hoá những nhóm phân cực của các cấu tử thành những nhóm không phân cực tương ứng, hạn chế được khả năng hấp phụ mạnh trong quá trình sắc ký khí do tương tác của những nhóm phân cực gây ra

- Có 2 kỹ thuật dẫn xuất hoá:

+ Trimetylsilan hoá:

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong sắc ký khí Nhờ kỹ thuật này những nhóm chức phân cực được silan hoá, dễ dàng nhất là các nhóm –OH, - COOH, - NH2, -NH và - SH, trong đó hydro hoạt động được thế bằng nhóm trimetylsilyl (CH3)3 Si

+ Metyleste hoá:

Để phân tích các axit béo thông thường người ta chuyển chúng thành dẫn xuất metyleste, hoặc dẫn xuất hoá chúng thành loại trimetylsilyleste nhưng không bền bằng sản phẩm metyleste hoá

* Dẫn xuất CLB

Phân tích trực tiếp CLB bằng phương pháp sắc ký thường gặp khó khăn, CLB phân cực do có chứa nhóm -OH nên thường gây hiện tượng doãng chân pic, nhiệt độ phân tích thường phải đặt cao, làm cho định tính,

định lượng gặp khó khăn, dễ mắc sai số, độ nhạy lại thấp Hiện nay qua tham khảo tài liệu cho thấy hầu hết các tác giả đều sử dụng phương pháp dẫn xuất Trimetylsilan hoá để dẫn xuất clenbuterol [12], [14], [20]

Khi phân tích CLB bằng phương pháp GC/MS cần thiết phải dẫn xuất hoá, các chất được dùng để dẫn xuất hoá như là: N, O- Bis (trimetylsilyl) acetamit (BSA); sylon (BFT); trifluoroacetamid (BSTFA), trimetyl clorosilan (TMCS) và N – metyl-N (trimetylsilyl) trifluoro acetamid (MSTFA)

Phản ứng dẫn xuất hoá xảy ra theo cơ chế thế, nhóm trimetyl – silyl thế nguyên tử hydro linh động của CLB tạo thành chất dẫn xuất CLB – TMS theo phương trình phản ứng sau:

H2N – C6H2 Cl2-– CHOH-CH2 – NH-C(CH3)3

+ F3C – CO –N(CH3)-Si (CH3)3

H2N – C6H2 Cl2-– CHOSi(CH3)3 -CH2 – NH-C(CH3)3

+ F3C-CO-NH-CH3

Hiệu suất phản ứng tạo thành CLB – TMS phụ thuộc vào các điều kiện phản ứng CLB – TMS được sử dụng để phân tích định tính và định lượng CLB.[16], [30], [34]

1.3 Phương pháp chiết clenbuterol trong dịch sinh học

Chiết là quá trình tách chất từ một pha bằng cách cho pha này tiếp xúc với pha thứ hai không trộn lẫn với pha thứ nhất, nếu hai pha đều là lỏng

ta có chiết lỏng – lỏng, nếu một pha lỏng và một pha rắn ta có chiết lỏng – rắn [1]

Cx(A) là nồng độ chất X trong dung môi A

Cx (B) là nồng độ chất X trong dung môi B

Nếu hệ số phân bố Kpb > 99/1 thì coi như chất X đã chuyển gần hết vào pha A Đây là điều kiện cần thiết của quá trình chiết lấy chất ra khỏi mẫu, tách chất ra khỏi chất nền của mẫu ban đầu, chuyển chất vào dung môi chiết

Ưu điểm của phương pháp là giá thành thấp, dịch chiết phù hợp với

hệ thống sắc khí và có thể dễ dàng thay thế dung môi để có độ chọn lọc cao Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm liên quan đến việc thường phải sử dụng một lượng lớn dung môi độc và dễ cháy, dẫn đến các vấn đề về xử lý chất thải và môi trường Hơn nữa trong thực tế chiết lỏng –

lỏng có thể tạo thành dạng nhũ dịch, là một vấn đề khó xử lý, đặc biệt khi nhũ bền và không thể phá vỡ nhũ bằng các kỹ thuật như làm lạnh, lọc, li tâm hay thêm một thể tích nhỏ dung môi hữu cơ khác [1], [2], [3]

Đối với clenbuterol, Adam A và các cộng sự đã khảo sát các loại dung môi chiết như sau: diclorometan, n-hexan, ethyl acetat và diethyl ether

và dùng các hệ đệm acetat, phosphat, borat, carbonat và citrat Các tác giả nhận thấy rằng dùng hệ đệm natri acetat 0,2 M và axit acetic (95: 5), pH ≈ 5,8 là thích hợp nhất và dung môi diclorometan chiết mẫu tóc đã qua xử lý

là tốt hơn còn với mẫu dịch sinh học thì dung môi diethyl ether là phù hợp [14]

Trong mẫu thực phẩm Ramos và các cộng sự đã sử dụng phương pháp ngâm chiết mẫu với dung dịch axit pecloric 0,1M sau đó chiết với hệ dung môi ethyl acetat : isopropanol (9:1), chất dẫn xuất là BSTFA, thiết bị

sử dụng phân tích là GC-MS giới hạn phân tích định tính đạt 4àg/kg [30]

1.3.2 Chiết pha rắn (SPE)

Chiết pha rắn là quá trình lưu giữ một chất từ hệ phức tạp bằng một chất rắn được gọi là chất liên kết (sorbant), sau đó tách chất đó ra khỏi chất liên kết bằng một dung môi hữu cơ - gọi là quá trình rửa giải SPE là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các chất ảnh hưởng của nền, hoặc làm giàu các chất cần phân tích

trước khi tiến hành các kỹ thuật phân tích [1], [15]

Thực ra kỹ thuật SPE đã được sử dụng từ lâu để tinh chế dịch chiết trong chiết xuất lỏng- lỏng Những công nghệ tiên tiến đã tạo ra nhiều chất liên kết chọn lọc, hiệu quả nên trong vài thập kỷ qua kỹ thuật chiết pha rắn ngày càng được ứng dụng rộng rãi SPE không những đóng vai trò độc lập như một kỹ thuật tách chiết mà còn được cài

đặt vào các hệ GC/MS, HPLC/MS tạo thành một hệ thống phân tích tự

động hoàn chỉnh [1], [7], [32]

1.3.2.1 Quá trình nghiên cứu SPE

Sự phát triển của kỹ thuật chiết pha rắn gắn liền với sắc ký lỏng

cổ điển Từ năm 1906 nhà hoá học Nga Tsvet dùng cột nhồi calci carbonat rắn hấp phụ các chất màu thực vật, sau đó dùng ether dầu hoả rửa giải chất màu ra khỏi cột Kỹ thuật tách này theo thuật ngữ hiện nay gọi là tách pha thuận Sau đó nhiều loại chất rắn được dùng thay thế cho calci carbonat trong sắc ký pha thuận như oxyd silic, oxyd nhôm, Florisil

Năm 1941 Martin và Synge đã dùng một dung môi phân cực là nước hấp phụ trên bề mặt silicagel làm pha tĩnh và dùng một dung môi

ít phân cực như cloroform- ethanol cho qua cột để tách các dẫn xuất acetyl của acid amin, hình thành khái niệm sắc ký phân bố

Năm 1950 Howard và Martin đã dùng một pha tĩnh không phân cực để liên kết với các hợp chất không phân cực được hoà tan trong dung môi phân cực Các tác giả đã xử lý bề mặt oxyd silic bằng diclorodimethysilan làm cho bề mặt trở thành phân cực, bề mặt này lưu giữ một dung môi không phân cực làm pha tĩnh Dùng n- octan bão hoà nước làm pha tĩnh để tách các acid béo mạch thẳng bằng pha động nước- methanol (80: 20), sắc ký pha đảo ra đời

Năm 1966 Abel và cộng sự đã thay pha tĩnh lỏng ở trên bằng chất rắn hấp thụ trực tiếp chất phân tích Các tác giả đã điều chế pha rắn bằng cách cho triclorosilan phản ứng với oxyd silic, tạo ra bề mặt liên kết Người ta tiếp tục nghiên cứu cách xử lý bề mặt của, dùng thuốc thử

organosilan xử lý SiO2 tạo ra nhiều loại nguyên liệu có tính chất khác nhau dùng làm pha rắn cho chiết lỏng rắn Có nhiều kiểu dụng cụ chiết pha rắn như: đĩa (disk), ống (cartrige), bằng các chất liệu polymer như PTFE (Polytetrafluoro Ethylen), PE (Polyethylen) với các chất nhồi có thông số kỹ thuật rất khác nhau Cột có nhiều hình dạng khác nhau nhưng thông thường nhất là hình trụ [1], [7], [15]

* So với chiết lỏng- lỏng cổ điển, SPE có đặc điểm:

- Giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ sử dụng (thường <10mL)

do đó làm giảm chi phí dung môi và chi phí xử lý dung môi thải

- Chiết chọn lọc chất quan tâm (do hoạt động trên nguyên tắc sắc

ký lỏng)

- Thời gian chiết nhanh (vài phút)

- Tỷ lệ thu hồi các chất được chiết cao, không tạo nhũ tương

- Độ lặp lại của kỹ thuật chiết tương đối cao cho kết quả phân tích tin cậy

- Có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết

SPE đã được sử dụng rộng rãi trong thực hành phân tích, nó có thể thay thế phần lớn kỹ thuật chiết lỏng - lỏng cổ điển Chiết pha rắn có thể được thực hiện phổ biến trên cột chiết, màng chiết ít sử dụng hơn, ngoài ra còn sử dụng trên sợi chiết như vi chiết pha rắn (SPME) [1], [31]

1.3.2.2 Các loại pha rắn của SPE

• Pha liên kết

Pha liên kết được tổng hợp từ hạt silicagel có kích thước 40- 60 à

m Trên bề mặt của nó có liên kết hoá học với một pha lỏng Không thể dùng trực tiếp silicagel với hỗn hợp dung môi nước vì nước sẽ làm mất hoạt tính của silicagel, làm cho tương tác rất yếu với các chất cần phân

tích nên mất khả năng lưu giữ Vì vậy cần làm cho bề mặt của silicagel trở nên sơ nước (hydrophobe) Gipin và Burke (1973) đã dùng clorosilan phản ứng với nhóm OH của silicagel tạo ra liên kết mạch Si -O- Si Dạng liên kết này là cơ sở cho tổng hợp phần lớn pha liên kết sau này, như pha liên kết đơn chức kiểu siloxan Si- O- Si- R tạo ra một chất liên kết alkyl pha đảo có số carbon của gốc R là 2, 4, 8 và 18

Nguyên tắc tổng hợp tương tự nhau nhưng với công nghệ hiện đại chưa tạo ra được sản phẩm đồng nhất Sự khác nhau về tính chất như diện tích bề mặt, kích thước hạt, kích thước lỗ (pore) không chỉ giữa sản phẩm của các nhà sản xuất mà cả giữa những lô sản phẩm của cùng một nhà sản xuất Các loại pha liên kết như pha đảo, pha thuận, pha trao đổi ion với các cấu trúc, tải lượng, thế ion khác nhau [1], [2], [7], [31]

• Pha liên kết kiểu siloxan (Si- O- Si- R) có một số tính chất sau:

- Trên bề mặt pha liên kết đơn chức tồn tại các nhóm silanol chưa tham gia phản ứng Các nhóm này được coi là những vị trí thấp phụ tồn tại ở 3 dạng khác nhau [1]

Nhóm OH tự do gắn vào một nguyên tử silic

Hai nhóm OH gắn vào hai nguyên tử silic cạnh nhau

Hai nhóm OH gắn vào cùng một nguyên tử silic

Ba dạng liên kết- OH phản ứng ở mức độ khác nhau tạo liên kết hydro, hoặc trao đổi cation với chất tan trong dung dịch Trong khi đó liên kết siloxan lại sơ nước Để đảm bảo pha liên kết này không phân cực, cần giảm thiểu mức silanol bằng cách cho phản ứng với monoclrotrimethysilan

- Gốc R trong siloxan quyết định tính chất của pha liên kết Gốc

R không phân cực tạo ra pha đảo Ngược lại nếu chúng mang những nhóm phân cực như amin, hydroxid làm cho bề mặt trở thành phân cực,

ta có pha thuận Nếu gốc R có chứa các nhóm có thể trao đổi cation hoặc anion ta được pha trao đổi ion

- Độ ổn định của pha liên kết phụ thuộc vào pH dung dịch

Độ tan của Silicagel sẽ tăng lên khi pH>7 và pH<2, nguyên nhân

là do acid và base sẽ thúc đẩy quá trình thuỷ phân, cắt liên kết của gốc organosilyl (R- Si- ) với bề mặt của pha liên kết đơn chức

Trường hợp liên kết đa chức, pha rắn ổn định hơn với acid, bởi vì gốc organosilyl liên kết với bề mặt ở một số vị trí Tuy nhiên dung lượng của pha rắn liên kết này đối với một số chất phân cực sẽ giảm đi

do mất đi tương tác thứ cấp của nhóm OH silanol

- Đường kính lỗ kiểm soát sự di chuyển vào ra của chất phân tích Nếu đường kính lỗ nhỏ hơn 10nm, hiệu ứng thắt cổ chai có thể xảy ra Trong trường hợp này khi xử lý bề mặt với monoclorosilan sẽ tồn tại những vùng không được dẫn xuất hoá

Các lỗ có đường kính trên 50nm có vai trò quan trọng trong sắc

ký theo cỡ (size exclusion chromatography) Dạng sắc ký này thường dùng hạt có kích thước lỗ 275- 300A0 Những phân tử có khối lượng trên 2.000 có thể thâm nhập vào cỡ lỗ này, lưu giữ một thời gian nhờ các tương tác như sơ nước, phân cực hay trao đổi ion

Người ta có thể kết hợp trimetylsilan với pha rắn bề mặt đa chức

để bề mặt pha liên kết trở thành sơ nước, ngăn cản phản ứng phụ giữa chất phân tích và silanol Pha được xử lý kiểu này gọi là pha liên kết EC

- Khi chiết lỏng - rắn, đánh giá chất lượng pha rắn căn cứ vào yếu

được dùng trong tách chiết pha đảo

* Polyme SDB

Nhựa XAD thành phần chính là polyme SDB đã được dùng từ những năm 1960 - 1970 để chiết xuất các hợp chất hữu cơ trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích môi trường Polyme SDB có dung lượng cao, diện tích bề mặt lớn, các vòng thơm SDB tạo ra tương tác cho electron giữa pha rắn và liên kết (π) của chất hoà tan làm tăng khả năng lưu giữ của pha rắn Mặt khác, pha rắn này chấp nhận cả những nhóm ưa nước như acid sulfonic nên tăng cường sự vận chuyển nước vào pha rắn dẫn

đến đẩy nhanh quá trình chuyển khối, nâng cao hiệu quả pha rắn, nên một số hãng đã tìm cách gắn thêm đặc tính phân cực khi tổng hợp nhựa SDB Do dung lượng cao hơn C18 nên polyme SDB có vai trò quan trọng khi yêu cầu giới hạn phát hiện thấp Mặt khác SDB ổn định hơn

pha liên kết silioxan Nó có thể hoạt động ở pH trong khoảng từ 2-12 [1], [7]

* Than hoạt

Than hoạt được dùng trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích chất hữu cơ từ năm 1958 nhưng có nhược điểm là hấp phụ không thuận nghịch chất phân tích trên bề mặt Nó chứng tỏ không chỉ là pha rắn có hiệu ứng sơ nước mà còn có tương tác đặc biệt với chất cần phân tích nhất là các chất hữu cơ rất phân cực Điều này có thể liên quan đến phức carbon - oxy (mang điện dương) trong than hoạt có khả năng trao

đổi anion với dung dịch nước acid hoá [31]

1.3.2.3 Cơ chế liên kết và rửa giải

Quá trình rửa giải chất phân tích trong chiết pha đảo khá đơn giản Chọn một dung môi ít phân cực đủ để phá liên kết do lực Vander Waals lưu giữ chất phân tích trên pha rắn Nguyên tắc chung lựa chọn dung môi rửa giải là sử dụng dãy dung môi có độ phân cực giảm dần Các cấu tử quan tâm bị lưu giữ chặt sẽ được rửa giải bằng dung môi ít

phân cực Việc rửa giải các cấu tử trong pha đảo có thể dựa vào tính tan của chúng [7]

Để có thể rửa giải hiệu quả cần cho dung môi rửa giải tiếp xúc thực sự với pha liên kết, tức là có đủ tính sơ nước để hoà tan tương hỗ với bề mặt pha rắn và pha liên kết (C8, C18) Dung môi thíchhợp cho quá trình rửa giải pha đảo là methanol, acetonitril và ethyl acetat Ba dung môi này có khả năng:

- Tạo liên kết hydro với nhóm silanol trên bề mặt pha rắn

- Hoà tan dư lượng nước còn sót lại trong pha liên kết

- Phá vỡ dễ dàng tương tác Vander Waals giữa chất phân tích và pha liên kết

Với chất tan sơ nước mạnh, để tăng hiệu quả quá trình rửa giải người ta thường thêm metylenclorid và ethyl acetat (tỷ lệ 1: 1) Ngoài ra

có thể dùng thêm một số dung môi khác cho rửa giải trong chiết pha

đảo Nếu dung môi sơ nước được dùng thì cần làm khô chân không để loại bỏ hết vết nước còn sót lại trên pha rắn nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi rửa giải có thể tiếp xúc hiệu quả với tất cả bề mặt pha rắn, hoà tan chất phân tích [1], [7]

• Pha thuận

Cơ chế tách chiết pha thuận bắt nguồn từ quá trình lưu giữ chất phân tích nhờ bề mặt phân cực ứng dụng để chiết các chất phân cực vừa đến phân cực mạnh Các tương tác phân cực trong trường hợp này là liên kết hydro, liên kết (π - π), tương tác lưỡng cực - lưỡng cực Ngoài pha liên kết, trong tách pha thuận người ta còn dùng một số pha không liên kết

Nước và các dung môi phân cực không được dùng trong chiết pha thuận bởi vì chúng sẽ chiếm các vị trí hoạt động trên pha rắn làm giảm tương tác phân cực giữa chất phân tích và pha rắn

Quá trình rửa giải pha thuận:

Nguyên tắc chung lựa chọn dung môi rửa giải là sử dụng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần, cấu tử quan tâm thứ nhất bị lưu giữ yếu rửa giải bằng dung môi phân cực, các cấu tử còn lại (lưu giữ mạnh hơn) rửa giải bằng dung môi phân cực tăng lên Việc rửa giải pha thuận cũng có thể dựa vào tính tan của chúng [7]

Nói chung các chất base được lưu giữ mạnh trên bề mặt có tính acid như silica hay alumina base Các hợp chất như alcol, aldehyd, dẫn xuất halogen hoà tan trong hexan có thể được hấp thụ mạnh trên silicagel Để rửa giải các chất này trong nhiều trường hợp dùng methanol [1], [7]

• Trao đổi ion

Trao đổi ion là một dạng sắc ký nhờ các loại nhựa tổng hợp có khả năng trao đổi ion với dung dịch được sử dụng từ năm 1935 Cơ chế của quá trình tách ở mức năng lượng cao tương tác ion, do đó chất phân tích phân cực có thể bị loại bỏ rất hiệu quả khỏi dung môi phân cực bao gồm cả nước cũng như các dung môi kém phân cực hơn Các chất hấp phụ trao đổi ion thường có các nhóm chức cation, anion liên kết với polime Các nhóm cation thường là nhóm: -SO3H, -COOH Các nhóm anion thường là:

R4N+Cl-, R3N+HCl- Polime thường là SDB, benzenacrylic hoặc pha liên kết silica Phản ứng trao đổi ion trên nhựa trao đổi ion xảy ra tức thời, tuy nhiên cần có một thời gian để các ion có thể khuếch tán tiếp cân bề mặt trao đổi Quá trình khuếch tán phu thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước ion, đường

kính lỗ và kích thước hạt tiểu phân Nguyên tắc triển khai thường qua các bước sau:

- Xét cơ chế trao đổi: dựa vào pKa của hợp chất cần nghiên cứu xác

địn pH cần thiết để đảm bảo xảy ra quá trình trao đổi, chọn nhựa trao đổi ion thích hợp

- Xác định các yếu tố cản trở quá trình trao đổi ion có mặt trong dung dịch

- Chọn chất rửa giải để lấy hết chất nghiên cứu đã được lưu giữ trên nhựa trao đổi ion

Nguyên tắc chọn dung dịch rửa giải là dựa vào sự biến đổi pH hoặc lực ion của đệm, rửa giải chất phân tích đầu bằng đệm mạnh hơn đệm rửa các chất cản trở, rửa giải những chất phân tích khác bằng các đệm mạnh hơn liên tiếp.[23], [31], [32]

• Quá trình chiết pha rắn

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước hình 1.5.[1], [7], [15]

Bước 1: chuẩn bị pha rắn hay còn gọi là hoạt hoá pha rắn bằng cách:

cho dung môi chảy qua chất rắn để làm ướt vật liệu nhồi và solvat hoá các nhóm chức của chất rắn, đuổi không khí ở trong cột bằng cách lấp đầy dung môi Dung môi điển hình cho quá trình chuẩn bị cột là: methanol, nước, dung dịch đệm (dung môi nên phù hợp với mẫu chiết)

Bước 2: cho mẫu phân tích chảy qua cột

Cơ chế của quá trình trên bao gồm lực tương tác Vander Waals (còn gọi là không phân cực, tính kỵ nước hoặc pha ngược), liên kết hydro, các lực lưỡng cực, trao đổi ion, cation Trong quá trình này, chất phân tích được làm giàu trên chất rắn Một vài thành phần của mẫu vẫn có thể còn giữ lại cùng với chất phân tích còn các thành phần khác không được lưu giữ bị loại

Hình 1.2: Các bước tiến hành trong quá tình chiết pha rắn

Bước 3: Là bước loại bỏ tạp chất ra khỏi cột để giữ lại chất phân tích

Quá trình rửa này sẽ loại bỏ nền mẫu ra khỏi bề mặt rắn của cột, trong khi

đó vẫn giữ được chất phân tích Nếu nền mẫu là dung dịch nước, cần phải

sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước – dung môi hữu cơ Nếu mẫu

bị hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi đó

Bước 4: Là bước chiết chất phân tích ra khỏi chất rắn bằng dung môi

thích hợp Dung môi được chọn phải phá vỡ tương tác giữa chất phân tích

và chất rắn để rửa giải được chất phân tích Dung môi rửa giải càng ít chất (các chất này cũng bị hấp phụ trên cột) càng tốt Đây là nguyên tắc cơ bản của phương pháp chiết pha rắn

Một số tác giả đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để chiết Clenbuterol từ mẫu sinh học và các tác giả nhận thấy rằng dùng cột chiết C8 và C18 là phù hợp Daniel Zalko và các cộng sự đã chiết rất thành công nhờ phương pháp SPE như sau: 1mL nước tiểu pha loãng với methanol (1:2) quay ly tâm 10 phút tốc độ 10.000 vòng/phút, lấy dịch lọc bay hơi chân không cạn bớt, lọc qua màng 0,45 àm Dịch thu được (∼ 1mL) thêm 9mL dung dịch amoni acetat 50 mM, pH 6,8 Dùng cột pha đảo C8 (5mL, Merck) rửa bằng 2 mL methanol, methanol/acid focmic (19:1) Một số tác

giả khác đã sử dụng phương pháp chiết trao đổi cation sử dụng SCX để chiết clenbuterol từ mẫu nước tiểu với pH 3 [14], [16], [22]

1.3.3 Vi chiết pha rắn (Solid Phase Micro Extraction- SPME)

Các kỹ thuật chiết đã nêu vẫn còn một số hạn chế chưa thể đáp ứng thật tốt nhu cầu phân tích nhanh trong phân tích vi lượng bằng sắc

ký lỏng, sắc ký khí hay điện di mao quản Một kỹ thuật chiết mới có thể khắc phục rất tốt các hạn chế của các phương pháp đã nêu đó là kỹ thuật vi chiết pha rắn SPME không đòi hỏi các dung môi hoặc các thiết bị phức tạp Kỹ thuật này có thể làm giàu các cấu tử bay hơi và không bay hơi, trong cả mẫu lỏng, mẫu khí cho phân tích GC, GC- MS

và HPLC Đây là công nghệ mới trong SPE do Pawliszyn và cộng sự ở trường đại học Waterloo sáng chế năm 1989 [1], [7]

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên quá trình cân bằng chất phân tích với một lớp polyme sơ nước nằm trên một sợi quang silica nóng chảy Chất phân tích từ môi trường ngoài (nước, không khí) tuỳ thuộc vào ái lực với pha rắn giữ cân bằng với màng bao trên sợi quang

Thiết bị chiết

Gồm một sợi dài làm bằng silica nung chảy được phủ một lớp mỏng (từ 7- 100àm) của một trong các chất carbowax, polydimethyloxan, polyacrylat Các pha này có thể được trộn với các chất hấp thụ rắn như hợp chất trùng cao phân tử divinylbenzen, nhựa hoặc carbon hoạt tính Sợi này được đặt trong lòng một chiếc kim gắn với một pittông làm bằng thép không rỷ Tổ hợp này được đặt trong một bộ phận bảo vệ còn gọi là xy lanh [8]

Trong luận văn này chúng tôi triển khai nghiên cứu tách chiết CLB bằng cột pha rắn trong nước tiểu thỏ đã uống CLB, tiếp theo là phân tích định tính và định lượng chất này bằng kỹ thuật GC-MS

- Tủ sấy có điều khiển nhiệt độ Memmert, (Germany)

- Bộ quay cất chân không Kika USA

- Cân điện tử Sartorius BL 3100, ISO 9001, (Canada)

- Máy lắc IKA của Đức

- Máy ly tâm Potofix 32, (Hettich Germany)

- Tủ lạnh National, NR-B17D1

- Bình khí N2, (Tanaka, Japan)

- Hệ thống bơm hút chân không Membran, Vacuabrand, (Germany)

- Máy cất nước hai lần Aquatron, (UK)

- Máy đo pH

2.1.2 Dụng cụ, hóa chất

- Bình tam giác (100ml, 250ml, 500ml)

- Bình định mức (2ml, 5ml, 10ml, 50ml, 100ml)

- Các ỗng đựng mẫu (15ml, 30ml có chia vạch đến 1ml)

- Cốc thuỷ tinh(50ml, 100ml, 250ml)

- Pipét (1ml, 2ml, 10ml, 25ml), micopipét 25àl, 100àl

- Xilanh bơm mẫu 10àl có chia vạch 0,2àl

- Cột chiết pha rắn SCX (strong cation exchange) 6ml, Agilent

- Chất chuẩn clenbuterol (Merck)

- Dung môi Methanol tinh khiết, (Merck)

- Chất tạo dẫn xuất N–methyl–N (trimethylsilyl) trifuoroacetamid (MSTFA), (Sigma)

- Hóa chất HCl, KH2PO4, dung dịch NH4OH, (Merck)

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Sử dụng clenbuterol chuẩn cho vào nước tiểu thỏ tạo mẫu giả bảo quản tại -120C trước khi phân tích Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm

Sử dụng clenbuterol chuẩn cho thỏ uống ở những liều khác nhau, thu nước tiểu thỏ trong thời gian 72h, bảo quản ở nhiệt độ lạnh -12 0C trước khi phân tích

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trước tiên chúng tôi tiến hành xác định điều kiện tối ưu dẫn xuất CLB với MSTFA, phân tích CLB-TMS trên sắc kí khí khối phổ, xây dựng

đường ngoại chuẩn, xây dựng quy trình chiết pha rắn, đánh giá phương pháp phân tích trên mẫu giả và cuối cùng áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng để phân tích mẫu thực nghiệm cho thỏ uống clenbuterol

2.3.1 Phân tích định tính, định lượng CLB-TMS

2.3.1.1 Xây dựng chương trình phân tích trên GC-MS

Thực hiện khảo sát cột, tốc độ dòng khí mang, nhiệt độ bơm mẫu, chương trình nhiệt độ, chế độ làm việc detector

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa CLB

Để CLB phản ứng với MSTFA đạt hiệu quả cao nhất cần phải khảo sát nhiệt độ phản ứng và thời gian phản ứng tối ưu CLB dùng để dẫn xuất hóa có nồng độ 1ppm, thể tích MSTFA dùng để thực hiện phản ứng là 50àl Nghiên cứu phản ứng dẫn xuất ở 6 nhiệt độ khác nhau 400C, 500C, 600C,

700C, 800C, 900C Sau khi xác định được nhiệt độ tối ưu để phản ứng xảy ra với hiệu suất cao nhất sẽ cố định nhiệt độ đó để khảo sát thời gian phản ứng tối ưu Chuẩn bị dung dịch có nồng độ như trên tiến hành phản ứng ở các thời gian khác nhau 20 phút, 40phút, 60phút, 90phút, 120phút Mỗi thí nghiệm đuợc thực hiện lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình

2.3.2 Xây dựng quy trình chiết pha rắn

- Chọn cơ chế chiết phù hợp: pha đảo, trao đổi cation

- Xử lý cột chiết pha rắn

- Chọn dung môi rửa tạp chất

- Chọn dung môi rửa giải

- Xác định hiệu quả dung môi rửa giải

- Xác định hiệu lực tách chiết thông qua hệ số thu hồi

- Thực hành trên mẫu tự tạo là nước tiểu thỏ, tính hệ số thu hồi

2.3.3 Thẩm định phương pháp

- Khoảng nồng độ tuyến tính

Để đảm bảo độ chính xác, chúng tôi xác lập mối tương quan giữa nồng độ của CLB trong mẫu với diện tích pic tương ứng Mối tương quan giữa nồng độ chất phân tích với diện tích pic thu được biểu thị bằng phương trình với các hệ số tương ứng và đồ thị Việc xây dựng được tiến hành trên 5-7 nồng độ khác nhau của chất phân tích

Yêu cầu đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị

hệ số tương quan r phải không dưới 0,99

- Độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành phân tích ở 3 mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic CLB Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD%

RSD(%) =

X

Yêu cầu RSD(%) không quá 5%

- Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp:

Xác định giới hạn phát hiện có thể được thực hiện bằng thực nghiệm, hay qua đường chuẩn tuyến tính Trong nghiên cứu này chúng tôi

sử dụng phương pháp xác định bằng cách so sánh chiều cao pic sắc ký và nhiễu đường nền, với sự trợ giúp của phần mềm máy sắc kí

- Xác định giới hạn định lượng của phương pháp:

Giới hạn định lượng nhằm xác định phương pháp có thể định lượng chính xác được tại nồng độ thấp nhất trong mẫu là bao nhiêu Giới hạn định lượng thường được xác định bằng 3 lần giới hạn phát hiện

2.3.4 Phân tích CLB trong mẫu nước tiểu thỏ thực nghiệm

Để đánh giá phương pháp đã xây dựng đáp ứng yêu cầu phân tích thực tế chúng tôi tiến hành cho thỏ uống CLB sau thời gian nhất định thu nước tiểu để phân tích theo quy trình kỹ thuật đã thẩm định

Phần iii thực nghiệm và kết quả

3.1 Xây dựng chương trình phân tích trên GC-MS

Chúng tôi tiến hành tối ưu hoá điều kiện phân tích trên thiết bị

GC-MS của hãng Agilent 6890N Từ thực nghiệm cho thấy nếu sử dụng loại cột

có độ phân cực cao, thời gian lưu của CLB-TMS bị kéo dài làm tốn thời gian phân tích Khi sử dụng cột có độ phân cực ít như HP5 thời gian lưu của píc sắc kí đạt được là 12,497 Kết quả này tách riêng được píc sắc ký tốt

quả tốt, nếu đặt quá cao dễ gây nhiễm bẩn đối với mẫu phân tích, song nếu

đặt quá thấp chất phân tích không thể hoá hơi Tốc độ dòng khí được lựa chọn là 1,2mL/phút đảm bảo phù hợp với kích thước cột sắc ký Sau khi tối

ưu hoá điều kiện phân tích qua thực nghiệm Chương trình phân tích trên hệ GC-MS được lựa chọn như sau:

- Máy: Sắc kí khí khối phổ Model Agilent 6890N, USA

- Cột mao quản: HP5 - MS 30m x 0,25mm, độ dày pha tĩnh 0,25àm

đã xác dịnh, các ion chính nhận được từ CLB – TMS trên phổ khối được chỉ ra trong hình 3.1, hình 3.2, thời gian lưu của CLB - TMS là 12,497 phút, hình 3.3